專利名稱：琥珀酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用能產(chǎn)生琥珀酸的微生物來制造琥珀酸的方法。
背景技術(shù)：
基于發(fā)酵的琥珀酸生產(chǎn)一般在供給足量氧氣的好氧條件下、供給少量氧氣的微好氧條件下或不供給氧氣的厭氧條件下進行。目前為止的記載是，較之于好氧條件，微好氧條件下或厭氧條件下對發(fā)酵反應(yīng)更有利(專利文獻I 4，非專利文獻I)。特別地，還有這樣的記載以棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)為題材，基于模擬(FBA模型)試驗結(jié)果，供給微量氧氣的條件相比于厭氧條件，提高了琥珀酸的生產(chǎn)，以及通過缺損LDH基因進一步提高了琥珀酸的生產(chǎn)(非專利文獻I)。 專利文獻5和6中記載了，在使用酵母或曲霉等真核細胞生產(chǎn)琥珀酸中，在缺氧條件下，氧氣消耗速度(移動速度)控制在0. 01 5mmol/L/hr以下,或通過通氣進行氧氣供給控制時(oxygen limited conditions),氧氣消耗速度控制在 5. 5 7mmol/L/hr?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻[專利文獻I]日本專利特開2004-194570號公報[專利文獻2]日本專利特開2006-6344號公報[專利文獻3]日本專利特開2005-95169號公報[專利文獻4]國際公開W02005/026349號小冊子[專利文獻5]國際公開W02009/065778號小冊子[專利文獻6]國際公開W02010/003728號小冊子[非專利文獻][非專利文獻 I] Shinfuku et al. , Development and experimental verificationof a genome-scale metabolic model for Corynebacterium glutamicum (谷氛酸棒狀桿菌的基因組尺度代謝模型的建立和實驗證實).Microbial Cell Factories 2009, vol. 8:4
發(fā)明內(nèi)容
但是，由于非專利文獻I中記載的模擬(FBA模型)試驗是以菌體增殖達最佳狀態(tài)為目的進行計算的，因此條件是作為原料的糖代謝用于菌體增殖、菌體的代謝物主要產(chǎn)生乳酸(碳收率最大60%)、琥珀酸中碳收率最大20%左右。進而，在微好氧條件下以及厭氧條件下的琥珀酸生產(chǎn)中，氧攝取速度(OUR)/糖攝取速度(GUR)為0. 21時，相對于模擬結(jié)果的碳收率為19. 2%，實施例的碳收率為3. 1%，模擬結(jié)果與實施例相背離。由此可知，在菌體增殖受到限制的條件下，向基于產(chǎn)生琥珀酸的微生物的發(fā)酵反應(yīng)的氧氣供給和琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)的詳細關(guān)系尚不明確。此外，模擬中的發(fā)酵條件下菌體增值速度高，在菌體增殖受限制的條件下，向發(fā)酵反應(yīng)的氧氣供給和琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)的詳細關(guān)系尚不明確。
而且，在工業(yè)規(guī)模下進行生產(chǎn)時，必須控制為不供給氧氣的厭氧環(huán)境，具體來說，如專利文獻I記載的那樣，通過減壓將反應(yīng)水溶液中溶解的氣體除去，或通過氮氣等將氧氣從反應(yīng)體系中除去。然而，由于增設(shè)除去溶解氣體用的減壓設(shè)備和控制氮氣供給等要花費大量費用，所以在工業(yè)利用上不理想。此外，在工業(yè)規(guī)模下進行從反應(yīng)體系除去氧氣時，反應(yīng)開始前要花費大量的時間，因此使用的菌體和培養(yǎng)基等的狀態(tài)發(fā)生了變化，反應(yīng)本身可能出現(xiàn)障礙。此外，工業(yè)規(guī)模的琥珀酸生產(chǎn)中，氧氣供給和琥珀酸生產(chǎn)效率的關(guān)系尚不清
/E. o本發(fā)明的課題是提供比以往的生產(chǎn)效率高，尤其是可以適應(yīng)工業(yè)規(guī)模的琥珀酸的制造方法。本發(fā)明人們，為了解決上述課題而潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了通過能產(chǎn)生琥珀酸的微生物從原料糖制造琥珀酸時，在微生物的菌體增殖受到限制的條件下，通過將氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度的比控制在特定的范圍，即在供給極微量的氧的環(huán)境下進行琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)，可提高琥珀酸生產(chǎn)效率，從而完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明的主旨如下。[ I ] 一種琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物與糖反應(yīng)的琥珀酸制造方法中，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度的比(mmol-02/mol-SA)在0. I以上、240以下，反應(yīng)中微生物的倍增時間在40小時以上。[2] [I]中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反應(yīng)中的相對琥珀酸的氧移動速度減少率(％/g/L)在I. 2以下。[3] [I]或[2]中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，氧移動速度(mmol-02/L/hr)在0.01以上、5以下。[4] [I] [3]的任一項中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，該微生物選自棒狀桿菌、大腸桿菌、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬、放線桿菌(Acinobacillus)屬、絲狀真菌、酵母菌。[5] [I] [4]的任一項中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，該微生物是被變異為乳酸脫氫酶活性低于非變異株的微生物，和/或變異為丙酮酸羧化酶活性強于非變異株的微生物。[6] [I] [5]的任一項中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反應(yīng)中的pH為5以上、10以下。[7]—種含琥珀酸聚合物的制造方法，包括根據(jù)[I] [6]的任一項所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸進行聚合反應(yīng)的工序。[8] —種琥珀酸衍生物的制造方法，包括根據(jù)[I ] [6]的任一項所述的方法制造琥珀酸的工序，和以所得到的琥珀酸為原料合成琥珀酸衍生物的工序。
具體實施例方式以下詳細地說明本發(fā)明的實施方式。以下記載的構(gòu)成要件的說明是本發(fā)明的實施方式的一個例子(代表例)，只要不超過本發(fā)明的主旨，就不被這些內(nèi)容所限定。<本發(fā)明的概要>
本發(fā)明是一種琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物與糖反應(yīng)的琥珀酸制造方法中，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度的比(mmOl-02/mOl-SA)的范圍在0. I以上、240以下，反應(yīng)中微生物的倍增時間在40小時以上?！次⑸铩当景l(fā)明的方法中使用的微生物只要是具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物就沒有限制。本發(fā)明中，所謂琥珀酸產(chǎn)生能力是指，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物時，在該培養(yǎng)基上蓄積琥珀酸的能力。具體地，雖然沒有特別的限制，但琥珀酸產(chǎn)生能力的程度能夠通過琥珀酸的糖消費碳收率等來表示。對于琥珀酸的糖消費碳收率(C_mol%)雖然沒有特別的限制，但如果糖消費碳收率過低，則相對于作為原料的糖的琥珀酸生產(chǎn)效率有降低的傾向，因此通常在40C-mol%以上，優(yōu)選在50C-mol%以上，更優(yōu)選在60C-mol%以上。另一方面，通常在133C_mol%以下，優(yōu)選在120C-mol%以下，更優(yōu)選在110C-mol%以下。另外，所謂琥珀酸中的糖消費碳收率 (C-mol%)是指，相對于消費的糖所含的碳原子(C原子)的摩爾數(shù)，生產(chǎn)的琥珀酸所含碳原子的摩爾數(shù)之比。本發(fā)明的方法所使用的微生物，只要具有琥珀酸產(chǎn)生能力就沒有特別的限制，可列舉從棒狀桿菌、大腸桿菌、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬細菌、放線桿菌(Acinobacillus)屬細菌、絲狀真菌和酵母菌組成的群組中選擇的微生物。其中，優(yōu)選棒狀桿菌、大腸桿菌、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬細菌、放線桿菌(Acinobacillus)屬細菌、酵母菌，更優(yōu)選棒狀桿菌、大腸桿菌、酵母菌，特別優(yōu)選棒狀桿菌。本發(fā)明的方法中使用的棒狀桿菌可列舉屬于棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、節(jié)細菌(Arthrobacter)屬、分枝桿菌(Mycobacterium)屬、細桿菌(Microbacterium)屬、微球菌(Micrococcus)屬的細菌。作為短桿菌屬細菌,使用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。另外，黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌和谷氨酸棒桿菌相互的親緣關(guān)系非常近，性質(zhì)也類似，在現(xiàn)在的分類學中有時也被分類為同一個種。作為特別優(yōu)選的棒狀桿菌親株的具體例子可列舉，黃色短桿菌MJ-233 (FERMBP-1497)、同 MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)、谷氨酸棒桿菌 ATCC31831、乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869 等。另夕卜，由于現(xiàn)在黃色短桿菌有時也被分類為谷氨酸棒桿菌(Lielbl，W.，etal., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991，vol. 41，p255_260),所以本發(fā)明中，黃色短桿菌MJ-233株及其變異株MJ-233AB-41株分別與谷氨酸棒桿菌MJ-233株及MJ-233AB-41株是相同的株。黃色短桿菌MJ-233于1975年4月28日在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)以受托番號FERM P-3068寄托保藏，1981年5月I日基于布達佩斯條約移交國際寄托保藏，以FERM BP-1497的受托番號寄托保藏。作為厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬細菌，使用產(chǎn)琥拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)等。
作為放線桿菌(Acinobacillus)屬細菌,使用產(chǎn)琥拍酸放線桿菌(Acinobacillussuccinogenes)等。絲狀真菌可列舉屬于曲霉(Aspergillus)屬、青霉(Penicillium)屬、根霉(Rizopus)屬等的微生物。作為曲霉屬微生物，使用黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等。作為青霉屬微生物，使用產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、簡青霉(Penicillium simplicissimum)等。作為根霉屬微生物，使用米根霉(Rizopus oryzae)等。酵母菌可列舉屬于酵母屬(Saccaromyces)、裂殖酵母屬(Shizosaccaromyces)、念珠菌屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、接合酵母 屬(Zygosaccharomyces)等的微生物。作為酵母屬(Saccaromyces)微生物，使用酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、貝酵母(S. bayanus)等。作為裂殖酵母屬(Shizosaccaromyces)微生物，使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。作為念珠菌屬(Candida)微生物,使用白念珠菌(Candida albicans)、索諾拉念珠菌(C. sonorensis)、光滑念珠菌(C. glabrata)等。作為畢赤酵母屬(Pichia)微生物,使用畢赤酵母(Pichia pastoris)、樹干畢赤酵母(Pichia Stipidis)等。作為克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)微生物，使用乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)等。作為接合酵母屬(Zygosaccharomyces)微生物，使用拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailli)、魯氏酵母(Z. rouxii)等。該琥珀酸生產(chǎn)能力可以是本發(fā)明的方法中所使用的微生物的野生株所具有的性質(zhì)，也可以是通過育種賦予的性質(zhì)。通過育種賦予琥珀酸生產(chǎn)能力的方法沒有特別限制，具體來說可使用通過UV照射或NTG處理等通常的變異處理而得到變異株的方法、通過細胞融合或基因重組法等遺傳性方法得到誘導重組體的方法等迄今微生物育種中采用的方法。上述重組體可使用強化琥珀酸合成酶基因的表達或弱化琥珀酸分解酶基因和副產(chǎn)物合成基因的表達等公知的方法得到。使用本發(fā)明方法的重組體可以施加單獨的變異，也可以施加2種或3種以上的變異。具體地可列舉例如，被變異為乳酸脫氫酶活性比非變異株降低的微生物等。被變異為丙酮酸羧化酶(以下也稱為“PC”或“pc”)活性比非變異株增強的微生物，例如，可以與日本專利特開平11-196888號公報中記載的方法同樣地，通過用質(zhì)粒使pc基因在宿主微生物中高表達來構(gòu)筑。此外，可以通過同源重組組裝于染色體上，也可以通過啟動子取代來增強PC基因的表達(日本專利特開2008-259451號公報)。轉(zhuǎn)化可通過例如電脈沖法(Res. Microbiol.，Vol. 144，p. 181-185，1993)等進行。
所謂“PC活性增強”是指PC活性相對于野生株或親株等非變異株，每單位重量菌體優(yōu)選增加I. 5倍以上，更優(yōu)選增加3.0倍以上。PC活性的增強可通過公知的方法，例如，按J. Bacteriol.，158，55-62，(1984)中記載的方法測定PC活性來確認。作為pc基因的具體的導入方法，使用日本專利特開2008-259451號中記載的方法。此外，變異為乳酸脫氫酶(以下有時稱作“LDH”)活性比非變異株降低的微生物，例如，可以通過日本專利特開平11-206385號公報中記載的基于同源重組的方法，或通過使用sacB基因的方法(Schafer，A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)破壞染色體上的LDH基因來構(gòu)筑。另外，所謂“LDH活性降低”是指與非變異株比較，LDH活性下降。LDH活性完全消失也可以。LDH活性的降低可通過公知的方法(L. . Kanarek, et al. , J. Biol.Chem. 239，4202 (1964)等)測定LDH活性來確認。進一步，本發(fā)明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增強和/或LDH 活性降低，還可以是變異為從醋酸激酶(以下也稱為“ACK”)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(以下也稱為“PTA”)、丙酮酸氧化酶(以下也稱為“P0XB”)和輔酶A轉(zhuǎn)移酶(以下也稱為“CTF”)組成的群組中選出的I種以上的酶活性降低的微生物。雖然可以將PTA和ACK任一方的活性降低，但為了有效降低醋酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生，優(yōu)選降低二者的活性。所謂“PTA活性”是指，對磷酸向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移生成乙酰磷酸的反應(yīng)進行催化的活性。所謂“變異為PTA活性降低”是指，PTA的活性比非變異株，例如野生株降低。PTA活性與非變異株比較，優(yōu)選每單位重量菌體降低至30%以下，更優(yōu)選降低至10%以下。此外，PTA活性完全消失也可以。PTA活性的降低可通過例如，Klotzsch, H. R. , MethEnzymol. 12，381-386(1969)等記載的方法測定PTA活性來確認。所謂“ACK活性”是指，對由乙酰磷酸和ADP生成醋酸的反應(yīng)進行催化的活性。所謂“變異為ACK活性降低”是指，ACK的活性比非變異株，例如野生株降低。ACK活性與非變異株比較，優(yōu)選每單位重量菌體降低至30%以下，更優(yōu)選降低至10%以下。此夕卜，ACK活性完全消失也可以。ACK活性的降低可通過Ramponi的方法(Ramponi G. , Meth.Enzymol. 42，409-426 (1975))測定ACK活性來確認。谷氨酸棒桿菌(包括被分類到黃色短桿菌的菌)中，如 Microbiology. 1999 Feb; 145 (Pt 2) :503-13 中記載的那樣，由于 PTA 和 ACK兩種酶被pta-ack操縱子(GenBank Accession No. X89084)編碼,所以破壞pta基因時,可以降低PTA和ACK兩種酶的活性。降低PTA和ACK的活性可以通過公知的方法，例如，利用同源重組的方法或按照使用sacB基因的方法(Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)破壞它們的基因來進行。具體地可以按照日本專利特開2006-000091號公報中公開的方法來進行。作為pta基因和ack基因，除了上述具有GenBank Accession No. X89084堿基序列的基因以外,還可以使用具有宿主染色體上的Pta基因和ack基因發(fā)生同源重組程度的同源性的基因。此處，所謂發(fā)生同源重組程度的同源性是指，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上。此夕卜，如果是能與上述基因在嚴格條件下雜交的DNA，就可以發(fā)生同源重組。所謂“P0XB活性”是指對由丙酮酸和水生成醋酸的反應(yīng)進行催化的活性。所謂“變異為POXB活性降低”是指，POXB的活性比非變異株，例如野生株低。POXB活性與非變異株比較，優(yōu)選每單位重量菌體降低至30%以下，更優(yōu)選降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失的情況。POXB活性的降低可通過Chang Y.，et al.，J. Bacteriol. 151，1279-1289(1982)等中記載的方法測定活性來確認。POXB的活性降低，可以通過公知的方法，例如，利用同源重組的方法或按照使用sacB基因的方法(Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)等破壞poxB基因來進行。具體地可以按照W02005/113745號公報等公開的方法來進行。作為poxB基因，可舉出例如具有GenBank Accession No. Cgl2610(GenBank Accession No. BA000036 的第 2776766-2778505號的互補鏈)的堿基序列的基因，但具有宿主染色體DNA上的poxB基因發(fā)生同源重組程度的同源性也可以，因此也可以使用該序列的相同基因。此處，所謂發(fā)生同源重組程度的同源性是指，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上。此外，如果是能與上述基因在嚴格條件下雜交的DNA，就可以發(fā)生同源重組。所謂“CTF活性”是指對將乙酰輔酶A的輔酶A向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)移而生成醋酸的反應(yīng)進行催化的活性。所謂“變異為CTF活性降低”是指，CTF的活性比非變異株，例如野生株降低。CTF活性與非變異株比較，優(yōu)選每單位重量菌體降低至30%以下，更優(yōu)選降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失情況。CTF活性的降低可通過Scherf U and Buckel ff. Appl Environ Microbiol. 1991; vol. 57, pp. 2699-2702.等中記載的方法測定。作為Ctf 基因，可舉出例如具有 Genbank Accession No. Cgl2569 (GenbankAccession No. BA000036的第2729376-2730917號的互補鏈)的堿基序列的基因，但具有宿主染色體DNA上的Ctf基因發(fā)生同源重組程度的同源性也可以，因此也可以使用該序列的相同基因。此處，所謂發(fā)生同源重組程度的同源性是指，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上。此外，如果是能與上述基因在嚴格條件下雜交的DNA，就可以發(fā)生同源重組。此外，本發(fā)明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增強或PC活性增強且LDH活性降低以外，還可以組合上述變異中的2種以上變異所得到的微生物。作為理想的微生物，可列舉例如日本專利特開2008-259451號公報等中記載的黃色短桿菌MJ233/PC-4/ A LDH 株、國際公開 W02009/065777 號小冊子、國際公開 W02009/065778 號小冊子、國際公開W02009/065779號小冊子、國際公開W02009/065780號小冊子、國際公開TO2010/003728號小冊子等中記載的組合了破壞編碼乙醇脫氫酶的ADHl和ADH2基因、破壞編碼甘油三磷酸脫氫酶的GPDl基因、增強磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、增強蘋果酸脫氫酶活性、增強富馬酸酶活性、增強富馬酸還原酶活性、增強蘋果酸轉(zhuǎn)運體活性的酵母菌株，例如 SUC-200 (MATA ura3-52 leu2_112 trpl-289 adhl: :lox adh2: :loxgpdl: :Kanlox, overexpressing PCKa, MDH3, FUMR, FRDg and SpMAEl)等。< 培養(yǎng) >本發(fā)明中，所謂培養(yǎng)主要是指，令琥珀酸制造方法中所使用的微生物增殖而制備微生物菌體的工序?？梢允÷耘囵B(yǎng)工序，也可以將在寒天培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)之物直接用于反應(yīng)，此外，還可以將培養(yǎng)工序重復數(shù)次。本發(fā)明中，將主要制造琥珀酸的工序稱為“琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)”或“反應(yīng)”，將制備直接供應(yīng)琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)的菌體的培養(yǎng)稱為“本培養(yǎng)”，將制備供應(yīng)該本培養(yǎng)的菌體的培養(yǎng)稱為“種培養(yǎng)”。培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，可以使用上述微生物的培養(yǎng)中所使用的通常的培養(yǎng)基?？梢允褂美缦蛄蛩徜@、磷酸鉀、硫酸鎂等無機鹽構(gòu)成的組合中添加肉類提取物、酵母提取物、蛋白胨等天然營養(yǎng)源的一般的培養(yǎng)基。本反應(yīng)中使用的令上述微生物增殖而得到菌體的培養(yǎng)條件不受限制，但通常，如果是棒狀桿菌，只要是生長最適溫度就無特別限制，但通常為25V以上，另一方面，通常為35°C以下，優(yōu)選32°C以下，特別優(yōu)選30°C以下。培養(yǎng)時，通氣、攪拌同時供氧。生長最適溫度是指琥珀酸生產(chǎn)所使用的條件中生長速度最快的溫度。培養(yǎng)時間只要是得到規(guī)定量的菌體的時間就沒有特別限制，通常在6小時以上、96小時以下。此外，作為更適合制造琥珀酸的菌體制備方法，還可以使用日本專利特開2008-259451號公報中記載的短時間內(nèi)重復交替碳源的枯竭和充足來進行培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)后的菌體，可以將含微生物的培養(yǎng)液直接用于琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)，也可以將菌體通過離心分離、膜分離等回收后再用于反應(yīng)。作為本發(fā)明的制造方法所使用的微生物，還可以使用該菌體的處理物。作為菌體的處理物，可列舉例如，將按上述方法培養(yǎng)、收集的菌 體用丙烯酰胺、卡拉膠等固定的固定化菌體、將菌體破碎后的破碎物、該離心分離的上清液或?qū)⒃撋锨逡和ㄟ^硫酸銨處理等部分純化后的部分。<培養(yǎng)所使用的糖>培養(yǎng)中使用普通的糖。培養(yǎng)所使用的糖，只要是上述微生物能同化吸收并生產(chǎn)琥珀酸的糖就沒有特別限制，通常使用半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖、蔗糖、淀粉或纖維素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇或核糖醇等多元醇等發(fā)酵性糖類物質(zhì)，其中優(yōu)選葡萄糖、蔗糖、果糖或甘油，特別優(yōu)選選葡萄糖或蔗糖。此外，也使用含有上述發(fā)酵性糖類物質(zhì)的淀粉糖化液或糖蜜等，具體地優(yōu)選從甘蔗、甜菜或糖楓等植物中榨取的糖液。這些糖可以單獨或組合使用。上述糖的使用濃度沒有特別限制，在不阻礙琥珀酸的生產(chǎn)的范圍內(nèi)盡可能提高是有利的，相對于反應(yīng)液，通常在5%(W/V)以上，優(yōu)選在10%(W/V)以上，另一方面，通常在30% (W/V)以下，優(yōu)選在20% (W/V)以下。此外，也可以應(yīng)對隨著反應(yīng)進行的上述糖的減少，進行糖的追加添加。<琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)>本發(fā)明的琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)的特征在于，在令具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物和糖反應(yīng)的琥珀酸的制造方法中，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比(mmol-02/mol-SA)在
0.I以上、240以下，反應(yīng)中的微生物的倍增時間在40小時以上。<氧移動速度>本發(fā)明中的氧移動速度，只要后述氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比在上述范圍之內(nèi)就沒有特別限制，也可以是不向反應(yīng)槽供給氧的厭氧氣氛(氧移動速度為0的條件)。此處，不向反應(yīng)槽供給氧的厭氧氣氛(氧移動速度為0的條件)可以通過例如，將容器密閉而在不通氣的條件下反應(yīng)、供給氮氣等惰性氣體使其反應(yīng)，或通入含有二氧化碳氣體的惰性氣體等方法獲得，但存在琥珀酸收率或琥珀酸生產(chǎn)速度低下、丙酮酸等副產(chǎn)物增加造成的琥珀酸純化成本增加，以及為了實現(xiàn)氧移動速度為0而將反應(yīng)槽用氮或不含氧的惰性氣體等置換而使成本增加等問題。另一方面，如果氧移動速度過高，也會產(chǎn)生琥珀酸的糖消費碳收率低下或琥珀酸生產(chǎn)速度低下、副產(chǎn)物醋酸的產(chǎn)量增加造成的琥珀酸純化成本增加，還有為了實現(xiàn)高氧移動速度而將攪拌數(shù)設(shè)定得高和/或通氣速度設(shè)定得高所帶來的動力成本增加等問題，所以氧移動速度通常為0.01 [mmol 02/L/hr]以上，優(yōu)選為0. 02 [mmol 02/L/hr]以上，更優(yōu)選為0.05 [mmol 02/L/hr]以上,另一方面,通常為5 [mmol 02/L/hr]以下,優(yōu)選為3,更優(yōu)選為
2.5[mmol 02/L/hr]以下，特別優(yōu)選為 2[mmol 02/L/hr]以下。本發(fā)明中，反應(yīng)液中的氧移動速度可以通過將溶液用氮氣置換，降低溶解氧的濃度后，進行通氣或攪拌，從溶解氧濃度的變化求出的方法(Wise ff. S. J. Gen. Microbiol.，1951，vol. 5，pp. 167-177)等測定。本發(fā)明中，向反應(yīng)槽供給氧的方法沒有特別的限制，可以使用例如，通氣的方法或向液體中溶解氧的方法。優(yōu)選通氣的方法。也可以適當進行反應(yīng)液的攪拌而調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)。為了調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)，可以僅通過反應(yīng)液的攪拌使氧溶解，也可以進行反應(yīng)液的攪拌和通氣，也可以只進行通氣使氧溶解。此外，還可以設(shè)置用于有效地產(chǎn)生基于攪拌的亂流的擋板。 本發(fā)明中的通氣方法沒有特別限制，可舉出令含氧氣體與反應(yīng)液或進料液接觸的方法。為了調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)，可以直接使用純氧或空氣等含氧氣體，也可以混合使用。此外，純氧或空氣等含氧氣體還可以與氮氣或二氧化碳等氣體任意混合。此外，還可以將用過一次的氣體回收，再度使用。為了調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)，可以將含氧氣體用能調(diào)節(jié)通氣量的壓縮機，通過孔噴射器(orifice sparger)、噴嘴噴射器(nozzlesparger)或環(huán)噴射器(ring sparger)等噴射器(通氣管)，以及多孔管等向反應(yīng)槽的氣相部通入氣體，也可以向反應(yīng)液中直接通氣。此外，為了調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)，可以通過將氧氣溶解于反應(yīng)中進料的進料液中，再供給該液體而間接地添加。也可以在向反應(yīng)液或進料液等通氣時，將氣體從配管等直接向液體中流通，可以使用噴射器等氣流擴散裝置，也可以使用膜等。為了調(diào)節(jié)至上述氧移動速度的范圍內(nèi)，可以測定通入氣體或排除氣體的流量、壓力或組成，反應(yīng)液或進料液中的氧濃度或氧化還原電位或進料液的流量等中的任一種，同時調(diào)節(jié)任一種。<琥珀酸生產(chǎn)速度>本發(fā)明中，所謂琥珀酸生產(chǎn)速度(mmol/L/hr)是指每IL在I小時中生產(chǎn)的琥珀酸的量，如果過小則有需要長反應(yīng)時間造成的成本增加或琥珀酸以外的副產(chǎn)物的產(chǎn)量增加造成的琥拍酸收率低下的傾向，因此通常為lmmol/L/hr以上,優(yōu)選5mmol/L/hr以上。另一方面，雖然不被上限所限制，但通常為1000mmol/L/hr以下,優(yōu)選700mmol/L/hr以下,更優(yōu)選300mmol/L/hr 以下。<氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比>本發(fā)明中，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比(mmOl-02/mOl-SA)如果過小，則帶來如下問題較之于適合琥珀酸生產(chǎn)的氧供給量減小，琥珀酸收率下降或琥珀酸生產(chǎn)速度下降，副產(chǎn)物丙酮酸的產(chǎn)量增加造成的琥珀酸純化成本增加，為了實現(xiàn)非常小的氧移動速度條件的要求而將反應(yīng)層用氮置換等帶來的成本增加等，因此在0. I以上，優(yōu)選0. 2以上，更優(yōu)選0.3以上。另一方面，如果這個比過大，則產(chǎn)生如下問題較之于適合琥珀酸生產(chǎn)的氧供給量增大，琥珀酸收率下降或琥珀酸生產(chǎn)速度下降，此外，副產(chǎn)物醋酸的產(chǎn)量增加造成的琥珀酸純化成本增加，氧移動速度增大引起的伴隨著菌體增殖的副產(chǎn)物增加，琥珀酸生產(chǎn)速度減小帶來的反應(yīng)時間增加所造成的成本的增加等，因此在240以下，優(yōu)選200以下，更優(yōu)選150以下，進一步優(yōu)選100以下，特別優(yōu)選50以下。將氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比作為指標的原因是如下考慮的。通常，琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)中，為了使琥珀酸收率最大，理論上較好的是使菌體的增殖速度無限小，不供給氧的厭氧環(huán)境最佳。但是，本發(fā)明的結(jié)果顯示出，在厭氧環(huán)境下的琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)中，丙酮酸等副產(chǎn)物量變大、琥珀酸收率降低，通過供給微量的氧氣，副產(chǎn)物量降低、琥珀酸收率提高，進而琥珀酸生產(chǎn)速度提高。這樣，我們判斷，在伴隨著副產(chǎn)物的產(chǎn)生的琥珀酸生產(chǎn)中，不是在只考慮了琥珀酸生產(chǎn)的理論上優(yōu)選的厭氧條件下，而是在供給微量氧氣的條件下，琥珀酸生產(chǎn)能力得以提高。這意味著，琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)中，必須控制合適的氧供給。但是僅將氧移動速度作為指標設(shè)定某個范圍的話，例如，如果在琥珀酸生產(chǎn)速度小的反應(yīng)時供給了適合高琥珀酸生產(chǎn)速度的氧量，琥珀酸生產(chǎn)變成了好氧狀態(tài)，導致上述那樣的醋酸等副產(chǎn)物增加，所以不理想，因此認為將表示對應(yīng)于琥珀酸生產(chǎn)速度的氧量的氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比作為指標是優(yōu)選的。此處，我們認為本發(fā)明中，作為主要顯示相對于具有琥珀酸生產(chǎn)能力的微生物的琥珀酸代謝需要多少氧量的指標，控制氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比的值是重要的。 該氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度之比，尤其是可以成為工業(yè)上的琥珀酸生產(chǎn)反應(yīng)的條件設(shè)定時的優(yōu)選指標。工業(yè)生產(chǎn)時，琥珀酸生產(chǎn)速度可以根據(jù)原料成本或制造設(shè)備成本來選擇、變化優(yōu)選的速度。該指標在這樣的條件的變更中可以容易地對應(yīng)，是有用的?！幢对鰰r間〉本發(fā)明中，所謂倍增時間是指，上述微生物的菌體數(shù)增加到2倍所消耗的時間，以某2點的菌體濃度(OD)或干燥菌體重量的值為變量，用以下計算式(I)表示。[數(shù)I]
權(quán)利要求
1.一種琥珀酸的制造方法，其特征在于，是使具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物與糖反應(yīng)的琥珀酸制造方法，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度的比mmOl-02/mOl-SA在0. I以上、240以下，反應(yīng)中微生物的倍增時間在40小時以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其特征在于，反應(yīng)中的相對琥珀酸的氧移動速度減少率％/g/L在I. 2以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2中所述的方法，其特征在于，反應(yīng)中的氧移動速度mmol-02/L/hr在0. 01以上、5以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3的任一項中所述的方法,其特征在于,該微生物選自棒狀桿菌、大腸桿菌、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬、放線桿菌(Acinobacillus)屬、絲狀真菌和酵母菌組成的群組。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4的任一項中所述的方法，其特征在于，該微生物是被變異為乳酸脫氫酶活性低于非變異株的微生物，和/或被變異為丙酮酸羧化酶活性強于非變異株的微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5的任一項中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反應(yīng)中的pH為5以上、10以下。
7.一種含琥珀酸的聚合物的制造方法，包括按照權(quán)利要求I 6的任一項所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸進行聚合反應(yīng)的工序。
8.一種琥珀酸衍生物的制造方法，包括按照權(quán)利要求I 6的任一項所述的方法制造琥珀酸的工序，和以所得到的琥珀酸為原料合成琥珀酸衍生物的工序。
全文摘要
一種琥珀酸的制造方法，其特征在于，是使具有琥珀酸產(chǎn)生能力的微生物與糖反應(yīng)的琥珀酸制造方法，氧移動速度相對于琥珀酸生產(chǎn)速度的比(mmol-O2/mol-SA)在0.1以上、240以下，反應(yīng)中微生物的倍增時間在40小時以上。
文檔編號C12P7/46GK102812127SQ201180011827
公開日2012年12月5日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者吉川勝德, 城戶大助, 村瀨誠 申請人:三菱化學株式會社