專利名稱：將核酸進行測序之組合物與方法
技術領域：
本發(fā)明系關于測定一核酸之序列的方法。此外，本發(fā)明關于核苷酸類似物與其在一核酸測序中的用途。
背景技術：
已發(fā)展出各種技術與程序來獲得基因信息，包括在基因密碼(genetic codes)中之分離標志的廣泛的基因剖析研究或鑒定形態(tài)(broad genetic profiling oridentifying pattern)與整個基因體的核苷酸程度之測序。對于在多種應用領域，例如生物技術、鑒識生物學(forensic biology)、診斷(diagnostic)、系統(tǒng)生物學(systematicbiology)、合成生物學(synthetic biology)與個人健康照顧(personal healthcare)中的基礎生物學研究而言，DNA序列的知識已變成不可缺少。DNA測序的出現(xiàn)已顯著地增進了生物學研究與發(fā)現(xiàn)。盡管技術已發(fā)展至在核苷酸程度讀取一基因序列，但此類方法可為費 時且極度昂貴的。藉由從電泳基礎方法轉移至芯片基礎測序，新世代測序(Next GenerationSequencing)之最新的技術(于 Metzker, M. L.，NATUREREVIEWS GENETICS 11:31-45(2010)中回顧)，已大幅降低測序之成本，其不是自經(jīng)擴增之目標分子的族群得到序列信息，而通常包括將單一目標分子進行測序。實時測序的引入，其中監(jiān)測連續(xù)核苷酸并入事件的發(fā)展，同時執(zhí)行核酸聚合程序，已改善了測序的效率。實時單一分子測序的一般策略為源自焦磷酸測序(pyrosequencing)的概念，其中以一光可偵測標記來標記核苷酸三磷酸鹽單體的PPi部分。在焦磷酸測序反應中，當各單體被并入一增長之鏈時，即在聚合酶擴展(polymerase extension)期間，光訊號被釋放且偵測(參見，例如 Ronaghi, et al.，SCIENCE, 281:363-365 (1998) ;Hyman, ANAL.BI0CHEM.，174:423-436(1988);與美國專利號 6，255，083 與 7，329，492)。使用零階波導(zero-mode waveguide, ZMW)以在單一分子測序中增加訊號對噪聲比(signal-to-noiseratio)之單一分子偵測的方法也已被描述于美國專利號7，170, 050與7，056, 676中。在任何酶居中(enzyme-mediated)、模板依賴(template-dependent)測序程序中，并入程序的整體精確度、持續(xù)性(processivity)與正確性可直接影響序列測定。目標序列讀取之較低的正確性可能需要多倍覆蓋率(multiple-fold coverage)以測定出一具有高程度的信賴度之目標序列。不論近來之發(fā)展，存在著對每個測序反應提供較高之正確性之測序策略的需要。

發(fā)明內容
于此提供之實施例提供用于擴大單一分子訊號偵測之觀察期間以改善單一分子序列測定的正確性的新穎方法。實施例包括一測定一目標核酸之核苷酸序列的方法。在一些實施例中，方法包括步驟(a)提供一反應復合物,包括,一模板核酸,其包括一目標核酸序列、一引物核酸，其包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的一序列，與一聚合酶酶或一酶復合物，其包括5’至3’聚合活性與校對之3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應復合物與復數(shù)個核苷酸類似物接觸，其中該復數(shù)個之一個別的核苷酸類似物包括至少一堿基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，其為指出該堿基配對部分的身份；(C)藉由該酶或酶復合物之5’至3’聚合活性，使該酶或酶復合物得以將一核苷酸類似物以一模板依賴方式并入一新生股(nascent strand),藉此將該標記部分結合至該新生股；(d)偵測該經(jīng)并入之核苷酸類似物的該光可偵測標記；(e)藉由該酶或酶復合物之校對之3’至5’外核酸酶活性，使該酶或酶復合物得以從該新生股移除該經(jīng)并入之核苷酸類似物的該標記部分；以及(f)重復步驟(c)-(e)以測定該目標核酸的序列。于此描述之方法包括一種測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酶或酶復合物所并入之一核苷酸堿基的方法，該方法包括步驟(a)執(zhí)行一核酸聚合反應，其利用一聚合酶酶或酶復合物之5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者，且以一模板依賴方式導致一新生股的產(chǎn)生，其中執(zhí)行該反應于下列存在時(i) 一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii) 一引物核酸，包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的一序列；(iii) 一聚合酶酶或一酶 復合物，包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(iv)復數(shù)個核苷酸類似物，其中該復數(shù)個之一個別的核苷酸類似物包括至少一堿基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記；以及(b)偵測該光可偵測標記，其中該標記為指出該堿基或存在于藉由該酶或酶復合物并入該新生股之該核苷酸類似物中之堿基的身份。實施例還包括一種測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，該方法包括步驟(a)執(zhí)行一核酸聚合反應于下列存在時Q) —模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii) 一引物核酸，包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的一序列；(iii) 一聚合酶酶或一酶復合物，包括用于以一模板依賴方式并入一核苷酸類似物的一反應位置；(iv)復數(shù)個核苷酸類似物，其中該復數(shù)個之一個別的核苷酸類似物包括至少一堿基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，且其中一旦該類似物藉由該聚合酶酶或酶復合物以一模板依賴方式被并入該新生股，該類似物不終止一新生股之產(chǎn)生，且其中相較于包括藉由該聚合酶酶或酶復合物之5’至3’聚合活性被移除的一標記的一核苷酸類似物，該核苷酸類似物提供至少一個經(jīng)延長之偵測期間與經(jīng)延長之中介脈沖持續(xù)期間；以及(b)偵測在各個依序并入事件中所并入之該標記部分。于此敘述之任何測序方法中所使用的光可偵測標記可為一熒光團(fluorophore)或可藉由一光偵測器偵測之任何其它適合之標記。于此敘述之任何方法中所使用的核苷酸類似物可包括至少一突光淬熄部分(fluorescence quenching moiety) 在藉由酶或酶復合物之5’至3’聚合活性以一模板依賴方式并入核苷酸類似物之時，該熒光淬熄部分從該核苷酸類似物被移除。在一些方面中，熒光淬熄部分，視需要而定藉由一連接物(linker)，附著至一核苷酸類似物之5’端。在一些方面中，熒光淬熄部分附著至于核苷酸類似物之5’端之三磷酸鹽基團的3或Y磷酸鹽。在一些方面中，標記部分包括一光可偵測標記與一可選的連接物其連結光可偵測標記至一磷酸連接(phosphate linkage)。在一些其它方面中，標記部分包括(a) —或多個非互補核苷酸殘基；(b) —光可偵測標記；以及(C) 一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基。該一或多個非互補核苷酸殘基為獨立地擇自一無堿基核苷酸殘基與包括一堿基之一核苷酸殘基，而該堿基實質上缺乏與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一個堿基配對的能力。核苷酸類似物之堿基配對部分一般包括一堿基，該堿基具有在該反應復合物之一并入位置中與該目標核酸之一對應堿基堿基配對的能力。在一些方面中，堿基配對部分之3’端經(jīng)由一磷酸連接連結至標記區(qū)域。在一些實施例中，堿基配對部分包括至少三個磷酸鹽機團于其5’端，其中，最接近該堿基配對部分(a磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一硫代磷酸鹽(phosphorothioate)、甲基磷酸鹽(methyIphosphonate)或硼燒磷酸鹽(boranophosphate)。實施例還包括一化合物,具有式I :
權利要求
1.一種測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步驟 (a)提供一反應復合物，包括，ー模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引物核酸，其包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的ー序列，與一聚合酶酶或ー酶復合物，其包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性； (b)使該反應復合物與復數(shù)個核苷酸類似物接觸，其中該復數(shù)個之ー個別的核苷酸類似物包括至少ー堿基配對部分與至少ー標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，其為指出該堿基配對部分的身份； (c)藉由該酶或酶復合物之5’至3’聚合活性，使該酶或酶復合物得以將ー核苷酸類似物以ー模板依賴方式并入一新生股，藉此將該標記部分結合至該新生股； (d)偵測該經(jīng)并入之核苷酸類似物的該光可偵測標記； (e)藉由該酶或酶復合物之3’至5’外核酸酶活性，使該酶或酶復合物得以從該新生股移除該經(jīng)并入之核苷酸類似物的該標記部分；以及 (f)重復步驟(c)-(e)以測定該目標核酸序列的序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該光可偵測標記為一突光團。
3.根據(jù)權利要求2所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該核苷酸類似物還包括至少ー熒光淬熄部分，且其中在該核苷酸類似物藉由該酶或酶復合物之5’至3’聚合活性并入該新生股之時該熒光淬熄部分從該核苷酸類似物被移除。
4.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少ー堿基配對部分，具有一 5’端與一 3’端,包括一或多個核苷酸殘基其各包括ー堿基,該堿基具有在該反應復合物之一反應位置中與該目標核酸序列之一對應堿基堿基配對的能力。
5.根據(jù)權利要求4所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該堿基配對部分之3’端為藉由一磷酸連接連結至該標記部分。
6.根據(jù)權利要求5所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該標記部分包括一光可偵測標記與一可選的連接物其連結該光可偵測標記至該磷酸連接。
7.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法,其中該標記部分還包括 (a)—或多個非互補核苷酸殘基；以及 (b)一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基。
8.根據(jù)權利要求7所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法,其中該ー或多個非互補核苷酸殘基為獨立地擇自ー無堿基核苷酸殘基與包括一堿基之一核苷酸殘基，而該堿基實質上缺乏與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一個堿基配對的能力。
9.根據(jù)權利要求3所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該熒光淬熄部分為附著至一核苷酸類似物的5’端。
10.根據(jù)權利要求9所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該熒光淬熄部分為藉由一連接物附著至一核苷酸類似物的5’端。
11.根據(jù)權利要求9所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該核苷酸類似物為ー核苷酸三磷酸鹽類似物，其具有一 a磷酸鹽、一 3磷酸鹽與一 Y磷酸鹽，且其中該熒光淬熄部分為附著至在該核苷酸類似物之5’端之三磷酸鹽基團的該3或Y磷酸鹽。
12.根據(jù)權利要求4所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一堿基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團于其5’端，其中最接近該堿基配對部分(a磷酸鹽)的磷酸鹽基團為ー硫代磷酸鹽。
13.根據(jù)權利要求4所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一堿基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團于其5’端，其中最接近該堿基配對部分(a磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一甲基磷酸鹽。
14.根據(jù)權利要求4所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一堿基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團于其5’端，其中最接近該堿基配對部分(a磷酸鹽)的磷酸鹽基團為ー硼烷磷酸鹽。
15.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，介于在該反應復合物之活性位置之該核苷酸類似物的結合與從該新生股之標記部分的移除之間的時間長度為從50至250毫秒。
16.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執(zhí)行于，藉由介于兩個連續(xù)之偵測步驟(d)之間的時間長度為從約0.2秒至I秒的條件下。
17.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執(zhí)行于，藉由介于兩個連續(xù)之偵測步驟(d)之間的時間長度為從0.2秒至0.6秒的條件下。
18.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執(zhí)行于，藉由介于兩個連續(xù)之偵測步驟(d)之間的時間長度為自0.3秒至0.5秒的條件下。
19.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中在步驟(f)中重復步驟(c)-(e)以測定該目標核酸的序列包括持續(xù)監(jiān)測與記錄在要被依序并入該引物股之核苷酸類似物之該標記部分中的各光可偵測標記的依序并入。
20.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法,其中各核苷酸類似物包括 (a)于該核苷酸類似物的5’端,ー堿基配對部分包括一或多個核苷酸殘基,其各包括ー堿基，該堿基為具有在該反應復合物之一活性位置中與目標核酸序列之一對應堿基堿基配對的能力，以及 (b)于該核苷酸類似物的3’端，ー標記部分視需要而定包括一或多個非互補核苷酸殘基，其之各個實質上缺乏與該目標核酸序列之一對應的堿基堿基配對的能力。
21.ー種化合物，其具有式(I)O /0 \ O (* ^i I * 1 O 4XR2 /n Y1 A式⑴n > r 或一其藥學上可接受之鹽類或水合物，其中n 為 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 ；R1與各個R2為擇自0_與！~L「Q，其中 (I)R1與各個民為0_;或 (Ii)R1為I~~L廠Q且各個R2為0_ ;或 (iii)R1為0_，ー個R2為ILfQ且任何剩余之R2獨立地為0_、S_、BH3_或CH3 ； R3為ー核苷酸部分，其包括ー熒光染料F ； R4為H、0H、鹵素(包括氟、氯、溴與碘)、烷基(包括CH3、CH2CH3)或烷氧基(經(jīng)取代與未經(jīng)取代兩者)(包括OCH3與OCH2CH3)； Y1與Y3為各自獨立地擇自O、S—、BH3-與CH3 ； L1為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、酷、胺基與磺?；?； Q為ー熒光淬熄部分；以及 B1為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶。
22.根據(jù)權利要求21所述的化合物，其中R3為擇自
23.根據(jù)權利要求21所述的化合物，其中R3為擇自
24.根據(jù)權利要求22所述的化合物，其中n為I，R1為I~い一。且R2為0_。
25.根據(jù)權利要求22所述的化合物，其中Y1為
26.根據(jù)權利要求22所述的化合物，其中R3為I廣ろ
27.根據(jù)權利要求22所述的化合物，其中R3為
28.根據(jù)權利要求22所述的化合物，其中Y3為(F。
29.一種測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步驟 (a)提供一反應復合物，包括，ー模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引物核酸，其包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的ー序列，與一聚合酶酶或ー酶復合物，其包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應復合物與根據(jù)權利要求21所述的化合物接觸； (c)藉由該酶或酶復合物之5’至3’聚合活性，使得使該酶或酶復合物得以將根據(jù)權利要求21所述的化合物并入一新生股，藉此將基團F結合至該新生股； (d)偵測該基團F，其為指出堿基B1與視需要而定存在之堿基B2的身份與順序； (e)藉由該酶或酶復合物之3’至5’外核酸酶活性，使該酶或酶復合物得以移除位于經(jīng)并入之核苷酸殘基之3’位置的該F基團，該經(jīng)并入之核苷酸殘基具有堿基B1與視需要而定存在之堿基B2 ；以及 (f)重復步驟(c)-(e)以測定該目標核酸序列的序列。
30.根據(jù)權利要求I所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法,其中該復數(shù)個核苷酸類似物包括至少四種類型的核苷酸類似物，各種類型包括一獨特之堿基配對部分與一獨特之熒光團，該熒光團為可與其它類型之該復數(shù)個之核苷酸類似物的熒光團區(qū)別。
31.根據(jù)權利要求30所述的測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該復數(shù)個核苷酸類似物還包括一核苷酸類似物，其具有ー熒光淬熄部分，該熒光淬熄部分在該核苷酸類似物并入該新生股之時從該核苷酸類似物被移除。
32.一種測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酶或酶復合物所并入之一核苷酸堿基的方法，該方法包括步驟 (a)執(zhí)行ー核酸聚合反應，其利用一聚合酶酶或酶復合物之5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者，且以ー模板依賴方式導致一新生股的產(chǎn)生，其中執(zhí)行該反應于下列存在時 (i)ー模板核酸，包括一目標核酸序列， (ii)一引物核酸，包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的ー序列； (iii)一聚合酶酶或ー酶復合物，包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性； (iv)復數(shù)個核苷酸類似物，其中該復數(shù)個之ー個別的核苷酸類似物包括至少ー堿基配對部分與至少ー標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記；以及 (b)偵測該光可偵測標記，其中該標記為指出該堿基或存在于藉由該酶或酶復合物并入該新生股之該核苷酸類似物中之堿基的身份。
33.根據(jù)權利要求32所述的測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酶或酶復合物所并入之一核苷酸堿基的方法，其中于各個依序的核苷酸并入事件中執(zhí)行該偵測步驟，該核苷酸并入事件系在籍由該酶或酶復合物之3’至5’外核酸酶活性來移除于先前并入事件中所并入之該核苷酸類似物的光可偵測標記之后。
34.一種測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，該方法包括步驟 (a)執(zhí)行ー核酸聚合反應于下列存在時 (i)ー模板核酸，包括一目標核酸序列， (ii)一引物核酸，包括與該模板核酸之一區(qū)域互補的ー序列； (iii)一聚合酶酶或ー酶復合物，包括用于以ー模板依賴方式并入ー核苷酸類似物的一反應位置； (iv)復數(shù)個核苷酸類似物，其中該復數(shù)個之ー個別的核苷酸類似物包括至少ー堿基配對部分與至少ー標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，且其中一旦該類似物藉由該聚合酶酶或酶復合物以ー模板依賴方式被并入該新生股，該類似物不終止一新生股之產(chǎn)生，且其中相較于包括藉由該聚合酶酶或酶復合物之5’至3’聚合活性被移除的一標記的一核苷酸類似物，該核苷酸類似物提供至少ー個經(jīng)延長之偵測期間與經(jīng)延長之中介脈沖持續(xù)期間；以及 (b)偵測在各個依序并入事件中所并入之該標記部分。
35.根據(jù)權利要求34所述的測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中相對于包括藉由該聚合酶酶或酶復合物的5’至3’聚合活性來移除之一標記的ー類似物的偵測期間，該偵測期間以至少10倍被延長。
36.根據(jù)權利要求34所述的測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中兩個連續(xù)之偵測步驟被以約0. 2至約I秒分隔。
37.根據(jù)權利要求34所述的測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中該核苷酸類似物還包括至少ー熒光淬熄部分，且其中該熒光淬熄部分在該核苷酸類似物藉由該酶或酶復合物之5’至3’聚合活性并入該新生股之時從該核苷酸類似物被移除。
38.根據(jù)權利要求34所述的測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中藉由該酶或酶復合物經(jīng)由其5’至3’聚合活性來移除該標記部分。
39.根據(jù)權利要求1、32或34項之任一項所述的方法，其中該目標核酸序列包括序列重復。
40.根據(jù)權利要求1、32或34項之任一項所述的方法，其中該目標核酸序列包括一或多個序列重復，其擇自(A)n、(T)n、(C)n或(G)n，其中n為3或更大之整數(shù)。
全文摘要
實施例系關于將核酸進行測序的方法。實施例包括核苷酸類似物與包括校對活性之一核酸聚合酶酶或酶復合物的用途。核苷酸類似物可變成被并入一復制之股并且誘發(fā)聚合酶的校對活性，因此延長了與核苷酸并入相關之訊號的持續(xù)期間，產(chǎn)生更顯著的測序結果并增加核酸測序的正確性。
文檔編號C12Q1/68GK102782159SQ201180012142
公開日2012年11月14日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權日2010年6月2日
發(fā)明者傅祖儒, 張上嘉, 潘詔智, 范振業(yè), 邱創(chuàng)汎 申請人:財團法人工業(yè)技術研究院