專利名稱：增強的多重fish的制作方法
增強的多重FISH 說明本發(fā)明涉及熒光原位雜交的發(fā)夾環(huán)的多重應(yīng)用和實驗的重復(fù)性、特異性和速度的增強。本發(fā)明的第一個方面是能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合，其中所述組合包含(a)包含能形成發(fā)夾環(huán)(如分子信標)的序列的至少一種核酸，和(b)第二核酸分子、第三核酸分子和可選地至少一個稱為輔助核酸的其他核酸分子。臨床樣品中致病生物體的快速鑒定越來越重要，用以降低發(fā)病率和致死率以及治療感染疾病的成本。在應(yīng)用DNA-信標技術(shù)進行原位雜交應(yīng)用方面的突破(I)使FISH技術(shù)能與PCR系統(tǒng)和微陣列技術(shù)在速度方面競爭并在成本效率上超越。本發(fā)明的目標是找到解決FISH已經(jīng)經(jīng)歷的重復(fù)性問題并且進一步增加實驗時間的速度。為了增加實驗的速度，需要分析實驗動力學(2)。在PCR實驗中，所有參與雜交的成分在均一溶液中并且采用二級動力學。微陣列采用準一級反應(yīng)速率，因為捕獲的寡核苷酸固定在固相而分析物在溶液中(3)。FISH中，互換不同作用(B卩，分析物固定在固相，而寡核苷酸在溶液中)，然而，從動力學方面看，所述構(gòu)型相似。當探針附著在固相時，測量的速率常比溶液中所測低多至三個數(shù)量級(3)。因此，不能期望原位雜交動力學產(chǎn)生與均一溶液相同的數(shù)量級。本領(lǐng)域現(xiàn)有的雜交實驗的動力學屬性能概括如下
權(quán)利要求
1.ー種能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合，其中所述組合包含 (a)至少ー個第一核酸分子，包含 (i)能與靶標序列雜交的序列， ( )能形成莖干的兩段互補序列，和 (iii)發(fā)光基團和淬滅基團，如果核酸形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，淬滅基團使熒光基團淬滅；如果寡核苷酸與靶標序列雜交，熒光基團能在激發(fā)后發(fā)射發(fā)光信號， (b)第二核酸分子，第三核酸分子和可選的至少ー個其他核酸分子， 其中，所述第二核酸分子、第三核酸分子和可選的至少ー個其他核酸分子與靶標序列在位于第一核酸雜交序列5’或/和3’的序列雜交。
2.如權(quán)利要求I所述的組合，其特征在于，所述核酸適用于原位雜交，特別是FISH。
3.如權(quán)利要求I或2所述的組合，其特征在于，所述靶標核酸序列選自DNA序列和RNA序列，并且其中所述靶標核酸序列優(yōu)選rRNA序列或mRNA序列。
4.如權(quán)利要求1-3中任ー項所述的組合，其特征在于，所述各核酸分子與靶標序列的雜交位點彼此直接相鄰，或其中至少兩個核酸分子與靶標序列的雜交位點相隔至少ー個核苷 酸。
5.如前述權(quán)利要求中任ー項所述的組合，其特征在干，至少ー個與所述靶標序列雜交的核酸分子序列長16-26核苷酸。
6.如前述權(quán)利要求任ー項所述的組合，其特征在干，所述組合的各核酸分子與靶標序列獨立雜交 (i)AG 范圍為-15-25kcal/mol，(ii)總AG 范圍為-60- -150kcal/mol、-80- _150kcal/mol 或-100- _120kcal/mol,或/和 (iii)比靶標序列自然重新折疊所產(chǎn)生AG更負的AG。
7.如前述權(quán)利要求中任ー項所述的組合，其特征在于，所述組合用于診斷應(yīng)用，特別是診斷細胞存在。
8.如前述權(quán)利要求中任ー項所述的組合，其特征在于，所述組合用于測定抗生素抗性、毒素生產(chǎn)或/和癌基因表達。
9.包含如前述權(quán)利要求中任一項所述組合的試劑盒或芯片。
10.一種鑒定樣品中細胞的方法，所述方法包含步驟 (a)提供樣品， (b)將(a)樣品與權(quán)利要求1-8中任一項所述的核酸分子組合在允許寡核苷酸與細胞中靶標序列雜交的條件下接觸，和 (C)測定第一核酸分子的發(fā)光基團的發(fā)光， 其中，第一寡核苷酸的熒光指示靶標序列的出現(xiàn)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述樣品選自生物樣品，特別是臨床樣品O
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)和(c)在原位完成，特定通過FISH。
13.如前述權(quán)利要求10-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中使用的雜交緩沖液不含二價陽離子。
14.如前述權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合或如權(quán)利要求9所述的試劑盒或芯片在鑒定細胞中的應(yīng)用。
15.如前述權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合或如權(quán)利要求9所述的試劑盒或芯片在診斷細胞存在的藥物組合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目標是能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合。為了克服FISH實驗的重復(fù)性問題和減少實驗時間，聯(lián)用發(fā)夾探針和毗鄰所述發(fā)夾探針靶位點退火的輔助探針。
文檔編號C12Q1/68GK102844445SQ201180012360
公開日2012年12月26日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者I·P·斯里普頓, W·斯坦·弗雷赫馮 申請人:米阿科姆診斷有限公司