專利名稱：使用稀脈萍的koda 的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有以下的式⑴所示的結構的植物激素(通用名9_羥基-10-氧代-順式-12 (Z)，15 (Z)-十八碳二烯酸，以下稱為K0DA)的制造方法。
/WWY1AZWcooh
O OH
背景技術：
KODA作為具有植物花芽形成促進作用、植物激活作用及包含這些作用的植物生長 調節(jié)作用的植物激素(日本特開平9-295908號公報、日本特開平11-29410號公報、日本特開2001-131006號公報、日本特開2009-17829號公報)已知。KODA已知存在于各種植物種中，且已知受到脅迫的稀脈萍(Lemna paucicostata)與其他植物相比釋放出極高的水平(數(shù)百倍)的K0DA。利用該性質，可使用由作為浮萍科植物的一種的稀脈萍提取得到的提取法來制造K0DA。作為其他的制造方法，可使用以下方法制造KODA :通過使9位生成物特異性脂加氧酶(LOX)、丙二烯氧化物合酶(AOS)這樣的酶，按照植物體內的脂肪酸代謝途徑作用于作為不飽和脂肪酸的α -亞麻酸(通用名順式-9，12，15-十八碳三烯酸)而獲得的酶法；以及通過運用通常公知的化學合成法來獲得的化學合成法。這些制造方法在日本特開平11-29410號公報中公開。KODA是具有植物生長調節(jié)作用的植物激素，因此期待在農業(yè)領域的使用。在農業(yè)領域使用時，與藥品等領域不同，如果不能夠以低成本進行大量生產，則不耐實用。在使用α -亞麻酸作為起始物質的酶法中，如以下記載的那樣，以α -亞麻酸作為底物，使9位生成物特異性脂加氧酶(LOX)作用，在9位導入氫過氧基(-00Η)，接著通過使丙二烯氧化物合酶(AOS)作用，從而制造K0DA。/\=/w/\=yvwAcooH
LOX
I
/WWVyWVaccj0h
OOH
AOS
Λ=Λ^\..7ΛΛΑ/λοοοη
of 非酶的轉換
~^VWa COOH O OH但是，9位生成物特異性脂加氧酶不能商業(yè)獲得，由植物提取則材料的獲得和/或處理非常費工夫，另外目前為止已知的9位生成物特異性脂加氧酶活性低。進而，目前為止得到的9位生成物特異性脂加氧酶的cDNA以大腸桿菌表達時，多為不溶性，難以大量獲得顯示活性的蛋白質。丙二烯氧化物合酶是具有將氫過氧化的脂肪酸轉換為丙二烯氧化物的活性的酶，丙二烯氧化物不穩(wěn)定，因而非酶地轉換為酮醇體。AOS是存在于植物、動物及酵母中，在植物中則存在于全部被子植物中的酶。但是，丙二烯氧化物合酶通常具有自殺底物的性質，提高底物的濃度時，反而導致生成量的減少。由于這些脂加氧酶、丙二烯氧化物合酶的缺點，酶法對于大量生產不合適。另一方面，通過化學合成法難以實現(xiàn)農業(yè)領域所需的低成本。另一方面，在現(xiàn)有的提取法中，通過培養(yǎng)已知以高效率生產花芽誘導物質的稀脈萍441株來進行提取法，但即使在使用該株的情況下，所生產的KODA的量也不能說充分。因此，期望提供低成本且大量地制造KODA的方法。

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供在收量的方面被改良了的KODA的制造方法。用于解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題而進行了深入研究，篩選了各種稀脈萍株，結果發(fā)現(xiàn)，與其他的稀脈萍株相比，稀脈萍SH株生產極高的水平的K0DA。發(fā)明的效果根據(jù)上述的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者們提供以下方法在基于提取法的KODA的制造方法中通過將稀脈萍SH株作為起始物質，從而以高收量制造KODA的方法。進而本發(fā)明者們著眼于作為KODA高生產株的稀脈萍SH株的代謝途徑，在稀脈萍中以9位生成物特異性脂加氧酶的基因序列(序列號I)、以及丙二烯氧化物合酶的基因序列(序列號2)為首進行了鑒定。該序列號I及序列號2的堿基序列都是來自于稀脈萍SH株的序列。因此本發(fā)明者們提供以下方法在基于提取法的KODA的制造方法中，通過使用含有由包含序列號I和/或序列號2所示的序列的DNA、或與該DNA實際上相同的DNA組成的基因的稀脈萍株，從而以高的收量制造KODA的方法。本發(fā)明進一步提供通過使用了以上記載的KODA高生產稀脈萍株的制造方法生產的 KODA。


圖I是顯示62種稀脈萍株的KODA生產量的圖。
圖2A是顯示稀脈萍SH株的LOX基因的基因序列的圖。圖2B是顯不圖2A的基因序列的繼續(xù)的圖。圖2C是顯示圖2B的基因序列的繼續(xù)的圖。圖3A是顯示稀脈萍SH株的AOS基因的基因序列的圖。圖3B是顯示圖3A的基因序列的繼續(xù)的圖。圖3C是顯示圖3B的基因序列的繼續(xù)的圖。圖4是顯示大腸桿菌中表達的稻L0X(r9_L0X)與稀脈萍SH株的LOX的活性的比較圖。圖5是顯示大腸桿菌中表達的擬南芥AOS與稀脈萍SH株的AOS的活性的比較圖。
具體實施例方式本發(fā)明的生產KODA的方法包括以下工序對KODA高生產性的特定的稀脈萍株施加脅迫，從該受到脅迫的稀脈萍株中溶劑提取K0DA，然后純化。在本發(fā)明的一種方式中，本發(fā)明中所使用的KODA高生產性的特定的稀脈萍株是表達以下蛋白質的株，所述蛋白質由與包含序列號I所不的喊基序列的DNA相同或實際上相同的DNAJP /或與包含序列號2所示的堿基序列的DNA相同或實際上相同的DNA編碼。進而，本發(fā)明中使用的KODA高生產性的特定的稀脈萍株是表達與包含序列號3所示的氨基酸序列的蛋白質相同或實際上相同的蛋白質、和/或與包含序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質相同或實際上相同的蛋白質的株。序列號3是來自于稀脈萍SH株的9位生成物特異性脂加氧酶的氨基酸序列，序列號4是來自于稀脈萍SH株的丙二烯氧化物合酶的氨基酸序列。KODA在植物中由亞麻酸受到LOX及AOS的作用而生成，因此，認為表達與KODA高生產性的稀脈萍SH株所具有的LOX和/或AOS相同或實際上相同的LOX和/或AOS的株，KODA的生產性與稀脈萍SH株同樣地高。在這里，“實際上相同的DNA”，是指對于參考基準的DNA，具有至少70%的同一性，而且在被轉錄·翻譯的情況下，編碼具有與參考基準的DNA被轉錄·翻譯而生成的蛋白質的酶活性(包含序列號I的堿基序列的DNA的情況下為LOX活性，包含序列號2的堿基序列的DNA的情況下為AOS活性)相同的酶活性的蛋白質的DNA。同一性優(yōu)選為至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、至少99. 5%或至少 99. 9%0另外，“實際上相同的DNA”，是指可在高嚴格的條件下與包含參考基準的DNA的互補堿基序列的DNA雜交，且編碼具有與由參考基準的DNA編碼的蛋白質的酶活性(包含序列號I的堿基序列的DNA的情況下為LOX活性、包含序列號2的堿基序列的DNA的情況下為AOS活性)相同的酶活性的蛋白質的DNA。雜交可按照公知的方法或根據(jù)該公知的方法的方法，例如 J. Sambrook等，Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989記載的方法來進行，另外作為高嚴格的雜交條件，是指包含例如NaCl濃度為約10 40mM、優(yōu)選為約20mM，溫度為約50 70°C、優(yōu)選為約60 65°C的條件。進而，本發(fā)明還涉及作為上述DNA序列的片段、并編碼具有由原DNA編碼的蛋白質的酶活性的蛋白質的DNA片段。所謂“實際上相同的蛋白質”，是指包含在參考基準的蛋白質的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列，并且具有參考基準的蛋白質的活性的蛋白質。進而，所謂“實際上相同的蛋白質”，是指包含與參考基準的氨基酸序列具有至少98%的同一性的序列，并且具有參考基準的蛋白質的活性的蛋白質。同一性優(yōu)選為至少99%、至 少99. 5%、或至少99. 9%。本發(fā)明的KODA的制造方法利用提取法。具體地說，將稀脈萍的破碎物進行離心分離(8000Xg，10分鐘左右)，在得到的上清和沉淀物中，將除去上清后的級分作為含有KODA的級分用于下面的工序。可將該級分作為起始物來分離 純化K0DA。為了促進利用稀脈萍的KODA的生產，優(yōu)選在進行離心分離前對稀脈萍施與以下說明的特定的脅迫。另外，進而作為在制備效率上優(yōu)選的起始物，可舉出使稀脈萍漂浮或浸潰后的水溶液。該水溶液只要在稀脈萍可生長的范圍內則沒有特別限定。該水溶液的具體例在后述的實施例中記載。浸潰時間可以在室溫下為2 3小時左右，但沒有特別限定。另外，通過該方法制備KODA時，在制造效率上優(yōu)選預先對于稀脈萍施與可誘導KODA的特定的脅迫。具體地說，作為特定的脅迫可舉出干燥脅迫、熱脅迫、滲透壓脅迫等。干燥脅迫可以如下施與例如在低濕度(優(yōu)選相對濕度為50%以下)、室溫下，優(yōu)選24 25°C左右，將稀脈萍以在干燥的濾紙上展開的狀態(tài)放置。該情況下的干燥時間大概20秒以上，優(yōu)選為5分鐘以上，更優(yōu)選為15分鐘以上。熱脅迫可以通過例如在溫水中浸潰稀脈萍來施與。該情況下的溫水的溫度為40V 65°C，優(yōu)選為45 V 60°C，更優(yōu)選為50°C 55°C。另外，溫水中處理的時間大概5分鐘左右就足夠，在比較低溫的情況下，例如在40°C左右的溫水中處理稀脈萍的情況下，優(yōu)選處理2小時以上。另外，上述熱脅迫處理后，優(yōu)選迅速將稀脈萍放回冷水中。滲透壓脅迫可以通過例如使稀脈萍接觸高濃度的糖溶液等高滲透壓溶液來施與。該情況下的糖濃度，例如在甘露醇溶液的情況下，為O. 3M以上，優(yōu)選為O. 5M以上。處理時間例如在使用O. 5M甘露醇溶液的情況下，為I分鐘以上，優(yōu)選為3分鐘以上。這樣可以制備所需的本發(fā)明的含KODA的起始物。接著，可以對如上述制備的起始物進行如以下那樣的分離 純化方法，從而制造所需的K0DA。另外，這里所示的分離方法為例示，用于由上述起始物制造KODA的分離方法并不限于這些分離方法。首先，對于上述起始物進行溶劑提取，優(yōu)選提取含有本發(fā)明KODA的成分。對該溶劑提取中使用的溶劑沒有特別限定，可使用例如氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丁醇等。這些溶劑中，在能夠比較容易地除去雜質這樣的方面，優(yōu)選氯仿。將該溶劑提取所得的油相部分，使用通常公知的方法進行洗滌、濃縮，通過使用ODS (十八烷基硅烷)柱等反相分配柱色譜用柱的高速液相色譜(HPLC)，鑒定、分離花芽誘導活性級分，由此分離本發(fā)明K0DA。另外，還可根據(jù)起始物的性質等組合使用通常公知的其他分離方法，例如超濾、凝膠過濾色譜等。實施例實施例I :K0DA高牛產稀脈萍株的篩詵準備從各種場所采集的62種稀脈萍，在稀釋為1/2倍的Hunter培養(yǎng)基中，在來自于24 25°C的日光色熒光燈的連續(xù)光照射下進行傳代培養(yǎng)。稀釋為1/2倍的Hunter培養(yǎng)基包含以下的成分
權利要求
1.一種以下式所示的化合物的生產方法，,K^xWYYVVVncoohO OH 所述方法包括以下工序對稀脈萍株施加脅迫，由施加了該脅迫的稀脈萍株溶劑提取上述化合物，然后純化， 其中，所述稀脈萍株的特征在于，表達由選自下述(a) (e)中的DNA編碼的蛋白質和/或由選自下述(i ) (V )中的DNA編碼的蛋白質， (a)包含序列號I所不的喊基序列的DNA； (b)與含有包含序列號I所示的堿基序列的DNA的互補堿基序列的DNA在高嚴格的條件下雜交，且編碼9位生成物特異性脂加氧酶活性體的DNA ； (c)編碼包含序列號3所示的氨基酸序列的蛋白質的DNA； (d)編碼包含與序列號3所示的氨基酸序列具有至少99%的同一性的序列，且具有9位生成物特異性脂加氧酶活性的蛋白質的DNA ； (e)編碼包含在序列號3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了I或數(shù)個的氨基酸的氨基酸序列，且具有9位生成物特異性脂加氧酶活性的蛋白質的DNA ； (i )包含序列號2所不的喊基序列的DNA ； (ii )與包含序列號2所示的堿基序列的DNA具有至少90%的同一性，且編碼丙二烯氧化物合酶活性體的DNA ； (iii )與含有包含序列號2所不的喊基序列的DNA的互補喊基序列的DNA在聞嚴格的條件下雜交，且編碼丙二烯氧化物合酶活性體的DNA ； (iv )編碼包含序列號4所不的氣基酸序列的蛋白質的DNA ； (V )編碼包含在序列號4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I或數(shù)個的氨基酸的氨基酸序列，且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白質的DNA。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述稀脈萍株表達由包含序列號I所示的堿基序列的DNA編碼的脂加氧酶和由包含序列號2所示的堿基序列的DNA編碼的丙二烯氧化物合酶。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其中，所述脅迫選自干燥脅迫、熱脅迫和滲透壓脅迫。
4.根據(jù)權利要求I 3的任一項所述的方法，其中，所述溶劑選自氯仿、乙酸乙酯、乙醚和丁醇。
全文摘要
鑒別來自于稀脈萍SH株的新的脂加氧酶及新的丙二烯氧化物合酶的基因，使用表達該脂加氧酶及丙二烯氧化物合酶的稀脈萍株，以高的收量制造植物生長調整劑(KODA)。
文檔編號C12P7/40GK102834522SQ20118001336
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權日2010年3月11日
發(fā)明者橫山峰幸, 別府敏夫 申請人:株式會社資生堂