專利名稱：含增強免疫應答的Fc融合蛋白的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及調節(jié)免疫應答，且更具體地用Fe融合蛋白增強個體中細胞介導 的免疫應答。
背景技術：
成功應用癌癥疫苗治療病人還是較為困難，并且不斷需要改善刺激針對癌細胞表達抗原的細胞介導和其他免疫應答的組合物和方法的效力。本發(fā)明滿足了此類和其他相關的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了抑制個體中的細胞生長的組合物和方法。被本發(fā)明組合物和方法靶向的細胞表達抗原、抗原的模擬表位或CXCR4趨化因子受體。在一個實施方式中，所述方法包括將含編碼免疫球蛋白(Ig)Fc和由所述細胞表達的抗原或該抗原的模擬表位的多聚核苷酸的組合物給予所述個體。在另一個實施方式中，該方法包括將含編碼免疫球蛋白Fe和由所述細胞表達的CXCR4趨化因子受體的拮抗肽的多聚核苷酸的組合物給予所述個體。在各種實施方式中，本發(fā)明抑制癌細胞的生長，但不限于腫瘤細胞。編碼所述IgFc的多聚核苷酸在一個實施方式中是重組溶瘤性細胞痘苗病毒。所述多聚核苷酸編碼的融合蛋白可包括人IgGl Fe或人IgG3 Fe，且還可包括T輔助細胞表位。本發(fā)明也提供了包括編碼所述蛋白的多核苷酸和/或所述編碼蛋白的組合物。所述蛋白包括免疫球蛋白Fe和抗原或所述抗原的肽模擬物，或者免疫球蛋白Fe和由癌細胞表達的受體的拮抗肽。附圖簡述圖I.在荷瘤小鼠中疫苗接種47-0^-或47-0^4(3￥2&致敏的樹突狀細胞(0〇8)和過繼性細胞轉移(ACT)的示意圖。A，疫苗接種47-LDA-或47-LDA-FcY2a致敏的DC。在IL-15和IL-21載體存在下，每兩周用47-LDA-或47_LDA_Fc y 2a致敏的DC免疫A/J小鼠(n=5)。第三次免疫后三周，通過陰性選擇獲取CD8+脾細胞，并將其用于NXS2荷瘤小鼠的ACT。B，ACT和DC疫苗對原發(fā)性腫瘤生長的抑制。用2X106NXS2細胞攻擊A/J小鼠。15天后，ACT和DC疫苗接種前一天通過5Gy TBI或9Gy TBI加上BM轉移(IO7細胞)誘導荷瘤小鼠中的淋巴細胞減少。第16天，與DC疫苗一起，遞送接觸過抗原的⑶8+T細胞(2 X IO7)的過繼性轉移。通過每周1-3次用測微計測量皮下腫瘤和測定腫瘤體積(寬X長X寬/2=mm3)來監(jiān)測腫瘤生長。C，ACT和DC疫苗對轉移性疾病的抑制。NXS2荷瘤小鼠在腫瘤切除時經歷了非清髓性(nonmyeloablative)或清髓性TBI。一天后，該小鼠接受了 DC疫苗和自免疫小鼠的CD8+T細胞(2X IO7)或自未免疫未經免疫小鼠的未分離的脾細胞的ACT。存活時間定義為小鼠因擴展性腫瘤生長或轉移發(fā)生而處死的時間點。圖2. 47-LDA-FC Y 2a融合蛋白及其與DC相互作用的表征。A，47_LDA_Fc y 2a融合蛋白和47-LDA多肽與生物素化的14G2單抗和鏈霉親和素-HRP的蛋白印跡。B，47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白和47-LDA多肽與未成熟⑶IIc+DC的結合。源于骨髓(BM)的DC用FITC-偶聯(lián)的⑶I Ic特異性mAb聯(lián)合生物素化的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或47-LDA多肽染色，然后用鏈霉親和素-PE染色并通過流式細胞術分析。用抗CD86-PE mAb染色的DC作為特異性對照涵蓋于其中。給定⑶Ilc陽性DC上的47-LDA-Fc y 2a,47-LDA和⑶86分子的百分數(shù)和平均熒光強度(MFI)。箭頭表示直方圖中細胞的來源。數(shù)據(jù)源于所進行三次實驗中的一次代表性實驗。C，LPS刺激后，由47-LDA-Fc y 2a+、47_LDA+、⑶86+DC和其陰性對應物細胞內表達的IL-12p70。未成熟DC用生物素化的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白、47-LDA多肽或CD86特異性單抗染色，然后用鏈霉親和素-PE染色。在BD FACSAria 流式細胞儀上 分選陽性和陰性細胞群，用I μ g/ml LPS孵育過夜，并通過用對IL_12p35亞單位特異的大鼠抗小鼠IL_12p70單抗，然后用羊抗大鼠二抗的細胞內染色分析IL-12p70表達。用同型對照抗體估計本底染色(MFK2. 6)。所有流式細胞術評價都在FACScan或FACSCalibur流式細胞儀上進行。在前向角和側向角散射參數(shù)上設門后，用CellQuest軟件常規(guī)獲取并分析至少10，000個門內事件。數(shù)據(jù)源于所進行三次實驗中的一次代表性實驗。圖3. LPS刺激后，CCL22在47-LDA.和47-LDA-Fc y 2a+DC中的分化表達和由47-LDA-和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗對CD4+脾細胞中的IFN- Y和TNF-的誘導。未成熟DC用生物素化的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白、47-LDA多肽或⑶86特異性單抗染色，然后用鏈霉親和素-PE染色。在BD FACSAria 流式細胞儀上分選BD47-LDA+ (A)和47-LDA-Fc Y 2a+(B) DC，用I μ g/ml LPS孵育24小時，并通過用大鼠抗小鼠CCL22單抗，然后羊抗大鼠二抗的細胞內染色分析CCL2表達。CCL22表達陽性的細胞的MFI和百分數(shù)如圖所示。淺灰色區(qū)域指用同型對照抗體估計的本底染色。數(shù)據(jù)源于所進行三次實驗中的一次代表性實驗。C，47-LDA-DC和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗(分別為黑色和陰影柱)免疫小鼠的脾細胞中的IFN-Y和TNF-α的表達(分別為黑色和陰影柱)。在IL-15和IL-21載體存在下，用LPS誘導成熟后的，包被47-LDA多肽或47-LDA-Fc y 2a融合蛋白的DC免疫A/J小鼠(n=5)三次。從用LPS處理過的DC免疫的小鼠中分離的細胞作為對照(空心柱)。最后一次免疫后三周，通過用表達47-LDA模擬表達的DC過夜刺激后的細胞內染色分析IFN- Y和TNF- α在⑶4+脾細胞中的表達。D，NXS2神經母細胞瘤特異性的CTL應答。通過陰性選擇獲取源自47-LDA-DC (·)和47-LDA-Fc Y 2a-DC (■)疫苗免疫小鼠的CD8+脾細胞。如材料和方法部分所述，用表達47-LDA的DC (黑色圖標)或空質粒轉染的DC (空心圖標)以20:1的比例培養(yǎng)細胞。在標準51Cr釋放試驗中分析對NXS2細胞的CTL活性。所有測定為三重樣品所測，SD且SD〈10%。結果表述為四次獨立實驗的均值土SDSD。圖4. 47-LDA-DC和47_LDA_Fc y 2a_DC疫苗免疫小鼠中的調節(jié)性T (Treg)細胞誘導和功能的分析。最后一次47-LDA-DC (A)或47-LDA-Fc Y 2a-DC (C)免疫后三周，摘除腋窩淋巴結，并通過抗CD4-PE、抗CD25-FITC和抗FoxP3-AlexaFluor 647單抗，或相關同型對照染色分析其Treg細胞表達。直方圖說明門內群(⑶4+⑶25+細胞)中表達FoxP3。為分析Treg細胞對Teff細胞增殖的影響，來自47-LDA-DC (B)或47-LDA-Fc Y 2a_DC (D)疫苗免疫小鼠的⑶8+細胞裝載CFSE，并在有或無Treg細胞(比例1:1)的條件下，用表達47-LDA的同系DC (比例20:1)培養(yǎng)72小時。細胞用PE偶聯(lián)的抗CD8mAb染色，并用流式細胞術分析。標示經歷一輪以上細胞分化的細胞百分比。數(shù)據(jù)源于所進行三次實驗中的一次代表性實驗。圖5. 47-LDA-和47_LDA_Fc y 2a_DC疫苗和ACT對NXS2原發(fā)性和轉移性腫瘤生長的抑制。上圖，ACT和47-LDA-DC疫苗(A)和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗(B)針對原發(fā)性腫瘤生長的保護。A/J小鼠(n=8-10)皮下注射2X106NXS2細胞，并在15天后，用靜脈過繼性轉移分離自47-LDA或47-LDA-Fc y 2a疫苗免疫的同系小鼠的富集CD8+的脾細胞治療。如材料和方法部分所述，通過TBI (5Gy ;·)或(9Gy ;■)加上⑶8+T細胞轉移前一天的BM (IO7細胞)移植誘導荷瘤小鼠的淋巴細胞減少。在IL-15和IL-21載體存在下，小鼠每兩周免疫
所述DC疫苗。5Gy (〇)或9Gy (□)輻射加上BM移植的NXS2荷瘤小鼠作為對照。下圖，過繼轉移的⑶8+脾細胞和47-LDA-DC (C)和47-LDA-Fc y 2a_DC (D)疫苗對轉移性疾病的控制。對于擴散性疾病的免疫治療，在腫瘤切除時，經歷非清髓性(5Gy ;·)或清髓性(9Gy ；■ )TBI的NXS2荷瘤A/J小鼠接受來自免疫小鼠的⑶8+脾細胞(2X IO7細胞)的ACT以及47-LDA-或47-LDA-Fc Y 2a-DC疫苗。5Gy (〇)或9Gy (□)輻射加上BM移植的NXS2攻瘤小鼠作為對照。E，NXS2攻瘤小鼠接受來自未免疫A/J小鼠的ACT以及DC疫苗。在IL-15和IL-21載體存在下，小鼠每兩周免疫所述DC疫苗。對照小鼠具有用有(〇)或無(D)TBI和BM移植所切除的原發(fā)性腫瘤。存活時間定義為小鼠因擴展性腫瘤生長或轉移發(fā)生而處死的時間點。繪制Kaplan-Meier生存曲線,并用對數(shù)秩Mantel-Cox方法確定顯著性。圖6. ACT和DC疫苗接種后，荷瘤和無瘤小鼠的細胞應答分析。上圖，NXS2荷瘤小鼠的脾細胞中缺乏增殖性應答(A)和CTL活性(B)。A，未免疫小鼠脾細胞的ACT和47-LDA多肽-DC疫苗免疫后，進展為漸進性生長腫瘤的小鼠中分離的脾細胞裝載CFSE，并用表達47-LDA的同系DC (比例20:1)培養(yǎng)72小時。細胞用PE偶聯(lián)的抗⑶4或抗⑶8單抗染色，并用流式細胞術分析。標示經歷一輪以上細胞分化的細胞百分比。數(shù)據(jù)源于所進行四次實驗中的一次代表性實驗。B，用標準51Cr釋放試驗分析荷瘤小鼠的刺激或對照CD8+脾細胞針對NXS2細胞的CTL活性。所有測定為三重樣品測得，且結果表述為三次獨立實驗的均值土SD。下圖，接受來自未免疫小鼠的ACT和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗后，無瘤小鼠中的增殖性應答(C)和對NXS2的CTL活性(D)分析。如上圖中所述進行實驗。圖7.帶有rOVV-EGFP或r0VV-47-LDA_Fc y 2a融合蛋白的基于溶瘤性病毒療法的治療性癌癥疫苗。A,r0VV-47-LDA-Fc y 2a載體對腫瘤生長的抑制。A/J小鼠(n=10)皮下注射 2 X 106NXS2 細胞，并在 15 天后靜脈注射 108PFUr0VV-47-LDA-Fc y 2a (▲)或 rOVV-EGFP(■)載體治療。PBS治療的荷瘤小鼠作為對照(〇)。存活時間定義為小鼠因擴展性腫瘤生長或轉移發(fā)生而處死的時間點。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并用對數(shù)秩Mantel-Cox方法確定顯著性。B，腫瘤特異性免疫記憶保護小鼠免受NXS2再次攻擊。rOVV-47-LDA-Fc y 2a(▲)或rOVV-EGFP (■)載體治療的無瘤小鼠用NXS2再次攻擊。NXS2腫瘤攻擊的未治療小鼠作為對照(O)。每天檢查動物，直至腫瘤可觸，其后通過每周測量皮下腫瘤1-3次監(jiān)測腫瘤生長。
圖8提供了圖形化表示的數(shù)據(jù)，顯示出本發(fā)明有效抑制臨床相關的小鼠模型中的FADU和4T1腫瘤的生長。為獲取圖8中總結的數(shù)據(jù)，小鼠皮下(s. c)植入FA⑶或4T1腫瘤細胞。每天通過靜脈注射遞送轉染細胞上清的蛋白G柱上純化的CTCE-9908-Fc融合蛋白(200毫克/小鼠)。通過每周用測微計測量皮下腫瘤1-3次和測定腫瘤體積(寬X長/寬/2=mm3)監(jiān)測腫瘤生長。圖9. CXCR4-A-Fc融合蛋白及其與CXCR4的相互作用的表征。A，非還原(NRC)和還原(RC)條件下分離自病毒感染細胞上清的CXCR4-A-Fc的蛋白印跡。B，CTCE-9908肽對CXCR4-A-Fc與SUPT-I細胞上的CXCR4結合的抑制。用生物素化的CXCR4_A_Fc (300 μ g/ml)孵育細胞，并分析其與鏈霉親和素-PE的結合。對于抑制試驗，用CTCE-9908肽(100 μ g/ml)孵育所述細胞，然后用融合蛋白染色。用同型對照估計本底染色。C.融合蛋白對遷移的抑制。4T1細胞(5X IO4)種在僅有培養(yǎng)基或含CXCR4-A-Fc或CTCE-9908肽(100 μ g/ml)的培養(yǎng)基中的8μπι transwell (轉移室)系統(tǒng)的上室中。下室加入Iml含SDF-1 (1，OOOng/ml)的培養(yǎng)基。經transwell膜遷移10小時后，固定細胞，染色并在6個觀察視野中計數(shù)，以量化遷移。結果為每顯微鏡視野下的遷移細胞數(shù)量的均值土SD。實驗值減去對照培養(yǎng)物 中的遷移細胞數(shù)量。數(shù)據(jù)為三次實驗中的一次代表性實驗。D. CXCR4-A-FC對SDF-I誘導鈣動員的抑制。在37°C下避光，將10 μ M吲哚-IAM裝載細胞(I X IO6) 45分鐘。3至5分鐘的基底熒光檢測后，將CTCE-9908或CXCR4-A-Fc (300 μ g/ml)加至裝載吲哚-I的細胞中，然后加入SDF-I (50ng/ml)。記錄作為時間函數(shù)的熒光變化值，并通過測量410nm發(fā)射光(鈣結合吲哚-I)與490nm發(fā)射光的比值而確定。收集SDF-I和抑制劑給藥前后一段時間(0-5分鐘)內的410和490nm發(fā)射光以及410:490比值。數(shù)據(jù)為兩次實驗中的一次代表性實驗。***，P〈0. 0001。

圖10.單獨或聯(lián)合遞送0VV-CXCR4-A-Fc或ASA404對4T1原發(fā)性和轉移性腫瘤生長的抑制。A.接種BALB/c(n=8-12)和7X 1044T1細胞到胸乳腺脂肪墊中。帶有100_150mm3腫瘤體積(V)的4T1荷瘤小鼠靜脈注射OVV-EGFP或0VV-CXCR4A_Fc (IO8PFU)或最大耐受劑量的ASA404 (20mg/kg)。B.單獨或聯(lián)合遞送0VV-CXCR4-A_Fc或ASA404對4T1原發(fā)性和轉移性腫瘤生長的抑制。繪制Kaplan-Meier生存曲線且確定腫瘤攻擊組小鼠的中位生存時間。用對數(shù)秩Mantel-Cox方法估計生存時間的組間統(tǒng)計學差異。C.對于轉移性疾病療法,4T1荷瘤小鼠經歷單獨或聯(lián)合ASA404的溶瘤性病毒療法(V=約200mm3)，且腫瘤八天后切除。對照小鼠未經治療切除腫瘤。存活時間定義為小鼠因擴展性腫瘤生長或轉移發(fā)生而處死的時間點。D.單細胞懸液免疫熒光染色處理后4天，通過流式細胞術確定MDSC(Grl+、CDllb+、Ly6G+)在腫瘤微環(huán)境中的百分數(shù)。E.通過ELISA試驗測定由腫瘤制得的細胞裂解液中的SDF-I水平(*，P〈0. 05 ;*#，P〈0. 0001)。數(shù)據(jù)表示為三次獨立實驗的算術均值 +SD0發(fā)明詳述本發(fā)明利用了我們的發(fā)現(xiàn)，即含抗體Fe區(qū)和i)模擬存在于抗原中表位的模擬表位；或ii)癌細胞上表達的受體的肽拮抗劑的融合蛋白能用于增強對表達該抗原的細胞的免疫應答，且抑制通過該肽拮抗劑結合的受體的信號轉導。本發(fā)明涵蓋含此類融合蛋白的組合物、含編碼此類融合蛋白的多核苷酸的組合物和使用此類組合物預防和治療疾病的方法。所述方法包括將本發(fā)明組合物給予個體，以使表達所述抗原的細胞或表達所述肽拮抗劑結合的受體的細胞的生長受到抑制。本文所用的“模擬表位”是指模擬表位結構的肽序列。對所述模擬表位產生的免疫應答會指向其模擬的所述表位，還因此會識別含所述表位的抗原。在一個實施方式中，認為所述模擬表位自身能作為抗原起作用。我們證明了包括含活化性Fe融合蛋白和模擬表位或癌細胞上表達的受體的肽拮抗劑的融合蛋白的治療性疫苗產生了抗腫瘤應答，所述應答的特征部分在于刺激抗原特異性T細胞。在本發(fā)明的具體證明中，我們顯示出活性Fe融合蛋白環(huán)境中表達的含⑶2神經節(jié)苷脂的CD166交叉反應性模擬表位(本文稱為“47-LDA”)的治療性疫苗在荷瘤同系小鼠中產生了腫瘤特異性T細胞。所述模擬表位表達為與通用T輔助細胞表位和小鼠IgG2a Fe片段相連的融合蛋白(47-LDA-Fc Y 2a)，以遞送所述抗原性盒至樹突狀細胞(DC)上的活化性Fe Y受體。
47-LDA 模擬表位的序列是 GPGPGEDPSHSLGLDAALFM(SEQ ID NO: I)。SEQ ID NO:2提供包括通用T輔助細胞表位和47-LDA模擬表位的示范性氨基酸序列，其為KCKRQCGPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGCKRKIHIGPGQAFYTGPG PGEDPSHSLGLDAALFM。 SEQID NO: 2中1-6位氨基酸組成間隔。7-11位和25-29位氨基酸組成接頭。雖然認為任意T輔助細胞表位可與本發(fā)明結合，T輔助細胞表位的非限制實施方式包括稱為非天然泛(pan)DR 表位(PADRE)的通用 Th 肽[AKFVAAWTLKAAA SEQ ID NO: 3]和 HIV gpl20 糖蛋白的 V3 環(huán)[CKRKIHIGPGQAFYT SEQ ID NO:4]。這些代表性的T輔助細胞表位也各顯示于SEQ ID Ν0:Χ中。 我們也顯示出，用47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白免疫荷瘤小鼠誘導出比47-LDA多肽-樹突狀細胞(DC)疫苗更高水平的抗腫瘤免疫應答和保護。治療性47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗的抗腫瘤效力與通過使用表達47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的重組溶瘤細胞痘苗病毒(rOVV)的病毒療法相關癌癥疫苗所得到的效力相當。然而，后者治療不需要全身照射(TBI)或過繼性細胞轉移(ACT)，且在已建立的耐受環(huán)境中導致抗腫瘤免疫應答的誘導。在本發(fā)明另一個實施方式中，我們運用了作為CXCR4趨化因子受體拮抗劑的抗癌試劑(CTCE-9908)。該CXCR4的肽拮抗劑包括氨基酸序列KGVSLSYR-K-RYSLSVGK (SEQ IDN0:5)。因而，在一個實施方式中，CXCR4的肽拮抗劑包括序列KGVSLSYR (SEQ ID N0:6)。CTCE-9908阻斷CXCR4受體與CXCL12的在轉移性細胞浸潤器官組織中至關重要的相互作用，從而減少了腫瘤轉移。多種腫瘤細胞類型表達CXCR4受體。CTCE-9908肽已由加拿大溫哥華的趨化因子治療公司(Chemokine Therapeutics)開發(fā),并已用于晚期癌癥病人中的I/II期臨床試驗。通過進行本發(fā)明的方法，我們利用了 Fe片段天然存在的二硫鍵以保持CTCE-9908肽的二聚體結構。我們在DNA載體中，在活化性小鼠和人Fe Y片段(分別為IgG2a和IgGl)的環(huán)境中，表達了 CTCE-9908肽，并證實了該構建體在具有小鼠版CTCE融合蛋白的小鼠同系(T41乳癌)和異種移植(FADU人頭頸癌)模型中的抗腫瘤效果。我們相信其通過調動抗體依賴性細胞毒性(ADCC)腫瘤殺傷機制放大了該治療效果。因而，本發(fā)明提供了各種增強對抗原的免疫應答的組合物和方法，其中所述抗原為與優(yōu)選結合活化的Fe Y受體的免疫球蛋白(Ig) Fe區(qū)組合的融合構建體。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括融合構建體的組合物，其中所述融合構建體包括小鼠IgG2a或人IgGl的Fe區(qū)或此類Fe區(qū)的片段。在各種實施方式中，盡管也可使用來自其他抗體類型的Fe區(qū)，或合成/人造的Fe區(qū)，F(xiàn)e區(qū)是來自IgA、IgG或IgE抗體的Fe區(qū)或其片段。所述Fe區(qū)可包括或由與哺乳動物，如人產生的Fe區(qū)相同的氨基酸序列組成。在各種實施方式中，所述Fe區(qū)可具有與由小鼠和/或人產生的Fe區(qū)80%至100%之間(涵蓋其間的所有整數(shù))的氨基酸序列相似性。所述Fe區(qū)可以是完整Fe區(qū)，意指整個Fe區(qū)，或者可以是所述Fe區(qū)的片段。Fe區(qū)的片段優(yōu)選包括特異性結合Fe Y受體的氨基酸序列。本領域普通技術人員知道，抗體的所述“Fe區(qū)”是指所述抗體的“可結晶的片段”區(qū)，其包括取決于抗體的種類而構成兩或三種恒定結構域(CD)的兩條重鏈。本領域熟知編碼Fe區(qū)的核苷酸序列，以及小鼠和人免疫球蛋白的Fe區(qū)氨基酸序列。在一個實施方式中，用作本發(fā)明中的Ig區(qū)的合適的智人Ig Y-IC區(qū)具有序列 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDffLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEffESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRff QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:7)。
在另一個實施方式中，合適的人IgY-3鏈C區(qū)具有ASTKGPSVFP LAPCSRSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPSNTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSCDTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKffYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDffLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRffQQG NIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:8)。因為個別抗體同種型擁有對Fe Y受體(帶有對小鼠IgG2a和IgG2b同種型或人IgGl和IgG3同種型較高親和力的活化性Fe Y受體)的不同親和力，所以由所呈遞的抗原復合物結合的活化性-抑制性受體之比的差異可預測DC誘導免疫應答的能力?？刂拼送房赡技ㄟ^抗體療法或癌癥疫苗的獲得性免疫力和免疫記憶。在一個實施方式中，所述融合蛋白的Fe部分僅包括抗體重鏈。本領域技術人員知道為使用小鼠動物模型證實本發(fā)明，所述融合蛋白的Fe部分優(yōu)選為IgG2a或IgG2b Fe小鼠Ig部分，而為了人疾病的治療和/或預防，所述Fe部分優(yōu)選為IgGl或IgG3Fc部分。在某些實施方式中，本文提供的所述融合蛋白的Fe部分不涵蓋抗原識別部分(即所述融合蛋白的抗體部分不含抗體可變區(qū))。因而，所述融合蛋白不同于含抗原結合部分的抗體，且這還可能涵蓋交叉鏈接的或其他方式連接的模擬表位、抗原或肽受體配體。編碼所述Fe融合蛋白的DNA構建體能用本領域技術人員熟知的任意常規(guī)技術制得。例如，所述Fe融合編碼構建體能用商購試劑制得。比如，英杰公司(INVIV0GEN)提供的pFUSE-Fc系列質粒，其開發(fā)以便于通過將編碼給定蛋白序列融合至免疫球蛋白(Ig) Fe區(qū)來構建Fe融合蛋白。在此構建體中，所述Fe區(qū)包括IgG重鏈和鉸鏈區(qū)的CH2和CH3結構域。所述鉸鏈作為所述Fe融合蛋白兩部分之間的靈活間隔起作用，這允許所述融合蛋白的每一部分獨立地行使功能。一般地，活化Fe Y受體的任意Fe區(qū)(和相應地，編碼此Fe區(qū)的任意多核苷酸)能用于進行本發(fā)明。
編碼該融合蛋白的DNA構建體能通過使用任意適當?shù)牡鞍妆磉_系統(tǒng)表達產生用于分離和/或純化，或用于治療性目的的融合蛋白。各類標簽或其他部分能添加至該融合蛋白，使得用例如各種親和層析的方法易于將其純化。對于治療性目的，可制取包括該融合蛋白，和/或包括編碼該融合蛋白的多核苷酸的組合物，如藥學制劑。用于治療性目的的組合物可通過將該Fe融合蛋白和/或編碼它們的多核苷酸與任意適當?shù)乃帉W可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑混合而制取。適于與所述試劑混合的組合物的一些實例可見于Remington:The Science and Practice ofPharmacy (《雷明登藥物科學與實踐》)(2005)21世紀版,賓西法利亞州費城,LippincottWilliams和Wilkins。該組合物還可包括任意適當?shù)淖魟?。如果用于本發(fā)明方法的治療性物質為多核苷酸，該多核苷酸可作為裸多核苷酸、聯(lián)合遞送試劑、或作為包括和/或表達該多核苷酸試劑的重組質?；虿《据d體給予個體。適當?shù)慕o藥遞送試劑包括密如斯M(Mirus) Transit TKO親脂試劑、脂質轉染試劑、脂質轉染胺試劑、細胞轉染試劑(cellfectin)、或陽離子聚合物(例如聚賴氨酸)、或脂質體。在一個 實施方式中，該Fc-Ag/拮抗劑融合物由重組溶瘤性重組痘苗病毒(rOVV)編碼。就此而言，溶瘤性病毒選擇性地在癌細胞中復制并破壞之。這種作用的一級機制由包括該病毒在細胞裂解位點表達免疫原性/治療性蛋白的二級機制補充。盡管評價溶瘤性病毒活性的大量臨床試驗利用了局部(例如腫瘤內)或區(qū)域(例如腔內或動脈內)途徑，我們認為浸潤性和轉移性癌癥的有效治療將優(yōu)選使用病毒的系統(tǒng)給藥進行[例如見Hu，J. C.，等Clin Cancer Res2006.12:6737-6747]。因為細胞外包膜痘苗病毒覆蓋自身于源自宿主細胞的含若干宿主補體控制蛋白和少數(shù)外露的病毒蛋白的包膜中，使其抵抗補體中和，所以痘病毒特征在于其能通過血液全身擴散。在臨床前模型和早期臨床試驗中，已證明工程化的溶瘤性痘苗病毒(OVV)在癌癥治療中有前景的結果[Kirn，D. H.和Thorne，S.H. , Nat Rev Cancer 2009. 9:64-71，Mastrangelo, M. J.等.Cancer Gene Ther1999. 6:409-422; Park, B. H.等.Lancet Oncol 2008. 9:533-542; Thorne, S. H.等.CurrGene Ther 2005.5:429-443;Zeh,H.J.和 Bartlett,D.L.，Cancer Gene Ther2002. 9:1001-1012; Zhu, J.等· Blood 2007. 109:619-625]，且已證實，患有廣泛分布轉移性腫瘤的病人中存在全身病毒擴散[Park, B. H.等.Lancet Oncol 2008. 9:533-542, 47-49;Mastrangelo, M. J.等 J Clin Invest 2000.105:1031-1034;Mastrangelo, M. J.等· AdvExp Med Biol 2000. 465:391-400; DiPaola, R. S.等.J Transl Med 2006.4:1]。然而，多數(shù)病人未能有效治療，因而預計OVV在人上的效果能從與本發(fā)明提供的組合物和方法的組合中受益。在一個實施方式中，將所述多核苷酸通過如樹突狀細胞的抗原呈遞細胞給藥途徑給予所述個體，所述抗原呈遞細胞包括表達該Fc-Ag/拮抗劑融合蛋白的多核苷酸。"Fc-Ag/拮抗劑”是指該Fe區(qū)存在于具有抗原、其模擬表位或癌細胞特異性肽受體拮抗劑之一的嵌合蛋白或編碼這樣的嵌合蛋白的核酸序列中。在一個實施方式中，該Fc-Ag/拮抗劑可表達為與通用T輔助細胞表位和Fe片段相連的融合蛋白，以將抗原性表達盒送至所述抗原呈遞細胞上的活化的Fe Y受體，以誘導抗原特異性T細胞。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了增強對抗原免疫應答的方法，所述方法包括將所述Fc-Ag融合蛋白-樹突狀細胞擴增的T細胞過繼性轉移至個體。在一個實施方式中，所述過繼性轉移的T細胞為⑶8+T細胞?！阿?+”T細胞是指表達⑶8 (分化群8)的T細胞。CD8是良好表征的跨膜糖蛋白，用作T細胞受體(TCR)的共受體。CD8結合人抗原呈遞細胞表面的I類主要組織相容性復合體(MHC-I)蛋白。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了將疫苗誘導的CD8+T細胞和表達Fc-Ag融合蛋白的樹突狀細胞的的分離群過繼性轉移到帶瘤宿主，以促進過繼性轉移的T細胞體內擴增與腫瘤生長的抑制，或編碼Fc-Ag融合的多核苷酸。在一個實施方式中，本發(fā)明誘發(fā)了對所述抗原的增強的T細胞應答，呈遞(或被模擬)本發(fā)明Fc-Ag融合物中的抗原。所述增強的T細胞應答包括但不必定限于顯示出對攜帶所述抗原的細胞的細胞毒活性的T細胞的增加，或顯示出增強的對所述抗原的生存力和/或抗原記憶應答的T細胞的增加，或抗原特異性的效應T細胞的數(shù)量和/或活力的增加，或前述類型的細胞介導的免疫應答的組合增加。本發(fā)明方法引發(fā)的T細胞應答可伴有體液和/或先天免疫應答中的有益變化。在一個實施方式中，可通過抑制個體中表達所述抗原的腫瘤細胞的生長，和/或通過延長個體生存時間證明免疫應答增強。 預計包括能被肽(模擬表位)模擬的表位的任意抗原適用于本發(fā)明?？乖瓋?yōu)選包括適于被抗原呈遞細胞呈遞的并與MHC I類分子連接的表位。因而，當其存在于所述融合蛋白中時，所述抗原可以是或可包括蛋白或肽。所述抗原可以是重組抗原，其可以是化學合成的，其可以是從細胞培養(yǎng)物中分離的，或者其可以是從獲自個體的生物樣品中分離的。所述抗原可以呈遞在感染性物種中的細胞上，或者所述抗原可以由病變或感染的細胞、組織或器官表達。在一個實施方式中，所述抗原是腫瘤抗原。腫瘤抗原可以是可商購的抗原，或者其可以通過常規(guī)技術獲取，如通過重組法，或通過制備腫瘤細胞裂解液以鑒定用于本發(fā)明組合物和方法中的新抗原。在各種實施方式中，所述癌細胞抗原可以由癌細胞表達，其具體實例包括但不限于纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、頭頸癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、骨髓癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤(Wilns’ tumor)、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽覺神經瘤、少枝膠質瘤(oliodendroglioma)、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、成視網膜細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胸腺瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom’s macroglobulinemia)和重鏈病。在一個實施方式中，所述抗原是GD2神經節(jié)苷脂的CD166交叉反應性模擬表位。在另一個實施方式中，所述抗原是CTCE-9908。所述抗原可能是由感染性物質或感染性物種表達的抗原，其非限制性的實例包括病毒、細菌、真菌、原蟲、或任意其他寄生蟲或其他感染性物質?？紤]如抗原的分子組成、所述治療個體的大小和年齡和所述個體可能疑似有或可能已經診斷的疾病類型和階段的因素，本領域技術人員知道如何制備實施本發(fā)明方法的劑量方案。本發(fā)明可能用于誘發(fā)增強的預防性或治療性的免疫應答。所述組合物給藥的個體可以是需要治療的個體，和/或已經診斷為、疑似有、或有風險進展為與所述抗原表達相關的疾病或其他紊亂的個體。本領域技術人員可確定涵蓋于本發(fā)明組合物中和/或用于本發(fā)明方法的Fc-Ag/拮抗劑融合蛋白、或編碼所述Fc-Ag/拮抗劑融合蛋白的表達載體、或細胞如包括所述Fc-Ag/拮抗劑融合蛋白或編碼所述Fc-Ag/拮抗劑融合蛋白的表達載體或其他表達盒的抗原呈遞細胞的量。因而，在一個實施方式中，以本發(fā)明組合物的有效劑量給藥。有效劑量可以是抑制所述個體中表達所述抗原的細胞生長的組合物的量，或延長所述個體存活時間或緩解個體中與所述抗原表達相關的疾病癥狀的量。本發(fā)明方法可聯(lián)合常規(guī)療法進行，所述常規(guī)療法旨在治療與所述抗原相關的疾病或紊亂。例如，如果所述方法用于增強個體中對腫瘤抗原的免疫應答，包括但不限于化療、手術干預和放療的治療形式能先于、同時或晚于本發(fā)明方法進行。
正如本文表述的實施例所證，為開發(fā)一種限制腫瘤疫苗在荷瘤小鼠中與Treg細胞相互作用能力的方法，我們首先比較了由呈遞給DC的47-LDA肽模擬物作為與通用Th表位聯(lián)用的線性多肽或作為與小鼠IgG2a Fe片段的融合蛋白所產生的功能性腫瘤特異性細胞應答。我們顯示出47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白-DC疫苗不僅擴增了腫瘤特異性⑶8+T細胞，還在將未免疫脾細胞ACT至經歷清髓性TBI和BM移植的荷瘤小鼠后誘導了初次免疫應答。47-LDA-Fc Y 2a疫苗誘導的CD8+T細胞抑制了原發(fā)性腫瘤生長，并保護了所述荷瘤小鼠免于發(fā)展出最輕的殘留疾病。另一方面，由47-LDA多肽-DC疫苗誘發(fā)的保護導致了腫瘤生長延遲，這僅在清髓性條件下的ACT后顯著。此研究的結果與治療性疫苗接種于荷瘤小鼠期間FcyR能調節(jié)T細胞介導的免疫應答的發(fā)現(xiàn)一致。47-LDA-Fc Y 2a+DC比47-LDA+DC誘導產生更高水平的腫瘤特異性免疫應答的能力更強的機制仍不清楚?？赡苁怯捎诒磉_IL-12的抗原呈遞細胞起始I型而非Treg細胞應答能力更強，所以LPS誘導成熟后，，47-LDA-Fc y 2a+DC群內比47-LDA+對應物中表達IL-12的細胞數(shù)量上升有助于產生此效果。與接受47-LDA-DC疫苗的動物相比，47-LDA-Fc y 2a+DC中CCL22趨化因子表達的減少和47-LDA-Fc y 2a+DC免疫小鼠中更低比例的Treg細胞進一步支持該觀察現(xiàn)象。我們的結果與之前的發(fā)現(xiàn)一致，所述發(fā)現(xiàn)即炎癥環(huán)境的特性通過指導所述成熟DC采取與每種這樣的T細胞類型相互作用的穩(wěn)定傾向，能影響Teff和Treg細胞活化之間的平衡。然而值得注意的是，盡管在癌癥疫苗的設計中已經表明了 DC功能的改變，但在用腫瘤相關抗原模擬表位的治療性疫苗接種期間，為抵消與腫瘤進展相關的免疫抑制而協(xié)調DC應答已經被廣泛評價。因而，這些發(fā)現(xiàn)突出了肽模擬表位的用于癌癥免疫治療的新應用。已經確定的是，活化和抑制低親和力Fe Y R對調節(jié)效應細胞免疫應答至關重要。其在誘導獲得性免疫中的作用顯示出抗原以免疫復合物的形式給予DC期間，活化/抑制受體的功能中的改變能影響DC在體內的活化并增強抗腫瘤T細胞應答。此概念被抑制性Fe Y RIIb受體的選擇性阻斷使人DC成熟并產生對抗體包被的腫瘤細胞的免疫力，和來自Fe Y RIIb缺陷小鼠的DC顯示出共刺激分子更高的表達(能解釋啟動抗原特異性T細胞的能力的增加)的觀察現(xiàn)象所支持。然而，在可危及疫苗有效性和/或實際的可行性的所述抗原結合的再生性方面，大蛋白載體的使用產生諸多困難。因此，包含所述抗原和輔助細胞表位以及具有對活化性Fe Y R結合親合力增加的IgG抗體的Fe區(qū)的合成構建體應該提供在制造和表征方面與免疫復合物不同的優(yōu)勢。這也表明了，47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白使DC能在荷瘤小鼠中有效地啟動和擴增特異性的CD8+CTL應答的能力可產生腫瘤免疫療法改進的效
果ODC疫苗或手術后抗腫瘤免疫應答的研究已顯示出Treg細胞是攜帶弱免疫原性腫瘤的宿主中T細胞記憶發(fā)育的根本障礙。盡管手術當前仍是對固體腫瘤的主要療法，但還是需要記憶T細胞應答以對術后腫瘤復發(fā)和轉移的持續(xù)預防。如多數(shù)癌癥病人中所見，我們的結果顯示了僅手術或疫苗不會誘導對弱免疫原性的腫瘤相關抗原的保護。然而，在我們的模型中，手術聯(lián)合淋巴刪除、ACT和DC疫苗接種能使長期的腫瘤保護的進展成為可能。盡管我們不能排除在術后免疫力的誘導期間，沒有Treg時腫瘤自身作為抗原的來源可能啟動針對多種腫瘤抗原的T細胞應答的可能性，但沒有所述47-LDA模擬表位DC疫苗接種 時所產生的抗腫瘤免疫力僅延伸了荷瘤小鼠的存活。相反，在清髓性荷瘤小鼠宿主中，用靶向活化性Fe Y Rs的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白主動免疫導致了對原發(fā)性腫瘤的顯著性抑制，并對發(fā)生自發(fā)轉移疾病的保護。雖然使用離體產生的DC提供了獨特的機會以避免腫瘤誘導的DC功能異常，并允許了對DC特性的精確操作，用于對病人細胞離體操作的專業(yè)細胞培養(yǎng)設施的需求促進了試圖開發(fā)能靶向荷瘤宿主身體內的內源性DC的無細胞疫苗。經工程改造以選擇性遞送腫瘤抗原或其模擬表位到DC的疫苗可與誘導DC體內極化的策略偶聯(lián)而無需任何體外處理。我們使用rOVV-47-LDA-Fc y 2a載體的病毒治療方法將轉基因直接遞送到腫瘤損傷處(數(shù)據(jù)未顯示)用于DC的分泌和交叉呈遞，得到的結果表明了沒有任何外援細胞因子治療、ACT、TBI或體外操作時保護性Teff以及記憶T細胞的誘導。需要進一步研究，以更好的定義病毒遞送的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白在腫瘤微環(huán)境中交叉呈遞對Teff和Treg之前的平衡以及病毒療法誘導的抗腫瘤免疫應答的有效性和持續(xù)時間的影響。就此而言，若干系列的證據(jù)指出，VV通過產生促炎癥反應細胞因子的TLR2/MyD88依賴性通路和使體外和體內的IFN-β活化的TLR獨立通路誘發(fā)的天然免疫應答。因為持續(xù)的天然免疫的TLR刺激需要打破體內已建立的Treg介導的耐受，且VV能提供TLR信號，所以VV作為疫苗載體的這種獨特的能力能導致宿主防御的活化并保護小鼠免受腫瘤攻擊。因而，在CD4+CD25+Treg存在下，通過基于病毒疫苗打破⑶8+T細胞耐受的可能性表明表達所述47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或其他腫瘤相關抗原的rOVV可證明是DC疫苗很好的替代，以克服體內CD4+CD25+T細胞介導的CD8耐受。總之，該工作強調了開發(fā)DC對腫瘤/自身抗原的攝取和處理以活化免疫效應細胞和限制所吸引的抗炎癥Treg細胞的能力的重要性。我們的發(fā)現(xiàn)闡明了旨在選擇性活化炎性與調節(jié)性型免疫細胞的癌癥免疫療法的新模式。以下實施例旨在用于說明但不限制本發(fā)明。實施例I本實施例提供了獲取本文所述數(shù)據(jù)所用材料和方法的記載。動物和細胞系雌性Α/J小鼠,6-8周齡,購自杰克遜實驗室(Jackson Laboratory)(緬因州巴港)。遵循Roswell Park癌癥研究院動物保護與使用委員會批準的方案進行實驗。小鼠NXS2神經母瘤細胞系(由加利福利亞州拉霍亞的Scripps研究院R. A. Reisfeld博士提供)是GD2陰性的C1300小鼠神經母瘤細胞(A/J背景)和GD2陽性的小鼠背根神經節(jié)瘤細胞的雜交產物。該雜交細胞系通過其H-2Kk陽性/H-2Kb陰性表型顯示出與A/J小鼠同系的MHCI ^ (Lode, H. N. , R. Xiang, T. Dreierj N. M. Varkij S. D. Gillies,和 R. A. Reisfeld. 1998.Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bonemarrow by targeted interleukin-2 therapy.(骨髓神經母細胞瘤轉移灶通過革巴向白介素-2治療由天然殺傷細胞介導的消除)Blood 91:1706-1715.)。14G2a雜交瘤細胞系分泌GD2 特異性 mAb (Mujooj K.，T. J. Kippsj H. M. Yang, D. A. Chereshj U. Wargallaj D. J. Sander,和 R. A. Reisfeld. 1989. Functional properties and effect on growth suppressionof human neuroblastoma tumors by isotype switch variants of monoclonalantiganglioside⑶2 antibody 14.18.(單克隆抗神經節(jié)苷脂GD2抗體14. 18.的同型切換變體對人成神經細胞瘤的生長抑制的功能特性和影響)Cancer Res 49:2857-2861)由R. A. Reisfeld 博士(Scripps 研究院)提供。47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的產生包括組織型纖溶酶原激活蛋白(tPA)分泌信號肽序列、兩種通用Th肽PADRE的47-LDA [AKFVAAWTLKAAA SEQ ID NO: 3; (Alexander, J. ,M. F. del GuerciojA. MaewaljL-Qiao, J. Fikesj R. W. Chesnutj J. Paulson, D. R. Bundle, S. DeFreesj 和 A. Sette. 2000. LinearPADRE T helper epitope and carbohydrate B cell epitope conjugates inducespecific high titer IgG antibody responses.(線性 PADRE T 輔助表位和糖 B 細胞表位偶聯(lián)物誘導特異高效價IgG抗體應答)J Immunol 164:1625-1633)和HIV gpl20糖蛋白的 V3 環(huán)[CKRKIHIGPGQAFYT SEQ ID N0:4;(Ahluwalia，A.，K. Gokulan，I. Nath，和 D. N. Rao. 1997. Modification of delivery system enhances MHC nonrestrictedimmunogenicity of V3 loop region of HIV-I gpl20.(遞送系統(tǒng)的改良增強 V3 loopregion of HIV_lgpl20 的 MHC 非限制性免疫原性)Microbiol Immunol 41:779-784)連同47-LDA模擬肽的表達載體的構建已廣泛報道(Bolesta，E.，A. Kowalczyk, A.Wierzbickij P. Rotkiewiczj B. Bambachj C. Y. Tsaoj I. Horwacikj A. Kolinski, H. Rokitaj M.Brecherj X. Wang, S. Ferronej 和 D. Kozbor. 2005. DNA vaccine expressing the mimotopeof GD2 ganglioside induces protective GD2 cross-reactiveantibody responses.(表達GD2神經節(jié)苷脂模擬表位的DNA疫苗誘導保護型GD2交叉反應抗體應答)CancerRes 65:3410-3418.) ο小鼠47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白通過使用EcoRI和BglII限制性酶切位點在pFUSE-mIgG2Aa_Fcl載體(英韋沃基公司(InvivoGen)，加利福尼亞州圣地亞哥)的hEFl-HTLV啟動子與小鼠IgG2a Fe區(qū)之間插入47-LDA多肽編碼序列而產生。利用Lipofectamine試劑(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)將47_LDA_Fc Y 2a融合蛋白構建體和空載穩(wěn)定轉染293T細胞，然后在含博來霉素的培養(yǎng)基中選擇。在蛋白G柱(GE健康公司(GE Healthcare),生物科學公司(Bio-Sciences Corp)，新澤西州皮斯卡特維)上，從轉染細胞上清培養(yǎng)物中純化47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白。根據(jù)廠家說明書，通過SDS_15%PAGE、14G2a mAb免疫印跡、然后ECL加上蛋白印跡檢測系統(tǒng)(安法馬西亞生物技術公司(Amersham Pharmacia Biotech))分析該融合蛋白。免疫如前人所述(Brinker，K.G.，H. Garner,和 J. R. Wright. 2003. Surfactant proteinA modulates the differentiation of murine bone marrow-derived dendritic cells.(表面活性劑蛋白A調控小鼠骨髓衍生的樹突細胞分化)Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol 284: L232-241 )，從BM前體細胞中體外產生DC。簡言之，從6到8周齡的雌性A/J小鼠(n=5)的脛骨和股骨中采集BM細胞，然后在補有10ng/ml GM-CSF的完全培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)6天。每2-3天補充培養(yǎng)基。第7天，多數(shù)非貼壁細胞已獲得DC形態(tài)學，且通過流式細胞術分析確定為⑶I Ic 高和 CD80、CD86、CD40 和 MHC II 類低。DC 以 10 μ g/ml 47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或47-LDA多肽(新英格蘭肽有限公司(New England Peptide, LLC,)馬薩諸塞州加德納)致敏5小時，用LPS( I. O μ g/ml)孵育I小時以誘導成熟，洗滌并靜脈注射(2X IO6)至小鼠(圖1A)。在疫苗接種時和五天后分別肌肉注射20yg編碼IL-15和IL-21細胞因子的DNA質粒。流式細胞術用生物素標記的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白或47-LDA多肽孵育未成熟DC，然后用鏈霉親和素-偶聯(lián)PE孵育。對于某些實驗，DC用以下單抗染色抗⑶llc-FITC、抗⑶80-PE、 抗CD86-PE、抗CD40-PE或抗MHC II類_PE(BD生物科學公司，加利福尼亞州圣何塞)。脾細胞用抗⑶4-PE、抗⑶8-PE、抗⑶25-FITC (BD生物科學公司)或相關的同種對照標記。特異性抗體染色前，細胞用Fe阻斷劑(抗⑶16/⑶32單抗)孵育10分鐘。細胞用含O. 01%疊氮化鈉和1%FCS的HBSS洗滌兩遍，用1%多聚甲醛固定，并在分析前4°C避光保存。本底染色用包括適當?shù)臒晒馊玖吓悸?lián)的或非偶聯(lián)的小鼠IgGl、IgG2a或IgG2b (BD生物科學公司)的同種對照估計。根據(jù)該廠家操作手冊用抗FoxP3-AlexaFluor 647mAb (e生物科學公司(eBioscience),加利福尼亞州圣地亞哥)的⑶4+CD25+淋巴細胞的細胞內染色確定腋窩、肱淋巴結和脾臟中Treg細胞的數(shù)量。分泌IFN- Y或TNF- α的⑶4+和⑶8+脾細胞的數(shù)量使用抗CD4-FITC和抗CD8-FITC mAb聯(lián)合抗IFN- y -PE或抗TNF- a -PE mAb (BD生物科學公司)確定。通過用檢測IL-12p35亞單位內的表位且不與IL-12p40交叉反應的大鼠抗小鼠IL-70p70 mAb (R&D 系統(tǒng)公司(R&D Systems, Inc.))染色測量 IL_12p70 在 LPS 刺激的 DC中的細胞內表達。通過用大鼠抗小鼠CCL22 mAb (R&D系統(tǒng)公司)染色測定CCL22在LPS刺激的DC中的細胞內表達。47-LDA-Fc y 2a\47-LDA多表位(polytope) +或CD86+DC的分選在BD FACSAria 流式細胞儀上進行(BD公司，新澤西州富蘭克林湖市)。所有流式細胞術評價都在FACScan或FACSCalibur流式細胞儀上進行。在前向角和側向角散射參數(shù)上設門后，用CellQuest軟件(BD生物科學公司)獲取并分析至少10，000個門內事件。T細胞的過繼性轉移和DC疫苗Α/J小鼠海組n=8-10)皮下注射2 X 106NXS2神經母細胞瘤細胞，15天后，通過靜脈注射從47-LDA-Fc Y 2a-或47-LDA多表位-DC免疫小鼠中分離的富集⑶8+的脾細胞治療，如圖IA中所述。根據(jù)廠家說明書，使用偶聯(lián)抗小鼠CD4的磁珠(L3T4)和抗小鼠CD45R(B220)mAb (MACS;美天旎生物科學公司(Miltenyi Biotec))陰性選擇CD8+脾細胞。所分離的⑶8+脾細胞(2X IO7)用LPS刺激成熟的包被47-LDA多肽或47-LDA-Fc融合蛋白的DC孵育。在rmIL-2 (I μ g/劑量)存在下，T細胞與DC的混合物(20:1比例)靜脈注射至清除淋巴細胞的NXS2荷瘤小鼠，如文獻所述(Zeng, R. , R. Spolski, S. E. Finkelstein, S.Oh, P. E. Kovanen, C. S. Hinrichs, C. A. Pise-Masison, M. F. Radonovich, J. N. Brady, N.P. Restifo, J. A. Berzofsky,和 W. J. Leonard. 2005. Synergy of IL-21 and IL-15 inregulating CD8+ T cell expansion and function. (IL-21 和 IL-15 在調控 CD8+T 細胞表達和功能中的協(xié)同作用)J Exp Med201:139-148)。荷瘤小鼠中的淋巴細胞減少由所述ACT和疫苗接種前一天的5Gy非清髓性TBI或9Gy清髓性TBI加上BM轉移(IO7細胞)誘導(圖1B)。攜帶已建立的皮下NXS2腫瘤的對照小鼠用5Gy或9Gy輻射加上BM移植。在IL-15和IL-21載體存在下，小鼠每兩周免疫DC疫苗，如文獻所述(Kowalczyk，A.，A.ffierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H. Rokita, Ε. Repasky, R. Fenstermaker, Μ.Brecher, Μ· Ciesielski,和D.Kozbor. 2007. Induction of protective immune responsesagainst NXS2 neuroblastoma challenge in mice byimmunotherapy with GD2 mimotopevaccine and IL-15 and IL-21 gene delivery.(通過 GD2 模擬表位疫苗和 IL-15 和 IL-21基因遞送，在小鼠中誘導針對NX32神經母細胞瘤攻擊的保護性免疫應答)Cancer ImmunolImmunother 56:1443-1458)。通過每周I到3次用測微計測量皮下腫瘤和測定腫瘤體積(寬X長X寬/2=mm3)來監(jiān)測腫瘤生長。對于擴散性疾病的免疫治療，在腫瘤切除時，NXS2荷瘤小鼠經歷了非清髓性(5Gy)或清髓性(9Gy)TBI (圖1C)。腫瘤切除一天后，所述小鼠接受來自免疫或未免疫小鼠的脾細胞(2X IO7細胞)的ACT以及DC疫苗。在IL-15和IL-21載體存在下，小鼠每兩周 免疫 DC 疫苗，如文獻所述(Kowalczyk, A. , A. ffierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H.Rokita, E. Repasky, R. Fenstermaker, M. Brecher, M. Ciesielski,和 D. Kozbor. 2007.Induction of protective immune responses against NXS2 neuroblastoma challengein mice by immunotherapy with GD2 mimotope vaccine and IL-15 and IL-21 genedelivery.(通過⑶2模擬表位疫苗和IL-15和IL-21基因遞送，在小鼠中誘導針對NX32神經母細胞瘤攻擊的保護性免疫應答)Cancer Immunol Immunother 56 :1443-1458)。對照小鼠具有用有或無TBI和BM移植切除的原發(fā)性腫瘤。存活時間定義為小鼠因擴展性腫瘤生長或轉移發(fā)生而處死的時間點。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并用對數(shù)秩Mantel-Cox方法確定顯著性。疫苗誘導的IFN- Y和TNF- α的表達和T細胞增殖的體外分析。分析來自免疫47-LDA-Fc Y 2a或47-LDA多肽包被的DC的Α/J小鼠的脾細胞在用表達47-LDA的DC以20:1的比例過夜刺激后的IFN- Y和TNF- α的表達。從免疫空載的小鼠中分離的細胞作為對照。為研究47-LDA-DC和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗免疫小鼠中的Treg細胞的誘導,最后一次免疫三周后,從免疫小鼠中摘除脾臟、腋窩和肱淋巴結并通過用抗CD4-PE、抗CD25-FITC和抗FoxP3-Alexa Fluor 647 mAb或相關的同種對照染色分析其Treg細胞的數(shù)量。為分析Treg細胞對Teff細胞增殖的影響，在37°C下，將來自47-LDA-DC或47-LDA-Fc Y 2a_DC疫苗免疫小鼠的⑶8+T細胞裝載25 μ M羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE ；Molecular Probes (分子探針公司)，俄勒岡州尤金市)10分鐘，并在有或無Treg細胞(比例I: I)的條件下，用表達47-LDA的同系DC (比例20:1)培養(yǎng)72小時。細胞用PE偶聯(lián)的抗CD8 mAb染色，并用流式細胞術分析。根據(jù)廠家說明書，用CD4+CD25+調節(jié)性T細胞分離試劑盒(美天旎公司)分離所述Treg細胞群。為分析ACT和DC疫苗接種后的荷瘤小鼠和無瘤小鼠中的⑶4+和⑶8+T細胞應答，脾細胞用25 μ M CFSE標記，并用表達47-LDA的DC孵育72小時。細胞用PE偶聯(lián)的抗⑶4或抗⑶8mAb染色,并通過流式細胞術分析。
CTL 試驗用表達47-LDA的DC以20:1的比例，以15%T細胞刺激因子(T-STIMTM培養(yǎng)補充劑，協(xié)作生物醫(yī)藥產品公司(Collaborative Biomedical Products),馬薩諸塞州貝德福德)作為外源IL-2來源培養(yǎng)脾細胞。刺激三天后，細胞分瓶并培養(yǎng)在補有小鼠rIL-2(O. 3ng/ml) (BD生物科學公司)的培養(yǎng)基中。刺激前，根據(jù)廠家說明書，通過使用T細胞富集柱(美天旎公司)的陰性選擇分離⑶8+T細胞。5天后，通過標準4小時51Cr釋放試驗分析對NXS2腫瘤細胞的CTL細胞裂解活性。特異性裂解的百分比計算為([實驗釋放cpm-自發(fā)釋放cpm]/[最大釋放cpm-自發(fā)釋放cpm] )X 100。從通過加入5%曲通X-100裂解的細胞的上清中確定最大釋放。從僅用培養(yǎng)基孵育的靶細胞中確定自發(fā)釋放。生產用于基于溶瘤性病毒療法癌癥疫苗的表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和47-LDA-Fc Y 2a 融合蛋白的 rOVV。
有各種制作適用于本發(fā)明的rOVV的方法。在具體的說明中，表達EGFP和47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的rOVV通過分別使用VSC20痘苗病毒與痘苗穿梭質粒pSEL_EGFP和pCB023-47-LDA-Fc y 2a在CV-I細胞中的同源重組而產生。母代痘苗病毒是帶有克隆于VGF基因位置的IacZ基因的VSC20。所述VSC20痘苗病毒如美國專利
發(fā)明者D·科茲博 申請人:健康研究股份有限公司