專利名稱：Ctla4蛋白和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CTLA4蛋白、包含CTLA4蛋白的醫(yī)藥組合物、和所述蛋白的治療用途。
背景技術(shù)：
T細胞淋巴細胞通過提供對特定病原體的適應性反應而在細胞介導的免疫中起關(guān)鍵作用。T細胞活化取決于至少兩種信號傳導途徑的活化，其中ー種途徑為抗原特異性，另ー種途徑為抗原非特異性。T輔助細胞抗原性反應需要通過T細胞受體與在抗原呈遞細胞(APC)表面上的MHC(主要組織相容性復合體)所結(jié)合的抗原結(jié)合而活化第一信號傳導途徑。抗原性反應還需要通過T細胞表面上的⑶28蛋白與APC表面上的⑶80(B7-1)及CD86(B7-2)結(jié)合而活化可產(chǎn)生共刺激信號的第二信號傳導途徑。因為抗原特異性信號不足以產(chǎn)生完全抗原性反應，所以無共刺激的T細胞受體/抗原-MHC結(jié)合可導致克隆失活或無反應性(anergy)。(參看例如堅金斯(Jenkins)等人，1993，免疫學新見(Curr.Opin. Immunol. )5:361)。共刺激途徑不僅在T細胞活化和分化中起作用，而且在組織遷移和外周耐受性誘導中起作用。(參看薩洛蒙(Salomon)等人，2001，免疫學年評(Ann. Rev.Immunol.) 19:225)。經(jīng)活化的T細胞還在其細胞表面上表達細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA4)，CTLA4為以較高親和カ結(jié)合⑶80和⑶86的⑶28同系物。CTLA4表達引起競爭性結(jié)合⑶80和CD86、阻斷⑶80/86-⑶28相互作用以及終止T細胞活化。因為這些信號傳導途徑?jīng)Q定T細胞對抗原的反應以及對抗原的下游反應的量值，所以例如通過阻斷CD80/CD86與CD28和/或CTLA4之間的ー種或ー種以上相互作用而調(diào)節(jié)ー種或ー種以上共刺激信號的藥劑可有效治療由細胞介導的免疫反應調(diào)節(jié)異常所引起的病癥。(參看例如穆勒(Mueller)等人，1989,免疫學年評(Annu. Rev. Immunol.) 7:445)。適合破壞⑶80/86-⑶28相互作用的藥劑包括抗體和融合蛋白。舉例來說，在實驗性自身免疫腦脊髄炎(EAE)模型中，使用抗CD80和抗CD86抗體阻斷T細胞。(參看拉克(Racke)等人，1995，臨床研究雜志(J. Clin. Invest. )96:2195)。在另ー實例中，抗CD80和抗CD86抗體用于阻斷2型活體內(nèi)免疫反應(即由IgG抗體介導且針對細胞表面或基質(zhì)抗原的免疫反應)和IL-4產(chǎn)生。(格里沃爾德(Greenwald)等人，1997，免疫學雜志(J. Immunol.) 158:4088)已證明⑶28_Ig融合蛋白與樹突狀細胞上的⑶80和/或⑶86相互作用且使其活化，由此導致在活體內(nèi)產(chǎn)生增強的T細胞介導免疫反應的可溶性CD28的輔助活性。(奧拉博納(Orabona)等人，2004，自然免疫學(Nature Immunol.) 5 (11) : 1134)。或者，CTLA4-Ig融合蛋白已用于破壞⑶80/86-⑶28相互作用。(參看例如麥肯泰爾(McIntyre)等人，2005，未來藥物(Drugs of the Future)，30:873)。對T細胞活化和共刺激途徑的新近研究表明⑶80和⑶86可在免疫反應中，尤其在自身免疫性方面起不同作用。因此，已顯示僅阻斷⑶80或⑶86之一與⑶28的結(jié)合會在活體內(nèi)產(chǎn)生不同影響，其視所研究的疾病和投藥時序而定(參看薩洛蒙(Salomon)，2001，免疫學年評(Annu. Rev. Immunol.) 19:225 ;庫齊羅(Kuchroo)等人，1995，細胞(Cell) 80:707 ;拉克(Racke)等人，1995，臨床研究雜志(J. Clin. Invest.) 96:2195 ；蘭斯喬(Lenschow)等人，1995，實驗醫(yī)學雜志(J. Exp. Med.) 181:1145 ;和格里沃爾德(Greenwald)等人,免疫學雜志(J. Immunol.), 1997 , 158:4088)。當前正在開發(fā)結(jié)合CTLA4且破壞CTLA4對⑶28介導的T細胞反應的抑制的抗體以用于治療各種癌癥。人類抗CTLA4 IgG1抗體易普利姆瑪(Ipilimumab)正處于黑素瘤的III期試驗中以及乳癌和前列腺癌的II期試驗中。人類抗CTLA4 IgG2抗體曲美利姆瑪(Tremelimumab)正處于前列腺癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌的II期試驗中。結(jié)合⑶80和/或⑶86且破壞與CTLA4和⑶28的相互作用的融合蛋白為用于開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑的良好候選者。融合蛋白允許工程改造例如溶解性、穩(wěn)定性、可傳遞性和/或活性改進的蛋白質(zhì)。一種此類免疫調(diào)節(jié)劑為可溶性融合蛋白阿巴西普(abatacept) (Orenda )，其經(jīng)開發(fā)用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，攻擊關(guān)節(jié)、導致最終會引起骨侵蝕和關(guān)節(jié)變形的疼痛膨脹的自身免疫病癥。阿巴西普為ー種CTLA4_Ig融合蛋白，其由人類CTLA4的細胞外域以及人類免疫球蛋白G1 (IgG1)的包括鉸鏈、CH2和CH3域的經(jīng)修飾Fe部分組成。CTLA4域提供結(jié)合活性且威信Fe部分提供穩(wěn)定性、溶解性和可傳遞性。阿巴西普抑制T細胞上的CD28與APC細胞上的⑶80和/或⑶86蛋白的相互作用，由此導致T細胞活化受抑制。(參看例如史瓦茲(Schwartz), 1992,細胞(Cell) 71:1065)。因此，投與阿巴西普可導致T細胞増殖、活化和信號傳導的減少，且減弱類風濕性關(guān)節(jié)炎中的自身免疫反應。稱為貝拉西普(belatacept)的第二代可溶性重組CTLA4-Ig融合蛋白有兩個氨基酸與阿巴西普不同且對⑶80和⑶86具有較大結(jié)合親和カ。貝拉西普正處于進行中的用于腎和其它器官移植的III期試驗中。(參看林賽(Linsley)等人，2009,免疫學評論(Immunol. Reviews) 229:307-321)。第三種融合蛋白MAXY-4，一種來源于阿巴西普但對CTLA4標靶的結(jié)合增加的蛋白質(zhì)，當前正處于由普塞德治療劑有限責任公司(Perseid Therapeutics, LLC)和阿斯特拉制藥公司(AstellasPharma, Inc.)進行的臨床前開發(fā)中用于治療自身免疫疾病和移植排斥反應。使用阿巴西普的療法可能導致成本過高。阿巴西普的具有較高親和力的變體可降低所需的有效治療劑量且因此降低療法成本。此外，由于為達成有益結(jié)果所需的藥劑較少，所以顯現(xiàn)對藥劑自身的免疫原性反應的風險也可降低。其它副作用也可減少。需要提供與CD80和CD86蛋白的結(jié)合有差異的改進的融合蛋白，例如通過產(chǎn)生對ー種同功異型物的相對親和力相對于另ー者較高的變體。所述改進的變體可提供對特定病況或病變的靶向免疫調(diào)節(jié)。在CTLA4-Ig和抗CTLA4抗體療法的一些情況下觀測到的不良反應、或免疫反應的惡化也可降低。
在章節(jié)2中或在本申請案的任何其它章節(jié)中對任何參考文獻的引用或鑒別不應解釋為承認所述參考文獻可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技木。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合⑶80和/或⑶86且序列與SEQ ID NO: I (圖1A)相關(guān)的包含CTLA4結(jié)合域的蛋白質(zhì)。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白另外包含為非CTLA4蛋白的融合搭配物，例如免疫球蛋白域。CTLA4具有3個⑶R樣環(huán)，在本文中稱為(以氨基端至羧基端的順序)⑶R樣環(huán)I、⑶R樣環(huán)2和⑶R樣環(huán)3。CTLA4的⑶R樣環(huán)顯示于圖IB中。對CTLA4的⑶R樣環(huán)進行全面誘變以產(chǎn)生具有 單一點突變的變體群體。接著基于群體中變體的行為篩選變體群體以鑒別所產(chǎn)生的對CD80或CD86的結(jié)合親和カ類似或增加的點突變體。鑒別在群體中的行為指示相對于野生型CTLA4對⑶80或⑶86的結(jié)合親和カ類似或較高的變體。自群體中分離ー些變體且進ー步表征其生物性質(zhì)，例如與CD80和CD86的結(jié)合(描述于實例I中)、抑制Jurkat細胞分泌IL-2 (描述于實例I中)及抑制T細胞增殖(描述于實例2中)。這些變體中的氨基酸取代列于表2、3、5、7、9、10和12中。其它變體不自群體中分離且其結(jié)合特征是基于其在群體中的行為。這些變體中稱為“候選”突變的氨基酸取代列于表4、6、8、11、13、14中。因此，本發(fā)明提供包含相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)具有至少I個氨基酸取代的CDR樣環(huán)的CTLA4蛋白。CDR樣環(huán)中的示范性取代見于表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中?？?単獨或組合)并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的較佳氨基酸取代包括(但不限于)⑶R樣環(huán)I中的氨基酸取代K28H和A29H。在某些方面，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和カ結(jié)合⑶80和⑶86的CTLA4蛋白。⑶R樣環(huán)中導致與CD80和CD86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表2中以及表15的第I行中。在其它方面，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和カ結(jié)合CD80并以中性親和カ(即與阿巴西普相當)結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。⑶R樣環(huán)中導致與⑶80以高親和力結(jié)合及與CD86以中性親和カ結(jié)合的示范性取代見于表3、4中以及表15的第2_5行中。在其它實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和カ結(jié)合CD80并以低親和カ結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。導致與⑶80以高親和力結(jié)合且與⑶86以低親和力結(jié)合的示范性取代見于表5、6中以及表15的第6行中。在一些實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和カ結(jié)合CD80并以高親和カ結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。導致與⑶80以中性親和カ結(jié)合且與⑶86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表7、8、以及表15的第7-8行中。在各種實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以低親和カ結(jié)合CD80并以高親和カ結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。導致與⑶80以低親和力結(jié)合且與⑶86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表9中以及表15的第9行中。在某些實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和カ結(jié)合⑶80和⑶86的CTLA4蛋白。導致與CD80和CD86以中性親和カ結(jié)合的示范性取代見于表10、11以及表15的第10-22行中。在各種實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和カ結(jié)合CD80并以低親和カ結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。以中性親和カ結(jié)合⑶80且以低親和カ結(jié)合⑶86的示范性取代見于表12、13以及表15的第23-26行中。在一些實施例中，本發(fā)明提供相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)在⑶R樣環(huán)中具有 至少I個氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以低親和カ結(jié)合CD80并以中性親和カ結(jié)合⑶86的CTLA4蛋白。以低親和カ結(jié)合⑶80且以中性親和カ結(jié)合⑶86的示范性取代見于表14中以及表15的第27-34行中。在某些實施例中，本發(fā)明提供一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自K28H、K28T、A29H、T51Y、M53F、M53Y、L58G、L61H、L61Y、K93M 和 K93Q 的氨基酸取代。在其它實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少 I 個選自 L58A、L58N、L58Q、L61A、K93V、L104H 和 L104Y的氨基酸取代。在其它實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少 I 個選自 T30E、M54R、G55P、E57P、L58E、L58P、L58Y、L61F和L104I的氨基酸取代。在各種實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括氨基酸取代K93I。在其它實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自L58H、L58K和D62H的氨基酸取代。在一些實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括至少I個選自M54W和M54Y的氨基酸取代。在其它實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自R33D和L61W的氨基酸取代。在其它實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自A29K、T51N、M53W、L96K和L96R的氨基酸取代。在各種實施例中，本發(fā)明提供一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自G27A、Y52F、N56T和L104M的氨基酸取代。在某些實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID N0:1具有至少I個選自以下的氨基酸取代P26I、P26L、P26M、P26Q、P26T、P26V、K28R、A29P、A29S、T30H、T30M、T30S、V32E、R33P、T51A、Y52H、Y52M、Y52W、M53D、M54D、M54G、M54H、M54L、G55D、G55H、G55T、N56A、N56F、N56G、N56H、N56I、N56K、N56L、N56M、 N56Q、N56R、N56S、N56V、N56Y、E57A、E57D、E57H、E57K、E57M、E57N、E57Q、E57R、E57S、E57T、E57V、L58I、L58R、L58T、T59I、T59M、T59N、T59Q、T59R、T59S、T59V、L61E、L61I、L61M、L61T、L61V、D62R、D63E、D63G、D63H、D63T、K93G、V94G、V94I、E95W、P99H、P99T、P99L 和 Y102T。在各種實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括氨基酸取代K28Y。在某些實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID N0:1具有至少I個選自以下的氨基酸取代P26N、G27I、G27Q、G27W、K28E、K28I、K28M、K28P、K28Q、K28V、T30I、T30L、M53E、M53L、M53N、M54A、M54Q、M54S、L58D、L58V、T59H、T59K、T59L、T59P、L61D、L61G、L61Q、L61R、D62A、D62E、D62S、D63Q、D63S和 K93R。在一些實施例中，本發(fā)明提供ー種與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少I個選自以下的氨基酸取代P26R、G27D、G27P、A29N、T30K、E31D、E31G、E31P、E31R、E31T、V32G、V32H、V32T、R33E、R33G、R33I、R33M、R33N、R33Q、R33W、R33Y、T51E、T51G、T51I、T51V、Y52A、Y52D、Y52I、Y52K、Y52L、Y52Q、Y52R、Y52S、Y52T、M53H、M53P、M53S、G55A、G55I、G55L、G55N、G55Q、G55R、G55Y、E57G、E57I、E57W、E57Y、T59D、T59G、T59Y、F60D、F60G、F60H、F60L、D62G、D62I、D62W、D63A、D63Y、K93D、K93H、K93N、K93P、K93W、V94A、V94D、V94H、V94N、V94P、V94R、V94T、V94W、E95G、E95I、E95K、E95P、E95Q、E95R、E95S、E95T、E95V、E95Y、L96A、L96G、L96H、L96M、L96P、L96Q, M97D、M97G、M97I、M97N、M97S、M97V、P99I、P99M、P99W、P99Y、P100H、P100L、P100T、P100V、P100W、P101L、Y102H、Y103H、Y103L、Y103P、Y103T 和 L104P。本發(fā)明的變體(^1^4蛋白可包含選自表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以及16-1到16-6中的一者或一者以上的ー個或ー個以上其它突變或突變的組合。在某些方面，相較于阿巴西普(SEQ ID N0:6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的突變不包含(a)A29K ； (b)M53E ；(c)L61Y ； (d)L104M ； (e)R33P ；(f)T59I ； (g)L61F。在其它方面，相較于阿巴西普(SEQ ID N0:6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的突變不由以下組成(a)A29K ；(b)M53E ； (c)L61Y ； (d)L104M ； (e)R33P ；(f)T59I ； (g)L61F ； (h)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I 和 L61F 中的兩者或兩者以上的組合；或(i) A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的三者或三者以上的組合。舉例來說且不加以限制，在特定實施例中，相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的突變不包含以下或不由以下組成(I) A29K和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F ； (2)M53E和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自A29K、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F ； (3) L61Y和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自A29K、M53E、L104M、R33P、T59I和L61F ； (4) L104M和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自A29K、M53E、L61Y、R33P、T59I和L61F ；(5)R33P和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自A29K、M53E、L61Y、L104M、T59I和L61F ;(6)T59I和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P和L61F ;或(7)L61F和任選的I個、2個或2個以上取代，這些取代獨立地選自 A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P 和 T59I。在某些方面，變體CTLA4多肽為融合蛋白。在某些實施例中，融合搭配物為免疫球蛋白恒定域，例如IgG115
在各種方面，本發(fā)明CTLA4蛋白具有與野生型CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列(SEQ IDNO: I的氨基酸21到112)或與野生型CTLA4細胞外域(SEQ ID NO: I)具有至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。在各種方面，相較于SEQ ID NO: I的⑶R樣環(huán)，本發(fā)明CTLA4蛋白在⑶R樣環(huán)中具有多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、或多達10個氨基酸取代。本文提供包含編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核苷酸序列的核酸，還提供包含核酸的載體。另外，本文提供經(jīng)包含編碼CTLA4蛋白的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的原核和真核宿主細胞，以及經(jīng)工程改造以表達所述核苷酸序列的真核(例如哺乳動物)宿主細胞。還提供通過培養(yǎng)宿主細胞來產(chǎn)生CTLA4蛋白的方法。本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療癌癥、自身免疫疾病和細胞、器官或組織移植物的排斥反應。在某些方面，CTLA4蛋白適用于治療選自類風濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病。應注意，除非本文另外明確規(guī)定，否則在本申請案中按照專利申請案中通常所見來使用不定冠詞“ー個(種)(a) ”和“ー個(種)(an) ”以及定冠詞“所述(the) ”，意思是ー個(種)或ー個(種)以上。另外，在本申請案中按照專利申請案中通常所見來使用術(shù)語“或(or) ”，意思是分離性的“或”或連接性的“和”。本說明書中提及的所有公開案都以引用的方式并入本文中。本說明書中已包括的對文件、法案、材料、裝置、物品等的任何論述僅出于為本發(fā)明提供內(nèi)容的目的。其不應視為承認任何或所有這些要素形成現(xiàn)有技術(shù)基礎的一部分或為與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的普通常識，就如同其在本申請案的優(yōu)先權(quán)日期之前已普遍存在一般。本發(fā)明的特征及優(yōu)點經(jīng)由其實施例的以下具體實施方式
將變得更明顯。
表格和


表I顯示野生型CTLA4_Ig的⑶R樣環(huán)中的氨基酸的編號。表2顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對⑶80和⑶86的親和力。表3顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對⑶80的親和カ但不實質(zhì)上影響⑶86結(jié)合。表4顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶80的親和力，同時不實質(zhì)上影響CD86結(jié)合的候選突變。 表5顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對⑶80的親和カ且減小對⑶86的親和力。表6顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶80的親和カ且減小對⑶86的親和カ的候選突變。表7顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可増加對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響⑶80結(jié)合。表8顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響CD80結(jié)合的候選突變。表9顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可減小對⑶80的親和カ且增加對⑶86的親和力。表10顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示不實質(zhì)上影響與⑶80或⑶86結(jié)合。表11顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中且不實質(zhì)上影響與⑶80或⑶86結(jié)合的候選突變。表12顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可減小對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響與CD80結(jié)合。表13顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以減小對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響⑶80結(jié)合的候選突變。表14顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以減小對⑶80的親和力，同時不實質(zhì)上影響⑶86結(jié)合的候選突變。表15顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中可并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的已知突變。第I行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶80和⑶86的親和カ的已知突變。第2-5行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶80的親和力，同時不實質(zhì)上影響⑶86結(jié)合的已知突變。第6行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶80的親和力，同時減小對⑶86的親和カ的已知突變。第7-8行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響⑶80結(jié)合的已知突變。第9行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以增加對⑶86的親和力，同時減小對⑶80的親和カ的已知突變。第10-22行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中且不實質(zhì)上影響⑶80或⑶86結(jié)合的已知突變。第23-26行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以減小對⑶86的親和力，同時不實質(zhì)上影響對⑶80的親和カ的已知突變。第27-34行顯示可并入野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中以減小對CD80的親和力，同時不實質(zhì)上影響對CD86的親和カ的已知突變。
表16-1到16-6顯示野生型CTLA4⑶R樣環(huán)中可并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的已知突變。圖1A-1C。圖IA顯示人類CTLA4細胞外域的氨基酸序列(SEQ ID N0:1)。通過目視檢查報導的CTLA4共晶體結(jié)構(gòu)鑒別CDR樣環(huán)中的氨基酸(加下劃線)。(史瓦茲(Schwartz)等人，2001，自然(Nature) 410:604 ;斯塔皮爾(Stamper)等人，2001，自然(Nature)410:608)。圖IB顯示野生型CTLA4的⑶R樣環(huán)的序列以及相應序列標識符。圖IC顯示以下的比對(i)全長人類CTLA4細胞外域且含有跨膜域(基因庫登錄號NM_005214 ；SEQ ID NO:5), (ii)如美國專利第5，434，131號中所述的阿巴西普(SEQ IDNO:6);和(iii)人類Fe Y I (SEQ ID NO: 7) 野生型CTLA4_Ig的細胞外域包含hCTLA4的氨基酸1-124，其對應于CTLA4細胞外域。CTLA4經(jīng)由位置120處的半胱氨酸殘基ニ聚化。阿巴西普在位置125處具有谷氨酰胺殘基，所述谷氨酰胺殘基在hCTLA4細胞外域與人類Fe Y I的接點處。hFc Y I的CH1區(qū)在相等位置處含有纈氨酸。具有IgGim(a)異型的人類Fe Y I區(qū)在位置126處起始且為斜體。存在于Fe Y I中且牽涉于ニ硫橋鍵中的在位置130、 136和139處的半胱氨酸殘基在阿巴西普中已突變成絲氨酸。FcyI的CH2區(qū)中的位置148在阿巴西普中從脯氨酸突變成絲氨酸。(戴維斯(Davis)等人，2007，風濕病學雜志(J. Rheumatol. )34(11) :2204)。圖2A-2B顯示如通過競爭AlphaLISA· 所測量的新穎CTLA4_Ig變體與CD80和⑶86的結(jié)合。顯示對⑶80和⑶86中至少ー者的結(jié)合改進的變體的相對結(jié)合活性顯示于圖2A中。顯示對⑶80和⑶86中至少ー者的結(jié)合相等的變體的相對結(jié)合活性顯示于圖2B中?？招暮蛯嵭臈l分別指示關(guān)于⑶80和⑶86的結(jié)合數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用獲自野生型CTLA4-Ig的IC50值校正，且顯示為來自兩組獨立實驗的平均改進倍數(shù)。證實在CH2域中含有突變P148S突變的阿巴西普的結(jié)合活性對配體結(jié)合的影響可忽略。稀釋曲線的各數(shù)據(jù)點在分析板中一式兩份重復。野生型CTLA4-Ig對⑶80和⑶86的平均IC5tl值分別測定為O. 89nM±0. 26和4. 26nM±0. 76。誤差棒表不獲自一式兩份重復實驗的值的范圍。圖3顯示如通過競爭AlphaLISA 所測量的已知CTLA4_Ig變體與⑶80和⑶86的
結(jié)合活性。圖4A-4C顯示野生型和CTLA4_Ig變體抑制Jurkat T細胞在經(jīng)受刺激時產(chǎn)生IL-2的能力。圖4A顯示在野生型CTLA4-Ig或?qū)φ湛贵w存在下，Jurkat T細胞在用表達⑶80或⑶86的CHO-Kl細胞刺激時產(chǎn)生的IL-2。圖4B顯示用滴定量的商業(yè)阿巴西普或野生型CTLA4-Ig或自行制得的貝拉西普獲得的完全抑制曲線。圖4C顯示所選本發(fā)明CTLA-Ig變體抑制IL-2產(chǎn)生的相對效能，其用獲自野生型CTLA4-Ig的IC5tl值校正。誤差棒表示得自一式兩份重復實驗的值的范圍。圖5A-5E顯示野生型和CTLA4_Ig變體抑制初級同種異體刺激的T細胞增殖的能力。符號表示一式三份重復測定的平均值。數(shù)據(jù)代表至少3個獨立實驗。圖6A-6D顯示野生型和CTLA4_Ig變體抑制ニ級同種異體刺激的T細胞增殖的能力。符號表示一式三份重復測定的平均值。數(shù)據(jù)代表至少3個獨立實驗。
具體實施例方式本發(fā)明提供抑制或遏制免疫反應的新穎多肽，其包含CTLA4的變異型⑶80-和/或⑶86結(jié)合片段(“CTLA4結(jié)合域”)。本發(fā)明多肽包含至少I個具有ー個或ー個以上維持或改變CTLA4與⑶80和/或⑶86的結(jié)合性質(zhì)的氨基酸取代的CTLA4結(jié)合域。任選地，變異型CTLA4結(jié)合域融合至不同(非CTLA4)氨基酸序列，例如免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列。這些新穎多肽在本文中統(tǒng)稱為“CTLA4蛋白”或“CTLA4多肽”。I. CTLA4 細胞外域本發(fā)明的變體多肽包含序列與CTLA4細胞外域(SEQ ID NO: I)相關(guān)的氨基酸序列。CTLA4細胞外域為采用具有3個CDR樣環(huán)的免疫球蛋白可變折疊的單鏈多肽。相較于CTLA4，本發(fā)明的變體多肽在至少I個⑶R樣環(huán)中含有至少I個維持或改變蛋白質(zhì)與⑶80和/或CD86的結(jié)合性質(zhì)的氨基酸取代。在某些方面，本發(fā)明的變體CTLA4多肽結(jié)合CD80和/或⑶86且阻斷其與其各別配體(例如CTLA4或⑶28)的相互作用，由此抑制一種或ー種以上免疫細胞介導的反應。本發(fā)明的變體CTLA4多肽亦可在CTLA4細胞外域的非CDR樣環(huán)部分中具有氨基酸突變(例如缺失、插入、添加或取代)。CTLA4細胞外域的非CDR樣區(qū)中的適合突變包括(但不限于)掲示于例如美國專利第5，977，318號；第6，107，056號； 第 6，750，334 號；第 7，034，121 號；第 7，229，962 號；第 7，432，344 號；第 7，504，554 號；第7，385，045號；第7，105，166號；第6，090，914號；第5，770，197號；和美國專利公開案第2009/0258031號中的突變，以上專利中的每ー者均以全文引用的方式并入本文中。在某些實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: I的氨基酸21-112)至少75%—致的氨基酸序列。在其它實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4細胞外域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: I的氨基酸1-124)至少75% —致的氨基酸序列。在各種實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列或與CTLA4細胞外域的氨基酸序列至少80% —致、至少85% —致、至少90% —致、至少91% —致、至少92% —致、至少93% —致、至少94% —致、至少95% —致、至少96% —致、至少97% —致、至少98% —致或至少99% —致的氨基酸序列。在一些實施例中，相較于野生型CTLA4細胞外域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含至少I個突變。在其它實施例中，相較于野生型CTLA4結(jié)合域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含至少I個突變。在其它實施例中，相較于野生型CTLA4細胞外域或相較于野生型CTLA4結(jié)合域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達11個、多達12個、多達13個、多達14個、多達15個、多達16個、多達17個、多達18個、多達19個、或多達20個氨基酸取代。在某些實施例中，CTLA4細胞外域包括人類CTLA4蛋白(SEQ ID NO: I)的氨基酸殘基1-124。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4多肽為CTLA4細胞外域的⑶80-和/或⑶86結(jié)合片段，其包含與CTLA4的CDR樣序列相關(guān)的CDR樣序列。在某些實施例中，結(jié)合片段包含CTLA4細胞外域的一部分，其起始于SEQ ID NO: I的氨基酸I到12之間的任何位置且終止于SEQ ID NO: I的氨基酸112到124之間的任何位置。在某些實施例中，結(jié)合片段是來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸112，來自SEQ ID NO: I的氨基酸10到氨基酸112，來自SEQ ID NO: I的氨基酸8到氨基酸112，來自SEQ ID NO: I的氨基酸6到氨基酸112，來自SEQ ID NO: I的氨基酸4到氨基酸112，來自SEQ ID NO: I的氨基酸I到氨基酸112、氨基酸113、氨基酸114、氨基酸115、氨基酸116、氨基酸117、氨基酸118、氨基酸119、氨基酸120、氨基酸121、氨基酸122或氨基酸123。在其它實施例中，結(jié)合部分是來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸114，來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸116，來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸118，來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸120，來自SEQ ID NO: I的氨基酸12到氨基酸122，或來自SEQ ID NO: I的氨基酸12、氨基酸11、氨基酸10、氨基酸9、氨基酸8、氨基酸7、氨基酸6、氨基酸5、氨基酸4、氨基酸3或氨基酸2到氨基酸124。在某些實施例中，CTLA4的⑶R樣環(huán)是移植于非CTLA4蛋白骨架上。非CTLA4蛋白骨架可為所屬領(lǐng)域中已知允許CDR樣環(huán)維持結(jié)合CD80和/或CD86的三維結(jié)構(gòu)的任何蛋白質(zhì)骨架。在某些實施例中，非CTLA4蛋白骨架為駱駝科重鏈抗體的可變域(VHH)或鯊新抗原受體的可變域(VNAR)( “納米抗體(nanobody)”)。在其它實施例中，骨架可來自于除免疫球蛋白以外的蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明的CTLA4變體蛋白中的所述骨架包括(但不限于)纖維連接蛋白III (fibronectin III) (AdNectin)、β夾心式蛋白(iMAB)、脂質(zhì)運載蛋白(Iipocalin)(抗運載蛋白(Anticalin) )、EETI-II/AGRP (微體(Microbody)) > BPTI/LACI-D1/ITI-D2 (Kunitz 域)、硫氧還蛋白(thioredoxin)(肽適體)、蛋白 A(親和體(Affibody))、錨蛋白重復序列(ankyrin repeat) (DARPin)、Y B-晶狀體球蛋白(Y B-crystallin)/ 泛素(ubiquitin)(親和素(Affilin)) > CTLD3 (四連接素(Tetranectin))和(LDLR-A 模組)3 (高親和性多聚體(Avimer))。在一些實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽為單體。在其它實施例中，CTLA4多肽為ニ聚體。在某些實施例中，CTLA4 ニ聚體為共價ニ聚體，例如經(jīng)ニ硫鍵連接的ニ聚體。在其它實施例中，CTLA4 ニ聚體為非共價ニ聚體。在其它實施例中，CTLA4多肽為多聚體，例如四聚體。本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CTLA4配體具有結(jié)合親和力。在某些實施例中，CTLA4多肽對人類CD80的細胞外域或其一部分具有結(jié)合親和力。在各種實施例中，CTLA4多肽對人類CD86的細胞外域或其一部分具有結(jié)合親和力。在一些實施例中，相較于野生型CTLA4細胞外域(例如在阿巴西普的情形下)的結(jié)合親和力，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力増加。如本文所用，對CD80和/或CD86具有“增加的親和カ”的變體(“高親和カ”變體)是指結(jié)合親和カ為CTLA4細胞外域?qū)Β?0和/或⑶86的結(jié)合親和力的至少I. 5倍、至少I. 75倍、至少2倍、至少2. 5倍、至少3倍、至少3. 5倍、至少4倍、至少4. 5倍、至少5倍、至少5. 5倍、至少6倍、至少6. 5倍、至少7倍、至少7. 5倍、至少8倍、至少8. 5倍、至少9倍、至少9. 5倍、至少10倍、至少20倍或20倍以上的本發(fā)明多肽。在其它實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力約等于野生型CTLA4細胞外域(例如在阿巴西普的情形下)對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力(“中性親和力”變體)。如本文所用，“中性親和力”變體對CD80和/或CD86的結(jié)合親和カ介于CTLA4細胞外域?qū)ε潴w的結(jié)合親和力的約O. 5倍到約I. 5倍之間，例如為CTLA4細胞外域的結(jié)合親和カ的約O. 6倍、約O. 7倍、約O. 8倍、約O. 9倍、約I倍、約I. I倍、約I. 2倍、約I. 3倍、約I. 4倍或約I. 5倍。在某些實施例中，相較于CTLA4細胞外域，本發(fā)明的變體多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和カ減小(“低親和力”變體)。如本文所用，本發(fā)明的“低親和力”變體的結(jié)合親和カ小于CTLA4細胞外域的結(jié)合親和力的O. 5倍、O. 4倍、O. 3倍、O. 2倍、O. I倍、O. 05倍、O. 01倍或O. 01倍以下。在特定實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白關(guān)于⑶80結(jié)合與⑶86結(jié)合兩者均為高親和カ變體。在一些實施例中，變體多肽關(guān)于CD80為高親和カ變體且關(guān)于CD86為中性親和カ變體。在其它實施例中，變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為高親和カ變體且關(guān)于CD80結(jié)合為中性親和カ變體。在其它實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白關(guān)于CD80結(jié)合為高親和カ變體且關(guān)于CD86結(jié)合為低親和カ變體。在其它實施例中，變體蛋白關(guān)于CD86結(jié)合為高親和カ變體且關(guān)于CD80結(jié)合為低親和カ變體。在其它實施例中，本發(fā)明的變體多肽關(guān)于CD80結(jié)合與CD86結(jié)合兩者均為中性親和カ變體。在各種實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為低親和カ變體且關(guān)于CD80結(jié)合為中性親和カ變體。在其它實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為中性親和カ變體且關(guān)于CD80結(jié)合為低親和カ變體。在某些實施例中，本發(fā)明的CTLA4多肽包含在全長CTLA4(基因庫登錄號AAL07473. 1，其以引用的方式并入本文中)的情形下的變體CTLA4結(jié)合域。2. CTLA4融合搭配物
在某些方面，本發(fā)明CTLA4多肽可為融合蛋白，其中變體CTLA4結(jié)合域與另ー多肽(在本文中稱為“融合搭配物”)的氨基酸序列可操作地連接。如本文所用，術(shù)語“融合搭配物，，是指直接或經(jīng)由連接子序列與CTLA4多肽變體共價連接的非CTLA4多肽。在各種實施例中，CTLA4結(jié)合域的C末端與融合搭配物的N末端連接。在一些實施例中，融合搭配物可包含跨膜域和/或細胞質(zhì)域。在所述實施例中，CTLA4融合蛋白在細胞表面上表達。在特定實施例中，融合搭配物包含促進CTLA4多肽分泌、表達和/或溶解的多肽。在一些實施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白為單體。在其它實施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白由于兩個單體的CTLA4部分之間和/或融合搭配物多肽之間的共價連接(例如由雙硫鍵)或由于單體的CTLA4和/或融合搭配物部分的非共價締合而為ニ聚體。在一些實施例中，融合搭配物為ニ聚化的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)域，例如λ抑制體、上游結(jié)合因子及白氨酸拉鏈域(例如fos/jun)。在特定實施例中，融合搭配物為免疫球蛋白(Ig)Fc多肽，即Ig多肽的Fe域或其片段。在某些實施例中，F(xiàn)e多肽或片段可源于各種物種，包括例如人類、小鼠、靈長類動物等，且可源干與其所連接的CTLA4結(jié)合域不同的物種。因此，舉例來說，在一些實施例中，CTLA4結(jié)合域來源于人類蛋白質(zhì)且融合搭配物來源于小鼠蛋白質(zhì)。在特定實施例中，CTLA4多肽與融合搭配物均來源于人類蛋白質(zhì)。在某些實施例中，Ig Fe多肽包含第一恒定區(qū)(CH1)、鉸鏈區(qū)、第二恒定區(qū)(CH2)以及第三恒定區(qū)(CH3)，順序為(從N末端至C末端)CH1-鉸鏈-CH2-CH3。在一些實施例中，融合搭配物任選包含第四恒定區(qū)(CH4)。在一些實施例中，融合搭配物為包含Ig多肽的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域的免疫球蛋白Fe片段。在其它實施例中，Ig Fe片段包含単一恒定域，例如鉸鏈區(qū)以及CH1XH2或CH3域。在某些方面，Ig Fe不具有鉸鏈，例如IgM。在一些實施例中，Ig Fe多肽包含野生型Ig Fe多肽。示范性Fe多肽包括(但不限于)IgG1. IgG2, IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD和IgM。在特定實施例中，F(xiàn)e多肽為IgG?；蛘?，免疫球蛋白Fe融合搭配物為經(jīng)修飾的Ig多肽。在某些實施例中，F(xiàn)e多肽相較于野生型具有ー個或ー個以上氨基酸取代。舉例來說，在某些實施例中，F(xiàn)e多肽為ー個或ー個以上半胱氨酸殘基已經(jīng)另一氨基酸(例如絲氨酸殘基)取代以消除在兩個Ig鏈之間形成的ー個或ー個以上雙硫鍵的突變IgG。在其它實施例中，F(xiàn)e多肽為ー個或ー個以上氨基酸殘基經(jīng)另ー氨基酸(例如脯氨酸)取代以降低效應功能(Fe受體結(jié)合降低)的IgG多肽。參看美國專利公開案第2009/0258031號。在一些實施例中，F(xiàn)e融合搭配物或其片段可經(jīng)修飾以相對于相應野生型序列改變至少一種恒定區(qū)介導的生物效應功能。舉例來說，在一些實施例中，F(xiàn)e多肽可經(jīng)修飾以相對于未經(jīng)修飾的Fe區(qū)降低至少ー種恒定區(qū)介導的生物效應功能，例如降低與Fe受體(FcyR)結(jié)合。Fe YR結(jié)合可通過使免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在Fe Y R相互作用所必需的特定區(qū)域處突變而降低(參看例如坎費爾德(Canfield)和莫里森(Morrison)，1991，實驗醫(yī)學雜志(J. Exp. Med. ) 173:1483-1491 ;和蘭德(Lund)等人，1991，免疫學雜志(J. Immunol.) 147:2657-2662)。Fe區(qū)的Fe Y R結(jié)合能力的降低也可降低依賴于Fe Y R相互作用的其它效應功能，例如調(diào)理作用(opsonization)、吞曬作用(phagocytosis)和抗體依賴性細胞細胞毒性(“ADCC”)。在其它實施例中，F(xiàn)e多肽可經(jīng)修飾以相對于未經(jīng)修飾的Fe區(qū)獲得或改進至少ー種恒定區(qū)介導的生物效應功能，例如增強Fe Y R相互作用(參看例如US 2006/0134709)。舉例來說，F(xiàn)e區(qū)可經(jīng)修飾以便以大于相應野生型恒定區(qū)的親和カ結(jié)合Fe Y RIIA, Fe y RIIB和/或FcyRIIIA。 因此，相較于具有相應野生型Fe區(qū)的融合蛋白，本發(fā)明的Fe融合蛋白可發(fā)生生物活性改變，由此導致調(diào)理作用、吞噬作用、或ADCC増加或減小。所述改變在所屬領(lǐng)域中為已知的。舉例來說，可如修飾抗體一般修飾Fe多肽以降低ADCC活性，例如如美國專利第5，834，597號和第7，083，784號；以及美國專利公開案第2006/0198840號和第2007/0122403號中所述。示范性ADCC降低變體對應于美國專利第5，834，597號的圖4中所示的“突變體3”，其中殘基236缺失且殘基234、235及237 (使用EU編號)經(jīng)丙氨酸取代。在一些實施例中,用于本發(fā)明CTLA4蛋白中的Fe多肽具有低含量巖藻糖或缺乏巖藻糖。Fe區(qū)中缺乏巖藻糖的抗體與ADCC活性增強相關(guān)，尤其在低劑量抗體的情況下。參看謝爾茲(Shields)等人，2002，生物化學雜志(J. Biol. Chem.) 277:26733-26740 ;新川(Shinkawa)等人，2003，生物化學雜志(J. Biol. Chem.) 278:3466-73。制備巖藻糖較少的蛋白質(zhì)的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)中生長。YB2/0細胞表達低含量的FUT8 mRNA,其編碼α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,一種為多肽的巖藻糖基化所必需的酶。另ー方面，本發(fā)明蛋白質(zhì)或其片段可包括已經(jīng)修飾以增加或降低對胎兒Fe受體FcRn的結(jié)合親和力的Fe區(qū)，其中所述修飾例如通過使免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在FcRn相互作用所涉及的特定區(qū)域處突變而達成(參看例如WO 2005/123780)。在特定實施例中，IgG種類的Ig Fe融合搭配物經(jīng)突變以使重鏈恒定區(qū)的氨基酸殘基250、314和428中的至少ー者單獨或以其任何組合，例如在位置250和428處、或在位置250和314處、或在位置314和428處、或在位置250、314和428處經(jīng)取代，其中位置250和428為特定組合。對于位置250，取代氨基酸殘基可為除蘇氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限干)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、白氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置314，取代氨基酸殘基可為除白氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限干)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置428，取代氨基酸殘基可為除甲硫氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限干)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、白氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。適合氨基酸取代的特定組合鑒別于美國專利第7，217，797號的表I中，表I以全文引用的方式并入本文中。所述突變増加Fe多肽與FcRn的結(jié)合，由此保護蛋白質(zhì)免遭降解且增加其半衰期。在某些實施例中，用于本發(fā)明的CTLA4融合蛋白中的Fe多肽具有與人類FcYl的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)至少75%—致的氨基酸序列。在各種實施例中，F(xiàn)e多肽具有與人類Fe Y I的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)至少80% —致、至少85% —致、至少90% —致、至少91% —致、至少92% —致、至少93% —致、至少94% —致、至少95% —致、至少96% —致、至少97% —致、至少98% —致或至少99% —致的氨基酸序列。在一些實施例中，相較于人類Fe Y I (SEQ ID NO: 7)，用于本發(fā)明的CTLA4融合蛋白中的Fe多肽包含至少I個突變。在其它實施例中，相較于野生型人類Fe Y 1，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達11個、多達12個、多達13個、多達14個、多達15個、多達16個、 多達17個、多達18個、多達19個、或多達20個或20個以上氨基酸取代。在一些實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白為融合蛋白，其包含有含約124個氨基酸且在C末端與含有約231個氨基酸的IgG Fe融合搭配物(Fe的鉸鏈、CH2和CH3區(qū))共價連接(直接或間接)的CTLA4結(jié)合區(qū)。在某些實施例中，CTLA4細胞外域和Ig Fe域經(jīng)由連接子連接，其中所述連接子包含約I到約10個氨基酸。在特定實施例中，連接子包含I個氨基酸。在一些實施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQ ID NO:5)，本發(fā)明的變體融合蛋白包含至少I個氨基酸取代。在某些實施例中，氨基酸取代位于CTLA4細胞外域中，例如位于CTLA4的⑶R樣環(huán)中。在其它實施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQ ID N0:5)，本發(fā)明的變體融合蛋白包含CTLA4細胞外域中的至少I個氨基酸取代以及Fe域中的至少I個氨基酸取代。在某些實施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白具有與野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)至少75%—致的氨基酸序列。在各種實施例中，融合蛋白具有與野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)至少80% —致、至少85% —致、至少90% —致、至少91%一致、至少92% —致、至少93% —致、至少94% —致、至少95% —致、至少96% —致、至少97%一致、至少98% —致或至少99% —致的氨基酸序列。在一些實施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQ ID勵七ん本發(fā)明的ロ^^融合蛋白包含至少I個突變。在其它實施例中，相較于野生型阿巴西普，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達11個、多達12個、多達13個、多達14個、多達15個、多達16個、多達17個、多達18個、多達19個、或多達20個或20個以上氨基酸取代。除上述修飾之外，本發(fā)明CTLA4蛋白也可在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中進行修飾以包括用于從宿主細胞進行分泌的信號序列、或肽純化序列，例如抗原決定基標簽、FLAG標簽、聚組氨酸序列、或GST融合物。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白包含ー個或ー個以上經(jīng)修飾的氨基酸，例如糖基化氨基酸、聚こニ醇化氨基酸、法呢基化(farnesylated)氨基酸、こ?；被帷⒔?jīng)生物素標記的氨基酸、與脂質(zhì)部分結(jié)合的氨基酸、和/或與有機衍生化試劑結(jié)合的氨基酸。在某些實施例中，存在經(jīng)修飾的氨基酸在例如以下方面有利(a)増加多肽血清半衰期和/或功能性活體內(nèi)半衰期，(b)降低多肽抗原性或免疫原性，(C)増加多肽儲存穩(wěn)定性，(d)増加生物可用性，(e)減小效應功能，和/或(f)減小或抑制本發(fā)明的兩個或兩個以上CTLA4蛋白之間不合需要的自締合(self-association)(例如形成聚集體)。氨基酸可在重組產(chǎn)生期間經(jīng)例如共翻譯或翻譯后修飾(例如在哺乳動物細胞中表達期間在N-X-S/T基元處的N連接糖基化)或通過合成手段修飾。另ー方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可通過在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中的一個或ー個以上氨基酸的側(cè)鏈添加保護基來加以修飾。所述保護基可例如通過降低多肽的親水性以及增加多肽的親脂性來促進本發(fā)明多肽穿過膜或穿過某些組織進行轉(zhuǎn)運。適合保護基的實例包括所屬領(lǐng)域中已知的酯保護基、胺保護基、?；Ｗo基和羧酸保護基(參看例如美國專利第6，121，236號)。以下章節(jié)5. 6和5. 7中論述本發(fā)明CTLA4蛋白的其它修飾，例如通過添加聚こニ醇或可檢測標記。 3. CTLA4多肽的穩(wěn)定性增加在某些方面，本發(fā)明提供相較于野生型CTLA4 Ig，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加的CTLA4多肽。本發(fā)明提供的CTLA4多肽相較于野生型CTLA4細胞外域的CDR樣環(huán)在其CDR樣環(huán)區(qū)中，和/或在CTLA4細胞外域中在CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有單個或多個氨基酸取代，其中至少I個取代使CTLA4多肽的穩(wěn)定性相較于野生型CTLA4 Ig得以增加。在某些實施例中，CTLA4多肽在儲存時的穩(wěn)定性増加。在其它實施例中，穩(wěn)定性増加是由于抵抗由蛋白酶等引起的降解。在各種實施例中，穩(wěn)定性增加是由于構(gòu)象穩(wěn)定性増加。在一些實施例中，穩(wěn)定性增加是由于聚集減少。在某些實施例中，穩(wěn)定性增加不影響本發(fā)明的變體CTLA4多肽對⑶80和/或⑶86的結(jié)合親和力。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白的穩(wěn)定性可為野生型CTLA4 Ig的穩(wěn)定性的至少O. I倍、至少O. 2倍、至少O. 3倍、至少O. 4倍、至少O. 5倍、至少O. 6倍、至少O. 7倍、至少O. 8倍、至少O. 9倍、至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白的穩(wěn)定性相對于野生型CTLA4 Ig的穩(wěn)定性增加任何上述值之間的范圍，例如O. I倍到2倍、5倍到10倍、O. 9倍到6倍等。在某些方面，樣品中本發(fā)明CTLA4多肽的穩(wěn)定性大于樣品中野生型CTLA4 Ig的穩(wěn)定性，其中所述樣品實質(zhì)上相同(例如均呈含有相同成分的醫(yī)藥組合物形式)和/或以實質(zhì)上相同的方式加工或處理(例如在相同的溫度和濕度條件下儲存相同時期)。在某些方面，本發(fā)明CTLA4多肽的穩(wěn)定性增加為保存期増加。保存期増加可由于氨基酸氧化減少所致(例如因為相對于野生型CTLA4-Ig，CDR樣環(huán)中或CTLA4細胞外域的CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中易氧化的氨基酸殘基，例如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸已經(jīng)取代)。保存期増加也可由于氨基酸環(huán)化減少所致(例如因為相對于野生型CTLA4-Ig，CDR樣環(huán)中或CTLA4細胞外域的CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中易環(huán)化的氨基酸殘基(例如天冬酰胺或谷氨酸)已經(jīng)取代)。保存期増加也可由于消除由可能以殘余含量存在于蛋白質(zhì)純化過程中的蛋白酶識別的氨基酸基元所致。保存期增加還可由于消除會導致蛋白質(zhì)聚集的氨基酸基元所致。保存期增加還可由于構(gòu)象穩(wěn)定性増加所致。相對于野生型CTLA4 Ig，保存期或構(gòu)象穩(wěn)定性的增加或氧化、環(huán)化、蛋白水解或聚集程度的減小可為至少O. I倍、至少O. 2倍、至少O. 3倍、至少O. 4倍、至少O. 5倍、至少O. 6倍、至少O. 7倍、至少O. 8倍、至少O. 9倍、至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些實施例中，相對于野生型CTLA4 Ig，保存期或構(gòu)象穩(wěn)定性的増加或氧化、環(huán)化、蛋白水解或聚集程度的減小是在任何上述值之間的范圍內(nèi)，例如O. I倍到2倍、5倍到10倍、O. 9倍到6倍等。本發(fā)明另外提供篩選相對于野生型CTLA4 Ig穩(wěn)定性増加的CTLA4多肽的方法。在特定實施例中，所述方法包含以下步驟(a)測定第一樣品中全長CTLA4多肽的量；和(b)比較第一樣品中全長CTLA4多肽的量與第二樣品中全長野生型CTLA4 Ig的量。分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法在所屬領(lǐng)域中為已知的。4. CTLA4多肽的免疫原性降低
在某些方面，本發(fā)明提供相較于貝拉西普或MAXY_4(Maxygen)免疫原性降低的CTLA4多肽。本發(fā)明提供的CTLA4多肽相較于貝拉西普或MAXY-4細胞外域的CDR樣環(huán)在其CDR樣環(huán)區(qū)中，和/或在CTLA4細胞外域中在CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有單個或多個氨基酸取代，其中至少I個取代使CTLA4多肽的免疫原性相較于貝拉西普或MAXY-4得以降低。在某些實施例中，免疫原性降低是由導致一個或ー個以上T細胞抗原決定基消除或減少的ー個或ー個以上氨基酸取代所致。在某些方面，免疫原性降低的本發(fā)明CTLA4蛋白相較于貝拉西普或MAXY-4具有類似或改變的生物活性，例如對CD80和/或CD86的親和カ。在某些實施例中，相對于貝拉西普或MAXY-4，本發(fā)明CTLA4多肽的免疫原性降低。所述多肽通常具有相對于CTLA4細胞外域和/或(如果存在)融合搭配物的變體序列。在某些實施例中，CTLA4多肽通常將在CTLA4細胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有1、2或3個氨基酸取代。在其它實施例中，CTLA4多肽可在CTLA4細胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有4、5、6、7、8、9或10個氨基酸取代。在其它實施例中，CTLA4多肽可在CTLA4細胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸取代。如本發(fā)明中所用，具有“降低的免疫原性”的變體是指相較于貝拉西普或MAXY-4CTLA4，包含變體序列的CTLA4多肽，其相較于貝拉西普或MAXY-4，引發(fā)的外周血液單核細胞中的増殖反應降低?？捎糜谠u估増殖反應的示范性増殖分析闡述于以下章節(jié)5. 6中。増殖反應降低可以反應者的百分比、刺激指數(shù)或兩者反映。在其它實施例中，相較于貝拉西普或MAXY-4中的相應肽，具有變體序列的肽導致反應者減少至少25%、反應者減少至少30%、反應者減少至少35%、反應者減少至少40%、反應者減少至少45%、反應者減少至少50%、反應者減少至少60%、反應者減少至少65%、反應者減少至少70%、反應者減少至少75%、反應者減少至少80%、反應者減少至少85%、反應者減少至少90%、反應者減少至少95%、反應者減少至少100%,或?qū)е路磻邷p少任何上述值之間的范圍，例如反應者減少25%-75%、反應者減少50%-90%、反應者減少60%_100%、反應者減少70%-90%等。在某些方面，通過以下章節(jié)5. 6中闡述的分析測定貝拉西普或MAXY-4的變體肽分別相較于貝拉西普或MAXY-4的相應野生型肽引發(fā)T細胞反應的能力。
在其它實施例中，相較于貝拉西普或MAXY-4中的相應肽，具有變體序列的肽導致刺激指數(shù)比由野生型CTLA4 Ig中的相應肽引發(fā)的刺激指數(shù)減小至少5%、減小至少10%、減小至少15%、減小至少20%、減小至少25%、減小至少30%、減小至少35%、或減小至少40%，或相較于野生型CTLA4 Ig,導致刺激減小任何上述值之間的范圍，例如減小5%-20%、減小10%-30%、減小30%-40%等。在某些實施例中，通過以下章節(jié)5. 6中闡述的分析測定刺激指數(shù)。5.核酸和表達系統(tǒng)本發(fā)明涵蓋編碼本發(fā)明CTLA4多肽的核酸分子以及經(jīng)工程改造以重組表達多肽的宿主細胞。本發(fā)明CTLA4蛋白可通過在宿主細胞中重組表達編碼CTLA4結(jié)合部分的核酸或編碼CTLA4融合蛋白的核酸制備。為了重組表達CTLA4蛋白，用ー種或ー種以上攜帯 編碼CTLA4蛋白的核酸的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞以使蛋白質(zhì)在宿主細胞中表達且任選分泌到培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中，蛋白質(zhì)可從所述培養(yǎng)基回收。使用標準重組DNA方法獲得編碼CTLA4蛋白的核酸，將這些核酸并入重組表達載體中且將載體引入宿主細胞中，所述方法例如以下文獻中描述的方法分子克隆實驗指南(Molecular Cloning;A LaboratoryManual),第2版(薩姆布魯克(Sambrook)、福瑞斯(Fritsch)和瑪尼蒂斯(Maniatis)(編)，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor),紐約(N. Y. ),1989);分子生物學現(xiàn)行規(guī)范(Current Protocols in Molecular Biology)(奧蘇貝爾 F. M. (Ausubel, F. Μ.)等人編，格林出版協(xié)會(Greene Publishing Associates), 1989);和美國專利第 4，816，397 號。編碼本發(fā)明的變體CTLA4多肽的核酸可部分或完全合成?；蛘?，首先獲得編碼CTLA4結(jié)合部分的核酸。這些DNA可由對例如H38 (HTLV-II相關(guān)的白血病)細胞系的總細胞RNA進行PCR來獲得。參看美國專利第5，434，131號。此外，如果CTLA4蛋白為融合蛋白，則編碼融合搭配物(例如免疫球蛋白恒定區(qū))的核酸可通過例如使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增且修飾編碼所要融合蛋白的生殖系DNA或cDNA獲得?？珊铣删幋a野生型阿巴西普的核酸且將其用作誘變的模板以便使用常規(guī)誘變技術(shù)來產(chǎn)生如本文所述的變體；或者，可直接合成編碼變體的核酸。一旦獲得編碼變體CTLA4結(jié)合域的核酸，即可通過標準重組DNA技術(shù)進一歩操作核酸，例如以可操作地連接編碼CTLA4結(jié)合域的DNA與編碼另一蛋白質(zhì)(例如融合搭配物，例如抗體恒定區(qū)和/或可撓性連接子)的另ー核酸。如本文中使用的術(shù)語“可操作地連接”預期指接合兩個核酸以使由這兩個核酸編碼的氨基酸序列保持同框(in-frame)。編碼CTLA4結(jié)合域的分離的DNA可通過可操作地連接編碼CTLA4結(jié)合域的DNA與編碼ー個或ー個以上重鏈恒定區(qū)(CH1. CH2、CH3和任選CH4)的另ー DNA分子而轉(zhuǎn)化成編碼融合蛋白的核酸。人類重鏈恒定區(qū)核酸的序列在所屬領(lǐng)域中為已知的(參看例如卡巴特E. A. (Kabat, E. A.)等人，1991,具有免疫學重要性的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest),第 5版，美國健康與公眾服務部(U. S. Department ofHealth and Human Services)，NIH公開案第91-3242號)并且涵蓋這些區(qū)域的核酸可通過標準PCR擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可為IgG1. IgG2, IgG3、IgG4, IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但在某些實施例中，為IgG1恒定區(qū)。為了表達本發(fā)明的CTLA4蛋白，將如上所述獲得的編碼部分或全長蛋白質(zhì)的DNA插入表達載體中以使核酸與轉(zhuǎn)錄以及翻譯控制序列可操作地連接。在這種情形下，術(shù)語“可操作地連接”預期指編碼CTLA4蛋白的核酸連接到載體中，以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)控編碼CTLA4蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預期功能。選擇表達載體和表達控制序列以與所用表達宿主細胞相客。通過標準方法將編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核酸插入表達載體中(例如連接CTLA4蛋白基因片段和載體上的互補限制位點，或如果無限制位點存在，則進行鈍端連接)。如果CTLA4蛋白為融合蛋白，則在插入編碼CTLA4結(jié)合域的序列之前，表達載體可能已攜帶融合搭配物序列，例如抗體恒定區(qū)序列。舉例來說，一種將僅包含CTLA4結(jié)合域的本發(fā)明蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成CTLA4融合蛋白的方法為將編碼CTLA4結(jié)合域的核酸插入已編碼免疫球蛋白Fe的表達載體中，以使CTLA4編碼序列與載體內(nèi)的Fe編碼序列可操作地連接?；蛘呋蛄硗猓亟M表達載體可編碼促進CTLA4蛋白從宿主細胞分泌的信號肽。編碼CTLA4蛋白的核酸可克隆到載體中以使信號肽與CTLA4蛋白編碼核酸的氨基端同框連接。信號肽可為CTLA4信號肽或異源信號肽，例如免疫球蛋白信號肽。除編碼CTLA4蛋白的核酸之外，本發(fā)明的重組表達載體還攜帯調(diào)控序列，所述序 列控制編碼CTLA4蛋白的核酸在宿主細胞中的表達。術(shù)語“調(diào)控序列”預期包括啟動子、增強子、和控制編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。所述調(diào)控序列描述于例如戈德爾(Goeddel),基因表達技術(shù)酶學方法(GeneExpression Technology:Methods in Enzymology) 185 (學術(shù)出te社(Academic Press),圣地亞哥(San Diego),加利福尼亞(CA), 1990)中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應了解,表達載體的設計(包括調(diào)控序列的選擇)可視例如欲轉(zhuǎn)型的宿主細胞的選擇、所要蛋白質(zhì)的表達量等因素而定。適用于哺乳動物宿主細胞表達的調(diào)控序列包括引導蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中高含量表達的病毒元件，例如來源于細胞巨大病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晩期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動子和/或增強子。對于病毒調(diào)控元件和其序列的進ー步描述，參看例如施廷斯基(Stinski)的美國專利第5，168,062號、拜耳(Bell)等人的美國專利第4，510，245號和夏弗納(Schaffner)等人的美國專利第4，968，615號。除CTLA4蛋白編碼核酸和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達載體還可攜帯其它序列，例如調(diào)控載體在宿主細胞中的復制的序列(例如復制起點)和可選標記基因?？蛇x標記基因有助于已引入有載體的宿主細胞的選擇(參看例如美國專利第4，399，216號、第4，634，665號和第5，179，017號,均屬于阿克賽爾(Axel)等人)。舉例來說，通常，可選標記基因賦予已引入有載體的宿主細胞對藥物(例如G418、嘌呤霉素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate))的抗性。適合的可選標記基因包括ニ氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于DHFR-宿主細胞中甲氨蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。對于CTLA4蛋白的表達，通過標準技術(shù)將編碼CTLA4蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式應涵蓋常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的多種技術(shù)，例如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沈淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等?？稍谠嘶蛘婧怂拗骷毎斜磉_本發(fā)明CTLA4蛋白。在某些實施例中，在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞或酵母宿主細胞)中進行CTLA4蛋白表達以使經(jīng)適當折疊、經(jīng)翻譯后修飾且具有免疫活性的抗體的分泌最佳。用于表達本發(fā)明的重組蛋白的示范性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括沃勞(Urlaub)和岑森(Chasin) 1980年在《美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA))) 77:4216-4220 中描述的 DHFR-CHO細胞，與DHFR可選標記一起使用，例如考夫曼(Kaufman)和夏普(Sharp) 1982年在《分子生物學(Mol. Biol.))) 159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞、293細胞和SP2/0細胞。當將編碼CTLA4蛋白的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞中時，通過培養(yǎng)宿主細胞持續(xù)一段足以使所述蛋白質(zhì)在宿主細胞中表達或使所述蛋白質(zhì)分泌到宿主細胞所生長的培養(yǎng)基中的時期來產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)?？墒褂脴藴实鞍踪|(zhì)純化方法自培養(yǎng)基回收CTLA4蛋白。重組DNA技術(shù)也可用于去除ー些或所有非與CTLA4配體結(jié)合所必需的編碼CTLA4蛋白的DNA。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還涵蓋由所述截短的DNA分子表達的分子。一旦產(chǎn)生編碼野生型阿巴西普或⑶R樣序列與阿巴西普的⑶R樣序列相關(guān)的 CTLA4蛋白的ー個或ー個以上部分的核酸，即可將進ー步改變或突變引入編碼序列中，例如以產(chǎn)生編碼具有不同CDR樣序列的CTLA4蛋白或?qū)e受體的親和カ降低的蛋白質(zhì)的核酸。也可通過化學合成(例如通過描述于固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis),第 2 版，1984 皮爾斯化學公司(The Pierce Chemical Co.),羅克福德(Rockford),伊里諾斯州(111.)中的方法)產(chǎn)生本發(fā)明CTLA4蛋白。變體蛋白質(zhì)也可使用無細胞平臺產(chǎn)生(參看例如楚(Chu)等人，生物化學第2期(Biochemia No. 2)，2001 (羅氏分子生物制品公司(Roche Molecular Biologicals)))。一旦已通過重組表達產(chǎn)生本發(fā)明CTLA4蛋白，即可通過所屬領(lǐng)域中已知用于純化蛋白質(zhì)的任何方法對其進行純化，所述方法例如使用可與本發(fā)明蛋白質(zhì)的CTLA4結(jié)合域反應的抗體；或色譜法(例如離子交換色譜法、親和カ(例如對CD80和/或CD86的親和カ)色譜法和篩分柱色譜法(sizing column chromatography));離心法；差異溶解度；或通過任何其它標準技木。另外，本發(fā)明CTLA4蛋白可與本文所述或另外為所屬領(lǐng)域中已知的異源多肽序列融合以便于純化。一旦經(jīng)分離，必要時可例如通過高效液相色譜法(參看例如費希爾(Fisher),生物化學和分子生物學的實驗室技術(shù)(Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology)(沃克(Work)和伯登(Burdon)編，愛思卩隹爾公司(Elsevier), 1980))或通過凝膠過濾色譜法在SuperdexTM 75柱(醫(yī)藥和生物技術(shù)有限公司(PharmaciaBiotech AB),烏普薩拉(Uppsala),瑞典(Sweden))上進一步純化CTLA4蛋白。6. CTLA4蛋白的生物活性在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白具有某些生物活性，例如與阿巴西普競爭結(jié)合⑶80和/或⑶86，或阻斷T細胞反應。因此，在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與阿巴西普競爭結(jié)合⑶80或⑶86。競爭結(jié)合CD80或CD86的能力可使用競爭分析加以測試。在競爭分析的一個實例中，AlphaLISA (放大發(fā)光親近性均相(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous))或AlphaScreen 分析可用作ELISA的非洗滌替代分析。在AlphaLISA 分析中，融合有標簽(例如CA-HA)的配體⑶80或⑶86與結(jié)合有抗標簽抗體(例如山羊抗人類CA)的AlphaLISA 受體珠粒結(jié)合且經(jīng)生物素標記的阿巴西普與AlphaScreen 抗生蛋白鏈菌素(strepavidin)涂覆的供體珠粒(拍金埃爾默公司(PerkinElmer),沃爾瑟姆(Waltham),馬薩諸塞州(MA))結(jié)合。在不存在競爭性CTLA4變體的情況下，阿巴西普與CD80或CD86相互作用且產(chǎn)生615nm下的信號。添加的未標記的CTLA4變體與阿巴西普/⑶80或⑶86相互作用競爭，從而在數(shù)量上減少熒光以使得能夠測定相對結(jié)合親和力?？墒褂脴藴史椒ㄓ昧蚧?NHS-生物素對阿巴西普進行生物素標記且在PBS中透析。AlphaLISA 受體珠粒的結(jié)合是通過根據(jù)“AlphaLISA 分析開發(fā)指南”(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))進行。在384孔AlphaPlate (珀金埃爾默公司(PerkinElmer))中在分析緩沖液(例如含1%BSA、0. 01%吐溫20(Tween 20)的PBS(pH 7. I))中進行結(jié)合。各孔含有O. 5nM經(jīng)生物素標記的阿巴西普、從40nM起始以1:4連續(xù)稀釋的CTLA4競爭劑、O. 078 μ g/ml⑶80和5 μ g/ml結(jié)合山羊抗人類CA的受體珠粒。在室溫下在黑暗中將板培育I小時。接著以5 μ g/ml添加抗生蛋白鏈菌素供體珠粒到各孔中。在室溫下在黑暗中將板再培育30分鐘，此后在En Vision讀取器(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))上進行讀取。利用軟件GRAPHPAD PRISM(GraphPad,圣地亞哥(San Diego))使用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。對于⑶86結(jié)合，首先培育8nM經(jīng)生物素標記的阿巴西普、從IOOnM起始以1:4連 續(xù)稀釋的競爭劑、O. I μ g/ml⑶86和10 μ g/ml結(jié)合山羊抗人類CA的受體珠粒，接著添加10 μ g/ml抗生蛋白鏈菌素供體珠粒。這種競爭分析的變化形式也可用于測試本發(fā)明CTLA4蛋白與阿巴西普之間的競爭。舉例來說，在某些方面，CTLA4蛋白用作參照物且阿巴西普用作測試分子。另外，可使用在所培養(yǎng)的細胞(例如哺乳動物細胞，例如CH0)的表面上表達的膜結(jié)合配體來代替可溶性CD80或CD86。所屬領(lǐng)域中已知并且可使用其它形式的競爭分析。在各種實施例中，當本發(fā)明CTLA4 蛋白以 O. 01 μ g/ml、0. 025 μ g/ml、O. 05 μ g/ml、0. 075 μ g/ml、0. I μ g/ml、0. 25 μ g/ml>0. 5 μ g/ml>0. 75 μ g/ml、I μ g/ml、2 μ g/ml、10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml的濃度或以介于任何上述值之間的范圍內(nèi)的濃度(例如以介于
O.I μ g/ml到2 μ g/ml的范圍內(nèi)的濃度)使用時，CTLA4蛋白使經(jīng)標記的阿巴西普的結(jié)合減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、或介于任何上述值之間的范圍內(nèi)的百分比(例如本發(fā)明CTLA4蛋白使經(jīng)標記的阿巴西普的結(jié)合減少10%到40%、50%到70%、40%到60%、或80%到99%)。在某些方面，測試本發(fā)明CTLA4變體引發(fā)T細胞反應的能力。具體說來，使用多中心(multi-pin)形式由模擬表位(Mimotope)(阿德雷德(Adelaide),澳大利亞(Australia))合成CTLA4肽?？珊铣蒀TLA4多肽序列，例如呈有12個氨基酸重疊的15聚體肽形式。將肽以約l-2mg/ml再懸浮于DMSO(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。保持儲備肽冷凍在-20°C下。為了分離外周血液單核細胞，可從史丹福血液中心(StanfordBlood Center),帕洛阿爾托(Palo Alto),加利福尼亞(CA)購得社區(qū)供體白細胞層產(chǎn)物。用不含鈣或鎂的DPBS按1:1 v:v稀釋白細胞層物質(zhì)。用12.5ml Ficol IPaque-PLUS (通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare))使經(jīng)稀釋的白細胞層物質(zhì)(25_35ml)處于50ml錐形離心管(薩斯特公司(Sarsted)或考斯塔公司(Costar))下層。在室溫下以900g將樣品離心30分鐘。從界面收集外周血液單核細胞(PBMC)。添加DPBS以使最終體積達到50ml且以350g將細胞離心5分鐘。將集結(jié)成粒的細胞再懸浮于DPBS中且計數(shù)。為了分離樹突狀細胞，將含108個新鮮分離的PBMC的AIM V培養(yǎng)基(英杰公司(Invitrogen))(總體積為30ml)接種于T75培養(yǎng)瓶(考斯塔公司(Costar))中。將過量PBMC于90%胎牛血清(FCS)、10%DMS0中以5X IO7個細胞/毫升冷凍于_80°C下。在37°C下于5%C02中培育T75培養(yǎng)瓶2小吋。去除非粘著細胞，且用DPBS洗滌粘著單層細胞。為了區(qū)分樹突狀細胞與單核細胞，添加30ml含有800個單位/毫升GM-CSF(R和D系統(tǒng)(R and D Systems))和500個單位/毫升IL_4(R和D系統(tǒng)(R and D Systems))的AIM V培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶培育5天。在第5天添加IL-Ia (音杰公司(Endogen))和TNF a (音杰公司(Endogen))分別達到50pg/ml和O. 2ng/ml。將培養(yǎng)瓶再培育兩天。在第7天，通過添加3ml含有O. 5到I. Omg絲裂霉素C (Mitomycin C)(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))的IOOmM EDTA達到最終濃度為IOmM EDTA和16. 5到33 μ g/ml絲裂霉素C來收集樹突狀細胞。在37°C和5%C02下再培育培養(yǎng)瓶I小吋。收集樹突狀細胞，且在AIM V培養(yǎng)基中洗滌2-3次。對于細胞培養(yǎng)，在第7天，在37°C水浴中迅速解凍先前冷凍的自體PBMC。立即將細胞稀釋于DPBS或AIM V培養(yǎng)基中且以350g離心5分鐘。通過陰性選擇使用磁珠(Easy-S?、?+試劑盒，干細胞技術(shù)公司(Stem Cell Technologies))來增濃CD4+細胞。在 96 孔圓底板(考斯塔(Costar)9077)中以每孔每2 X IO4個樹突狀細胞對應2 X IO5個CD4+T細胞來共培養(yǎng)自體CD4+T細胞和樹突狀細胞。以約5 μ g/ml添加肽。對照孔僅含有O. 25%v:v的DMSO(西格瑪(Sigma))媒劑。陽性對照孔含有O. 25%的DMSO和I μ g/ml的破傷風類毒素(tetanus toxoid)(李斯特生 物公司(List Biologicals)或卡爾生物化學公司(CalBioChem))。將培養(yǎng)物培育5天。在第5天,姆孔添加O. 25 μ Ci的氣化胸苷(安瑪西亞公司(Amersham)或通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare))。在第6天,使用Packard Filtermate細胞收集器將培養(yǎng)物收集到過濾墊。使用Wallac MicroBeta 1450閃爍計數(shù)器(拍金埃爾默公司(Perkin Elmer))進行閃爍計數(shù)。通過對6到12個重復實驗的個別結(jié)果求平均值來計算平均背景CPM值。對四個陽性對照孔的CPM值求平均值。對各肽的重復實驗孔或一式三份孔求平均值。通過用平均實驗CPM值除以平均對照值來計算陽性對照孔和肽孔的刺激指數(shù)值。為了納入數(shù)據(jù)集之中，需要破傷風類毒素陽性對照孔中大于3. O的刺激指數(shù)。記錄產(chǎn)生2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)的任何肽的反應。使用來自ー組100個供體的外周血液樣品對肽進行測試。匯集對所有肽的反應。對于所測試的各肽，計算在2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)下起反應的供體組(donor set)的百分比。此外，還計算所有供體的平均刺激指數(shù)。通過分析在100個供體的組內(nèi)對肽的反應百分比來鑒別CD4+T細胞抗原決定基肽。對所測試的說明CTLA4多肽的所有肽計算平均反應百分比和標準偏差。大于或等于平均背景反應加上3個標準偏差的反應率被視為潛在CD4+T細胞抗原決定基。在其它方面，本發(fā)明CTLA4多肽抑制在一系列活體外分析中抑制CD80和/或CD86的活性，例如細胞増殖、細胞激素(例如IL-2)產(chǎn)生和細胞粘著。在一些實施例中，所分析的活性為本發(fā)明CTLA4多肽的免疫抑制活性。具體說來，從供體新鮮收集的人類血液用等體積PBS稀釋且根據(jù)制造商說明書使用Histopaque (西格瑪(Sigma)) Ficol I梯度部分分離以分離PMBC。PMBC在補充有10%FBS (海科隆公司(Hyclone))和 IXPSG(青霉素(penicillin)、鏈霉素(streptomycin)和谷氨酰胺)(英杰公司(Invitrogen))的RPMI培養(yǎng)基(西格瑪(Sigma))中稀釋且以I X IO5個細胞/孔的密度添加到96孔培養(yǎng)板(BD生物科學公司(BD Biosciences))中。待測試的CTLA4蛋白在相同培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋且一式四份添加到各孔中。通過添加PH)抗原(來自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mycos)的經(jīng)純化蛋白質(zhì)衍生物)達到5 μ 1/ml的最終濃度來引發(fā)細胞増殖。在37°C下培育5天之后，以每孔I μ Ci添加3H胸苷(通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare))且在37°C下將板再培育18小時。使用制造商推薦的條件用細胞收集器(FilterMate Omnifilter-96收集器,拍金埃爾默公司(Perkin Elmer))收集細胞且使用閃爍計數(shù)器(沃拉克特里克斯(Wallac Trilux))測量3H胸苷并入量。利用GraphPadPrism 5軟件使用非線性回歸曲線擬合模型(S形劑量-反應，可變斜率)和最小平方擬合法分析細胞増殖數(shù)據(jù)。測定各變體的IC5tl參數(shù)和其相關(guān)95%置信區(qū)間。在某些實施例中，分析的活性為抑制初級和ニ級同種異體刺激(allo-stimulated)的T細胞的增埴。具體說來，所述活性可通過人類外周血液⑶4+T細胞的增殖來測量，例如如由拉森(Larsen)等人，2005，美國移植雜志(Am.J. Transplant.) 5:443-453所述。在初級同種異體反應(allo-resp onse)分析中，分離人類⑶4+T細胞(每孔3-10 X IO4個)且與表達等量⑶80和⑶86的經(jīng)照射的人類B類淋巴母細胞系(lymphoblastoid cell line)(例如PM細胞,姆孔8. O X IO3個)，以及不同濃度的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白一起培育。初級同種異體刺激分析進行6天，隨后對于培養(yǎng)的最后7小時，添加每孔O. 5 μ Ci [3H]-胸苷。對于ニ級同種異體刺激分析，通過差異密度離心分離來自7天初級同種異體刺激的T細胞的活細胞且靜息24小吋。接著通過在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下以與上文相同的比率添加PM細胞來再刺激(ニ級刺激)T細胞。刺激T細胞3天，對于培養(yǎng)的最后7小時，脈沖添加[3H]-胸苷，且如上進行收集。或者，可如下文實例2中所述分析初級和ニ級同種異體刺激的T細胞的増殖。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4變體的活性可通過抑制細胞激素產(chǎn)生來測量。舉例來說，在特定實施例中，細胞激素為由Jurkat T細胞產(chǎn)生的IL_2(考克斯(Cox)等人，1999，蛋白質(zhì)表達和純化(Protein Expr. Purif.) 17 (I) : 26-32)。在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下用10 μ g/mL PHA-L和表達重組⑶80或⑶86的細胞(例如CH0-K1，每孔2. 5 X IO4個)刺激Jurkat細胞(每孔I. OX IO5個)。在培養(yǎng)24小時之后，使用例如AlphaLISA 人類IL-2試劑盒(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))測量培養(yǎng)上清液中的IL-2濃度。或者，可通過所屬領(lǐng)域中已知的其它方法(例如ELISA)測量IL-2濃度。或者，在另ー實施例中，可在ニ級同種異體刺激的T細胞的培養(yǎng)基中測量對細胞激素產(chǎn)生的抑制作用(拉森(Larsen)等人，2005，美國移植雜志(Am.J. Transplant.) 5:443-453)。去除來自如以上ニ級同種異體刺激分析中所述經(jīng)同種異體刺激3天的T細胞的培養(yǎng)上清液的等分試樣，隨后添加[3H]-胸苷。使用基于珠粒的分析(例如:Luminex (英杰公司(Invitrogen)))或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法(例如ELISA)測量細胞激素產(chǎn)生(例如IFN Y、IL-2、IL-4)的程度。在某些實施例中，分析的活性為細胞粘著。具體說來，將在細胞表面上重組表達CD80或CD86的細胞(例如CHO細胞)在培養(yǎng)基(例如含10%FBS的RPMI)中稀釋，接種于96孔板中井生長至匯合。當匯合時，將細胞與本發(fā)明CTLA4蛋白或阿巴西普一起培育或用作陰性對照。通過用溫熱培養(yǎng)基洗滌而從細胞去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。純化的T細胞未經(jīng)刺激，或經(jīng)I μ g/ml抗⑶3單株抗體預刺激(在37 °C下30分鐘)。將T細胞(IX IO5個細胞/孔，在100 μ I培養(yǎng)基中)接種于⑶80或⑶86表達細胞上且使其在37°C下粘著30分鐘。通過用溫熱培養(yǎng)基洗滌各孔3次來去除非粘著細胞且一式三份進行計數(shù)(例如通過臺盼藍拒染(trypan blue exclusion))。按(非粘著細胞的數(shù)目/輸入細胞的總數(shù))X 100%計算與CHO細胞的細胞粘著?；蛘?，T細胞可根據(jù)制造商說明書與熒光染料，例如鈣黃綠素(calcein) AM(分子探針公司(Molecular Probes),尤金(Eugene)俄勒網(wǎng)州(OR)) 一起培育，隨后接種到孔中。在與T細胞一起培育、去除含有非粘著T細胞的培養(yǎng)基并洗滌之后，通過熒光多孔板讀取器對板進行讀取。T細胞粘著的百分比由下式獲得(在測試融合蛋白存在下的特異性粘著-背景粘著)/(在阿巴西普存在下的特異性粘著-背景粘著)。7.CTLA4_Ig融合蛋白的動力學性質(zhì)在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對⑶80和⑶86具有高親和力。如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“高親和力”的變體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和カ改進至少I. 5倍。在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對⑶80具有高親和カ且對⑶86具有中性親和力。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有高親和カ且對CD86具有低親和力。在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD86具有高親和カ且對CD80具有中性親和力。 如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“中性親和力”的變體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和カ改進至少O. 5倍但小于I. 5倍。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有低親和カ且對⑶86具有高親和力。在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對⑶80與⑶86兩者均具有中性親和力。在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有中性親和カ且對CD86具有低親和力。在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有低親和カ且對CD86具有中性親和カ。如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“低親和力”的變體的結(jié)合親和カ改進小于O. 5倍。在特定實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白具有特定締合速率常數(shù)(km或匕值)、解離速率常數(shù)Gwf或匕值)、親和カ常數(shù)(Ka值)、解離常數(shù)(Kd值)和/或IC5tl值。在各種實施例中，可根據(jù)卡爾森(Karlsson)等人，1991，免疫方法雜志(J. Immunol.Methods) 145:229-240中掲示的方法使用表面等離子體共振測定CTLA4蛋白與⑶80或CD86細胞外域的相互作用的結(jié)合常數(shù)。在某些方面，所述值是選自以下實施例。在特定實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80結(jié)合的km為至少IOl1 s—1、至少 5X IO2IT1S' 至少 IO3IT1 sベ、至少 5X IO3MW 至少 IO4IT1 s' 至少 5X IO4IT1S' 至少IO5MW至少5X IO5IT1S'至少IO6MW至少SXIO6ITiSベ、至少IO7MW至少5 X IO7M-1 s'至少 IO8M-1 s'至少 5 X IO8M-1S'至少 IO9IT1 s'至少 5 X IO9IT1 s'或 km 在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5X IO4JrY1到IO6IrV1或IO2IrV1到sxioVs-1^在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶86結(jié)合的km為至少IOl1 s—1、至少 5X IO2IT1S' 至少 IO3IT1 sベ、至少 5X IO3MW 至少 IO4IT1 s' 至少 5X IO4IT1S' 至少IO5MW至少5X IO5IT1S'至少IO6MW至少SXIO6ITiSベ、至少IO7MW至少5 X IO7M-1 s'至少 IO8M-1 s'至少 5 X IO8M-1S'至少 IO9IT1 s'至少 5 X IO9IT1 s'或 km 在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5 X IO4Jr1S-1到IO6ITV1或IO3IT1S-1到5 X IO5MH。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80結(jié)合的Iitjff為2s—1或2s—1以下、I. 5s—1或 I.5s1 以下、Is1 或 Is1 以下、0. 5s1 或 0. 5s1 以下、0. Is1 或 0. Is1 以下、SXlO2S1 或5X IOY1 以下、KT2S-1 或 KT2S-1 以下、5X KT3S-1 或 5X KT3S-1 以下、IO^T1 或 l(T3s-1 以下、5X1(T4s-1 或 5X1(T4s-1 以下、ΙΟΛΓ1 或 ΙΟΛΓ1 以下、5X 1(T5s-1 或 5X 1(T5s-1 以下、l(T5sィ或IO-5S-1 以下、5X KTfV1 或 5X KTfV1 以下、KTfV1 或 KTfV1 以下、δΧΙΟ—Υ1 或 δΧΙΟ—Υ1 以下、KT7s-1 或 KT7s-1 以下、5Χ KT8s-1 或 5Χ KT8s-1 以下、KTiV1 或 KTiV1 以下，或 Iitjff 速率在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如Is-1到5 X KT3S'或5 X ΙΟ、—1到ΙΟΛ-1)。在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶86結(jié)合的Iitjff為lOs-1或lOs-1以下、5s1 或 5s1 以下、Is1 或 Is1 以下、O. 5s1 或 O. 5s1 以下、O. Is1 或 O. Is 1 以下、SXlO2S1 或5X IOY1 以下、KT2S-1 或 KT2S-1 以下、5X KT3S-1 或 5X KT3S-1 以下、IO^T1 或 l(T3s-1 以下、5X1(T4s-1 或 5X1(T4s-1 以下、ΙΟΛΓ1 或 ΙΟΛΓ1 以下、5X 1(T5s-1 或 5X 1(T5s-1 以下、IO^T1 或IOY1 以下、5X KTfV1 或 5X KTfV1 以下、KTfV1 或 KTfV1 以下、5X KT7S-1 或 5X IO^T1 以下、KT7s-1 或 KT7s-1 以下、5X ΙΟΙ—1 或 5X ΙΟΙ—1 以下、KTiV1 或 KTiV1 以下，或 Iitjff 速率在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如Is-1到5 X KT3S'或5 X ΙΟ、—1到ΙΟΛ-1)。在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80結(jié)合的KA(kon/koff)為至少至少 5 X IO5M'至少 IO5M'至少 5 X IO6M'至少 IO6M'至少 δΧΙΟ 1、至少 IO7M'至少 IO8M'至少 5 X IO8M'至少 IO9M'至少 5 X IO9M'至少 5 X IOiqM'至少 IO10M'至少 5 XlO11M-1,至少 IO11M'至少 5 X IO12M'至少 IO12M'至少 5 X IO13M'至少 IO13M'至少 5 X IO14M'至少IO14M'至少5Χ IO15M'至少IO15M-1,或Ka在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5 X IO5IT1 到 5 X IO13IT1 或 5 X IO8IT1 到 5 X IO15IT1)。在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的Ka (kon/koff)為至少5 X IO4M'至少 IO4M'至少 5 X IO5M'至少 IO5M'至少 5 X IO6M'至少 IO6M'至少 IO7M'至少 5 X IO7M' 至少 IO8M' 至少 5 X IO8M' 至少 5 X IO9M' 至少 IO9M' 至少 5 X IO10M'至少 IO10M'至少 5 X IO11M'至少 IO11M'至少 5 X IO12IT1 至少 IO12M'至少 5 X IO13M'至少IO13M'至少5X IO14M'至少IO14M-1,或Ka在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5X IO4IT1 到 IO13IT1 或 5X IO7IT1 到 5X IO13IT1)。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4與CD80結(jié)合的Kd(koff/kon)為5X 1(Γ6Μ或5X 1(Γ6Μ以下、I (T6M 或 I (T6M 以下、5 X I (T7M 或 5 X I (T7M 以下、I (T7M 或 I (T7M 以下、5 X I (T8M 或 5 X I (T8M以下、I (T8M 或 I (T8M 以下、5 X I (T9M 或 5 X I (T9M 以下、I (T9M 或 I (T9M 以下、5 X I (TiqM 或 5 X I (T10M以下、1(Γ10Μ 或 1(Γ10Μ 以下、5X 1(ΓηΜ 或 5X 1(ΓηΜ 以下、1(ΓηΜ 或 1(ΓηΜ 以下、5X 1(Γ12Μ 或5 X KT12M 以下、1(Γ12Μ 或 KT12M 以下、5 X 1(Γ13Μ 或 5 X KT13M 以下、1(Γ13Μ 或 KT13M 以下、5X KT14M 或 5X KT14M 以下、1(Γ14Μ 或 1(Γ14Μ 以下、5X 1(Γ15Μ 或 5X 1(Γ15Μ 以下、1(Γ15Μ 或 1(Γ15Μ以下，或Kd在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如10_7M到5X 10_13M、或5X 10_9M到I(T15M)。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的KdGwZIO為1(Γ5Μ或1(Γ5Μ以下、5X 1(Γ6Μ 或 5X KT6M 以下、1(Γ6Μ 或 KT6M 以下、5X 1(Γ7Μ 或 5X KT7M 以下、1(Γ7Μ 或KT7M 以下、5X 1(Γ8Μ 或 5X 1(Γ8Μ 以下、1(Γ8Μ 或 KT8M 以下、5X 1(Γ9Μ 或 5X 1(Γ9Μ 以下、1(Γ9Μ或 KT9M 以下、5X KTiciM 或 5X 1(Γ10Μ 以下、ΙΟ,Μ 或 ΙΟ,Μ 以下、5X 1(ΓηΜ 或 5X 1(ΓηΜ 以下、1(ΓηΜ 或 1(ΓηΜ 以下、5Χ 1(Γ12Μ 或 5Χ 1(Γ12Μ 以下、1(Γ12Μ 或 1(Γ12Μ 以下、5X 1(Γ13Μ 或 5X 1(Γ13Μ以下、1(Γ13Μ 或 1(Γ13Μ 以下、5 X 1(Γ14Μ 或 5 X 1(Γ14Μ 以下、1(Γ14Μ 或 1(Γ14Μ 以下、5 X 1(Γ15Μ 或5 X 10_15Μ以下、10_15Μ或10_15Μ以下，或Kd在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如10_6Μ到 5Χ 1(T1QM、或 5Χ KT9M 到 I(T15M)。
在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合⑶80且在結(jié)合分析(例如AlphaLISA 競爭分析)中抑制0)80與阿巴西普結(jié)合，IC5tl值為小于ΙΟΟΟηΜ、小于750nM、小于500nM、小于ΙΟΟηΜ、小于50nM、小于ΙΟηΜ、小于5nM、小于InM、小于O. 75nM、小于O. 5nM、小于O. 25nM、小于O. InM、小于5X 1(Γ2ηΜ、小于1(Γ2ηΜ、小于5Χ 1(Γ3ηΜ、小于I(Γ3ηΜ、小于5 X 1θΛιΜ或小于ΙΟΛιΜ，或IC5tl在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如IOOnM到5 X 1(Γ2ηΜ或O. 5ηΜ與5 X ΙΟΛιΜ)。在一些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合⑶86且在結(jié)合分析(例如AlphaLISA 競爭分析)中抑制CD86與阿巴西普結(jié)合，IC5tl值為小于ΙΟΟΟηΜ、小于500nM、小于ΙΟΟηΜ、小于50nM、小于ΙΟηΜ、小于5nM、小于InM、小于O. 75nM、小于O. 5nM、小于O. 25nM、小于O. InM、小于 5X 10_2nM、小于 1(Γ2ηΜ、小于 5Χ 1(Γ3ηΜ、小于 1(Γ3ηΜ、小于 5X 1θΛιΜ 或小于 1θΛιΜ，或IC50在任何ー對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如IOOnM到5 X 10_2ηΜ或O. 5ηΜ與5 X 10_4ηΜ)。在某些實施例中，在比較分析中，本發(fā)明融合蛋白的動力學性質(zhì)與阿巴西普類似或相對于阿巴西普得以改迸。舉例來說，在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/ 或CD86結(jié)合的km速率在阿巴西普的km的約O. 05倍到1000倍的范圍內(nèi)，例如km為阿巴西普的kon的O. 06倍、kon為阿巴西普的kon的O. 08倍、kon為阿巴西普的kon的O. I倍、kon為阿巴西普的kon的O. 5倍、kon為阿巴西普的kon的I倍、kon為阿巴西普的kon的I. I倍、kon為阿巴西普的km的I. 2倍、km為阿巴西普的km的I. 3倍、km為阿巴西普的km的I. 4倍、km為阿巴西普的km的I. 5倍、km為阿巴西普的km的I. 6倍、km為阿巴西普的km的
1.6倍、km為阿巴西普的km的I. 7倍、km為阿巴西普的km的I. 8倍、km為阿巴西普的km的I. 9倍、km為阿巴西普的km的2倍、km為阿巴西普的km的2. 25倍、km為阿巴西普的kon的2. 5倍、km為曲妥珠單抗(traztuzumab)的km的2. 75倍、km為阿巴西普的km的3倍、km為阿巴西普的km的4倍、km為阿巴西普的km的5倍、km為阿巴西普的km的6倍、kon為阿巴西普的kon的7倍、kon為阿巴西普的kon的8倍、kon為阿巴西普的kon的9倍、kon為阿巴西普的km的10倍、km為阿巴西普的km的15倍、km為阿巴西普的km的20倍、km為阿巴西普的km的50倍、km為阿巴西普的km的75倍、km為阿巴西普的km的100倍、kon為阿巴西普的km的150倍、km為阿巴西普的km的200倍，或km在任何ー對上述值之間的范圍內(nèi)，例如km為阿巴西普的km的O. I倍-75倍、km為阿巴西普的km的5倍-100倍、kon為阿巴西普的kon的O. 05倍-1000倍、kon為阿巴西普的kon的O. 75倍-250倍等。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80和/或⑶86結(jié)合的Iitjff速率在阿巴西普的koff的約O. 001倍到約3倍的范圍內(nèi)，例如koff為阿巴西普的koff的O. 002倍、koff為阿巴西普的I^ff的0. 003倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的0. 004倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的O. 005倍、koff為阿巴西普的koff的O. 006倍、koff為阿巴西普的koff的O. 0075倍、koff為阿巴西普的koff的O. 01倍、、 為阿巴西普的koff的O. 025倍、、 為阿巴西普的koff的O. 05倍、koff為阿巴西普的koff的O. 075倍、koff為阿巴西普的koff的O. I倍、koff為阿巴西普的koff的O. 25倍、koff為阿巴西普的koff的O. 5倍、koff為阿巴西普的koff的O. 75倍、koff為阿巴西普的I^ff的I倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的I. 25倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的I. 5倍、koff為阿巴西普的koff的I. 75倍、koff為阿巴西普的koff的2倍、koff為阿巴西普的koff的
2.25倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的2. 5倍、Iitjff為阿巴西普的Iitjff的3倍、Iitjff為阿巴西普的koff的4倍、為阿巴西普的的5倍，或Iw在任何ー對上述值之間的范圍內(nèi)，例如為阿巴西普的koff的O. Ol倍到I. 25倍、koff為阿巴西普的koff的O. 05倍到2. 5倍、或koff為阿巴西普的I^ff的O. 006倍到O. I倍等。在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80和/或⑶86結(jié)合的在阿巴西普的Ka的約O. I倍到約1000倍的范圍內(nèi)，例如Ka為阿巴西普的Ka的O. 2倍、Ka為阿巴西普的Ka的O. 25倍、Ka為阿巴西普的Ka的O. 5倍、Ka為阿巴西普的Ka的O. 75倍、Ka為阿巴西普的Ka的I倍、Ka為阿巴西普的Ka的2倍、Ka為阿巴西普的Ka的3倍、Ka為阿巴西普的Ka的4倍、Ka為阿巴西普的Ka的5倍、Ka為阿巴西普的Ka的10倍、Ka為阿巴西普的Ka的15倍、Ka為阿巴西普的Ka的20倍、Ka為阿巴西普的Ka的30倍、Ka為阿巴西普的Ka的40倍、Ka為阿巴西普的Ka的50倍、Ka為阿巴西普的Ka的75倍、Ka為阿巴西普的Ka的100倍、Ka為阿巴西普的Ka的200倍、Ka為阿巴西普的Ka的250倍、Ka為阿巴西普的Ka的300倍、Ka為阿巴西普的Ka的350倍、Ka為阿巴西普的Ka的400倍、Ka為阿巴西普的Ka的500 倍、Ka為阿巴西普的Ka的750倍、Ka為阿巴西普的Ka的1000倍，或Ka在任何ー對上述值之間的范圍內(nèi)，例如Ka為阿巴西普的Ka的O. I倍到100倍、Ka為阿巴西普的Ka的10倍到50倍、或Ka為阿巴西普的Ka的5倍到50倍等。
在其它實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80和/或⑶86結(jié)合的も(1^ノ1^)在阿巴西普的Kd的約O. 001倍到10倍的范圍內(nèi)，例如Kd為阿巴西普的Kd的O. 001倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 002倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 003倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 004倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 005倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 0075倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 01倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 025倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 05倍、Kd為阿巴西普的Kd的
0.075倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. I倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 2倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 3倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 4倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 5倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 75倍、Kd為阿巴西普的Kd的I倍、Kd為阿巴西普的Kd的I. 5倍、Kd為阿巴西普的Kd的2倍、Kd為阿巴西普的Kd的3倍、Kd為阿巴西普的Kd的4倍、Kd為阿巴西普的Kd的5倍、Kd為阿巴西普的Kd的6倍、Kd為阿巴西普的Kd的7倍、Kd為阿巴西普的Kd的8倍、Kd為阿巴西普的Kd的9倍、Kd為阿巴西普的Kd的10倍，或Kd在任何ー對上述值之間的范圍內(nèi)，例如Kd為阿巴西普的Kd的O. 001倍到O. 5倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. I倍到4倍、Kd為阿巴西普的Kd的O. 05倍到I倍等。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與⑶80和/或⑶86結(jié)合且抑制細胞生長或IL2產(chǎn)生，IC5tl值在阿巴西普的IC5tl的約O. 001倍到10倍的范圍內(nèi)，例如IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 005倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 01倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 05倍、IC50為阿巴西普的IC5tl的O. I倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 2倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 3倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 4倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 5倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 6倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 7倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 8倍、IC50為阿巴西普的IC5tl的O. 9倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的I倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的
1.5倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的2倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的3倍、IC5tl為阿巴西普的IC50的4倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的5倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的6倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的7倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的8倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的9倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的10倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的100倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的500倍、IC50為阿巴西普的IC5tl的1000倍，或IC5tl在任何ー對上述值之間的范圍內(nèi)，例如IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 005倍到O. 2倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. I倍到I. 5倍、IC5tl為阿巴西普的IC5tl的O. 2倍到2倍等。在某些實施例中，CDR樣環(huán)中的單ー取代可導致上述相較于阿巴西普的IC5tl差異，其中本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白相較于阿巴西普可在⑶R樣環(huán)中包含所述取代和多達5個其它取代、多達10個其它取代、多達15個其它取代或多達20個其它取代。8.CTLA4蛋白結(jié)合物本發(fā)明CTLA4蛋白包括例如通過使任何類型的分子與蛋白質(zhì)共價連接以使得所述共價連接不干擾與⑶80或⑶86結(jié)合而經(jīng)修飾的結(jié)合物。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可與效應部分或標記結(jié)合。如本文所用的術(shù)語“效應部分”包括例如抗贅生性藥劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(尤其放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金屬、納米粒子和報告基團(例如熒光化合物或可用NMR或ESR光譜法檢測的化合物)。 在一個實例中，CTLA4蛋白可與效應部分(例如細胞毒性劑、放射性核素或藥物部分)結(jié)合以改變給定生物反應。效應部分可為蛋白質(zhì)或多肽，例如而不限于毒素(例如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(Diphtheria toxin))、信號傳導分子(例如α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogenactivator))、免疫抑制劑(例如環(huán)孢素 A(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)、卡普司-IH (Campath-IH)或糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid))或消炎劑(例如阿司匹林(aspirin)或萘普生(naproxen))或生物反應調(diào)節(jié)劑，例如抗體、抗淋巴細胞球蛋白(anti-lymphocyte globulin)、蛋白質(zhì)或細胞激素(例如抗TNF α抗體或影響細胞遷移的抗體，例如那他珠單抗(natalizumab))。在另ー實例中，效應部分可為細胞毒素或細胞毒性劑。細胞毒素和細胞毒性劑的實例包括紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化こ錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新喊(vincristine)、長春喊(vinblastine)、秋水仙喊(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道諾霉素(daunorabicin)、ニ輕基炭疽菌素ニ酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素 D (actinomycin D)、I-去氫睪酮(Ι-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、和嘌呤霉素、以及其類似物或同系物。效應部分還包括(但不限干)抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6_ 硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5_ 氟尿P密唳(5-f Iuorouracil)、達卡巴嗪(dacarbazine))、燒基化劑(例如ニ氯甲基ニZa 胺(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)和洛莫司汀(Iomustine) (CCNU)、環(huán)憐酉先月安(eye Iothosphamide)、白消安(busulfan)、ニ溴甘露糖醇(dibromomannitol)、鏈佐霉素(streptozotocin)、絲裂霉素C5 (mitomycin C5)和順ニ氯ニ月安鉬(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II))(DDP)順鉬(cisplatin))、蒽環(huán)霉素(anthracycline)(例如道諾霉素(daunorubicin,先前為 daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如放線菌素D (dactinomycin,先前為actinomycin)、博萊霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin) (AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))、和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。其它效應部分可包括放射性核素，例如(但不限干)111In和9°Y、Lu177、鉍213、锎252、銥192和鶴18V錸188 ;和藥物,例如(但不限于)燒基磷酸膽堿(alkylphosphocholine)、拓撲異構(gòu)酶I抑制劑、紫杉燒(taxoid)和蘇拉明(suramin)。使所述效應部分與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)在所屬領(lǐng)域中為眾所周知的(參看例如赫斯多姆(Hellstrom)等人，控制藥物遞送(Controlled Drug Delivery),第 2版，第623-53頁(羅濱遜(Robinson)等人編，1987));索普(Thorpe)等人，1982，免疫學評論(Immunol.Rev. )62:119-58和杜波夫基克(Dubowchik)等人，1999，藥理學與治療學(Pharmacologyand Therapeutics)83:67-123)。 在某些方面，CTLA4蛋白與小分子毒素結(jié)合。在某些示范性實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素的肽類似物或衍生物，例如奧瑞他汀(auristatin)(美國專利第5，635，483號和第5，780，588號)結(jié)合。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經(jīng)由其N(氨基)末端、C(羧基)末端或在內(nèi)部與抗體連接(WO 02/088172)。示范性奧瑞他汀實施例包括N末端經(jīng)連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF，如美國專利第7，498，298號中所掲示，所述專利因此以全文引用的方式并入本文中(掲示例如連接子和制備與連接子結(jié)合的單甲基纈氨酸化合物(例如MMAE和MMAF)的方法)。在其它示范性實施例中，小分子毒素包括(但不限干)卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美國專利第 5，208, 020 號)、新月毒素(trichothene)和CC1065。在本發(fā)明的一個實施例中，CTLA4蛋白與ー個或ー個以上美登素分子(例如每個蛋白質(zhì)分子約I到約10個美登素分子)結(jié)合。美登素可例如轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，May-SS_Me可還原成May_SH3且與蛋白質(zhì)反應(查理(Chari)等人，1992，癌癥研究(Cancer Research) 52:127-131)以產(chǎn)生類美登素-蛋白質(zhì)(maytansinoid-protein)或類美登素-Fe融合結(jié)合物。也可使用的卡奇霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括(但不限干)Y 11、Y 31、Y 31、N-こ?；?Y 11、PSAG 和 Θ 11(希曼(Hinman)等人，1993，癌癥研究(Cancer Research) 53:3336-3342 ；洛德(Lode)等人，1998，癌癥研究(CancerResearch) 58:2925-2928 ;美國專利第5，714，586號；美國專利第5，712，374號；美國專利第5，264，586號；美國專利第5，773，001號)。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可與免疫抑制劑連接。所述藥劑包括糖皮質(zhì)激素、細胞生長抑制劑、抗體、作用于免疫親和素(immunophilins)的藥物、士他汀類(statins),和其它藥劑，例如干擾素(例如INF-β和INF-γ)、類鴉片(opioids)、TNF結(jié)合劑(例如英利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、姜黃素(curcumin)和兒茶素(catechins))、霉酹酸酯(mycophenolate)、IL-I 受體拮抗劑，和其它小分子藥劑(例如芬戈莫德(fingolimod)、多球殼菌素(myriocin))。示范性糖皮質(zhì)激素包括(但不限于)氫皮質(zhì)酮(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)、潑尼龍(prednisolone) > 甲潑尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、こ酸氟氫皮質(zhì)酮(fludrocortisone acetate)、こ酸脫氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone acetate)和醛固酮(aldosterone)。示范性細胞生長抑制劑包括(但不限干)環(huán)磷酰胺、亞硝基脲(nitrosoureas)、鉬化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰基嘌呤、卩密唳類似物、蛋白質(zhì)合成抑制劑，和抗生素，例如放線菌素D、蒽環(huán)霉素、絲裂霉素C、博來霉素和光神霉素。示范性免疫抑制抗體包括(但不限于)抗CD20抗體、抗IL2受體抗體(達利珠單抗(daclizumab)、巴利昔單抗(basiliximab))、卡普司-1H、抗α 4 β i整合素抗體、抗IL-15抗體、抗IL-6受體抗體和抗CD3抗體(莫羅單抗(muromonab))。作用于免疫親和素的示范性藥劑包括(但不限干)環(huán)孢素、他克莫司和西羅莫司(sirolimus)。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可與消炎劑連接。示范性消炎剤包括(但不限干)非類固醇消炎剤，例如布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林、萘普生、ニ氟尼柳 (diflunisal)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、卩比羅昔康(piroxicam)、雙氯芬酸(diclofenac)、卩引哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、依托度酸(etodolac)、酮洛酸(ketorolac)、卩惡丙嗪(oxaprozin)和塞來昔布(celecoxib),和糖皮質(zhì)激素，其也具有免疫抑制活性。在一個實例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可與聚(こニ醇)(PEG)部分連接。在ー個特定實例中，PEG部分可經(jīng)由位于蛋白質(zhì)中的任何可用氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團(例如任何游離氨基、亞氨基、硫醇基、羥基或羧基)連接。所述氨基酸可天然存在于蛋白質(zhì)中或可使用重組DNA方法工程改造到蛋白質(zhì)中。參看例如美國專利第5，219，996號。多個位點可用于連接兩個或兩個以上PEG分子。PEG部分可通過位于CTLA4蛋白中的至少I個半胱氨酸殘基的硫醇基共價連接。當硫醇基用作連接點時，可使用適當活化的效應部分，例如硫醇選擇性衍生物，例如順丁烯ニ酰亞胺和半胱氨酸衍生物。CTLA4蛋白可使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)，例如美國專利第4，179，337號、第4，301，144號、第4，496，689號、第4，640，835號、第4，670，417號和第4，791，192號中所述的技術(shù)與PEG或其它親水性合成聚合物(例如聚丙ニ醇或聚氧化烯)連接，或與例如聚こ烯醇或聚こ烯吡咯烷酮(PVP)等聚合物連接?！皹擞洝暴`詞在本文中使用時是指可直接或間接與本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合的可檢測化合物或組合物。標記本身可為可檢測的(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或在酶標記情形下，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學變化。適用熒光部分包括(但不限干)熒光素(fluorescein)、異硫氰酸熒光素、若丹明(rhodamine)、5_ ニ甲胺-I-萘磺酰氯、藻紅素(phycoerythrin)等。適用酶標記包括(但不限于)堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。尤其適用于診斷目的的其它CTLA4蛋白結(jié)合物描述于以下章節(jié)5. 7中。9. CTLA4蛋白的診斷用途本發(fā)明CTLA4蛋白，包括已例如通過生物素化、辣根過氧化物酶或任何其它可檢測部分(包括描述于章節(jié)5. 6中的部分)修飾的蛋白質(zhì)，可有利地用于診斷目的。具體說來，CTLA4蛋白可用于例如(但不限于)與⑶80和/或⑶86結(jié)合以達成體外白血球分型(typing)，從而確定B細胞成熟階段；檢測與B細胞相關(guān)的疾??；分離CD80和/或⑶86陽性細胞；以及體外和體內(nèi)診斷方法。(參看例如橫地(Yokochi)等人，1982，免疫學雜志(J. Immunol. ) 128 (2) :823-27)。舉例來說，所述蛋白質(zhì)可在免疫分析中用以定性和定量地測量生物樣品中CD80和/或CD86陽性細胞的含量。用于執(zhí)行所述診斷技術(shù)的通用指導見于例如哈露(Harlow)等人，抗體技術(shù)實驗指南(Antibodies:A LaboratoryManual),第 2版(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1988)和漢普頓R(Hampton R)等人，血清學方法實驗指南(Serological Methods A LaboratoryManual) (APS出版社(APS Press), 1990)中，其各自以全文引用的方式并入本文中。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可在分析中用以鑒別能夠調(diào)控T細胞/B細胞相互作用的其它藥劑，例如抗CTLA4抗體或其片段。具體說來，所述分析鑒別能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)與CD80和/或CD86的結(jié)合的藥劑。適用于篩選調(diào)控T細胞/B細胞相互作用的藥劑的分析在所屬領(lǐng)域中為已知的且包括(但不限干)競爭ELISA分析。本發(fā)明另外涵蓋與診斷劑結(jié)合的CTLA4蛋白或其片段。所述蛋白質(zhì)可在診斷上用以例如檢測相關(guān)標祀在特定細胞、組織或血清中的表達；或監(jiān)測免疫反應的發(fā)展或進展作為臨床測試程序的一部分，以例如確定給定治療方案的功效。通過使蛋白質(zhì)與可檢測物質(zhì)偶合可便于檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物 質(zhì)、放射性物質(zhì)、發(fā)射正電子的金屬(使用各種正電子發(fā)射斷層攝影法)和非放射性順磁金屬離子。可檢測物質(zhì)可直接地或使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)經(jīng)由中間物(例如所屬領(lǐng)域中已知的連接子)間接地與蛋白質(zhì)(或其片段)偶合或結(jié)合。酶標記的實例包括熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利第4，737，456號)、熒光素、2，3- ニ氫酞嗪ニ酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、こ酰膽堿酯酶、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、溶菌酶、糖類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶(Iactoperoxidase)、微過氧化物酶(microperoxidase)等。適合輔基復合物的實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生蛋白(avidin)/生物素；適合熒光物質(zhì)的實例包括傘酮(umbelIiferone)、突光素、異硫氰酸突光素、若丹明、ニ氯三嗪基胺突光素、丹磺酰氯(dansyl chloride)或藻紅素；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾(Iuminol);生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白(aequorin);且適合放射性物質(zhì)的實例包括125I、mI、mIn或99Tc。本發(fā)明提供⑶80和/或⑶86表達的檢測，其包含使用ー種或ー種以上本發(fā)明CTLA4蛋白(任選與可檢測部分結(jié)合)接觸生物樣品(例如細胞、組織或體液)，和檢測樣品對于CD80-和/或CD86表達細胞是否為陽性，或樣品相較于對照樣品，是否已改變(例如減小或增加)表達CD80和/或CD86的細胞的數(shù)目。可使用本發(fā)明方法診斷的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些實施例中，組織或體液為外周血液、外周血液白血球、活檢組織(例如乳房或淋巴結(jié)活檢體)和組織。10.使用CTLA4蛋白的治療方法10. I臨床益處本發(fā)明CTLA4蛋白與抗原呈遞細胞上的⑶80和/或⑶86相互作用且調(diào)控T細胞與⑶80/⑶86陽性細胞的相互作用。因此，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療涉及T細胞與⑶80/CD86陽性細胞(包括抗原呈遞細胞)的相互作用調(diào)節(jié)異常的病理學病況。
如以上章節(jié)5. I中所述，在某些實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對⑶80和CD86具有不同結(jié)合親和力。在其它實施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80與CD86兩者具有類似結(jié)合親和力。⑶80和⑶86與T細胞表面蛋白質(zhì)(例如⑶28和CTLA4)結(jié)合且引發(fā)不同生物效應。舉例來說，⑶86與天然T細胞上的⑶28結(jié)合可引發(fā)T細胞反應。因此，例如通過投與對CD86具有高或中性結(jié)合親和力的本發(fā)明的變體CTLA4多肽抑制或減少⑶86與⑶28的結(jié)合可抑制T細胞反應的起始且導致T細胞無反應性。此外，⑶80與CTLA4的結(jié)合可終止T細胞反應。因此，例如通過投與對CD80具有高或中性結(jié)合親和力的本發(fā)明的變體CTLA4多肽抑制或減少⑶80與T細胞上的CTLA4的結(jié)合可阻斷反應的終止且延長T細胞反應。因此，在某些實施例中，對⑶80具有高結(jié)合親和力且對⑶86具有低結(jié)合親和力的變體CTLA4多肽，或?qū)D80具有中性結(jié)合親和カ且對CD86具有低結(jié)合親和力的變體CTLA4多肽適用于治療要求T細胞介導的細胞殺滅增強的病況，例如癌癥。在其它實施例中，對CD86具有高親和カ或中性結(jié)合親和カ且對CD80具有低親和カ的變體CTLA4蛋白，或?qū)D80與CD86兩者均具有高結(jié)合親和力的變體CTLA4蛋白適用于治療由T細胞介導的細 胞殺滅增強所引起的病況，例如自身免疫疾病、或組織、器官或細胞移植排斥反應。在某些實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療贅生物。本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療腫瘤，包括癌癥和良性腫瘤。本文中待治療的癌癥的實例包括(但不限干)黑素瘤、乳癌、前列腺癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌。所述癌癥的更特定實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)和各種類型的頭頸部癌，以及多發(fā)性骨髄瘤、B細胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL);小淋巴細胞性(SL)NHL;中度/濾泡性NHL ;中度彌漫性NHL ;重度免疫母細胞性NHL ;重度淋巴母細胞性NHL ;重度小無裂細胞NHL ;巨瘤癥性 NHL (bulky disease NHL);套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS相關(guān)的淋巴瘤；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’s Macroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病(Hairy cellleukemia)、慢性骨髓母細胞白血病、和移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)、以及與母斑病(phakomatosis)、水腫(例如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和梅格斯氏綜合癥(Meigs’syndrome)相關(guān)的異常血管增生。更具體說來，可用本發(fā)明CTLA4蛋白治療的癌癥包括⑶80和/或⑶86陽性癌癥。在一些實施例中，適用于癌癥治療的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD80具有高親和カ且對CD86具有低親和力。在其它實施例中，適用于癌癥治療的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD80具有中性親和カ且對⑶86具有低親和カ。在某些方面，癌癥治療方法包括在向患者投與本發(fā)明CTLA4蛋白的步驟之前，檢測癌細胞上的CD80和/或CD86的步驟。所述檢測步驟可通過所屬領(lǐng)域中已知的用于測量癌細胞上的CD80和/或CD86蛋白質(zhì)含量的任何方法(包括(但不限于)免疫組織化學分祈)來達成。在某些實施例中，可使用經(jīng)標記的抗CD80和/或抗CD86抗體進行免疫組織化學分析。
在各種實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療自身免疫疾病。在一些實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用治療患有自身免疫疾病的患者，其先前尚未針對所述疾病進行治療。在其它實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療患有自身免疫疾病且對用甲氨蝶呤、疾病改善抗風濕病藥物或抗TNFa拮抗劑的治療反應不充分的患者。在各種實施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療選自類風濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病。在一些實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療選自強直性脊柱炎、硬皮病、多發(fā)性硬化癥和全身性紅斑狼瘡癥的自身免疫疾病。更具體說來，本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療選自以下的自身免疫疾病急性播散性腦脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis,ADEM)、急性壞死性出血腦白質(zhì)炎、艾迪森氏病(Addison’s disease)、無Y球蛋白血癥、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、斑形脫發(fā)、淀粉樣變性、強直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗磷脂綜合癥(APS)、自身 免疫再生不能性貧血、自身免疫自主神經(jīng)障礙、自身免疫肝炎、自身免疫高脂質(zhì)血癥、自身免疫免疫缺乏、自身免疫內(nèi)耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫視網(wǎng)膜病、自身免疫血小板減少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura,ATP)、自身免疫甲狀腺病、軸索和神經(jīng)兀神經(jīng)病(axonal & neuronal neuropathies)、巴洛病(Balo disease)、白塞氏病(Behcet’s disease)、大皰性類天皰瘡、心肌病、卡斯曼病(Castleman disease)、口炎性腹瀉(非熱帶性)、卻格司氏病(Chagas disease)、與慢性疲勞綜合癥或肌肉纖維疼痛相關(guān)的自身免疫病況、慢性發(fā)炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病(chronic inflammatorydemyelinating polyneuropathy, CIDP)、慢性復發(fā)性多灶性骨髄炎(CRMO)、謝格-司托司綜合癥(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性類天皰瘡(cicatricial pemphigoid) / 良性粘膜性類天皰瘡、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、科根氏綜合癥(Cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心臟傳導阻滯、科沙奇病毒心肌炎(coxsackie myocarditis) > CREST病、原發(fā)性混合冷球蛋白血癥、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、德維克氏病(Devic’s disease)(視神經(jīng)脊髄炎)、盤狀狼瘡、德雷斯勒氏綜合癥(Dressier’s syndrome)、子宮內(nèi)膜組織異位癥、嗜伊紅血球筋膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、實驗性過敏腦脊隨炎、埃文斯綜合癥(Evans syndrome)、纖維性肺泡炎、巨細胞動脈炎(顳動脈炎)、腎小球腎炎、古巴士德氏綜合癥(Goodpasture’ssyndrome)、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、古立安-白瑞綜合癥(Guillain-Barresyndrome)、橋本氏腦炎(Hashimoto's encephalitis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、溶血性貧血、亨-舍ニ氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊振皰疫、低Y-球蛋白血癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病變、免疫調(diào)節(jié)脂蛋白、包涵體肌炎、胰島素依賴性糖尿病(第I型)、間質(zhì)性膀胱炎、幼年性關(guān)節(jié)炎、幼年性糖尿病、川崎綜合癥(Kawasaki syndrome)、蘭伯特-伊頓綜合癥(Lambert-Eaton syndrome)、溶白血球血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質(zhì)性結(jié)膜炎、線性IgA疾病(LAD)、狼瘡(SLE)、萊姆病(Iymedisease)、美尼爾氏病(Meniere’s disease)、顯微多血管炎、混合結(jié)締組織病(MCTD)、莫倫氏潰瘍(Mooren’s ulcer)、姆查-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、發(fā)作性睡病、視神經(jīng)脊髄炎(參看德維克氏病)、嗜中性球減少癥、眼瘢痕類天皰瘡、視神經(jīng)炎、反復性風濕病、PANDAS(與鏈球菌(Streptococcus)相關(guān)的嬰兒自身免疫神經(jīng)精神病癥)、副腫瘤性小腦退化、陣發(fā)性夜間血紅素尿(paroxysmal nocturnalhemoglobinuria, PNH)、帕里羅伯格綜合癥(Parry Romberg syndrome)、帕森那-特納綜合癥(Parsonnage-Turner syndrome)、睫狀體平坦部炎(外周性眼色素層炎)、天皰瘡(pemphigus)、外周神經(jīng)病、靜脈周腦脊髓炎、惡性貧血、POEMS綜合癥、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動脈炎、第I型、第II型和第III型自身免疫多腺體綜合癥、風濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎、心肌梗塞后綜合癥、心包切開后綜合癥、孕酮性皮炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性肺纖維化、壞疽性膿皮病、單純紅血球形成不全、雷諾氏綜合癥(Raynauds phenomenon)、反射交感性營養(yǎng)不良、萊特氏綜合癥(Reiter’s syndrome)、復發(fā)性多軟骨炎、腿不寧綜合癥、腹膜后纖維化、風濕熱、類風濕性關(guān)節(jié)炎、類肉瘤病、史密德綜合癥(Schmidt syndrome)、鞏膜炎、硬皮病、休格連氏綜合癥(Sjogren’s syndrome)、精子和睪丸自身免疫性、僵人綜合癥、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、高安氏動脈炎(Takayasu’ s arteritis)、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血小板減少性紫癜(TTP)、托洛薩-亨特綜合癥(Tolosa-Hunt syndrome)、橫貫性脊髄炎、潰瘍性結(jié)腸炎、未分化結(jié)締組織疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、大皰性皮膚病、白斑癥和韋格納氏肉芽腫病(Wegener’sgranulomatosis)。在某些實施例中，適用于治療自身免疫疾病的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有高親和カ且對CD80具有低親和力。在其它實施例中，適用于治療自身免疫疾病的本發(fā)明變體 蛋白質(zhì)對CD86具有中性親和カ且對CD80具有低親和力。在其它實施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對⑶86與⑶80兩者均具有高親和力。在各種實施例中，本發(fā)明CLTA4蛋白質(zhì)適用于治療細胞、器官和組織移植物的排斥反應、移植物抗宿主疾病和/或適用于誘導患有第I型糖尿病的患者的異種移植耐受性，例如胰島異種移植耐受性。在一些實施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有高親和カ且對CD80具有低親和カ。在其它實施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有中性親和カ且對CD80具有低親和カ。在其它實施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86與CD80兩者均具有高親和カ。在一些實施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療由依賴于T細胞活化的病毒増殖引起的感染。所述病毒包括(但不限于)HTLV-I、HIV-I和HIV2病毒。因此，本發(fā)明提供治療有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含向所述患者投與本發(fā)明CTLA4蛋白。任選地，例如在以下時間之后重復所述投藥I天、2天、3天、5天、I周、2周、3周、I個月、5周、6周、7周、8周、2個月或3個月。可以相同劑量或不同劑量重復投藥。可重復投藥I次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。舉例來說，根據(jù)某些給藥方案，患者接受CTLA4療法持續(xù)一段較長時期，例如6個月、I年或I年以上。在各種實施例中，CTLA4療法的時期與無CTLA4療法的時期交替。在某些實施例中，向患者投與的蛋白質(zhì)的量為治療有效量。如本文所用，“治療有效”量的CTLA4蛋白可以單次劑量投與或歷經(jīng)治療方案的過程投與，例如歷經(jīng)I周、2周、3周、I個月、3個月、6個月、I年或I年以上的過程。示范性治療方案描述于以下章節(jié)5. 8. 4中。在某些實施例中，CTLA4療法在疾病發(fā)作時或接近疾病發(fā)作時開始，例如在疾病發(fā)作之后I天到6個月開始。在一些實施例中，CTLA4療法在疾病已進展之后開始，例如在疾病發(fā)作之后6個月到I年、2年、或3年開始。在其它實施例中，CTLA4療法在疾病緩解期內(nèi)投與。在其它實施例中，CTLA4療法在疾病活動期內(nèi)投與。投與CTLA4療法的時序?qū)⒁曀鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的因素而定，例如疾病性質(zhì)和CD28-CD80/CD86共刺激途徑在所治療疾病中的作用。
根據(jù)本發(fā)明，治療疾病涵蓋治療已經(jīng)診斷為患有任何形式的處于任何臨床階段或表現(xiàn)形式的疾病的患者；延遲疾病癥狀或征象的發(fā)作或發(fā)展或加重或惡化；和/或防止和/或減輕疾病的嚴重性。本發(fā)明CTLA4蛋白所投與的“個體”或“患者”較佳為哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)。在某些實施例中，個體或患者為人類。在某些方面，人類為成人患者。在其它方面，人類為嬰兒患者。10. 2醫(yī)藥組合物和投藥途徑本文提供包含本發(fā)明CTLA4蛋白、任選的ー種或ー種以上其它治療劑(例如以下章節(jié)5. 8. 3中所述的組合治療劑)的組合物。組合物通常將作為一般將包括醫(yī)藥學上可接受的載劑的無菌醫(yī)藥組合物的一部分來提供。這種組合物可呈任何適合形式(視將其投與患者的所要方法而定)。本發(fā)明CTLA4蛋白可通過多種途徑投與患者，所述途徑例如經(jīng)ロ、透皮、皮下、鼻 內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、局部、鞘內(nèi)和腦室內(nèi)。在任何給定情況下，最適合的投藥途徑均將視特定蛋白質(zhì)、個體、和疾病的性質(zhì)和嚴重性以及個體的身體狀況而定。對于治療本文所述的適應癥，本發(fā)明CTLA4蛋白的有效劑量經(jīng)單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥可在約O. lmg/kg到約75mg/kg的范圍內(nèi)，或經(jīng)單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥達到O. 01 μ g/ml到5000 μ g/ml血清濃度的血清濃度，或其中任何有效范圍或值，視所治療的病況、投藥途徑以及個體的年齡、重量和狀況而定。在某些實施例中，例如對于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，各劑量可在每公斤體重約O. 2mg到約50mg，例如每公斤體重約O. 5mg到約20mg的范圍內(nèi)。CTLA4蛋白可調(diào)配成水溶液且通過輸注投與。醫(yī)藥組合物宜呈每劑量含有預定量的本發(fā)明CTLA4蛋白的單位劑型。這種單位可含有例如(但不限于)0. Img到5g,例如Img到lg、100mg到500mg、或IOmg到50mg。用于本發(fā)明中的醫(yī)藥學上可接受的載劑可呈現(xiàn)多種形式，視例如待治療的病況或投藥途徑而定?？赏ㄟ^混合具有所要純度的蛋白質(zhì)與所屬領(lǐng)域中常用的任選的醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(其在本文中皆稱為“載劑”)，即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐剤、等張齊U、非離子清潔劑、抗氧化劑和其它雜項添加剤，將本發(fā)明CTLA4蛋白的治療調(diào)配物制備成凍干調(diào)配物或水溶液以供儲存。參看雷明頓藥物科學(Remington’s PharmaceuticalSciences),第16版(奧斯陸(Osol)編1980)。所述添加劑在所用劑量和濃度下對接受者必須無毒。緩沖劑有助于維持pH值在接近生理條件的范圍內(nèi)。其可以約2mM到約50mM范圍內(nèi)的濃度存在。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機酸與無機酸和其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸ニ鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、丁ニ酸鹽緩沖液(例如丁ニ酸-丁ニ酸單鈉混合物、丁ニ酸-氫氧化鈉混合物、丁ニ酸-丁ニ酸ニ鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯ニ酸鹽緩沖液(例如反丁烯ニ酸-反丁烯ニ酸單鈉混合物、反丁烯ニ酸-反丁烯ニ酸ニ鈉混合物、反丁烯ニ酸單鈉-反丁烯ニ酸ニ鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和こ酸鹽緩沖液(例如こ酸-こ酸鈉混合物、こ酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液和三甲胺鹽(例如 Tris)?？商砑臃栏瘎┮宰柚刮⑸锷L，且其添加量可在0.2%-l%(w/v)范圍內(nèi)。適用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酷、對羥基苯甲酸丙酷、氯化十八基ニ甲基苯甲基銨、節(jié)燒銨(benzalconium)齒化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六輕季銨(hexamethonium chloride),和對輕基苯甲酸燒酯(例如對輕基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酷)、兒茶酚、間苯ニ酚、環(huán)己醇和3-戊醇?？商砑拥葟垊?有時稱為“穩(wěn)定劑”)以確保本發(fā)明的液體組合物的等張性，且等張劑包括多元糖醇，例如三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨醇和甘露醇。穩(wěn)定劑是指一大類賦形劑，其功能范圍可為膨脹劑到使治療劑溶解或有助于防止變性或粘著于容器壁的添加剤。典型穩(wěn)定劑可為多元糖醇(以上列挙)；氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-白氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖或糖醇，例如乳糖、巖藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳 糖醇、甘油等，包括環(huán)醇(cyclitols)，例如肌醇；聚こニ醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基こ酸鈉、硫甘油、α-單硫甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如具有10個或10個以下殘基的肽)；蛋白質(zhì)，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚こ烯吡咯烷酮；單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；ニ糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；和三糖，例如棉子糖；和多糖，例如葡聚糖。穩(wěn)定劑可以姆重量份活性蛋白質(zhì)O. I到10,000重量的范圍內(nèi)存在?？商砑臃请x子表面活性劑或清潔劑(也稱為“濕潤劑”)以有助于使治療劑溶解以及保護治療蛋白質(zhì)以免發(fā)生攪拌引起的聚集，其也允許調(diào)配物暴露于承受應カ的剪切面而不導致蛋白質(zhì)變性。適合的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamers) (184、188等)、氧化異丙烯多元醇(Pluronic polyols)、聚氧こ烯山梨糖醇酐單醚(TWEEN _20、TWEEN _80等)。非離子表面活性劑可以約0. 05mg/ml到約
I.0mg/ml,例如約0. 07mg/ml到約0. 2mg/ml的范圍存在。其它雜項賦形劑包括膨脹劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶剤。本文調(diào)配物除本發(fā)明CTLA4蛋白外還可含有組合治療劑。適合的組合治療劑的實例提供于以下章節(jié)5.8.3中。通過輸注投藥的給藥時程可在每6個月I次到毎日I次之間變化，視許多臨床因素而定，包括疾病類型、疾病嚴重性和患者對CTLA4蛋白的敏感性。待投與的本發(fā)明CTLA4蛋白的劑量將根據(jù)以下而變化特定抗體、疾病類型、個體、和疾病嚴重性、個體的身體狀況、治療方案(例如是否使用組合治療劑)和所選投藥途徑；所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當劑量。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應了解，本發(fā)明CTLA4蛋白的最佳量、和個別劑量的間隔將由所治療病況的性質(zhì)和程度、投藥形式、途徑和部位、以及所治療特定個體的年齡和狀況決定，且醫(yī)師將最終確定待使用的適當劑量。可適當?shù)囟啻沃貜瓦@個劑量。如果顯現(xiàn)副作用，則可根據(jù)正常臨床實踐來改變或降低給藥的量和/或頻率。10. 3組合療法以下描述可利用本發(fā)明CTLA4蛋白的組合方法。本發(fā)明的組合方法涉及向患者投與至少兩種藥劑，第一藥劑為本發(fā)明CTLA4蛋白，且第二藥劑為組合治療劑。CTLA4蛋白與組合治療劑可同時、依序或分別投與。本發(fā)明的組合治療方法可產(chǎn)生比累加效應大的效應，從而提供治療益處，其中CTLA4蛋白或組合治療劑均不以單獨治療有效的量投與。在本發(fā)明方法中，本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可并行(同時或依次)投與。如本文所用，如果本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑在同一天(例如在相同患者就診期間)投與患者，則認為其為依次投與。依次投藥可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時進行。相比之下，如果本發(fā)明CTLA4抗體和組合治療劑在不同天投與患者，例如本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可以I天、2天或3天、I周、2周或I個月時間間隔投與，則認為其為分別投與。在本發(fā) 明的方法中，投與本發(fā)明CTLA4蛋白可在投與組合治療劑之前或之后進行。作為非限制性實例，本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可并行投與一段時期，隨后的第二時期中交替投與本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑。由于投與本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑具有潛在協(xié)同效應，所以所述藥劑可以在単獨投與所述藥劑中的一或兩者時不具治療有效性的量投與。在某些方面，組合治療劑為化學治療劑、抗風濕病藥物、消炎剤、放射線治療劑、免疫抑制劑或細胞毒性藥物。用于本文所述的組合療法中的抗風濕病藥物包括(但不限干)阿那白滯素(,anakinra)、金諾芬(auranofin)、硫唑嘌冷(azathioprine)、氣奎(,chloroquine)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、輕氯喹(hydroxychloroquine)、硫代苯酸金鈉(Myocrisin)、柳氮石黃月安卩比唳甲氨蝶呤(,sulfasalazine methotrexateノ 、環(huán) 舞酉先月安(eyeIophospnamide)、來M米特(Ieflunomide)和ニ甲胺四環(huán)素(minocycline)。在某些實施例中，抗風濕病藥物為TNF-α拮抗劑，包括(但不限干)以下藥劑例如英利昔單抗(infliximab) (REM丨CADE ;森特考公司(Centocor))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA :雅培公司(Abbott))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；戈利木單抗(golimumab) (SIMP0NI ;森特考公司(Centocor))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；塞妥珠單抗(certolizumab pegol) ( C1MZIA ,UCB)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；依那西普(etanercept) ( ENBREL ，安進公司(Amgen))或其片段、衍生物或類似物；IL_10 ;沙立度胺(thalidomide);黃嘌呤衍生物,例如配妥西菲林(pentoxifylline);和安非他酮(Bupropion) ( WELLBUTR丨N :,葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline))。對于治療癌癥，癌癥疫苗可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適合的癌癥疫苗包括靶向?qū)е掳┌Y的病毒的癌癥疫苗，例如用于肝癌的B型肝炎疫苗和用于子宮頸癌的人類乳頭狀瘤病毒疫苗(Gardasil 和Cervarix )?？膳c本發(fā)明方法組合使用的其它癌癥疫苗包括(但不限干)用于前列腺癌的Provenge (登來隆公司(Dendreon)，華盛頓西雅圖(Seattle WA))和GVAX 、用于黑素瘤的OncoVex—'BioVex生物公司(BioVex)，馬薩諸塞州沃本(Woburn MA))、用于非小細胞肺癌的Lucanix 、用于乳癌的Stimuvax 、和用于腎癌的Oncophage (安進克斯公司(Antigenics),馬薩諸塞州萊克星頓(Lexington MA))。在某些實施例中，癌癥疫苗在投與本發(fā)明CTLA4多肽之前投與。對于治療癌癥、自身免疫疾病或移植物排斥反應，消炎剤可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適用于本文所述的方法中的消炎剤包括(但不限干)布洛芬、阿司匹林、萘普生、ニ氟尼柳、酮洛芬、萘丁美酮、吡羅昔康、雙氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、依托度酸、酮洛酸、11 惡丙嗪、塞來昔布、こ酰胺苯酹、苯海拉明(diphenhydramine)、哌替唳(meperidine)、地塞米松、頗得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、安腸克(asacol)、憐酸可待因(codeine phosphate)、貝諾酯(benorylate)和芬布芬(fenbufen)。對于治療自身免疫疾病或移植物排斥反應，免疫抑制劑可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適用于本文所述的方法中的免疫抑制劑包括(但不限干)氫皮質(zhì)酮；潑尼松；潑尼龍；甲潑尼龍；地塞米松；倍他米松；曲安西龍；倍氯米松；こ酸氟氫皮質(zhì)酮；こ酸脫氧皮質(zhì)酮；醛固酮；環(huán)磷酰胺；亞硝基脲；鉬化合物；甲氨蝶呤；硫唑嘌呤；巰基嘌呤；嘧啶類似物；蛋白質(zhì)合成抑制劑；放線菌素D ;蒽環(huán)霉素；絲裂霉素C ;博萊霉素；光神霉素；雷 帕霉素；環(huán)孢素；他克莫司；西羅莫司；霉酚酸；咪唑立賓(mizoribine) ;15_去氧斯匹胍素(15-deoxyspergualin);霉酹酸嗎啉こ酯(MMF);抗胸腺細胞球蛋白(anti-thymocyteglobulin);抗CD20抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL2受體抗體(達利珠單抗、巴利昔單抗)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；卡普司-IH;抗Ci4P1整合素抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL-15抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL-6受體抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD3抗體(莫羅單抗)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗MHC抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD2抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD4抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CDlla/CD18抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD7抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD27抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD80和/或抗CD86抗體(例如 ATCC HB-253、ATCC CRL_2223、ATCC CRL_2226、ATCC HB-30 UATCC HB-11341 等)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗0040抗體(例如ATCC HB-9110)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD45抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD58抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD137抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗ICOS抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD150抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗0X40抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗4-1BB抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；和低分子量粘著拮抗劑，例如LFA-I拮抗劑、選擇素拮抗劑和VLA-4拮抗劑。用于本文所述的組合方法中的其它免疫調(diào)節(jié)化合物包括(但不限干)可溶性gp39(也稱為CD40配體(CD40L)、CD 154、T-BAM、TRAP)、可溶性⑶29、可溶性⑶40、可溶性CD80 (例如ATCC 68627)、可溶性CD86、可溶性CD28 (例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-I、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-I、可溶性LECAM-I、可溶性ELAM-1、可溶性 CD44、可與 gp39 反應的抗體(例如 ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 和 ATCCHB-12056)、可與 CD28 反應的抗體(例如 ATCC HB-11944 或mAb 9. 3，如由馬丁 (Martin)等人(臨床免疫學雜志(J. Clin. Immun.) 4 (I) :18-22, 1980)所述、可與LFA-I反應的抗體(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)、可與LFA-2反應的抗體、可與IL-12反應的抗體、可與IFN- Y反應的抗體、可與⑶48反應的抗體、可與任何ICAM反應的抗體(例如ICAM-I (ATCCCRL-2252)、ICAM-2 和 ICAM-3)、可與 CTLA4 反應的抗體(例如 ATCC HB-304)、可與 Thy-I 反應的抗體、可與CD56反應的抗體、可與CD29反應的抗體、可與TCR反應的抗體、可與VLA-4反應的抗體、可與VCAM-I反應的抗體、可與LECAM-I反應的抗體、可與ELAM-I反應的抗體、可與⑶44反應的抗體。對于治療癌癥，化學治療劑可適合與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。化學治療劑包括(但不限干)放射性分子；毒素，也稱為細胞毒素或細胞毒性劑，其包括任何對細胞活力有害的藥劑；含有化學治療化合物的藥劑和脂質(zhì)體或其它微脂粒。適合的化學治療劑的實例包括(但不限干)1_去氫睪酮、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿德カ霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整合素抗體、燒基化劑、別嘌呤醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、安美達錠(anastrozole)、氨茴霉素(AMC))、抗有絲分裂劑、順ニ氯ニ胺鉬(II) (DDP)順鉬)、ニ氨基ニ氯鉬(diamino dichloro platinum)、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、抗生素、抗代謝物、天冬酰胺酶(asparaginase)、BCG活體(膀胱內(nèi))、倍他米松憐酸鈉(betamethasone sodium phosphate)和こ酸倍他米松(betamethasone acetate)、比卡魯胺(bicalutamide)、硫酸博萊霉素(bleomycin sulfate)、白消安、甲酰四氫葉酸I丐(calcium leucouorin)、卡奇霉素、卡培他濱(capecitabine)、卡鉬(carboplatin)、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱(Cladribine)、秋水仙堿、結(jié)合雌激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺(Cyclothosphamide)、阿糖胞苷、阿糖胞苷、細胞遲緩素B、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素D (dactinomycin,先前為actinomycin)、鹽酸道諾霉素、朽1檬酸道諾霉素、地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、ニ溴甘露醇、ニ輕基炭疽菌素ニ酮、多西他賽(Docetaxel)、甲磺酸多拉司瓊(dolasetron mesylate)、鹽酸阿霉素、屈大麻酹(dronabinol)、大腸桿菌L-天冬酰胺酶(E. coli L-asparaginase)、伊洛昔單抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-a (epoetin- α )、伊文氏桿菌屬L-天冬酰胺酶(ErwiniaL-asparaginase)、酯化雌激素、雌ニ醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化こ錠、こ烯雌ニ醇(ethinylestradiol)、依替勝酸鹽(etidronate)、依托泊苷嗜澄菌因子(etoposide citrororumfactor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達拉賓(fludarabine phosphate)、氟尿卩密唳、氟他月安(fIutamide)、醒葉酸(folinicacid)、鹽酸吉西他濱、糖皮質(zhì)激素、こ酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短桿菌肽D、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCL)、輕基脲、鹽酸黃膽素(idarubicin HCL)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、干擾素 a-2b、鹽酸伊立替康(irinotecan HCL)、來曲唑(Ietrozole)、甲酰四氫葉酸I丐(leucovorin calcium)、こ酸亮丙立德(leuprolide acetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫司汀、類美登素(maytansinoid)、鹽酸ニ氯甲基ニこ胺(mechlorethamine HCL)、こ酸甲輕助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、こ酸甲地孕酮(megestrol acetate)、鹽酸美法侖(melphalan HCL)、硫醇嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睪固酮、光神霉素、絲裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特(niIutamide)、こ酸奧曲月太(octreotide acetate)、鹽酸昂丹司瓊(ondansetronHCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米勝酸ニ鈉(pamidronate disodium)、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸毛果蕓香素(pilocarpine HCL)、批利霉素(plimycin)、以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑(polifeprosan 20 with carmustine implant)、ロ卜非姆鈉(porfimer sodium)、普魯卡因、鹽酸丙卡巴肼(procarbazine HCL)、普萘洛爾(propranolol)、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈佐霉素(streptozotocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、替尼泊式(teniposide)、特諾波賽(tenoposide)、辜內(nèi)酉旨(testolactone)、四卡因(tetracaine)、喔替喊苯丁酸氣芥(thioepa chlorambucil)、硫鳥嘌呤、噻替哌、鹽酸拓樸替康(topotecan HCL)、朽1檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、維甲酸(tretinoin)、戍柔比星(valrubicin)、硫酸長春堿(vinblastine sulfate)、硫酸長春新堿(vincristine sulfate)和酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)。有時，對于治療癌癥，也向患者投與ー種或ー種以上細胞激素可為有益的。在ー較佳實施例中，CTLA4蛋白與生長抑制劑共投與。生長抑制劑的適合劑量為目前所用的劑 量且可由于生長抑制劑與CTLA4蛋白的組合作用(協(xié)同作用)而減小。10. 4治療方案本發(fā)明提供涉及投與本發(fā)明CTLA4_Ig融合蛋白的治療方案。治療方案將視患者的年齡、重量和疾病病況而變化。治療方案可持續(xù)2周到無限期。在具體實施例中，治療方案持續(xù)2周到6個月、3個月到5年、6個月到I或2年、8個月到18個月等。治療方案可為不變劑量方案或多變劑量方案。對于下述劑量示范性方案，CTLA4_Ig融合蛋白可以用于靜脈內(nèi)輸注的不含防腐劑的無菌溶液的形式投與。對于治療重量小于60kg的成人的類風濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以50mg到750mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實施例中，初始劑量為100_600mg、250-500mg、300-550mg、350-500mg、50-250mg、或 400_600mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為 50-750mg，例如 100-600mg，例如 250_500mg，例如 300_550mg，例如 50_250mg，或劑量為400_600mgo對于治療重量介于60kg與100kg之間的成人的類風濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4_Ig融合蛋白以75mg到I OOOmg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實施例中，初始劑量為100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或 600_800mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為75-900mg，例如100-850mg，例如250_800mg，例如300_750mg，例如400-700mg,例如 75_500mg,例如 500-1000mg,或例如 600-800mg。對于治療重量大于IOOkg的成人的類風濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4_Ig融合蛋白以IOOmg到1500mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實施例中，初始劑量為250_1250mg、500-1100mg、750-1000mg、100_800mg、250_900mg、或 700_1200mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為IOOmg 到 1500mg,例如 250-1250mg,例如 500-1 IOOmg,例如 750-1000mg,例如 100-800mg,例如 250-900mg,或例如 700-1200mg。對于治療年齡介于6歲與17歲之間且重量小于75kg的患者的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以O. I到15mg/kg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實施例中，初始劑量為 O. 2-12. 5mg/kg、0. 5_12mg/kg、1-10. 5mg/kg、2-10mg/kg、3_9mg/kg、或4-8. 5mg/kg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后姆4周靜脈內(nèi)投與，齊Li量為O. I到15mg/kg,例如O. 2-12. 5mg/kg、0. 5_12mg/kg、1-10. 5mg/kg、2-10mg/kg、3_9mg/kg、或 4-8. 5mg/kg。對于治療年齡為6歲到17歲且重量大于75kg的患者的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以75mg到IOOOmg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實施例中，初始劑量為 100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或 600_800mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為75-900mg，例如100_850mg，例如250_800mg，例如300_750mg，例如400-700mg，例如75-500mg，例如500_1000mg，或例如600_800mg。在這些實施例中，最大劑量不應超過lOOOmg。在某些實施例中，本發(fā)明CTLA4_Ig融合蛋白用于治療對甲氨蝶呤療法或?qū)κ褂?抗TNFa藥劑(例如依那西普(Enbrei )、英利昔單抗(Remicade )、阿達木單撤Humka )、塞妥珠單抗(Cimzia )、或sTNFR-IgG(來那西普(Ienerc^pt)))的療法反應不充分的類風濕性關(guān)節(jié)炎患者。10. 5診斷和醫(yī)藥試劑盒本發(fā)明涵蓋含有本發(fā)明CTLA4蛋白(包括CTLA4蛋白的結(jié)合物)的醫(yī)藥試劑盒。醫(yī)藥試劑盒為包含本發(fā)明CTLA4蛋白(例如呈凍干形式或呈水溶液形式)和ー種或ー種以上以下物質(zhì)的包裝·組合治療劑，例如如以上章節(jié)5. 8. 3中所述；·用于投與CTLA4蛋白的裝置，例如筆、針和/或注射器；和·如果蛋白質(zhì)呈凍干形式，則用于再懸浮抗體的醫(yī)藥級水或緩沖液。在某些方面，分別包裝各單位劑量的CTLA4蛋白，且試劑盒可含有ー個或ー個以上單位劑量(例如2個單位劑量、3個單位劑量、4個單位劑量、5個單位劑量、8個單位劑量、10個單位劑量或10個以上單位劑量)。在一具體實施例中，所述ー個或ー個以上單位劑量各自收納于注射器或筆中。本文還涵蓋含有本發(fā)明CTLA4蛋白(包括蛋白質(zhì)結(jié)合物)的診斷試劑盒。診斷試劑盒為包含本發(fā)明CTLA4蛋白(例如呈凍干形式抑或呈水溶液形式)和ー種或ー種以上適用于執(zhí)行診斷分析的試劑的包裝。當CTLA4蛋白用酶標記吋，試劑盒可包括為所述酶所需的底物和輔因子(例如提供可檢測發(fā)色團或熒光團的底物前體)。此外，可包括其它添加齊U，例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或溶解緩沖液)等。在某些實施例中，包括于診斷試劑盒中的CTLA4蛋白是固定于固體表面上，或在試劑盒中包括上面可固定蛋白質(zhì)的固體表面(例如載片)?？纱蠓淖兏鞣N試劑的相對量以提供溶液中實質(zhì)上使分析敏感度最佳化的試劑濃度。在一具體實施例中，蛋白質(zhì)和ー種或ー種以上試劑可以干粉(通常經(jīng)凍干)的形式提供(個別地或組合)，所述干粉包括溶解后將提供具有適當濃度的試劑溶液的賦形劑。實例I :鑒別對⑶80和⑶86具有親和カ的CTLA4-IG變體I.材料和方法
I. I.產(chǎn)生 CD80 和 CD86 蛋白⑶80和⑶86蛋白表達為單體分泌的融合蛋白。使⑶80或⑶86的細胞外域與含有Cys到Ser突變以破壞分子間雙硫鍵的人類λ恒定區(qū)融合(赤松(Akamatsu)等人，2007，免疫方法雜志(J Immunol. Methods) 327:40) 使 CD80-C λ 或 CD86-C λ 融合蛋白在 293Τ細胞的培養(yǎng)上清液中短暫表達。通過ELISA，使用山羊抗人類λ輕鏈抗體(生物資源公司(Biosource),卡馬里奧(Camarillo),加利福尼亞(CA))進行捕捉并使用結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人類λ鏈抗體(南方生物技術(shù)公司(Southern Biotech),伯明翰(Birmingham),亞拉巴馬州(AL))進行檢測,來估計這些融合蛋白的產(chǎn)生量。I. 2. CTLA4-Ig 變體與 CD80 和 CD86 的結(jié)合使融合有C λ -HA標簽的⑶80或⑶86與結(jié)合有山羊抗人類CX抗體的AlphaLISA 受體珠粒結(jié)合，且使經(jīng)生物素標記的阿巴西普與AlphaScreen 抗生蛋白鏈菌素涂覆的供體珠粒(拍金埃爾默公司(Perkin Elmer),沃爾瑟姆(Waltham),馬薩諸塞州(MA))結(jié)合。使用標準方法用硫基-NHS-生物素對阿巴西普進行生物素標記且在PBS中透 祈。通過遵循制造商的說明書(“AlphaLISA 分析開發(fā)指南”，珀金埃爾默公司(PerkinElmer)),執(zhí)行AlphaLISA 受體珠粒的結(jié)合。在384孔AlphaPlate (拍金埃爾默公司(Perkin Elmer))中在分析緩沖液(含1%BSA、0. 01%吐溫20的PBS(pH 7. I))中執(zhí)行結(jié)合分析。各孔含有0.5nM經(jīng)生物素標記的阿巴西普、從40nM起始以1:4連續(xù)稀釋的未標記CTLA4-Ig變體蛋白質(zhì)、0. 078 μ g/ml⑶80和5 μ g/ml結(jié)合山羊抗人類C λ的受體珠粒。在室溫下在黑暗中培育板I小吋。隨后以5μ g/ml添加抗生蛋白鏈菌素供體珠粒到各孔中。在室溫下在黑暗中將板再培育30分鐘，此后在EnVision讀取器(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))上進行讀取。利用軟件GRAPHPAD PRISM(GraphPad,圣地亞哥(San Diego))使用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。對于⑶86結(jié)合分析，如上所述在AlphaPlate中培育8nM經(jīng)生物素標記的阿巴西普、從IOOnM起始以1:4連續(xù)稀釋的未標記CTLA4-Ig變體蛋白質(zhì)、0. I μ g/ml⑶86和10 μ g/ml結(jié)合山羊抗人類C λ的受體珠粒，隨后添加10 μ g/ml抗生蛋白鏈菌素供體珠粒。I. 3.產(chǎn)生表達細胞表面⑶80或⑶86的細胞系將編碼全長人類⑶80和⑶86的基因亞克隆到適當哺乳動物表達載體中。用脂染胺(Lipofectamine) 2000 (英杰公司(Invitrogen))將含有 CD80 或 CD86 的 cDNA 的各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CH0-K1 (ATCC)細胞中且針對在含有0. 5mg/ml G418的F12K培養(yǎng)基(45%DMEM，45%F12K，10%FBS)中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進行選擇。通過FACS揀選⑶80或⑶86在細胞表面上的表達最高的1%單ー克隆且進行培養(yǎng)以產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系。證實兩個細胞系之間的表達量大致彼此相等。I. 4. CTLA4-Ig變體抑制Jurkat T細胞的IL-2產(chǎn)生的效能在10 μ g/ml PHA-P和滴定量的阿巴西普或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下培育Jurkat細胞(每孔3. O X IO5個)和穩(wěn)定表達CD80或CD86的CH0-K1 (每孔I. O X IO4個)。24小時后，使用AlphaLISA 人類IL-2試劑盒分析上清液以測量分泌的IL-2的量。2.結(jié)果利用AlphaLISA 證實關(guān)于CD80或CD86的結(jié)合的總計27個高親和力變體和4個中性親和カ變體。在19個對CD80具有高親和カ的CTLA4-Ig變體中，具有突變K28H的CTLA4-Ig變體顯示最高親和力，其結(jié)合親和カ是野生型CTLA4-Ig對⑶80的結(jié)合親和力的11. 9倍(圖2A)。在18個對⑶86具有高親和カ的CTLA4_Ig變體中，具有突變A29H的CTLA4-Ig變體顯示最高親和力，其結(jié)合親和カ是野生型CTLA4-Ig對⑶86的結(jié)合親和力的14. 2 倍(圖 2A)。突變A29Y和L104E為并入貝拉西普(LEA29，百時美施貴寶公司(Bristol-MyersSquibb))中的突變且在本分析中被再鑒別為高親和カ變體(圖3)。在AlphaLISA 分析中，貝拉西普顯示相較于野生型CTLA4-Ig，與⑶80和⑶86的結(jié)合分別改進22倍和32倍(數(shù)據(jù)未圖示)。 在無阻斷劑的典型24小時分析中，在由PMA和穩(wěn)定表達⑶80或⑶86的CHO-Kl細胞刺激的Jurkat T細胞的培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生2. 1-3. 5ng/ml IL-2。在例如CTLA4_Ig蛋白或抗⑶80或抗⑶86抗體等阻斷劑存在下，通過阻斷共刺激信號而抑制IL-2產(chǎn)生。在不存在PHA-P或?qū)τ贑D80或CD86表達呈陰性的CHO-Kl的情況下，Jurkat細胞不產(chǎn)生IL-2。類似地，在不存在Jurkat細胞的情況下，在培養(yǎng)的CHO-Kl的培養(yǎng)上清液中未檢測到IL-2 (圖4A)。 發(fā)現(xiàn)當Jurkat T細胞由PMA和表達⑶80或⑶86的CHO-Kl細胞刺激時，野生型CTLA4-Ig與阿巴西普的抑制曲線實質(zhì)上重疊(圖4B)。這ー結(jié)果指示野生型CTLA4-Ig和阿巴西普抑制Jurkat細胞產(chǎn)生IL-2的程度相同(即具有類似效能)。野生型CTLA4_Ig對⑶80和⑶86的平均IC5tl值分別測定為I. 2nM和17. 2nM。盡管相較于野生型CTLA4_Ig，貝拉西普中的兩個氨基酸突變使對CD80的結(jié)合改進22倍，但相較于野生型CTLA4-Ig或阿巴西普，貝拉西普關(guān)于抑制CD80介導的T細胞活化的效能僅顯示2. O倍的改進。相比之下，貝拉西普中所產(chǎn)生的CD86結(jié)合的32倍改進使得抑制CD86介導的T細胞活化的效能改進
11.5 倍。本發(fā)明CTLA4變體對⑶80的親和カ改進7. 2倍到11.9倍使得抑制⑶80介導的T細胞活化的效能改進I. I倍到2. 2倍。相比之下，本發(fā)明CTLA4變體對⑶86的親和カ改進7. O倍到14. 2倍使得抑制⑶86介導的T細胞活化的效能改進2. 4倍到6. 2倍。K28H和A29H CTLA4-Ig變體分別顯示對⑶80和⑶86的最高親和カ以及抑制T細胞活化的最高效能。因此，賦予與配體結(jié)合的較高親和力的突變通常使抑制T細胞活化的效能改進。同樣，具有中性親和カ的變體使生物活性無顯著差異(Y52F)。這些結(jié)果指示相較于野生型蛋白質(zhì)，對⑶86具有較高結(jié)合親和カ的變體相較于對⑶80具有較高結(jié)合親和カ的變體顯示較佳效能，這類似于關(guān)于貝拉西普獲得的結(jié)果。這一點可通過當基線結(jié)合親和カ較低時對生物活性具有較大影響的親合力效應來說明。野生型CTLA4-Ig對⑶80的結(jié)合親和力可能過高以致于不能通過親合力獲得進ー步改進。相比之下，野生型CTLA4-Ig對⑶86的親和カ比對⑶80的親和カ低13倍(克林斯(Collins)等人，2002,免疫學(Immunity) 17:201-210)，意味著CTLA4_Ig變體對CD86的親和カ可得到改進。親合力效應可見于關(guān)于具有突變L96K的CTLA4-Ig變體獲得的結(jié)果(圖4C)。盡管這種變體顯示⑶80結(jié)合親和力顯著降低(相較于野生型CTLA4-Ig，低10倍)，但這種變體的效能僅比野生型CTLA4-Ig的效能低2. 4倍，這是由于親合力對這種低親和カ變體的生物活性的影響增加之故。實例2 :評估CTLA4-IG變體抑制T細胞增殖的效能
I.材料和方法CTLA4_Ig變體體外抑制T細胞増殖反應的效能人類彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系SU-DHL_6(ATCC CRL-2959)在細胞表面上表達⑶80與⑶86兩者。將SU-DHL-6細胞維持于含有10%FBS的RPMI 1640中。通過如德國葛萊娜第一生化股份有限公司Leucosep (Leucosep Greiner Bio-One, Germany))的使用手冊■中所述的Ficoll-Paque Plus (通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare),皮斯卡塔市(Piscataway),新澤西州(NJ))密度梯度離心，從人類全血或白細胞層分離外周血液單核細胞(PBMC)。使用EasyS印陰性選擇人類CD4+T細胞增濃試劑盒(干細胞技術(shù)公司(STEMCELL Technologies),加拿大(Canada))從 PBMC 分離人類外周 CD4+T 細胞。將 T 細胞培養(yǎng)于含有10%熱失活FBS、β -巰基こ醇和100U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。所得培養(yǎng)物含有純度在90%以上的⑶4+。為了建立分析，將在50 μ L培養(yǎng)基中稀釋的不同濃度的CTLA4_Ig或其變體添加到圓底96孔微量滴定板的各孔中，一式三份。接著在150 μ L培養(yǎng)基中以5:1反應者-刺激物比率混合⑶4+Τ細胞(IX IO5個)與新鮮照射(10，000拉德(rad))的B淋巴瘤細胞系(2X IO4個)。添加細胞到含有CTLA4-Ig或變體的孔中，使得最終體積為每孔200 μし在 37°C下在5%C02中培育初級同種異體刺激分析物5天，以0. 5 μ Ci/孔添加氚化胸苷，再培養(yǎng)18小時。使用制造商推薦的條件用細胞收集器(Filtermate 0mnifilter-96收集器， 白金埃爾默公司(Perkin Elmer))收集細胞且使用閃爍計數(shù)器(沃拉克特里克斯(WallacTrilux))測量[3H]胸苷并入量。對于ニ級同種異體刺激分析，收集6天初級同種異體刺激的T細胞，通過Ficoll-Paque Plus密度梯度離心進行分離且在完全培養(yǎng)基中靜息24小吋。接著在CTLA4-Ig和其突變體存在下以如上的相同比率用新鮮照射的B淋巴瘤細胞再刺激T細胞3天。在37°C下培育二級刺激分析物2天，隨后添加0.5 μ Ci/孔的[3H]-胸苷，最后培養(yǎng)18小吋。如上文所指示執(zhí)行細胞收集。利用GraphPad Prism 5軟件，使用非線性回歸曲線擬合方法分析細胞増殖數(shù)據(jù)。為了評估CTLA4_Ig變體抑制經(jīng)同種異體抗原刺激的T細胞增殖的效能，用同種異體B細胞系SU-DHL-6 (對⑶80與⑶86均呈陽性)(通過FACS證實，數(shù)據(jù)未顯示)刺激經(jīng)純化的⑶4+T細胞。野生型CTLA4-Ig與商業(yè)阿巴西普的抑制曲線彼此緊密重疊，從而指示抑制CD4+T細胞中的增殖反應的效能相等。對CD80和/或CD86的結(jié)合改進的所有變體在初級和ニ級反應中均顯示較大的CD4+T細胞增殖反應抑制。對于初級和ニ級反應，觀測到IC50的改進分別在I. 5到20倍和I. 5到10倍的范圍內(nèi)(圖5和圖6)?？傊?，對⑶80和/或CD86的親和カ改進對CD4+T細胞的初級增殖反應的抑制作用大于ニ級反應，反映了記憶T細胞對ニ級反應的共刺激分子的依賴性降低(克洛夫特(Croft)等人，1997，重癥免疫學評論(Crit. Rev. Immunol.) 17:89)。在測試的8個變體中，A29H突變引起的抑制初級與ニ級增殖反應兩者的效能最大，分別約20倍和10倍。K28H突變次佳，其抑制初級和ニ級反應的效能分別改進約12倍和8倍(圖5和6。A29H突變顯示對⑶86的結(jié)合活性改進14倍，但與⑶80的結(jié)合僅改進
3.O倍。另ー方面，K28H突變體顯示對兩種配體的改進較為平衡，對⑶80和⑶86分別為12倍和9. 5倍(圖2A)。假定A29H和K28H突變的結(jié)合動力學和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相等，因為A29H突變引起的抑制初級與ニ級增殖反應兩者的改進最佳，所以增加對CD86的親和カ可對效能具有更大影響。
L96K突變使⑶80結(jié)合降低約11倍而使⑶86結(jié)合改進約11倍。對⑶86的結(jié)合較高同時對⑶80的結(jié)合降低的另ー實例為T51N(對⑶86為10倍而對⑶80為O. 25倍)。因為兩種變體均未顯示抑制初級或ニ級反應的效能降低，所以對CD80的結(jié)合喪失至少多達11倍似乎可由對⑶86的結(jié)合改進來補償。另ー種可能的解釋是，因為已知⑶80形成ニ聚體(池水(Ikemuzu)等人，2000，免疫學(Immunity) 12:51),所以親和カ喪失至少多達11倍可能對由CD80提供的親合力具有最小影響?？傊?，對任ー配體的親和カ較高皆使抑制同種異體抗原刺激中的増殖反應的效能改進，與使用Jurkat和表達⑶80或⑶86的CHO細胞系的24小時分析的結(jié)果一致(圖4)。CD80與CD86兩者均可促進初級和ニ級同種異體反應，但在涉及配體表達和其它共刺激/粘著分子的差異含量下有可能促進程度不同。具體實施例、參考文獻的引用本申請案中引用的所有公開案、專利、專利申請案和其它文獻出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度就如同已個別地將各個別公開案、專利、專利申請 案或其它文獻出于所有目的以引用的方式并入一般。盡管已說明且描述各種具體實施例，但應了解可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出各種變化。
權(quán)利要求
1.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID 勵1包含氨基酸取代1(28!1、429!1、了5謂、了51￥、し586、1(930、1(93皿和 L96K 中的ー個或ー個以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的變體CTLA4多肽，其包含氨基酸取代A29H。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的變體CTLA4多肽，其包含氨基酸取代K28H。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的變體CTLA4多肽，其包含氨基酸取代K28H。
5.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 K28H、K28T、A29H、T51Y、M53F、M53Y、L58G、L61H、L61Y、K93M和K93Q的氨基酸取代。
6.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 L58A、L58N、L58Q、L61A、K93V、L104H 和 L104Y 的氨基酸取代。
7.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 T30E、M54R、G55P、E57P、L58E、L58P、L58Y、L61F 和 L104I的氨基酸取代。
8.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括氨基酸取代K93I。
9.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少ー個選自L58H、L58K和D62H的氨基酸取代。
10.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括至少ー個選自M54W和M54Y的氨基酸取代。
11.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少ー個選自R33D和L61W的氨基酸取代。
12.—種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID勵1具有至少ー個選自ム291(、15謂、]\1531、し961(和し961 的氨基酸取代。
13.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少ー個選自G27A、Y52F、N56T和L104M的氨基酸取代。
14.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 P26I、P26L、P26M、P26Q、P26T、P26V、K28R、A29P、A29S、T30H、T30M、T30S、V32E、R33P、T51A、Y52H、Y52M、Y52W、M53D、M54D、M54G、M54H、M54L、G55D、G55H、G55T、N56A、N56F、N56G、N56H、N56I、N56K、N56L、N56M、N56Q、N56R、N56S、N56V、N56Y、E57A、E57D、E57H、E57K、E57M、E57N、E57Q、E57R、E57S、E57T、E57V、L58I、L58R、L58T、T59I、T59M、T59N、T59Q、T59R、T59S、T59V、L61E、L61I、L61M、L61T、L61V、D62R、D63E、D63G、D63H、D63T、K93G、V94G、V94I、E95W、P99H、P99T、P99L 和 Y102T 的氨基酸取代。
15.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 P26N、G27I、G27Q、G27W、K28E、K28I、K28M、K28P、K28Q、K28V、T30I、T30L、M53E、M53L、M53N、M54A、M54Q、M54S、L58D、L58V、T59H、T59K、T59L、T59P、L61D、L61G、L61Q、L61R、D62A、D62E、D62S、D63Q、D63S 和 K93R 的氨基酸取代。
16.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、 至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較 于 SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 P26R、G27D、G27P、A29N、T30K、E31D、E31G、E31P、E31R、E31T、V32G、V32H、V32T、R33E、R33G、R33I、R33M、R33N、R33Q、R33W、R33Y、T51E、T51G、T51I、T51V、Y52A、Y52D、Y52I、Y52K、Y52L、Y52Q、Y52R、Y52S、Y52T、M53H、M53P、M53S、G55A、G55I、G55L、G55N、G55Q、G55R、G55Y、E57G、E57I、E57W、E57Y、T59D、T59G、T59Y、F60D、F60G、F60H、F60L、D62G、D62I、D62W、D63A、D63Y、K93D、K93H、K93N、K93P、K93W、V94A、V94D、V94H、V94N、V94P、V94R、V94T、V94W、E95G、E95I、E95K、E95P、E95Q、E95R、E95S、E95T、E95V、E95Y、L96A、L96G、L96H、L96M、L96P、L96Q, M97D、M97G、M97I、M97N、M97S、M97V、P99I、P99M、P99W、P99Y、P100H、P100L、P100T、P100V、P100W、P101L、Y102H、Y103H、Y103L、Y103P、Y103T和 L104P 的氨基酸取代。
17.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID勵:1具有至少ー個選自1(285和し61 的氨基酸取代，其中當所述(1'1^4多肽的^1 樣環(huán)I中位置3處的賴氨酸為絲氨酸時，⑶R樣環(huán)I的位置4處的丙氨酸非精氨酸，且其中當所述CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)2中位置11處的白氨酸為脯氨酸時，⑶R樣環(huán)2的位置8處的白氨酸非絲氨酸。
18.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少ー個選自G27H、G27T、K28N和M54K的氨基酸取代，其中所述CTLA4多肽中的⑶R樣環(huán)I不由表16-1到16-6中所述的⑶R樣環(huán)I序列組成，且其中當⑶R樣環(huán)I的位置3處的賴氨酸為天冬酰胺時，⑶R樣環(huán)2的位置8處的白氨酸非絲氨酸。
19.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括取代G27S，且其中所述CTLA4多肽中⑶R樣環(huán)2的位置8處的白氨酸非絲氨酸。
20.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I具有至少ー個選自A29T和A29W的氨基酸取代，且其中⑶R樣環(huán)3的位置12處的白氨酸非谷氨酸。
21.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括取代T30G，其中所述CTLA4多肽中⑶R樣環(huán)I的位置4處的丙氨酸非酪氨酸，且其中CDR樣環(huán)3的位置12處的白氨酸非谷氨酸。
22.—種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括取代K28G，且其中所述CTLA4多肽中的⑶R樣環(huán)I不由表16_1到16_6中所述的⑶R樣環(huán)I序列組成。
23.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于 SEQ ID NO: I 具有至少ー個選自 P26H、P26K、P26S、A29V、T30A、T30D、T30N、T30Q、T30Y、M53V、M54V、G55E、N56D、L58S、T59A、D62N和K93E的氨基酸取代，且其中所述CTLA4多肽中的⑶R樣環(huán)IXDR樣環(huán)2或CDR樣環(huán)3不由表16_1到16_6中所述的⑶R樣環(huán)IXDR樣環(huán)2或⑶R樣環(huán)3序列組成。
24.—種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括取代K28D，且其中所述CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)I中位置4處的丙氨酸非甘氨酸。
25.—種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID勵1具有至少ー個選自？26ム；27￥、1(284和￥321的氨基酸取代，且其中所述(1'1^4多肽中的⑶R樣環(huán)I或⑶R樣環(huán)2不由表16-1到16-6中所述的⑶R樣環(huán)I或⑶R樣環(huán)2序列組成。
26.—種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸15到115具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID NO: I包括取代A29G，且其中所述CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)I中位置3處的賴氨酸非天冬氨酸。
27.一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQ ID NO: I的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQ ID ΝΟ:1具有至少ー個選自G27R、A29Q、T30R、D63K和L104V的氨基酸取代，且其中所述CTLA4多肽中的⑶R樣環(huán)I或⑶R樣環(huán)2不由表16_1到16_6中所述的⑶R樣環(huán)I或⑶R樣環(huán)2序列組成。
28.根據(jù)權(quán)利要求4到27中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其相較于SEQIDNO: I進ー步包含氨基酸取代A29Y。
29.根據(jù)權(quán)利要求I到28中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其相較于SEQIDNO: I進ー步包含氨基酸取代L104E。
30.根據(jù)權(quán)利要求I到29中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其包含與SEQIDNO: I的氨基酸I到124具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其包含選自表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16-1到16_6中的ー個或ー個以上的ー個或ー個以上其它突變或突變組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO: 6)不包含以下各項或不由以下各項組成(a)A29K ；(b)M53E ； (c)L61Y ； (d)L104M ； (e)R33P ； (f)T59I ； (g) L61F ； (h)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I 和 L61F 中的兩個或兩個以上的組合；或(i)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的三個或三個以上的組合。
33.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含A29K或不由A29K組成。
34.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含M53E或不由M53E組成。
35.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含L61Y或不由L61Y組成。
36.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含L104M或不由L104M組成。
37.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含R33P或不由R33P組成。
38.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含T59I或不由T59I組成。
39.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的⑶R樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO:6)不包含L61F或不由L61F組成。
40.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO: 6)不包含以下各項或不由以下各項組成A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的兩個或兩個以上的組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求I到30中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中所述變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的取代相較于阿巴西普(SEQ ID NO: 6)不包含以下各項或不由以下各項組成A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的三個或三個以上的組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求I到41中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其相較于SEQIDNO: I的氨基酸21到112包含至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個氨基酸、或至多3個或至多2個取代。
43.根據(jù)權(quán)利要求I到42中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其相較于SEQIDNO: I的氨基酸I到124包含至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個取代。
44.根據(jù)權(quán)利要求I到27中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中相較于SEQIDNO: I的氨基酸21到112，所述多肽中的僅有取代為分別陳述于權(quán)利要求I到27中的取代。
45.根據(jù)權(quán)利要求I到27中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中相較于SEQIDNO: I的氨基酸I到124，所述多肽中的僅有取代為分別陳述于權(quán)利要求I到27中的取代。
46.根據(jù)權(quán)利要求I到45中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其為融合蛋白。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的變體CTLA4多肽，其中所述融合蛋白包含與免疫球蛋白恒定區(qū)和任選信號序列連接的CTLA4細胞外域。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的變體CTLA4多肽，其包含與阿巴西普(SEQID NO:6)具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的變體CTLA4多肽，其相較于阿巴西普(SEQID NO:6)包含至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個取代。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的變體CTLA4多肽，其中相較于阿巴西普(SEQID NO:6)，所述多肽中的僅有突變?yōu)榉謩e陳述于權(quán)利要求I到20中的突變。
51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的CTLA4多肽，其中所述CTLA4細胞外域和所述免疫球蛋白恒定區(qū)是經(jīng)由鉸鏈連接。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的變體CTLA4多肽，其包含與阿巴西普(SEQID NO:6)具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的變體CTLA4多肽，其相較于阿巴西普(SEQID NO:6)包含至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個取代。
54.根據(jù)權(quán)利要求50所述的變體CTLA4多肽，其中相較于阿巴西普(SEQID NO:6)，所述多肽中的僅有突變?yōu)榉謩e陳述于權(quán)利要求I到20中的突變。
55.根據(jù)權(quán)利要求47、48或51中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)是選自IgGl、IgG2、和IgG3或IgG4。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CTLA4蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)為IgGl。
57.根據(jù)權(quán)利要求I到56中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其中對應于SEQIDNO: I中殘基120的位置處的氨基酸為半胱氨酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD80的結(jié)合親和カ小于包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶80的結(jié)合親和 力的O. 5倍。
59.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD80的結(jié)合親和カ為包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶80的結(jié)合親和力的約O. 5到約I. 5倍。
60.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD80的結(jié)合親和力比包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶80的結(jié)合親和力大I. 5倍以上。
61.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD86的結(jié)合親和カ小于包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶86的結(jié)合親和力的O. 5倍。
62.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD86的結(jié)合親和カ為包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶86的結(jié)合親和力的約O. 5到約I. 5倍。
63.根據(jù)權(quán)利要求I到57中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其對CD86的結(jié)合親和力比包含SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:6中所述氨基酸序列的多肽對⑶86的結(jié)合親和力大I. 5倍以上。
64.根據(jù)權(quán)利要求I到63中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽，其經(jīng)純化。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的變體CTLA4多肽，其經(jīng)純化達到至少85%、至少90%、至少95%或至少98%均質(zhì)性。
66.一種變體CTLA4多肽-藥物結(jié)合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I到65中任ー權(quán)利要求所述的變體CTLA4多肽。
67.ー種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I到65中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽或根據(jù)權(quán)利要求66所述的CTLA4多肽-藥物結(jié)合物以及醫(yī)藥學上可接受的載劑。
68.ー種核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求I到63中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽的核苷酸序列。
69.—種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的核酸。
70.一種原核宿主細胞，其經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求69所述的載體轉(zhuǎn)化。
71.—種真核宿主細胞，其經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求69所述的載體轉(zhuǎn)化。
72.—種真核宿主細胞，其經(jīng)工程改造以表達根據(jù)權(quán)利要求68所述的核酸。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的真核宿主細胞，其為哺乳動物宿主細胞。
74.一種制備CTLA4多肽的方法，其包含(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求72或73所述的真核宿主細胞，以及(b)回收所述CTLA4多肽。
75.一種治療癌癥的方法，其包含向有需要的人類給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I到65中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽、根據(jù)權(quán)利要求66所述的CTLA4多肽-藥物結(jié)合物、或根據(jù)權(quán)利要求67所述的醫(yī)藥組合物。
76.一種治療自身免疫疾病的方法，其包含向有需要的人類給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I到65中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽、根據(jù)權(quán)利要求66所述的CTLA4多肽-藥物結(jié)合物、或根據(jù)權(quán)利要求67所述的醫(yī)藥組合物。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述自身免疫疾病是選自類風濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
78.ー種治療或預防細胞、器官或組織移植物的排斥反應的方法，其包含向有需要的人類給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I到65中任ー權(quán)利要求所述的CTLA4多肽、根據(jù)權(quán)利要求66所述的CTLA4多肽-藥物結(jié)合物、或根據(jù)權(quán)利要求67所述的醫(yī)藥組合物。
79.根據(jù)權(quán)利要求74到78中任ー權(quán)利要求所述的方法，其進ー步包含在所述給藥之前測試分別受所述癌癥、自身免疫疾病或排斥反應影響的組織中的CTLA4表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及CTLA4蛋白，以及所述蛋白的用途，例如治療與免疫反應調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病。
文檔編號C12N15/00GK102822198SQ201180013629
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者赤松謙子, 羅伯特·B·迪布里吉, 大衛(wèi)·B·鮑爾斯, 維羅妮卡·阮 申請人:亞培生物醫(yī)療股份有限公司