專利名稱：免疫性流感成分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫性流感成分。
背景技術(shù)：
人、畜領(lǐng)域的現(xiàn)有獲批準(zhǔn)疫苗一般能有效應(yīng)對所謂的“一類(Class One)病原體”。一般來說，一類病原體(如麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹病毒)指的是這樣一類病原體(I)在嬰兒、幼兒、兒童和青少年中會感染或造成嚴(yán)重疾??；(2)攜帶一種相對穩(wěn)定的微生物基因組；(3)具有會導(dǎo)致自發(fā)性恢復(fù)的自然病史；和(4)誘發(fā)與多克隆(polyclonal)和多表位抗原識別有關(guān)的長期記憶。相反，二類病原體，如流感病毒、HIV-I、瘧原蟲、支原體(如那些會造成肺結(jié)核的支原體)、錐體蟲、血吸蟲、利什曼原蟲、邊蟲(Anaplasma)、腸道病毒、星形病毒、鼻病毒、諾瓦 克病毒、毒性/病原性大腸桿菌、淋球菌(Neisseria,奈瑟氏菌屬)、鏈霉菌、不可分型嗜血桿菌流感病毒、C型肝炎病毒、癌細胞等的特點剛好相反。例如二類病原體(1)傾向于在相當(dāng)大的宿主年齡范圍中感染和傳播，從兒童到老年階段都會發(fā)生感染和復(fù)發(fā)；(2)在其基因組的指定區(qū)域中表現(xiàn)出微生物遺傳不穩(wěn)定性(這類病原體成功進化的標(biāo)志);(3)有些情況下，包括疾病的自發(fā)性恢復(fù)，仍然會頻繁使宿主容易每年反復(fù)多次地感染和/或確診為慢性/活動性或慢性/潛伏性的感染狀態(tài)；(4)誘發(fā)寡克隆早期免疫反應(yīng)，該反應(yīng)會直接導(dǎo)致一組十分有限的、會提供狹窄的種特異性保護、無保護和/或增強感染的免疫優(yōu)勢表位；和(5)感染或接種疫苗后造成免疫失調(diào),如表位阻斷抗體(epitope-blocking antibody)、Ig子類非典型初次免疫反應(yīng)、記憶交叉反應(yīng)性回憶(anamnestic cross-reactive recall)和不恰當(dāng)?shù)腡hi和/或Th2細胞因子代謝。在免疫學(xué)水平上，相差很大的病原體會產(chǎn)生不同的發(fā)病機理和疾病結(jié)果，比如HIV-I與人類鼻病毒。高度成功的免疫系統(tǒng)逃避策略，如已經(jīng)演化出“假性印記”(Dec印tiveImprinting)并在跨宿主和微生物類群上被選擇和維持。因此，脊椎動物免疫系統(tǒng)(例如因病原體假性印記)運轉(zhuǎn)失效，基本上與60年中平均每年是否感染2-6次HIV-I或常見感冒病毒是相同的。盡管對于抗原輸送和表達方面取得的一些進步提高了某些二類病原微生物的免疫原性，現(xiàn)有疫苗技術(shù)尚未很快轉(zhuǎn)化為在人體中使用的廣泛有效的新型安全許可疫苗。這在很大程度上或許是因為對掌控脊椎動物素質(zhì)防御系統(tǒng)起源、譜發(fā)展(repertoiredevelopment)、維持、激活、衰老和在相似及不相似環(huán)境中的共同演化的基本原理認識不足。人體流感疫苗開發(fā)中目前缺乏的是這樣一種能誘發(fā)免疫和保護的成分，其同型和亞型依賴性較弱，并且因此不需要每年在目前基于雞蛋的技術(shù)生產(chǎn)方案中混合和生產(chǎn)多種亞型。一種適當(dāng)?shù)男庐a(chǎn)品是流感重組HA或NA亞單位疫苗，它可以誘發(fā)能交叉中和亞型內(nèi)抗原變體和不同亞型流感病毒的免疫反應(yīng)。流感是一種NIAID C類病原體，每年在美國造成36，000人死亡和220，000人住院。作為一種呼吸系統(tǒng)疾病，流感通過來自感染者咳嗽或打噴嚏產(chǎn)生的飛沫和/或受到污染的傳染體傳播。高風(fēng)險人群包括兒童和老年人，患上流感普遍會導(dǎo)致流感相關(guān)肺炎的次生并發(fā)癥、上呼吸道并發(fā)癥(兒童中耳炎)和其他系統(tǒng)疾病(如心血管疾病等)。流感是歷史上最大規(guī)模的流行病的根源；1918年的西班牙流感造成全世界4000多萬人死亡。在美國，每年流感引起的直接醫(yī)療成本(住院、就診和藥物等)預(yù)計高達46億美元。此外，美國每年因流感損失的工作日達I. 11億，因病假和生產(chǎn)力損失而給美國商業(yè)帶來的相關(guān)成本超過每年70億美元。一場嚴(yán)重流感疫情的總直接成本和間接成本(工作日損失、上學(xué)日損失等)每年至少有120億美元 。流感病毒，并且當(dāng)伴隨二次細菌感染時，很久以來都被視為大量發(fā)病率和死亡率的原因。并發(fā)癥包括肺炎、支氣管炎、充血性心力衰竭、心肌炎、腦膜炎、腦炎和肌炎。一些并發(fā)癥高危人群是那些患有慢性肺病或心血管疾病的人群、慢性(病)療養(yǎng)設(shè)施(包括療養(yǎng)院)的住院者，以及85歲及以上的老人。(流感預(yù)防與控制免疫實踐顧問委員會(ACIP)的建議。MMWR，1996 年，第 45 卷；以及 Thompson et al. , JAMA 2003;289:179-186)。美國老年人口數(shù)量在1976年到1999年間翻了一番，隨著二戰(zhàn)后一代生育高峰的到來，預(yù)計往后幾年還會增加。這個年齡段的人因流感相關(guān)疾病而死亡的概率是65-69年齡段人群的16倍。1990年代流感相關(guān)死亡數(shù)量增加的另一個重要因素是A型(H3N2)流感病毒的猖獗，這是一種致病性更強的近期的流行流感病毒。流感是一種單鏈核糖核酸(RNA)病毒，它會迅速變異而成為新的強毒菌。這種菌株分為三類，即流感A、B和C。該病毒根據(jù)兩種表面糖蛋白，即血球凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，又被進一步分為至少16個HA和至少9個NA亞型。最近由NIAID/NIH發(fā)起的人類流感病毒全基因組(1996-2004年從紐約州收集)分析表明，盡管HA相同，多個持續(xù)性種系發(fā)育不同的譜系在同一人群中共同傳播(co-circulate)，導(dǎo)致抗原新進化枝的重配和產(chǎn)生。雖然HA的抗原變異仍然是人類流感A病毒進化上的主要選擇性壓力，但是抗原新進化枝是通過持續(xù)性病毒譜系之間重配而不是通過抗原漂移而出現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)對于目前、以往流感疫苗株選擇和生產(chǎn)的年度方法意義重大(Holmes et al. , PLoS Biol. 20053 (9): e300)o流感可以從豬、禽、馬、狗和其他哺乳動物上得到。年度全球病毒跟蹤項目和后續(xù)的“反應(yīng)性(reactionary)”疫苗生產(chǎn)中的核心問題是抗原變異?？乖儺愂且环N保證特定病原體基因快速序列變異的進化機制，該病原體基因?qū)蝹€蛋白質(zhì)抗原的同源染色體進行編碼，通常涉及多個相關(guān)的基因復(fù)本，導(dǎo)致該病原體表面上的一個抗原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這樣，宿主免疫系統(tǒng)在感染或再次感染期間識別該病原體的能力會下降，在宿主能夠繼續(xù)對抗這種疾病前必須制造出新的抗體來識別已經(jīng)發(fā)生變化的抗原。結(jié)果，宿主對這種病毒性疾病不能保持完整的免疫力。這一現(xiàn)象代表了現(xiàn)代疫苗發(fā)展所面臨的最大困難之一，或者說是最大的困難。不出所料，感染或接種所有受批準(zhǔn)疫苗后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與亞型和菌株是高度特異的。實際上，這意味著自然、實驗感染和接種疫苗中誘發(fā)的抗體只能中和同型病毒。特定亞型/菌株的體液免疫反應(yīng)似乎與血球凝集素分子球狀頭部上發(fā)現(xiàn)的各種抗原位點的相對免疫優(yōu)勢有關(guān)(Wiley et al. , Nature, 1981年；289:373-378)。特別是，抗體反應(yīng)已經(jīng)映射到HA球狀頭部內(nèi)的五個主要抗原位點上。在這五個HA表位中(A-E)，A和B這兩個位點最具有免疫優(yōu)勢并與最高數(shù)量的氨基酸超突變性(hypervariability)有關(guān)，部分原因是反復(fù)出現(xiàn)基因點變異、刪除以及偶爾引入N聯(lián)糖基化位點，統(tǒng)稱為病毒的“抗原漂移” (Cox& Bender, Semin. Virol. 1995 ；6:359-70 ；Busch et al. , Sci. 286:1921, 1999 ；Plotkin &Dushoff, PNAS 100:7152，2003 ;和 Munoz & Deem, Vaccine, 23，1144，2005)。1953 年由 Francis (Ann. Int. Med.，1953，399:203)首次描述的原始抗原痕跡(original antigenic sin)是一種初次免疫反應(yīng)，當(dāng)不是通過同源,而是通過交叉反應(yīng)疫苗或輸入病毒亞型/菌株增強時，這種效應(yīng)會導(dǎo)致剛剛形成的抗體與先前的抗原反應(yīng)比與輸入抗原的反應(yīng)更理想。由燒幸回憶(aleatory recall)指導(dǎo)的免疫特異性喪失給宿主免疫系統(tǒng)帶來一個針對感染期間和感染之間的病毒變化產(chǎn)生(mount)平衡的有效的體液反應(yīng)現(xiàn)實問題。因此，自然感染和疫苗接種無法產(chǎn)生更有效的初次和記憶免疫交叉反應(yīng)就不足為怪了，因為譜系發(fā)展抵抗那些在抗原層次上較低的弱免疫性表位(less immunogenic epitopes)(可能是最保守的并能產(chǎn)生交叉應(yīng)變(cross-strain)免疫力)。免疫優(yōu)勢表位誤導(dǎo)免疫反應(yīng)遠離一個抗原上更保守的和更弱的免疫區(qū)域，這一免疫學(xué)現(xiàn)象最初被稱為“克隆優(yōu)勢”(Kohler et al. , J Acquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5:1158-68),后來更名為“假性印記” (Kohleret al. , Immunol. Today,1994 (10) :475_8)。假性印記背后的免疫優(yōu)勢的免疫學(xué)機理還未完全搞清楚，尚未有一個機理能夠充分解釋某些表位如何和為什么演變成免疫調(diào)節(jié)和免疫優(yōu)勢。在這一現(xiàn)象中觀察到的免疫反應(yīng)范圍包括誘發(fā)能在實驗室動物模型-病毒挑戰(zhàn)系統(tǒng)(experimental animal model-viralchallenge systems)中引起被動保護的高度菌株/分離菌特異性的中和抗體，一直到誘發(fā)一種結(jié)合非保護/非中和的、阻斷甚至病原體增強的抗體，有些情況下這種抗體能阻止宿主免疫系統(tǒng)識別附近的表位，以便干擾CD4 T細胞輔助。同樣觀察到通過免疫優(yōu)勢誘發(fā)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致一組聚焦更狹窄的表位，以及宿主輔助者的T細胞和細胞毒素細胞媒介免疫性(Gzyl et al. , Virology 2004 ；318 (2) :493-506;Kiszka et al. , J. Virol. 200276
(9):4222-32 ;和 Goulder et al. , J. Virol. 2000 ；74 (12) :5679-90)。疫苗接種是預(yù)防疾病的最佳方式，每年都要根據(jù)全世界范圍對活性病毒株的流行病學(xué)監(jiān)測來研發(fā)當(dāng)前的三價滅活病毒疫苗和弱毒活(減毒)流感疫苗。兩種疫苗都包含流感A和流感B亞型。獲批準(zhǔn)的流感疫苗由來自兩個流感A亞型(HlNl和H3N2)和一個流感B亞型的滅活完整的或化學(xué)分裂的亞單位制備組成。流感疫苗的生產(chǎn)涉及所選變體通過連續(xù)傳代或與其他高產(chǎn)菌株重配以適應(yīng)蛋中高產(chǎn)。所選流感病毒在雞蛋中生長，而流感病毒顆粒從尿囊液中提純。然后通過用滅活劑(如福爾馬林)處理滅活完整的或分裂的病毒制備。美國疫苗市場90%以上的份額被兩家公司占據(jù)，即Aventis Pasteur (市場份額50%以上)和Chiron (PowderJect)(英國)。一種鼻內(nèi)疫苗FluMist 經(jīng)過了批準(zhǔn)并于2003年首次面市?，F(xiàn)有流感疫苗的局限包括(I)老年人群中的功效降低。在老年人中，防病率較低，特別是那些已經(jīng)形成生活習(xí)慣的老年人(Gorse et al.，Infec. Dis, 190:11-19，2004)。在65或65歲以上的老年人群中，不到30%的人群身上觀察到對三價亞病毒顆粒流感疫苗的明顯抗體反應(yīng)(Powers &Belshe, J. Infec. Dis, 167:584-592，1993)；(2)用雞蛋生廣。現(xiàn)有制造工藝依罪雞蛋。流感病毒囷株必須在雞蛋中復(fù)制完好，因此每年需要大量的雞蛋供應(yīng)。由于需要尋找適當(dāng)?shù)牟《窘M合，生產(chǎn)每年都處境堪憂；(3)不能對付最近出現(xiàn)的菌株和漂移菌株，如90年代末的A/Sydney/5/97，或?qū)Ω稘撛诘拇罅餍芯?，?997年出現(xiàn)的香港H5N1病毒；(4)用現(xiàn)有完整或分裂流感疫苗保護的壽命短，并且效果會隨著因抗原變異而在流感流行株中出現(xiàn)遺傳改變而減弱。理想情況下，疫苗菌株與造成疾病的流感病毒配對。當(dāng)與來自感染個體的原始分離菌相比時，改變可能發(fā)生在雞蛋培養(yǎng)的流感病毒的血球凝集素中(Oxfordet al. , J. Gen. Virol. 72:185-189，1989 ；和 Rocha et al. , J. Gen.Virol. 74:2513-2518, 1993)，減弱了這種疫苗的潛在效果；(5)那些對雞蛋敏感的人使用在雞蛋中生產(chǎn)的疫苗有副作用；和
·
(6)現(xiàn)有受批準(zhǔn)的生產(chǎn)系統(tǒng)每個用流感病毒感染的雞蛋生產(chǎn)一個疫苗，生產(chǎn)時間約為24周。因此，現(xiàn)有的受批準(zhǔn)的流感疫苗(I)不會誘發(fā)能中和常見抗原變體(每年在一個流行病期間重復(fù)發(fā)生)以及亞型病毒和重配病毒的抗體；(2)不會在老年人群中產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)；以及(3)由于存在副作用(比如有些疫苗無法給兒童服用)而找不到更廣泛的適用性。

發(fā)明內(nèi)容
本披露部分涉及具有增強或最新免疫原性的新型流感抗原。一種值得關(guān)注的流感成分可以作為一種改性得到的改進疫苗，提供了具有不同排列和/或最新可識別表位的病毒或病毒亞單位抗原。更加有效和快速地使用重組體技術(shù)結(jié)合最新免疫再聚焦(immune refocusing)技術(shù)，免疫再聚焦技術(shù)導(dǎo)致亞單位HA、NA (或兩者)和/或含有HA、NA (或兩者)的成分通過產(chǎn)生一種具有改進的交叉菌株效果的流感疫苗而極大地改變了目前的疫苗開發(fā)實踐，從而擺脫了對全球每年跟蹤病毒這一當(dāng)前做法的需要，節(jié)省了大筆資金，分流醫(yī)療資源，包括每年為了用雞蛋生產(chǎn)和制造疫苗而不斷增加的時間和勞動力，以及人命。其他特點和優(yōu)勢在此描述，并將從以下圖紙和詳細描述中顯現(xiàn)出來。


提供以下圖紙的目的是為了解釋本披露的各個方面，決不能理解為限制本發(fā)明的范圍。圖I表示與免疫再聚焦HA抗原試驗結(jié)果有關(guān)的表I ;圖2表不與特定突變及其序列有關(guān)的表2 ；圖3表示HlNl HA上一組免疫再聚焦突變實例的近似位置。組A表示包含三個HA-I和HA-2鏈的HA三聚物的結(jié)構(gòu)。組B、C和D表示HA單體，顯示在所選突變的近似位置中的氨基酸。這些圖是根據(jù)流感的HlNl HA的結(jié)構(gòu)文件lRU7.pdb修改的(A/PR8/1934, Gamblin et al.，Science, 303:1838-1842，2004)，也可以從 RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到；圖4表示提供表位2和3中組合突變的表3;圖5表示提供表位5中組合突變的表4。
具體實施例方式流感在這里定義為包含A、B、C三種類型的病毒。這種病毒存在于禽類和各種哺乳動物中，如貓、狗、馬、豬等。A型在人體中是致病性最強的，既會導(dǎo)致季節(jié)性流行病，也會偶爾且極為罕見地導(dǎo)致更為致命的全國性傳染病疫情。這些類型是通過若干血清類型定義的，其反映了宿主對病毒顆粒表面上表達的抗原的免疫反應(yīng)。病毒攜帶大部分與疫苗保護有關(guān)的表位的表面上的兩種結(jié)構(gòu)是血球凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)。至少存在16種已知的H亞型和至少9中已知的N亞型。HA介導(dǎo)病毒的吸附和融合。NA具有唾液酸酶活性。“野生型”是指天然存在的有機體或其中的部分。該提法也涉及由自然過程產(chǎn)生的天然存在在人群的天然有機體中存在的核酸和蛋白質(zhì)，正如因自然突變產(chǎn)生并通過基因漂移、自然選擇等維持的多態(tài)性中所看到的那樣，而不包括具有(比如)通過重配手段得到的序列的核酸或蛋白質(zhì)?！懊庖咴焙汀翱乖痹谶@里可以互換使用，表示誘發(fā)抗體(以體液作為媒介的)和/或T細胞起源(以細胞作為媒介的)的特定免疫反應(yīng)的分子，例如，包含一種與這個分子或一個⑶/或ra8+T細胞結(jié)合的抗體，其中，⑶/或ra8+T細胞能識別表達這個分子(如受到病毒感染的細胞)的細胞。這個分子可以包含一個或幾個特定抗體或τ細胞結(jié)合的部位。眾所周知，這種部位稱為表位或決定基(determinants)?？乖梢允嵌嚯摹⒍嗪塑账?、多糖、脂類等，及其組合，如糖蛋白或脂蛋白。免疫原性化合物或產(chǎn)品，或抗原化合物或產(chǎn)品是指能誘發(fā)特定免疫反應(yīng)(可以是體液的、細胞的或二者兼具)的化合物或產(chǎn)品。疫苗是用于產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)的免疫原或抗原，即這種反應(yīng)，如抗體，減輕了宿主中免疫原或抗原或表達它們的實體的負面影響。眾所周知，用量是根據(jù)臨床前研究和臨床研究得出、推斷和/或確定的。需要時可以服用多倍劑量，從而保證延長預(yù)防性狀態(tài)或無反應(yīng)性狀態(tài)。出于本披露的目的，使用疫苗的成功端點(successful endpoint)是在宿主中存在誘發(fā)的免疫反應(yīng)(如體液的和/或T細胞為媒介的)，這種免疫反應(yīng)導(dǎo)致(比如)產(chǎn)生血清抗體，或由該宿主在任何組織或器官中制造的、與該抗原或關(guān)注免疫原結(jié)合的抗體。在一些實施例中，誘發(fā)的抗體以某種方式與一種攜帶同源抗原或免疫原的化合物、分子等結(jié)合，或者引導(dǎo)該宿主中和、減少、防范和/或排除感染和/或造成臨床疾病的病原體。這種免疫反應(yīng)可以用業(yè)內(nèi)已知的方法(如酶聯(lián)免疫吸咐測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)等)監(jiān)視。出于本披露的目的，免疫保護作用是在暴露宿主中存在這種抗病原體、抗免疫原、抗病毒等免疫反應(yīng)(如結(jié)合免疫原或感染細胞的抗體和/或T細胞)。這可以使用任何已知的免疫測定法(如ELISA和/或血球凝集素抑制測定法)確定。另外，人們也可以選擇使用病毒中和測定法確定(比如)是否存在循環(huán)中和抗病毒抗體。出于本披露的目的，在宿主中觀察到免疫保護作用，即存在循環(huán)抗流感抗體，至少七天、至少十四天、至少二十一天、至少三十天或更長時間，是一種關(guān)注疫苗具有功效的證據(jù)。此外，在一般情況下，對曾用于制作疫苗的同源性單一流感病毒株產(chǎn)生約1:40的血凝抑制(HI)滴度可作為終點，標(biāo)志著獲得一個候選疫苗。出于發(fā)明公開的目的，在動物模型中，暴露之后有任何的死亡推遲均可作為產(chǎn)生保護的證據(jù)。因此，在小鼠暴露于致病性流感病毒株的情況下，通常第一只小鼠死于暴露后10天左右。因而，出于本發(fā)明公開的目的，若暴露小鼠死亡首日推遲至少一天、至少兩天、至少三天或更多可認為產(chǎn)生了保護。免疫保護的時間可為至少14天、至少21天、至少28天、至少35天、至少45天、至少60天、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少I年、至少2年或更長。免疫保護首選的觀察群體為遠交種群，觀察病原體不同的種類、亞型、病毒株、變異株、等位基因等。值得關(guān)注的組成成分可以包括病毒顆粒、滅活或減毒(弱毒活)的病毒，或病毒亞基，如NA或HA。其組成成分還可包括病毒樣顆粒(VLP)，在本領(lǐng)域中已知為表達病毒蛋白和抗原的結(jié)構(gòu)，其可見于完整復(fù)制的病毒粒子，但在本發(fā)明公開的內(nèi)容中，表達的是一種免疫性減弱(immunodampened)的免疫優(yōu)勢表位。正常情況下，病毒樣顆粒缺乏病毒核酸或使其核酸復(fù)制的部分，因此病毒樣顆粒無傳染性。在另一實施例中，抗原、決定基或其部分可被克隆進入野生型病毒的基因組中，取代其同源野生型基因。重組病毒便可與野生型病毒一樣保存免疫性減弱分子。其病毒可以是流感病毒或另一種病毒載體。因此，例如，對一種可在雞蛋中能良好增殖的流感病毒株進行操作，以表達免疫性減弱分子，且該重組病毒可利用生產(chǎn)疫苗(用雞蛋產(chǎn)生免疫性減弱疫苗)的現(xiàn)有材料和方法進行增殖?？蓪σ呙邕M行定制，使其對一種、兩種或更多種抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)；對一種病毒，對兩種或更多種單獨的病毒系(lines)、病毒株、分化枝(clades)等產(chǎn)生免疫反應(yīng)；對一種、兩種或更多種表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)；對一種、兩種或更多 種血清型產(chǎn)生免疫反應(yīng)；等等。這可以通過包含多個組分、成分、病毒、病毒樣顆粒等獲得，其中上述組分、復(fù)合物、病毒、病毒樣顆粒等中的一種表達值得關(guān)注的免疫性減弱抗原，其對多個HA型、NA型(或兩者混合)產(chǎn)生反應(yīng)。此外，多個成分可參與到單個多功能合成物(composition)中。“免疫優(yōu)勢表位”是指位于一抗原的可選擇性激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的表位，并能有效或功能性排除該抗原上或的其他表位，這種排除可以是部分性或完全性的。“表位免疫性減弱”是指對表位進行修飾，以顯著抑制宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對該表位的抗體、輔助性或細胞毒性T細胞。但是，免疫性減弱不一定導(dǎo)致上述表位或?qū)υ摫砦环磻?yīng)的完全清除。免疫再聚焦(IR)或免疫再聚焦技術(shù)(IRT)可用于制造針對表達免疫優(yōu)勢表位的病原體的有效疫苗。該技術(shù)最適用的有機體的特征是該種有機體進化出了一種被稱為“假性印跡”的策略以逃避宿主的免疫應(yīng)答，如通過露出高水平的抗原漂移的免疫優(yōu)勢表位。這種免疫優(yōu)勢表位通常表現(xiàn)為多個氨基酸的形式，其可在不影響病原微生物生存力的條件下發(fā)生改變。免疫再聚焦與免疫性減弱是同義的?？乖庖邇?yōu)勢表位的免疫性減弱可導(dǎo)致宿主有機體產(chǎn)生高滴度的抗體或T細胞，以針對該抗原上非優(yōu)勢表位的應(yīng)答，和/或新的針對其他相對性免疫沉默表位的抗體滴度或T細胞應(yīng)答。這種免疫性減弱的抗原可作為有效疫苗，針對有中度或高度變異和/或保守免疫優(yōu)勢表位抗原的微生物。該免疫優(yōu)勢表位或抗原誘發(fā)的抗體可作為針對同源微生物的有效疫苗。通過檢查感染病原微生物的宿主有機體內(nèi)的血清或T細胞反應(yīng)性，可鑒定免疫優(yōu)勢表位。血清用于評估結(jié)合到鑒定抗原的抗體含量,該抗原可能引起宿主有機體內(nèi)的免疫應(yīng)答。若存在免疫優(yōu)勢表位，則血清中有大量抗體將結(jié)合免疫優(yōu)勢表位，而對存在于抗原表面或內(nèi)部的其他表位，則極少結(jié)合或不結(jié)合。確定免疫優(yōu)勢表位后，將免疫優(yōu)勢表位按照這里所述的材料與方法進行免疫性減弱，并且作為本領(lǐng)域中的一項設(shè)計選擇。這種操作可在核酸水平、蛋白質(zhì)水平、碳水化合物水平等進行，或在各水平組合進行，操作方法參照本文并為本領(lǐng)域所知。舉例來說，N-聯(lián)糖(CHO)的存在可由多肽的一級氨基酸序列確定。三聯(lián)氨基酸序列的組成是天冬酰胺，其后為任意氨基酸，最后為絲氨酸或蘇氨酸(N-X-S/T)，其中X為除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意氨基酸，該三聯(lián)氨基酸序列為添加N-連接CHO的靶標(biāo)。在表位上可添加或移除N-連接糖基化位點,操作方法及材料為本領(lǐng)域已知。例如，HIV的重組gpl20表現(xiàn)為分子水平導(dǎo)入N-聯(lián)序列子(NXT/S)，這可導(dǎo)致免疫優(yōu)勢V3區(qū)域中N-聯(lián)多聚糖的過度添加，顯示出新的抗原特性，如不能結(jié)合抗體，該抗體可識別野生型V3表位，同時誘導(dǎo)針對先前沉默或免疫源性較弱的其他表位的抗體應(yīng)答。存在過多的糖基部分(carbohydrate moiety)不會影響HIV-I重組病毒的感染能力。以重組糖蛋白進行免疫的實驗動物表現(xiàn)出中到高滴度的抗體，其在體外可中和感染同源性和異源性野生型HIV-1。因此，對gp 120/160 V3區(qū)域內(nèi)的免疫優(yōu)勢表位進行免疫性減弱，可引起免疫應(yīng)答再聚焦于同一抗原上的其他中和表位上，參見美國專利US 5，585，250和美國專利 US 5,853,724。此外，可替代、替換或刪除免疫優(yōu)勢表位上的一個特定的氨基酸以減弱其免疫原性。免疫性減弱的發(fā)生可通過替代、替換或刪除免疫優(yōu)勢表位上的一個、兩個、三個或更多個氨基酸，例如，通過定點誘變編碼抗原的核酸。本文提供了改變核酸/多肽的方法，并且為本領(lǐng)域所知。多種技術(shù)均可影響免疫性減弱，如改變、替換或刪除表位的特定氨基酸，或者，例如在表位或其附近添加糖基化位點。如本文所述，其改變可在多肽水平或多核苷酸水平生效，操作方法為本領(lǐng)域所知的。因此，多肽可通過添加、刪除或替換表位上或內(nèi)靶位點的一個或多個分子、基團、化合物等而發(fā)生變化。例如，可將一個特定的氨基酸進行化學(xué)衍生化，或進行修飾以攜帶一個額外基團，如多糖，如聚乙二醇。隨著免疫原性結(jié)構(gòu)的操作完成后，對突變蛋白(即值得關(guān)注的操作抗原(manipulated antigen),亦即值得關(guān)注的免疫性減弱的抗原)與確定的已知抗體的結(jié)合進行篩選分析，可以用于確定是否發(fā)生了免疫性減弱；該抗體可結(jié)合流感病毒的一個或多個免疫優(yōu)勢表位。舉例來說，合成的一條多肽可在其免疫優(yōu)勢表位的一級氨基酸序列中含有一處或多處改變?；蛘?，免疫優(yōu)勢表位的核酸序列進行修飾，以表達免疫性減弱表位。例如，其核酸序列因此可通過定點誘變進行修飾，表達氨基酸替換、插入、刪除等，其中有些可在免疫優(yōu)勢表位或其附近引入更進一步的修飾，如引入一個糖基化位點，如引入使免疫優(yōu)勢表位或其附近N-糖基化或O-糖基化的突變，等等。因此，可將值得關(guān)注的一條多肽中編碼一個或多個免疫性減弱表位的值得關(guān)注的核酸置于克隆和/或表達載體中，操作材料及方法為本領(lǐng)域所知，并且通常可作為一種設(shè)計選擇而從市場購買。例如，可使用質(zhì)粒、粘粒、病毒和復(fù)制子，很多都有銷售。病毒載體的來源包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、α病毒、噬菌體等。也可使用流感病毒。已知的用于增殖值得關(guān)注的載體的合適宿主細胞包括原核細胞、真核細胞、細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等?？蓪⒓毎麡?gòu)造以分泌值得關(guān)注的重組蛋白。這樣該多肽可被純化并用作免疫原。作為替代，可將此多肽插入于包含流感病毒基因組的載體或流感病毒中，一般情況下，會替換產(chǎn)生該多肽的同源編碼序列，使免疫再聚焦多肽能夠在所述流感病毒、病毒樣顆?；蚪Y(jié)構(gòu)、病毒表面結(jié)構(gòu)成分、亞基等中表達。因此，免疫再聚焦技術(shù)不依賴于載體技術(shù)，并可應(yīng)用于多重表達系統(tǒng)。因而，可將免疫再聚焦抗原納入到當(dāng)前使用的眾多新型疫苗載體中，其包括但不限于1)利用目前可以接受的技術(shù)(如在哺乳動物細胞或雞胚中培養(yǎng))而生產(chǎn)的重組流感病毒；2)重組的溫度敏感性流感病毒，如Flu-Mist ;3)裂解疫苗；4)表達在昆蟲、哺乳動物、酵母菌、細菌或其他細胞中的亞單位疫苗；5) DNA表達質(zhì)粒；以及6)異源性病毒表達系統(tǒng)，如重組牛痘病毒、腺病毒、慢病毒等。含有免疫再聚焦HA抗原的免疫原多種提純方法為本領(lǐng)域所知的。整合入免疫再聚焦HA抗原的重組病毒利用已建立的并當(dāng)前被批準(zhǔn)的，用于制備許可疫苗的技術(shù)進行提純。
在昆蟲、哺乳動物或其他體外表達系統(tǒng)中生產(chǎn)的亞單位疫苗可用常規(guī)的色譜分析法進行提純，分離和純化可用離子交換、凝集素結(jié)合樹脂、大小分級(sizefractionations)、抗體親和等方法。此外,還可設(shè)計將免疫原表達為含有融合區(qū)域以方便純化。例如，HA抗原可以多組氨酸融合的方式表達，使其在金屬活化樹脂上能夠快速而簡單地進行純化。如果需要的話，這種融合伴侶可利用本領(lǐng)域已知的方法，通過特定的蛋白水解而切除。獲得表位突變蛋白(不同于野生型的突變表位)的一個步驟及其類似方法為“丙氨酸掃描突變” (Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989);以及 Cunningham &Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6434-6437(1991))。一個或多個殘基被丙氛酸(Ala)或多聚丙氨酸(polyalanine)殘基替換。表現(xiàn)出對其替換的功能敏感性的這些殘基隨后可通過在替換位點引入進一步的或其他的突變進行提煉。因此，當(dāng)預(yù)先指定引入氨基酸序列變異位點時，突變本身的性質(zhì)是不需要預(yù)先指定的。對其他氨基酸可嘗試類似的替換，取決于所期望的掃描殘基特性。此外，替代的氨基酸的選擇可根據(jù)，例如，被取代氨基酸的大小、形狀或其他參數(shù)。例如，谷氨酰胺可替換谷氨酸以降低表位的電荷，而其大小和形狀的改變程度非常之輕微。一種更系統(tǒng)化地鑒定需要修飾的氨基酸殘基的方法包括，鑒定參與免疫系統(tǒng)刺激或免疫優(yōu)勢抗體識別的殘基，以及很少參與或不參與免疫系統(tǒng)刺激或免疫優(yōu)勢抗體識別的那些殘基。對所涉及的殘基進行丙氨酸掃描，每個丙氨酸突變均應(yīng)檢驗對免疫優(yōu)勢表位的免疫系統(tǒng)刺激或免疫優(yōu)勢抗體識別是否降低。在另一實施例中，選擇很少涉及或不涉及免疫系統(tǒng)刺激的殘基進行修飾。修飾可涉及到一個或多個殘基的刪除，一個殘基的替換，或相鄰于值得關(guān)注的殘基插入一個或多個殘基。在一個實施例中，修飾涉及的是該殘基被另一個氨基酸替換。最先替換的可以是保守性置換。若這種置換可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)刺激或與已知免疫優(yōu)勢抗體的反應(yīng)性升高，則可進行另一種保守性置換，以確定是否可獲得更顯著的變化。通過選擇在特性上與正常情況下位于該位點的殘基差異更大的氨基酸，在遠離免疫優(yōu)勢表位處可以實現(xiàn)在改變免疫系統(tǒng)應(yīng)答能力方面更為明顯的改變。因此，進行這種替換的同時還能保持(a)替換區(qū)域多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)，如折疊(sheet)或螺旋狀(helical)構(gòu)象；(b)祀位點分子的電荷或疏水性,或者(C)側(cè)鏈的大小。例如，基于一般側(cè)鏈的特性，天然存在的氨基酸可分成
(I)疏水性蛋氨酸(Μ或Met)，丙氨酸(A或Ala)，纈氨酸(V或Val )，亮氨酸(L或Leu)和異亮氨酸(I或lie);(2)中性，親水性半胱氨酸(C或Cys)，絲氨酸(S或Ser)，蘇氨酸(T或Thr)，天冬酰胺(N或Asn)和谷氨酰胺(Q或Gin)；(3)酸性天冬氨酸(D或Asp)和谷氨酸(E或Glu)；(4)堿性:組氨酸(H或His)，賴氨酸(K或Lys)和精氨酸(I^PArg)；(5)影響側(cè)鏈方向的殘基甘氨酸(G或Gly)和脯氨酸(P或Pro)，以及(6)芳香類色氨酸(W或Trp)，酪氨酸(Y或Tyr)和苯丙氨酸(F或Phe)。非保守性置換是指一種氨基酸與另一類中的一種氨基酸進行交換。保守性置換是指一種氨基酸與同類中的另一種氨基酸進行交換。 優(yōu)選的氨基酸置換為可減弱免疫優(yōu)勢表位的那些，但也可包括如下的，如(I)降低對蛋白水解的易感性，(2)降低對氧化的易感性，(3)改變免疫系統(tǒng)刺激活性，和/或
(4)賦予或修飾這些類似物的其他理化或功能特性。類似物可包括不同于天然存在的肽鏈序列的，該序列的多種突變蛋白。例如，在天然存在的或突變蛋白的序列中，可發(fā)生單個或多個氨基酸替換(如保守性氨基酸置換)。通常，保守性氨基酸置換不會明顯改變母體序列(parentsequence)的結(jié)構(gòu)特征(如替換氨基酸不應(yīng)有打破在母體或突變蛋白序列中的螺旋，或破壞母體序列中其他類型的特征性二級結(jié)構(gòu)的趨勢)，除非R基或側(cè)鏈的大小或構(gòu)象發(fā)生了改變(蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)與分子原理(Creighton, ed.，W. H. Freeman and Company, NewYork (1984);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡介，Branden & Tooze, eds, Garland Publishing, New York, NY(1991));以及 Thornton etal. , Nature 354:105 (1991))。通常，生物學(xué)特性改變的表位突變，其氨基酸序列至少有75%的氨基酸序列與母體分子的氨基酸序列相同或相似，至少80%、85%和90%，通常至少95%相同。在這里，與母體氨基酸序列相同或相似的定義為候選序列中氨基酸殘基的比例，所述候選序列在必要時，對齊或填補空隙后，與母體分子殘基相同(即相同殘基)或相似(即基于共同的側(cè)鏈特性，來自同一類的氨基酸殘基，前述)，實現(xiàn)最大的序列比例統(tǒng)一性。對值得關(guān)注的分子的共價修飾包括在發(fā)明公開的范圍內(nèi)，例如，對分子進行免疫性減弱，或獲得功能等價物，其可攜帶或不攜帶除免疫性減弱外的其他增強的、額外的或不同的功能或特征。如果適用的話，這可以通過化學(xué)合成或?qū)Ψ肿舆M行酶解或化學(xué)裂解制備。通過有機衍生試劑與分子的靶向氨基酸殘基反應(yīng)，可引入該分子的其他類型共價修飾，這種衍生試劑能選擇與側(cè)鏈、N-端殘基或C-端殘基反應(yīng)。同時，多種有機化學(xué)材料與方法可用于修飾表位的組分。例如，WO 05/35726教授了多種在生物分子上引入、修飾、改變、替換等取代基的方法。例如，半胱氨酰殘基可與α鹵代乙酸酯(及其相應(yīng)的胺)反應(yīng)，如氯乙酸或氯乙酰胺，生成羧甲基或脲甲基衍生物。半胱氨酰殘基也可通過與溴三氟丙酮(bromotr if Iuoroacetone )> <1-溴-0- (5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸鹽、N-燒基馬來酰亞胺、3-硝基-2-卩比唳基二硫化物(3-nitro-2-pyridyl disulfide)、甲基2-卩比唳基二硫化物(methyl 2-pyridyl disulfide)、對-氯萊基苯甲酸鹽、2_氯萊基_4_硝基苯酹和氯_7_硝基苯并-2-氧雜-1，3- 二唑等反應(yīng)而衍生化。在pH 5. 5-7. O時，組氨酰殘基可通過與焦碳酸二乙酯反應(yīng)而衍生化。也可使用對溴基溴化苯乙酮，其反應(yīng)優(yōu)選在pH 6. 0,0. IM的二甲胂酸鈉中進行。賴氨酰和α氨基末端殘基可與琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)，使殘基所帶電荷相反。其他用于衍化含α氨基殘基的合適試劑包括亞氨酸酯如甲基吡啶亞胺甲酯、磷酸吡哆醛、批口多醒、氯硼氫(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲和2，4_戍二酮，以及可與乙醛酸被轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基酸。精氨酰殘基的修飾可通過與一種或幾種常規(guī)試劑的反應(yīng)進行，如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化通常需要堿性反應(yīng)條件。此外，這些試劑也可與賴氨酸以及精氨酸的ε氨基反應(yīng)。酪氨酰殘基的特定修飾可通過芳香族重氮化合物或四硝基甲烷進行。例如，I-乙酰咪唑和四硝基甲燒可分別用于生成O-乙酰酪氨酰類(0-acetyl tyrosyl species)和
3-硝基衍生物。羧基側(cè)鏈基團(天冬氨酰基或谷氨?；?可通過與碳化二亞胺(R-N=C=C_R’ )的反應(yīng)進彳丁修飾，其中R和R’可以是不同的燒基，如1_環(huán)己基_3_ (2-嗎琳基-4_乙基)碳化二亞胺或I-乙基-3- (4-氮鐵-4，4-二甲基戍基)碳化二亞胺(l-ethyl-3-(4-azonia-4,
4-dimethyIpentyI)carbodiimide)。此外,通過與銨離子的反應(yīng),可將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰。通常將谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基在中性或堿性條件下去酰胺化，分別生成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基的去酰胺形式在該發(fā)明公開范圍內(nèi)。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲胺?；蛱K氨酰殘基上羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸α氨基的甲基化(Creighton,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子特性，W.H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983)),以及 N 末端氛基的乙酸化和任意 C末端羧基的酰胺化。另一類共價修飾涉及到通過化學(xué)或酶促反應(yīng)，將糖苷、糖、糖類等偶聯(lián)到值得關(guān)注的分子上。根據(jù)所使用的偶聯(lián)方式，可將糖連接于Ca)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(C)游離巰基，如半胱氨酸的巰基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳香族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的殘基；或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法參見 WO 87/05330 和 Aplin & ffriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981)。還可使用酶促方法添加糖基，如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶等。通過化學(xué)或酶促方法，可以實現(xiàn)將存在于值得關(guān)注的分子上的糖基部分去除。舉例來說，化學(xué)去糖基化需要將該分子暴露于三氟甲磺酸或其等效化合物中，導(dǎo)致除連接糖(Iinkingsugar) (N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或全部糖基解離，而保持分子其他部分的完整性?；瘜W(xué)去糖基化參見，如Hakimuddin et al. , Arch. Biochem.Biophys. 259:52 (1987)和 Edge etal. , Anal. Biochem. 118:131 (1981)。通過各種任何的內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶，可以實現(xiàn)用酶促法將分子上的糖基部分切割，參見Thotakuraetal. , Meth. Enzymol. 138:350 (1987)。從而,可以使用甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶、氨基葡萄糖苷酶、半乳糖甘酶等。利用常規(guī)方法(例如，利用能夠特異性結(jié)合相關(guān)基因的寡核苷酸探針，Innis等，參見 PCR 手冊方法與應(yīng)用指導(dǎo)，Academic (1990)和 Sanger et al. , Proc. Natl. Acad.Sci. 74:5463 (1977))，可輕松分離編碼流感病毒HA、NA等的RNA或DNA，并測序。分離后，可將DNA置于表達載體中，然后將載體置入宿主細胞，如大腸桿菌細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，在重組的宿主細胞中獲得合成的值得關(guān)注的蛋白質(zhì)。RNA或DNA也可進行修飾，例如，通過堿基替換以優(yōu)化特定宿主細胞內(nèi)的密碼子使用，或者通過共價連接異源多肽的編碼序列。因此，如本文所述，編碼和表達一個或多個免疫性減弱表位的值得關(guān)注的多核苷酸可參照分子生物學(xué)和本領(lǐng)域所知的重組材料與方法進行表達，以獲得值得關(guān)注的重組多肽的來源。 在另一個實施例中，編碼一個或多個免疫性減弱表位的值得關(guān)注的多核苷酸可替換流感病毒基因組中的同源野生型序列，得到表達一個或多個免疫性減弱表位的病毒、病毒樣結(jié)構(gòu)或亞單位。因而，可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對該病毒株進行增殖，如目前使用的基于雞蛋的技術(shù)，產(chǎn)生免疫原，其可作為疫苗單獨使用，或與其他活性制劑，如未修飾的病毒或多個病毒(如模擬目前的二價與三價疫苗)聯(lián)合使用。流感病毒、抗原、組分、亞單位、HA、NA等的“功能性片段、部分、變體、衍生物或類似 物”等及其組合的這些詞組術(shù)語及組合與某個元素相關(guān)，該元素的生物學(xué)活性在定性上與野生型、母體元素或原始非免疫性減弱的抗原一樣，這些是變體、衍生物、類似物等的來源。例如，HA的功能性部分、片段或類似物可與天然HA —樣刺激免疫應(yīng)答，盡管其應(yīng)答可能針對的是HA上的不同表位。因此，包含在該發(fā)明公開范圍內(nèi)的是病毒的功能性等效物，或值得關(guān)注的部分或衍生物。術(shù)語“功能性等效物”包括病毒和能夠刺激針對流感病毒的免疫應(yīng)答的部分。因此，一旦確定了候選的免疫性減弱多肽后，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能很好地對該氨基酸序列進行修飾，同時使其保持免疫性減弱的目的，以及暴露原先沉默的表位。因此，例如，可將編碼核酸進行修飾，使其在不對這兩個目的產(chǎn)生不利影響的條件下編碼氨基酸插入、刪除或替換。在另一個實施例中，只要不對這兩個目的產(chǎn)生不利影響，可參照本領(lǐng)域所知操作材料與方法將氨基酸進行修飾、衍生化、替換等。如本文所述，認為對原始免疫性減弱多肽的這些改變與修飾是功能等效的。免疫性減弱的程度可按照本文所述或本領(lǐng)域所知的在體外或動物試驗中進行定量。類似地，對原先沉默表位產(chǎn)生應(yīng)答的程度可按照本文所述或本領(lǐng)域所知的在體外或動物試驗中進行定量。當(dāng)對原始免疫性減弱序列進行修飾時，本文所述兩個目的中的一個在程度上可以接受的下降程度是一種設(shè)計選擇。一般來說，反應(yīng)性不超過25%的降低是可以容忍的，因為正常情況下，要求是對免疫優(yōu)勢表位的反應(yīng)盡可能低。因此，如果對原始免疫性減弱序列的修飾顯示，與在原始免疫性減弱表位中無反應(yīng)性相比，例如通過使用免疫優(yōu)勢表位抗體的ELISA確定，例如恢復(fù)了 25%的反應(yīng)性，則認為對于功能性等效物來說其反應(yīng)性降低是可以接受的。對免疫性減弱抗原的功能性等效物，可以認為降低不超過20%、15%、10%、5%或者不降低是可以接受的。類似地，對于現(xiàn)在針對原先沉默表位的反應(yīng)性，降低不超過25%是可以耐受的，因為正常情況下，要求是對原先沉默表位的反應(yīng)盡可能高。因此，如果對原始免疫性減弱序列的修飾顯示，與在原始免疫性減弱表位中最大反應(yīng)性相比，例如通過使用針對原先沉默表位抗體的ELISA確定，例如喪失了25%的反應(yīng)性，則認為對于功能性等效物來說其反應(yīng)性降低是可以接受的。對于原先表達沉默表位的抗原能性等效物，可以認為降低不超過20%、15%、10%、5%或者不降低是可以接受的。
流感病毒值得關(guān)注的部分，如攜帶HA、NA、M2及其組合的包膜或非包膜制劑，以及任何其他流感病毒抗原制劑，均可通過本領(lǐng)域所知的方法獲取。當(dāng)去除或減弱一個或多個非保護性的免疫優(yōu)勢表位(IDNPEs，其包括刺激產(chǎn)生病毒株特異性的、但范圍較窄的免疫力的表位)時，例如，通過分子內(nèi)修飾(如刪除、電荷改變、添加一個或多個N-聯(lián)序列子等)并作為抗原注入未免疫動物，對IDNPE的改變可在B細胞和/或T細胞水平誘導(dǎo)新層次的針對亞優(yōu)勢或原先沉默表位的免疫應(yīng)答(Garrity et al. , J. Immunol. (1997)159 (1):279_89)。這里所描述的技術(shù)被稱為“免疫再聚焦” 。一旦進行了改變，不管其改變是否，例如降低了目前已修飾的免疫優(yōu)勢表位的反應(yīng)性，減弱的表位、抗原等參照本文或本領(lǐng)域所知的進行確定。通過確定減弱抗原和與優(yōu)勢表位反應(yīng)的抗毒血清的反應(yīng)性，例如利用ELISA或Western blot，可對其進行體外試驗。顯示反應(yīng)性降低的候選者與明確的抗毒血清被選擇用于體內(nèi)試驗，以確定這些減弱抗原是否有免疫原性，以及宿主是否對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，例如，如本領(lǐng)域所知將小鼠進行免疫以減弱抗原，收獲血清并立即在體外檢測其反應(yīng)性。然后用野生型病毒測試抗毒血清，確定抗體是否仍可識別野生型表位或野生型抗原。這可以通過例如ELISA或Western blot進行。后者的信息眾多，可顯示是否結(jié)合了特定的免疫優(yōu)勢表位，以及抗毒血清是否仍可與流感病毒反應(yīng)，攜帶與小鼠抗毒血清反應(yīng)表位分子的大小，以及有可能明確其身份。免疫再聚焦疫苗候選設(shè)計成準(zhǔn)確折疊，并采用類似天然的構(gòu)象表位，用于刺激合適的免疫應(yīng)答?？乖瓬y試前，通常要先評估純化HA抗原結(jié)合到構(gòu)象依賴性抗體和細胞表面的病毒受體的能力。評估該相互作用的方法是本領(lǐng)域所熟知的，并被廣泛采用。將免疫再聚焦抗原發(fā)展為商業(yè)化疫苗前，通常需要進行非臨床試驗。一種方法是用免疫再聚焦候選疫苗注射或免疫動物，如小鼠、豚鼠、兔、雞、大鼠、雪貂等。免疫接種后，對這板免疫血清的多種活性進行評估，包括對純化抗原或病毒的反應(yīng)性(結(jié)合活性)，血凝抑制(病毒-受體作用的抑制，HI)和病毒中和(培養(yǎng)細胞感染的抑制和/或培養(yǎng)細胞內(nèi)復(fù)制的抑制，VN)。評估血清反應(yīng)性的方法是本領(lǐng)域所熟知的。將以免疫再聚焦抗原接種動物的血清與以未突變抗原接種動物血清的異源性HI和VN活性進行比較，用于評估保護性免疫的展寬(tooadening)和改善。因此，用抗原性研究中生成的多種免疫血清對流感病毒HlNl或其他血清型的異源性病毒株的HI和VN進行檢測。相對于未修飾抗原接種產(chǎn)生的血清，測試血清中HI或VN滴度上升表明用于產(chǎn)生上述測試血清的抗原可刺激免疫力的拓寬和提高。為進一步舉例說明對值得關(guān)注的候選疫苗選擇的分析范例，圖I中的表I提供了假設(shè)的數(shù)據(jù)集。檢測來自于A/California/04/2009病毒株的免疫再聚焦HA抗原(Mut HI,Mut H2，Mut H3和Mut H4)并檢測其對同源性和異源性病毒的抗病毒活性。異源性病毒(病毒株2-4)按來自親代California/04/2009 (Cal/04/09)病毒株的抗原趨異(antigenicdivergence)增加d順序進行描述。所有免疫原刺激的HI和VN滴度均等效于由未修飾抗原(WT-HA)誘導(dǎo)的滴度。通過兩者的檢測確定，在統(tǒng)計學(xué)上，來自Mut-Hl的血清所包含的對病毒株2-4的抗病毒活性水平高于WT-HA的滴度。來源于Mut-H2和Mut_H3的血清對病毒株2有2倍的HI和VN活性滴度，但是如果血清以2倍梯度稀釋進行稀釋，則可能無統(tǒng)計學(xué)意義。不過，來源于Mut-H2和Mut-H3的血清，其針對更趨異的病毒株3和4的HI和VN滴度明顯更高。表I中對這些數(shù)據(jù)的分析表明，Mut-Hl或Mut-H2可刺激最高水平的抗病毒活性，正常情況下，在流感臨床前試驗中，其作為相關(guān)性而測量。為進一步評估免疫再聚焦候選抗原的保護性免疫，可進行更多的動物模型研究。在一個這種試驗例子中，雪貂組分別用未修飾的抗原或首選的免疫再聚焦候選進行免疫(如列于表I的Mut-H2)。免疫后，將兩組雪貂分成亞組，并且每一亞組用流感的同源性或異源性病毒株進行接種(激發(fā))，如表I所示。在激發(fā)后的兩周內(nèi)，收集發(fā)病、發(fā)病機制和病毒復(fù)制的測量值。對測量值的分析顯示，相比以WT-HA免疫的組，以Mut-H2免疫和以異源性病毒株激發(fā)的雪貂，其發(fā)病和病毒復(fù)制下降，表明Mut-H2可刺激產(chǎn)生更廣的免疫力，可作為一種改進的候選疫苗。與已知的結(jié)合到母體免疫優(yōu)勢抗原的抗毒血清很少或不再與候選免疫性減弱抗原反應(yīng)，但在宿主內(nèi)仍保留免疫原性的候選免疫性減弱抗原，被選擇作為用于進一步測試的候選疫苗。候選疫苗在針對免疫再聚焦表位用于免疫識別的同時，也可刺激強化對母體免疫優(yōu)勢抗原的反應(yīng)性。例如，在標(biāo)準(zhǔn)化的基于抗病毒檢測中，可用多種流感病毒株測試小鼠抗毒血清對其的反應(yīng)性，確定該抗體反應(yīng)的通用性，即減弱抗原上新識別的表位是否通 用于更大范圍的流感病毒株，以及該抗體是否有廣譜的抗病毒活性。因此，重組HA(rHA)亞單位蛋白疫苗足以防護流感病毒同源性病毒株的激發(fā)。rHA也可用作老年人的免疫原。如本文所述，第二代免疫再聚焦HA亞單位疫苗也可誘導(dǎo)針對異源性病毒株的保護性免疫(Treanor et al. , J. Infectious Diseases 2006;193:1223-8)。因此，例如，一種值得關(guān)注的候選疫苗不僅可對同源抗原產(chǎn)生保護，如H1，也可對HI的不同系或分離株，如H2，H3，H4等產(chǎn)生保護。在一個實施例中，流感病毒的HA和NA被選擇作為宿主免疫應(yīng)答HA和NA上的其他非優(yōu)勢位點的再聚焦靶位，作為新的免疫保護性應(yīng)答的靶位，優(yōu)選是大范圍和廣譜的應(yīng)答中的一個，對各種病毒株等均有活性。例如，HA有5個免疫優(yōu)勢位點或表位，稱為A-E。位點A包括HA型病毒株140-146位的氨基酸，序列為KRRSNKS (SEQ ID N0:1)。與香港病毒株相比，懷俄明病毒株(Wyomingstrain)在該位點已有3個糖基化位點與之相關(guān)。因此,一種方法是去除位點A所確定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，例如，將KRRSNKS (SEQ ID NO: I)序列替換為GG。位點B包括HA的189-197位氨基酸，序列為SDQISLYAQ (SEQ ID NO: 2)。其形成螺旋狀，與158-161位序列為KYKY (SEQ ID NO:3)的氨基酸相互作用。B位點可進行許多可能的變化，如用NAS替代QIS ;用NIT替代SLY ;在158位用NST替代KYK ；以及在159位用NAS替代YKY，在這4個位點的所有這些變化均引入了一個N-糖基化。位點C包括276-278位的氨基酸，序列為KCN。NCT可替代KCN。位點D包括201-220位氨基酸的一個大的反向平行環(huán)。整個環(huán)可被刪除。而且，糖基化位點NIT可替代201-203位的RIT。位點E包括79-82位的氨基酸，序列為FQNK (SEQ ID N0:4)。糖基化位點NET可替代QNK。上述變化可進行聯(lián)合，例如，B位點NST和NTS的變化均可與所建議的C和/或E位點的示范性變化進行聯(lián)合。如本文所述，并如本領(lǐng)域所知，上述免疫優(yōu)勢位點的變化可通過克隆、定點誘變、基因合成擴增等獲得。
因此，上述A位點變化可由定點誘變獲得，使用的引物為A頂部GGAACAAGCTCTGCTTGCggcggtTTCTTTAGTAGATTGAATTGG(SEQ ID NO: 5)以及 A 底部CCAATTCAATCTACTAAAGAAaccgccGCAAGCAGAGCTTGTTCCCSEQ ID NO:6)，用來獲取包含上述刪除的序列 GTSSACGGFFSRLN(SEQ ID NO:7)和在刪除位點插入GG 二肽。B位點的變化可利用以下引物獲得，BI頂部CAAATCAGCCTATATGCTaatGCATCAGGAAGAATCAC (SEQ ID NO:8)以及 BI 底部GTGATTCTTCCTGATGCattAGCATATAGGCTGATTTG (SEQID 勵:9)，產(chǎn)生的序列為0151^八嫩561 1 (SEQ ID NO: 10);引物 B2 頂部CACCACCCGGTTACGGACaatGACacAATCAGCCTATATGCTCAAGC (SEQ ID NO: 11)以及 B2 底部GCTTGAGCATATAGGCTGATTgtGTCattGTCCGTAACCGGGTGGTG (SEQ IDNO: 12)，產(chǎn)生的序列為 HHPVTDNDTISLYAQ (SEQ IDN0:13);引物 B3 頂部CGGACAGTGACCAAATCAatCTAtcTGCTCAAGCATCAGGAAG (SEQ ID NO: 14)以及 B3 底部CTTCCTGATGCTTGAGCAgaTAGatTGATTTGGTCACTGTCCG (SEQ ID NO: 15)，產(chǎn)生的序列為 DSDQINLSAQASG (SEQ ID NO: 16);引物 B4 頂部GAATTGGTTGACCCACTTAAAtTACAcATACCCAGCATTGAACGTGAC (SEQ ID NO: 17)以及 B4 底部GTCACGTTCAATGCTGGGTATgTGTAaTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ ID NO: 18)，產(chǎn)生的序列為 NWLTHLNYTYPALNV (SEQ ID NO: 19);弓I物 B5 頂部GAATTGGTTGACCCACTTAAAAaACAAAacCCCAGCATTGAACGTGACTATG (SEQ IDNO: 20)以 及 B5 底部CATAGTCACGTTCAATGCTGGGgtTTTGTtTTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ IDN0:21),產(chǎn)生的序列為 NWLTHLKNKTPALNVTM (SEQ ID N0:22)。C位點的變化可利用以下引物獲得，Cl頂部GATCAGATGCACCCATTGGCAAtTGCAgTTCTGAATGCATCACTCC (SEQ ID NO:23)以及 Cl 底部GGAGTGATGCATTCAGAAcTGCAaTTGCCAATGGGTGCATCTGATC (SEQ IDNO:24)，產(chǎn)生的序列為 SDAPIGNCSSECIT (SEQ ID N0:25)。D位點的變化可利用以下引物獲得，Dl頂部CTATATGCTCAAGCATCAGGAAatATCACAGTCTCTACCAAAAG (SEQ ID NO:26)以及 Dl 底部CTTTTGGTAGAGACTGTGATatTTCCTGATGCTTGAGCATATAG (SEQ 10勵:27)，產(chǎn)生的序列為1^六0六56[175110 (SEQ ID N0:28)。E位點的變化可利用以下引物獲得，El頂部GATGGCTTCCAAAATAAGAcATGGGACCTTTTTGTTGAAC (SEQ ID NO:29)以及 El 底部GTTCAACAAAAAGGTCCCATgTCTTATTTTGGAAGCCATC(SEQ ID N0:30)，產(chǎn)生的序列為DGFQNKTTOLFVE (SEQ ID N0:31)。HAS I:CAGTCCTCATCAGATCCTTG (SEQ ID N0:32^PHAS2:GGTAAGGGATATCTCCAGCAG(SEQ ID NO:33)引物可用于測序,HAS3:cgcgattgcgccaaatatgcc (SEQ ID N0:34)作為陰性對照。多個抗原性位點有豐富的帶電荷氨基酸殘基。另一種方法是用丙氨酸殘基替代那些帶電荷的殘基。這種變化的例子包括A位點用AGA替代KRR ；B位點用AYKY (SEQ IDN0:35)替代 KYKY (SEQ ID N0:3)以及用 SAQI (SEQ ID N0:36)替代 SDQI ;C 位點用 ACN 替代KCN ；D位點用AIT替代RIT0此外，在B位點用來評估疏水性酪氨酸殘基功能的突變可由SLT替換SLY獲得。除B細胞表位外，T細胞表位也可進行免疫性減弱。177-199位殘基區(qū)域的主要OT4表位包括已靶定B位點外的一個MHC II類結(jié)合表位。使T細胞應(yīng)答減弱的LYIWGVHHP(SEQID NO: 37)殘基突變包括 VYIW (SEQ ID NO: 38)或 VTIW (SEQ ID NO: 39)替代 LYIW ;以及 IHAG (SEQ ID NO:40)替代 VHHP。在另一個實施例中，包含一個或多個免疫性減弱表位的值得關(guān)注的重組多肽，或者包含相同表位的載體，如病毒樣顆粒、病毒的亞單位組分，可用作獲得特異性抗體或抗毒血清的免疫原，該抗體或抗毒血清可識別表位，這些表位因免疫優(yōu)勢表位的免疫性減弱而變得不正常，但有免疫原性。利用本領(lǐng)域已知的材料與方法可制備該抗體，因此其可為多克隆性的，通過免疫動物并收集血清獲得，或者從暴露于相同病毒的人體中獲得，類似于目前使用的免疫球蛋白，或可為單克隆性的，按照已知的材料與方法獲得。獲取人源性或人類抗體的操作方法，以及改造上述抗體以盡可能減小免疫原性是有益的，如添加糖基(如PEG分子和其他取代基)以掩蓋該流感抗體上非正常免疫優(yōu)勢表位的免疫原位點，如本領(lǐng)域所知，參照例如美國專利US 5，821，337和WO 09/32661?？勺鳛楸粍右呙?passive vaccine)收集和管理該抗體。測試時，例如將值得關(guān)注的免疫原注入非人類哺乳動物，以獲取臨床前數(shù)據(jù)。典型的非人類哺乳動物包括非人類靈長類、犬類、貓類、嚙齒類和其他哺乳動物。這些哺乳動物可以是已經(jīng)建立的動物模型，用于以配方治療某一疾病的的動物模型，或者用于研究值得關(guān)注的免疫原的毒性。這些實施例中，均可在哺乳動物中進行劑量遞增研究?！楂@得如美國食品藥品管理局或歐洲藥品局等監(jiān)管機構(gòu)對人類制品的批準(zhǔn)，生物制藥必須符合有關(guān)監(jiān)管機構(gòu)規(guī)定的純度、安全性和效能標(biāo)準(zhǔn)。為生產(chǎn)符合這些標(biāo)準(zhǔn)的疫苗，可將重組微生物保存于培養(yǎng)介質(zhì)中，如認證的無傳染性海綿狀腦病(以下稱為“TSE”)的介質(zhì)。例如，包含疫苗編碼序列的質(zhì)?？蓴y帶非抗生素的選擇標(biāo)記，因為并不總能理想地利用抗生素抗性標(biāo)記來選擇和維持細菌內(nèi)的質(zhì)粒，該細菌被設(shè)計用于人體，盡管優(yōu)選的實施例與重組亞單位疫苗的使用有關(guān)。因而，在一個實施例中，本發(fā)明公開提供了一個選擇策略，其中例如，利用一種分解酶作為選擇標(biāo)記，使細菌能夠在含有上述分解代謝酶底物作為碳源的培養(yǎng)基上生長。這種分解酶的例子包括但不限于編碼乳糖攝取和半乳糖甘酶的 IacYZ (GenBank Nos. J01636, J01637, K01483or K01793)。其他在確定成分的培養(yǎng)基中提供代謝優(yōu)勢的選擇標(biāo)記包括但不限于利用半乳糖的galTK(GenBank No. X02306)，利用蔗糖的 sacPA (GenBankNo. J03006),利用海藻糖的 trePAR (GenBankNo. Z54245),利用木糖的xyIAB (GenBank No. CAB 13644 and AAB41094)等?；蛘?，其選擇還可涉及反義mRNA的使用，以抑制毒性等位基因，如sacB等位基因(GenBank No. NP 391325)。用于配制新型疫苗和上述制劑的具體方法對于本發(fā)明公開并不是關(guān)鍵性的，可以從下面選擇或可以包括一種生理緩沖液(Feigner et al. , U. S. Pat. No. 5, 589, 466(1996));磷酸招或輕基磷酸招(如Ulmer et al. , Vaccine, 18:18 (2000));單磷酰脂A (也稱為 MPL 或 MPLA ;Schneerson et al. , J. Immunol. , 147:2136-2140 (1991);如 Sasaki etal. , Inf. Tmmunol. , 65:3520-3528 (1997);以及 Lodmell et al. , Vaccine, 18:1059-1066(2000)) ;QS-21 皂苷(如 Sasaki et al. , J. Virol. , 72:4931 (1998));地塞米松(如 Maloneet al. , J. Biol. Chem. 269:29903( 1994))；CpG DNA序列(Davis et al. , J. Tmmunol. , 15:870(1998));干擾素-a (Mohanty et al. , J. Chemother. 14 (2) :194-197, (2002));脂多糖(LPS)拮抗劑(Hone et al. , J. Human Virol. , 1:251-256 (1998))等。使用商業(yè)化的佐劑也是一個設(shè)計選擇，如本領(lǐng)域所知。由于值得關(guān)注的免疫再聚焦技術(shù)不依賴于佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑，通過本文所述方法產(chǎn)生的抗原或可與其反應(yīng)的抗體與下列佐劑是相容的，如招膠和Novartis與GlaxoSmithKline等公司開發(fā)的新型合成物(如MF59和AS03)，以及調(diào)節(jié)劑和增強劑，如CpG和細胞因子。此處的制劑還可能包含超過一種的活性化合物，其為處理特定的適應(yīng)癥(indication)所必需，優(yōu)選是那些具有互補活性而不對彼此造成不利影響的化合物。例如，理想的是還可進一步提供佐劑。這些分子可適當(dāng)?shù)匾赃_到預(yù)期目的的數(shù)量聯(lián)合呈現(xiàn)。在給予抗原之前或之后，可依次施用佐劑。值得關(guān)注的免疫原可與第二組分一起使用，如治療部分與同一分子連接或混合，作為治療劑以綴合物(conjugate)施用、作為治療劑兩組分分開一起施用、作為治療劑在施用前混合等等，例如見Levine等主編的《新一代疫苗》,2nd Marcel Dekker, Inc. , NewYork，NY，1997。其他治療性制劑可為用于實現(xiàn)預(yù)期目的的任何藥物、疫苗等。因此，其治療性制劑可為生物小分子等。值得關(guān)注的免疫原可與第二流感免疫原成分、第三種第二流感免疫原成分等同時施用或依次施用，如可減弱其免疫性或不減弱。因此，值得關(guān)注的免疫性減弱抗原可與存在的疫苗進行聯(lián)合，形成二價疫苗、三價疫苗，等等，但是當(dāng)存在的疫苗是在雞蛋中生產(chǎn)時，應(yīng)避免使用這種方法?；蛘撸档藐P(guān)注的免疫性減弱抗原可與多種其他抗 原、亞單位、組分、病毒樣顆粒等進行聯(lián)合，形成多價疫苗。術(shù)語“小分子”及類似術(shù)語包括但不限于肽、模擬肽(P印tidomimetics)、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、碳水化合物、脂質(zhì)、核苷酸、核苷類似物、分子量低于10，000g/mol的有機或無機化合物(即包括雜原子有機化合物(heterorganic)和/或金屬有機化合物)、分子量低于5，000g/mol的有機或無機化合物、分子量低于1，000g/mol的有機或無機化合物、分子量低于500g/mol的有機或無機化合物、鹽類、酯類及其組合以及這些化合物在藥物學(xué)上可接受的其他形式，其可以刺激免疫應(yīng)答或有免疫原性，或具有所期望的藥理活性。因此，該發(fā)明公開中的免疫原可單獨施用，或聯(lián)合其他類型的治療施用，包括第二次免疫或治療該疾病的處理。其第二組分可以是一種免疫刺激劑。此外，本發(fā)明公開中的免疫原可與多種效應(yīng)分子進行連接，效應(yīng)分子如異源多肽、藥物等，見 WO 92/08495 ；W0 91/14438 ；W0 89/12624 ;U. S. Pat. No. 5，314，995 ;以及 EPO396，387。免疫原也可連接到一治療部分，如抗生素(一種治療制劑)或佐劑。該發(fā)明公開中的治療性化合物至少可減輕一種流感相關(guān)癥狀。該發(fā)明公開中的產(chǎn)品可以藥物學(xué)上可接受的成分來提供，如本工藝或本文所述。術(shù)語“生理上可接受的”、“藥物學(xué)上可接受的”等的意思是由聯(lián)邦或州政府監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)用于人體，或者列于美國藥典或其他公認的藥典中?？梢匀魏慰山邮艿姆绞?，將值得關(guān)注的產(chǎn)品施用到哺乳動物。導(dǎo)入的方式包括但不限于胃腸外、皮下、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服路徑，如果需要免疫抑制治療，也可病灶內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。其產(chǎn)品或成分可通過任意方便的路徑給藥，如輸注或靜脈團注(bolus injection),可通過上皮或皮膚黏膜內(nèi)層(如口腔黏膜、直腸與小腸黏膜等)吸收，還可與其他生物活性制劑共同給藥?？梢匀斫o藥，也可局部給藥。此外，通過任意合適的路徑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)入本發(fā)明公開中的治療性產(chǎn)品或成分也是可取的，路徑包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；例如腦室內(nèi)注射可通過連接于貯存器的腦室內(nèi)導(dǎo)管協(xié)助，如0_&)^貯存器。此外，該產(chǎn)品還可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^脈沖輸注進行給藥，特別是值得關(guān)注的產(chǎn)品的劑量下降時。優(yōu)選的給藥方法是注射，優(yōu)選是靜脈內(nèi)或皮下注射，其部分取決于給藥是短暫的還是長期的。
在當(dāng)前的發(fā)明公開中，已知其他多種輸送系統(tǒng)可用于產(chǎn)品的給藥，包括封裝于脂質(zhì)體、微粒或微膠囊內(nèi)(見 Langer, Science 249:1527 (1990) ；Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein et al. , (1989))。通過凝聚技術(shù)(coascervation techniques)或界面聚合制備微膠囊,如輕甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚甲基丙烯酸酯微膠囊，將活性成分包裹其內(nèi)，分別用于膠狀藥物輸送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或粗乳液。這些技術(shù)發(fā)表于 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)。也可采用肺部給藥，如通過使用吸入器或霧化器，并與霧化劑進行配制。值得關(guān)注的成分也可以干性粉末狀成分的形式給入患者的肺部，見美國專利US 6，514，496。對需要治療的區(qū)域，局部施用本發(fā)明公開中的治療性產(chǎn)品或成分是可取的。這可通過例如，局部注入、局部施用、利用注射，利用導(dǎo)管、栓劑或植入物實現(xiàn)，但并不局限于此，上述植入物可為有孔、無孔或凝膠狀材料(包括水凝膠或薄膜，如硅橡膠薄膜或纖維)。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明公開中的產(chǎn)品時，需要特別關(guān)注哪些材料是蛋白質(zhì)吸收的，哪些是無法吸收的。在又一實施例中，該產(chǎn)品可通過控制釋放系統(tǒng)輸送。一個實施例中，可使用泵(見 Langer, Science 249:1527 (1990) ；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987) ；Buchwald et al. , Surgery 88:507 (1980);以及 Saudek et al. , NEJM 321:574(1989))。在另一實施例中，可使用聚合材料(見Medical Applications of ControlledRelease, Langer et al.,eds. , CRC Press (1974) !Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance, Smolen et al. , eds. , Wiley (1984) ；Ranger etal. , J. MacromoI. Sci. Rev. MacromoI. Chem. 23:61 (1983);也可見于 Levy et al. , Science228:190 (1985) ；During et al. , Ann. Neurol. 25:351 (1989);以及 Howard et al. , J.Neurosurg. 71:105 (1989))。在又一實施例中，控制釋放系統(tǒng)可置于治療目標(biāo)附近。緩釋制劑是為與值得關(guān)注的產(chǎn)品一起使用而準(zhǔn)備的。緩釋制劑的合適實例包括含有免疫原的固態(tài)疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)為成形的制品，如薄膜或基質(zhì)。這種緩釋制劑基質(zhì)的合適實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2 —羥乙基丙烯酸甲酯)、聚乙烯醇)、聚乳酸(美國專利US 3，773，919)丄-谷氨酸與乙基-1^-谷氨酸(的1^1-1^11此&111&仏)共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如乳酸-乙醇酸共聚物組成的可注射微球)和聚-D- (-)-3-羥基丁酸。雖然乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物可使分子的釋放時間超過100天，但某些水凝膠可在較短的時間內(nèi)釋放出細胞、蛋白質(zhì)和產(chǎn)品。根據(jù)所涉及的機制，可為穩(wěn)定性設(shè)計出合理的策略。成分(compositions)的形式可以是溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑、長效藥劑(depots)等。該成分可與傳統(tǒng)的粘合劑(binder)與載體如甘油三酯共同配制成栓劑?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸續(xù)等。合適的載體的實例如Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences所述。這些成分含有有效量的免疫原，優(yōu)選的是純的形式與適當(dāng)量的載體組合，以為患者提供適當(dāng)?shù)慕o藥形式。如本領(lǐng)域所知，該制劑將按照合適的給藥模式而構(gòu)造。
可通過將具有理想純度的產(chǎn)品與任選藥物學(xué)上可接受的的載體、稀釋劑、賦形劑或穩(wěn)定劑進行混合，制備該產(chǎn)品的治療性制劑，以作為凍干制劑和水溶液用于儲存。本工藝通常采用緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑(18010111；^6『8)、非離子型洗漆劑、抗氧化劑及其他各種添加劑，見Osal主編的《Remington制藥科學(xué)》16版(1980)。這些添加劑使用的劑量和濃度通常對接受者是無毒的，因此賦形劑、稀釋劑、載體等的是藥物學(xué)上可接受的，或被普遍認為是安全的。得到或制造的免疫再聚焦多肽(其包括抗原、抗原一部分、表位、決定基等，可以以亞單位進行生產(chǎn)，基本上不含污染蛋白(其包括其他流感蛋白，聯(lián)合其他病毒或非病毒多肽);作為值得關(guān)注的IR多肽，其可在重組病毒中、病毒樣顆粒中，或者聯(lián)合病毒或細胞來源的一種或多種蛋白質(zhì)表達或制造；作為IR多肽，可作為一孤立分子表達或制造，然后與病毒或細胞來源的一種或多種蛋白質(zhì)聯(lián)合；等等，或者其抗體)基本上是純化的形式。“孤立的”或“純化的”免疫原或疫苗基本上沒有來自培養(yǎng)基的污染蛋白，其培養(yǎng)基為免疫原或疫苗獲得的來源，或者基本上在培養(yǎng)基中沒有化學(xué)前體和其他化學(xué)物質(zhì)，其包含化學(xué)合成的組分。術(shù)語“基本上無亞細胞物質(zhì)”包括細胞制劑，其中細胞被破壞，形成可從細胞的亞細 胞組分中分離的組分，包括死細胞及細胞部分，如細胞膜、形骸細胞等，其內(nèi)可分離免疫原或疫苗，或進行重組生產(chǎn)。因此，基本上無亞細胞物質(zhì)的免疫原或疫苗包括亞細胞污染物或任意其他不同于值得關(guān)注的產(chǎn)品的要素(element)低于30%，25%，20%, 15%，10%, 5%，2. 5%或1% (干重)的免疫原或疫苗。本文中，在含有免疫原或疫苗的液體制劑的背景下使用的術(shù)語“穩(wěn)定性”和“穩(wěn)定”是指制劑中的免疫原或疫苗在給定的生產(chǎn)、制備、運輸和儲存條件下，如I個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間對熱量和化學(xué)聚集、降解或碎裂的抵抗力。該發(fā)明公開中，“穩(wěn)定”的制劑在給定的生產(chǎn)、制備、運輸和儲存條件下，保持的生物活性等于或大于80%，85%，90%, 95%，98%，99%或99. 5%。上述免疫原或疫苗制劑的穩(wěn)定性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法對聚集度、降解度或碎裂度進行評估，包括物理觀察對比參照物，如通過顯微鏡、顆粒大小與計數(shù)測定等，但并不局限于此。術(shù)語“載體”是指與治療藥物共同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載劑。這種生理學(xué)載體可為無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥用成分通過靜脈內(nèi)給藥時，水是一種合適的載體。鹽溶液、葡萄糖溶液和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙醇等。如果有需要，其成分也可包含少量潤濕劑或乳化劑，或者PH緩沖劑。載體可包括一種鹽和/或緩沖劑。緩沖劑有助于維持pH在接近生理條件的范圍內(nèi)。緩沖最佳的濃度范圍大約為2mM-50mM。本發(fā)明公開中使用的合適緩沖劑包括有機酸和無機酸及其鹽，如檸檬酸鹽緩沖液(如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖液(如延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖液(如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)以及乙酸鹽緩沖液(如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。也可使用磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、三甲胺鹽緩沖液如Tris、HEPES和其他已知緩沖液。添加防腐劑可延緩微生物生長，其添加量的范圍為0.2%_1% (w/v)。本發(fā)明公開中使用的合適防腐劑包括苯酚、芐醇、間甲酚、十八烷基二甲基芐基氯化銨、苯扎鹵化銨(benzyaconium halides)(如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六烴季銨、對輕基苯甲酸燒酯，如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。等滲劑可確保本發(fā)明公開中的液體成分的生理等滲性(physiologicalisotonicity)，其包括多元糖醇，特別是三元或更多元的糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多元醇可以占大約O. 1%-25%重量存在，優(yōu)選考慮大約1%_5%其他成分的相對量。穩(wěn)定劑是指一大類賦形劑，其功能范圍可從填充劑至溶解治療劑，或者幫助防止變性或附著于容器壁的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可為多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖類或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、阿拉伯糖醇、赤蘚醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、內(nèi)消旋肌醇(myoinisitol)，半乳糖醇、甘油及其類似物，包括環(huán)多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即〈10個殘基)；蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮、糖類、單糖，如木糖、甘露糖、果糖或葡萄糖；二糖，如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如葡聚糖等。穩(wěn)定劑存在的范圍為每部分免疫原O. 1-10，OOOw/w。其他多種賦形劑包括填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸或維生素E)和助溶劑。如本文所用的，術(shù)語“表面活性劑”是指具有兩親結(jié)構(gòu)的有機物質(zhì)，即由相反溶解性趨勢(opposing solubilitytendencies)的基團組成,通常為油溶性碳氫鏈和水溶性離子基團。根據(jù)表面活性基團的電荷，可將表面活性劑分為陰離子型、陽離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑通常被作為多種藥用成分和生物材料制劑的潤濕劑、乳化劑、增溶劑和分散劑。添加非離子型表面活性劑或洗滌劑(亦被稱為“潤濕劑”)有助于治療藥物的溶解，以及對治療性蛋白質(zhì)的攪拌誘導(dǎo)性聚集(agitation-induced aggregation)產(chǎn)生保護，也可使該制劑暴露于剪切面壓力的同時，不引起蛋白質(zhì)的變性。合適的非離子型表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊咯沙姆(polyoxamers) (184、188等)、PluronicR多元醇和聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚CTWEEN-20 、TWEEN-80 等)。非離子型表面活性劑的存在范圍大約為 0. 05mg/ml-l. 0mg/ml,優(yōu)選為 0. 07mg/ml_0· 2mg/ml。如本文所用的，術(shù)語“無機鹽”是指不含碳的任意化合物，其來自于酸或酸部分或全部氫原子被金屬或類似金屬作用的基團取代，在藥用成分和生物材料制劑中通常作為滲透壓調(diào)節(jié)化合物。最常用的無機鹽為NaCl、KCl、NaH2PO4等。本發(fā)明公開可提供pH 范圍大約為 5. 0-7. 0,5. 5-6. 5,5. 8-6. 2,6. 0,6. 0-7. 5 或
6.5-7. O的免疫原或疫苗液態(tài)制劑。本發(fā)明公開涵蓋的制劑，如液態(tài)制劑，在商業(yè)冰箱和醫(yī)生辦公室或?qū)嶒炇覂?nèi)冰柜中，在-20°C至5°C的溫度下較為穩(wěn)定。為了儲存的目的，通過顯微鏡分析評估上述穩(wěn)定性，達到60天、120天、180天、I年、2年或更長。通過顆粒分析，本發(fā)明公開中的液態(tài)制劑也表現(xiàn)出穩(wěn)定性，在室溫下至少為幾個小時，如使用前I個小時、2個小時或大約3個小時。稀釋劑的實例包括磷酸鹽緩沖鹽、在膀胱(bladder)內(nèi)緩沖胃酸的緩沖液，如含蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(pH 7. 4)、單獨的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7. 4)或者含抗壞血酸、乳糖或糖精的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.4)。載體的實例包括蛋白質(zhì)，如脫脂牛奶中的蛋白質(zhì)，糖，如 蔗糖，或者聚乙烯基吡咯烷酮。這些載體使用的濃度通常為O. 1-90% (w/v)，但優(yōu)選范圍為1-10% (w/v)0用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可通過無菌過濾膜的過濾實現(xiàn)。例如，本發(fā)明公開中的亞細胞制劑可通過過濾滅菌。如果是口服制品，值得關(guān)注的制劑可包括一種或多種食用香料、增香劑、香味劑、著色劑、表面活性劑、粘合劑等，為攝入提供一種更可口的形式。免疫原或疫苗成分的配方、分配劑量和給藥形式應(yīng)與良好的醫(yī)學(xué)實踐一致?？紤]的因素包括疾病嚴(yán)重度、正在治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床情況、疾病原因、藥物輸送部位、給藥方法、給藥清單(the scheduling of administration)以及其他醫(yī)生已知的因素。免疫原或疫苗的“治療有效量”的施用量將由這些考慮因素指導(dǎo)，并可以是，以防止、改善或治療目標(biāo)疾病、病癥或紊亂所必需的最小劑量?？乖蛞呙绲牧繛樽阋哉T導(dǎo)所需要的體液和/或細胞介導(dǎo)性免疫應(yīng)答或在目標(biāo)宿主內(nèi)產(chǎn)生保護性的量。本發(fā)明公開中給予免疫原或疫苗的量將取決于對象種類、宿主身體特征如年齡、體重等，優(yōu)選的輸送方式等。一般來說，采用的劑量大致為每劑10-1500 μ g。相比較而言，目前的亞單位制劑含有來自三種病毒亞型的元素。其三價疫苗通常含有約7-25 μ g的來自三種組成病毒株每種的HA。這可作為滴定值得關(guān)注的疫苗成分的起始點。如本文所用的，術(shù)語“有效量”是指足以降低目標(biāo)疾病嚴(yán)重度和/或持續(xù)時間、改善其一種或多種癥狀、防止目標(biāo)疾病進展或使目標(biāo)疾病消退的治療量，或足以預(yù)防目標(biāo)疾病或其一種或數(shù)種癥狀發(fā)展、復(fù)發(fā)、發(fā)作或進展的治療量。例如，基于基線或正常水平，值得關(guān)注的治療可以增加宿主的生存能力或降低疾病嚴(yán)重度至少5%，優(yōu)選是至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。在另一實施例中，治療或預(yù)防藥物的有效量可減少目標(biāo)疾病的癥狀，如減少流感癥狀或疾病持續(xù)時間至少 5%，優(yōu)選是至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。本文還使用了它的等價術(shù)語“治療有效量”。在必要的情況下，該成分還可以包括增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因或其他“卡因”結(jié)尾的麻醉劑，以減輕注射部位的疼痛。一般情況下，其成分都是以單位劑量的形式分別提供或混合提供，例如安瓿或小藥囊等密封容器中的凍干粉末或無水濃縮物，標(biāo)明其活性藥物的量。成分進行輸注給藥的情況下，可用含藥用級滅菌水或鹽水的輸液瓶進行分散。成分進行注射給藥的情況下，例如可在試劑盒中提供含注射用滅菌水或鹽水的安瓿，使其成分可在給藥之前進行混合?；蛘?，安瓿還可有含值得關(guān)注的活性藥物的液體，例如，作為使用前稀釋的濃縮物，或以預(yù)備好施用的形式存在。在另一實施例中，按照易于單次使用，提供合適劑量與體積的值得關(guān)注的配方。提供的是含有有利于對上述疾病治療的有用材料的生產(chǎn)制品。其生產(chǎn)制品可包括容器和標(biāo)簽。合適的容器包括瓶子、藥水瓶、注射器和試管。容器可由多種材料制造，如玻璃或塑料。該容器可容納值得關(guān)注的復(fù)合物，并可有一個無菌的接入口(例如，該容器可為靜脈內(nèi)注射溶液袋或含有塞子的藥水瓶，塞子可用皮下注射針刺穿)。容器上或與其相關(guān)的標(biāo)簽表明該成分用于治療流感。其生產(chǎn)制品可進一步包括一個二級容器，其內(nèi)含有可接受藥用的緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽、林格氏液或葡萄糖溶液。其可進一步包括從商業(yè)和用戶角度看來需要的其他材料，包括緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和插入使用說明的包裝。本發(fā)明公開還包括試劑盒，比如含有值得關(guān)注的免疫原性的或疫苗成分及其同系物、衍生物等，例如可作為主動或被動(active or passive)疫苗,使用說明的用處相同等。其說明可包括配備成分、衍生物等的指導(dǎo)。該成分可為液體形式，也可為固體形 式，一般情況下，為干燥的或凍干的。其試劑盒可含有合適的其他試劑，如緩沖液、重懸液(reconstituting solution)和其他預(yù)期用途的必需成分。預(yù)定量的試劑組合可以考慮連同其使用說明一起包裝，如用于治療。此外，還可包括其他添加劑，如穩(wěn)定劑、緩沖液等。各種試劑的相對量可以變化，所提供的是試劑溶液的濃縮物，為用戶提供靈活，節(jié)省空間與試劑等。試劑盒可包含輸送裝置，如含針頭的器械，如注射器，當(dāng)需要時，可任選地預(yù)裝值得關(guān)注的成分用于輸送。上面討論的任何參考文獻的引用均不應(yīng)解釋為認可這些參考文獻是本公開發(fā)明的的先有技術(shù)。本文引用的所有參考文獻均通過參考全文而引入本文?，F(xiàn)在通過下列非限制性例子舉例說明本發(fā)明公開。#ll I來自懷俄明株(H3N2)的8個免疫減弱和再聚焦血凝素基因如上述進行設(shè)計和處理。例如，通過定點誘變替換核苷酸，導(dǎo)入N-聯(lián)序列子，引起復(fù)雜的糖基修飾，和/或在5個含病毒株特異性表位的主要免疫原性的和高度變異的位點處，刪除氨基酸和/或改變氨基酸的電荷。通過每個變化，N-聯(lián)序列子的導(dǎo)入用于最大化免疫性減弱的尺度，特別在較大的抗原位點，減少所需減弱的野生型氨基酸變化的數(shù)量的同時，最小化對糖蛋白和受體結(jié)合區(qū)域構(gòu)象復(fù)雜性的任何影響。在某些情況下，只需要3個氨基酸的變化。抗原位點B(187-196)同時針對B細胞和⑶4輔助性T細胞IDNPEs。為加快研究，同時設(shè)計了 DNA和蛋白質(zhì)亞單位疫苗。對于DNA免疫接種，將全長的血凝素基因克隆入巨細胞病毒(CMV)啟動子后的pTriEx載體(Invitrogen)。pTriEx-ΗΑ構(gòu)造體(constructs)對哺乳動物細胞的瞬時轉(zhuǎn)染顯示類似于天然病毒蛋白的全長血凝素基因表達為三聚體，且可溶解在質(zhì)膜提取物中。用含8種突變和I種未修飾全長野生型HA糖蛋白的DNA構(gòu)造體對9組遠交小鼠進行免疫。第10組以空PTriEx載體免疫，作為陰性對照。除DNA表達載體外，還應(yīng)制造重組蛋白用于免疫。HA胞外域含有三聚體糖蛋白峰組配的區(qū)域和結(jié)合宿主細胞受體的區(qū)域。此外，除去其跨膜和胞漿域可引起重組HA三聚體釋放進入培養(yǎng)上清液。因此，每一種突變HA基因均在胞外域的末端切去末端，并克隆進入含有噬菌體T7啟動子的載體。胞外域載體轉(zhuǎn)染進入感染了重組痘苗病毒的細胞，該病毒可表達噬菌體T7RNA聚合酶，引起HA三聚體的產(chǎn)生，該HA三聚體分泌進入培養(yǎng)基。提純胞外域三聚體作為蛋白免疫原。對小鼠進行預(yù)先采血。一組小鼠作為陰性對照，另一組以未修飾(野生型)抗原進行免疫。在另一組實驗中，主要組(principal groups)的小鼠在每個股四頭肌注射10微克突變HA糖蛋白DNA (在O. ImL的無菌水中)進行免疫。小鼠休養(yǎng)5周后，推注進行二次DNA免疫。再過4-5周后，再次對小鼠推注提純的胞外域糖蛋白，進行兩處皮下免疫，每處10微克。弟一次蛋白質(zhì)免疫在弗氏完全佐劑中配制，弟_■次在弗氏不完全佐劑中配制。最終免疫后兩周，小鼠被安樂死，并采血析出血清。
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對血清的以下性質(zhì)進行檢測1)利用Western blot和ELISA的形式,測定其對突變和野生型HA蛋白的反應(yīng)性，2)通過肽鏈ELISA，測定其對線性表位的識別，3)通過蛋白酶，測定其對構(gòu)象表位降解的保護，以及4)通過同源和異源流感病毒株的血凝素抑制和病毒中和，進行功能測定。通過HA特異性ELISA的測量，以免疫再聚焦HA亞單位工程抗原來免疫的小鼠血清導(dǎo)致產(chǎn)生高滴度的抗毒血清。各組小鼠均顯示,對野生型HA的滴度在1:100-300,000的范圍內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)HI檢測中抗毒血清顯示出的交叉亞型HI抗體的能力，對多種突變HA糖蛋白進行向下選擇。H3N2A/ffyoming/03/2003 的突變體 A2、BI、B2、B3、CE、CEB4、CEB5 和 Dl 對檢測中使用的一組異源病毒亞型的交叉亞型HI和/或病毒中和滴度相等或較高。因此，如標(biāo)準(zhǔn)化和接受的代理(surrogate)HI和病毒中和檢測的體外測量，免疫減弱和再聚焦引起HA糖蛋白亞單位候選疫苗的產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)顯著提升的交叉亞型抗病毒保護。突變體A2是在HA的A表位發(fā)生的突變，此處KRRSNKS (SEQ ID NO: I)被GG替換。BI是在HA的B表位發(fā)生的突變，在其197位氨基酸處導(dǎo)入一個糖基化位點(QIS替換為NAS)。B2是在HA的B表位發(fā)生的突變，在其189位氨基酸處導(dǎo)入一個糖基化位點(SDQ替換為NYT)。B3是在HA的B表位發(fā)生的突變，在其193位氨基酸處導(dǎo)入一個糖基化位點(SLY替換為NIT)。CE包含兩處突變，在276位向C表位導(dǎo)入一個糖基化位點(KCN替換為NCT),以及在83位向E表位導(dǎo)入一個糖基化位點(NKK替換為NKT)。CEB4為CE的B表位的一個額外突變，在158位添加一個糖基化位點(KYK替換為NST )。CEB5為CE的B表位的一個額外突變，在159位添加一個糖基化位點。Dl是在HA的D表位發(fā)生的突變，在其201位氨基酸處導(dǎo)入一個糖基化位點(RIT替換為NIT)。在另一組實驗中，與不同的H3N2病毒株相比，檢測再聚焦多肽抗原的血凝素抑制滴度和血清的中和滴度。其突變體來源于A/Wyoming/2003病毒株。M3有B2表位；M5有CE表位；M6有B4CE表位，如上所述。將小鼠暴露于多種突變蛋白，A/Wyoming/2003株病毒作為野生型陽性對照，而單獨的載體作為陰性對照。然后檢測小鼠血清對同源Wyoming株、Panama/1999株和Wellington/2004株這三株病毒的血凝素抑制滴度。其他小鼠血清用于檢測針對同源Wyoming株、Korea/2003株、Korea/2002株、Fujian/2002株、Brisbane/09/2006株和Brisbane/10/2007株的血清中和滴度。暴露于單獨載體的小鼠對照血清不產(chǎn)生可與Wyoming株、Panama株和Wellington株反應(yīng)的特異性血凝素抑制抗體(滴度=10)。暴露于野生型Wyoming病毒的小鼠產(chǎn)生可與Wyoming株和Wellington株反應(yīng)的抗毒血清(滴度=1280)，但與Panama株的反應(yīng)輕微(滴度=226)。M5突變體產(chǎn)生的抗毒血清與Wyoming和Wellington株的反應(yīng)劇烈程度是野生型的2倍(滴度=2560),但只是略低于Panama株(滴度=1920)。M6突變體產(chǎn)生的抗毒血清與毒M5突變體跟Panama和Wyoming株的反應(yīng)水平相等(滴度分別為2560和1280)。但當(dāng)M6突變體暴露于Wellington時，其產(chǎn)生的抑制性抗毒血清滴度較高，高于其他滴度的4倍(滴度=10240)。因此，免疫再聚焦導(dǎo)致其對除同源株外的其他兩株產(chǎn)生擴大(broadened)的應(yīng)答，以及當(dāng)使用三聯(lián)修飾突變蛋白時，伴隨著針對Wellington株產(chǎn)生極高的應(yīng)答。在中和的研究中，暴露于載體的小鼠不產(chǎn)生特異性抗體。暴露于Wyoming的小鼠產(chǎn)生可與Wyoming強烈反應(yīng)的抗毒血清(滴度=640);Korea和Brisbane 2006的滴度為Wyoming的四分之一(滴度=160);與Brisbane 2007幾乎無反應(yīng)(滴度=20)。小鼠抗毒血清中產(chǎn)生的M3突變蛋白對WyomingJrisbane 2006和fcisbane 2007的反應(yīng)性為野生型的4倍(滴度=2560)。該抗毒血清與Korea不反應(yīng)(滴度=3)。暴露于M5的小鼠產(chǎn)生的抗毒血清與Wyoming的反應(yīng)性(滴度=80)為Brisbane 2006 (滴度=160)的2倍，為Korea (滴度=2560)的30倍。該抗毒血清基本上與Brisbane 2007不反應(yīng)(滴度=20)。因此，對另外3株的擴大應(yīng)答從值得關(guān)注的免疫再聚焦抗原中獲得。因此，值得關(guān)注的成分可刺激針對存在于后續(xù)相關(guān)的親本株中的病毒的保護性免疫，以及針對過去的更常見的病毒的保護性免疫。因而，基于Brisbane/07的免疫再聚焦H3N2疫苗將會刺激針對尚未進化的病毒的保護性應(yīng)答，從而避免在接下來幾年中重新配方的必要性?？砷_發(fā)基于Wyoming或Brisbane的免疫再聚焦疫苗用于針對過去和后續(xù)所有的H3N2株的保護。Ml基于多種考慮，包括免疫優(yōu)勢表位、進化、序列多樣性和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析，設(shè)計了類豬HINlvA/California/04/2009株的免疫再聚焦血凝素抗原。設(shè)計下列突變以重新聚焦遠離高度變異的免疫優(yōu)勢位點的免疫應(yīng)答，并趨向更大范圍的保護性表位。如本文所述，免疫再聚焦突變可采用多種形式，包括刪除、添加或減少糖基化位點，以及替換表位的影響電荷、疏水性或某些其他化學(xué)特性。添加糖基化有屏蔽相對較大部分表位的優(yōu)勢，而電荷改變可集中于抗體抗原相互作用的特定位點。由于多種流感株與血清型HA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的高度相似性，相關(guān)A/PR8/34的3-D結(jié)構(gòu)分析可用于確定HA序列中推定的環(huán)和其他活性位點。將A/California/04/2009的HA與A/PR8/34的HA對齊，向Cal/04/09轉(zhuǎn)移PR8的確定殘基。圖2中的表2表示旨在重新聚焦免疫力，使其產(chǎn)生更廣泛保護性應(yīng)答的單位點突變。最初提出的突變大部分由氨基酸替換組成，其影響的是糖基化模式和/或局部電荷元素。突變的選擇基于用來確認免疫優(yōu)勢表位的可用序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，該表位可促進病毒株特異性應(yīng)答。沿著HA糖蛋白，以N-末端為起點的表位位點相關(guān)的序列與突變列于表2。包含D位點的C-末端部分(從214位開始)及融合區(qū)域(從314位開始)的殘基已被消去，以節(jié)省表的空間。突變的設(shè)計如下(i)表位C的Ml與M3突變和表位E的M6與M7突變被選擇作為涉及到結(jié)合單克隆抗體的位點或其緊鄰位點。由于其位于高度靈活的環(huán)和序列變異性高的區(qū)域內(nèi)，我們可以預(yù)測，其有助于病毒株特異性免疫力；(ii)突變 Ml、M2、M5、M6、M8、M9、M10、M14、M16、M18、M20、M22、M23、M25 在病毒
株特異性免疫優(yōu)勢位點導(dǎo)入糖基化位點時實現(xiàn)雙重目的，同時改變表位內(nèi)相關(guān)氨基酸的電荷;(1^)突變] 3、]\14、]\17、]\111、]\112、]\113、]\115、]\117、]\119、]\121、]\124和 M26 以不帶電荷的氨基酸殘基代替帶電荷的殘基；(iv)突變M5實現(xiàn)了在E位點添加糖基化的特殊目的，使其重新聚焦免疫力趨向于融合區(qū)域或HA-1HA-2融合位點內(nèi)的保守元素(如C和E突變)；以及(V)突變M25和M26的靶定位置為位于HA1-HA2裂解位點和融合區(qū)域(在表I中表示為位點"f")附近的免疫優(yōu)勢位點，重新聚焦免疫力使其趨向于這些高度保守的基因座。圖3確定了重疊于A/PR8/34HA結(jié)構(gòu)上單點突變的亞集。圖I表示大部分突變被插入到高度靈活的環(huán)狀部位，以在掩蓋表位的同時不破壞重組蛋白的類天然(native-like)折疊。突變插入多變的環(huán)部，確?？梢孕纬纱蠖鄶?shù)構(gòu)象表位。例3利用已知的方法,如定位點特異性誘變(快變(quick_change))或基因合成,可改造HA突變。一般情況下，快變突變可用于誘導(dǎo)單個或雙重突變，而基因合成可用于更復(fù)雜的組合。單點突變在評估指向每一表位的特定殘基的免疫再聚焦技術(shù)時最有幫助。不過，由于病原體利用一個以上的免疫優(yōu)勢可變表位(迷惑性表位)以逃避長期的免疫壓力，改進的免疫再聚焦抗原可將突變合并入多抗原位點。在2或3個表位中包含突變的免疫再聚焦HA抗原的例子如圖4所示，其在表3列出。在所有5個表位中包含突變的免疫再聚焦HA抗原的例子如圖5所示，其在表4列出。在表3和表4中，突變由圖2中表所示的單點突變的組合構(gòu)成。如圖3所示的結(jié)構(gòu)分析在組合突變的設(shè)計中非常有用，使選擇的突變能降低彼此間在電荷、空間位阻或其他不利作用方面的干擾可能性。為評估候選免疫再聚焦HA，有必要檢測突變的組合，其中某些組合由糖基化插入構(gòu)成，而其他大部分組合由僅僅降低表位中靜電荷的替換構(gòu)成。突變列表是為了本領(lǐng)域培訓(xùn)舉例的需要，一旦開始培訓(xùn)，可按照本文提供的材料與方法，在相似位點或為達成類似的目標(biāo)設(shè)計其他突變。例3描述的基于HlNl HA序列的抗原可作為疫苗刺激針對所有HlNl變體的廣泛免疫力。按本文所述制備其他突變，使基于HlNl的抗原能刺激產(chǎn)生針對其他血清型的流感病毒株的保護性免疫力，如H2、H5等。本文所述的抗原設(shè)計方法可用于制造基于其他流感血清型的疫苗或抗體，如H2N2、H5N1、H7、H9 等。
這些突變被用來刺激免疫力，以產(chǎn)生有廣泛反應(yīng)性的抗體，其可用于治療、診斷或其他用途。這些突變與佐劑聯(lián)合使用可引起交叉反應(yīng)性免疫寬度的額外改進。例 4根據(jù)2ICFR 610的指南，對重組免疫原的安全性、毒性和效能進行評估，包括(i)一般安全性測試，以及急性與慢性毒性測試。免疫原性數(shù)據(jù)來源于公認的能良好應(yīng)答人類流感疫苗的動物模型(如豚鼠、小鼠、雪貂或棉鼠)。其調(diào)查包括根據(jù)劑量和給藥間隔，利用含最終產(chǎn)品預(yù)期病毒株的疫苗，對免疫應(yīng)答進行評估。相關(guān)動物模型的免疫原性研究用于記錄產(chǎn)品的一致性，特別在為新型流感病毒疫苗生產(chǎn)過程的驗證階段。為動物研究選擇的恰當(dāng)非臨床終點包括死亡、體重下降、 病毒排泄(excretion)率、臨床征象如發(fā)熱、眼-鼻分泌物等。對各組雪貂或其他合適動物腹膜內(nèi)接種含300 μ g值得關(guān)注的免疫原的100 μ I免疫原。使用合適的陰性與陽性對照。注射后14天內(nèi)，監(jiān)測動物的一般健康狀況和體重。接受安慰劑和接受免疫原的動物均保持健康，且在觀察期間沒有體重下降和明顯的疾病征象。為進行更嚴(yán)格的安全性測試，對各組動物注射300 μ g的免疫原。接種后第一天，對每組中的3只動物進行安樂死，脾、肺及肝勻漿進行免疫原分析。在注射后第4、8、12和16周，分別將每組中的3只動物行安樂死，收取脾、肺及肝勻漿進行分析，以評估免疫原是否存在。如果沒有觀察到不良的健康反應(yīng)，且相比作為內(nèi)控的接種安慰劑的動物，其體重以正常速率增長，則認為該免疫原是安全的。為評估免疫原的急性與慢性毒性，在各組雪貂的皮內(nèi)按照分級劑量(gradeddoses)或鹽水接種300 μ g免疫原。接種后3天，將每組中的8只動物安樂死，以獲取免疫原對動物的急性效應(yīng)。接種后28天，對每組中剩余的8只動物安樂死，以評估對動物的任何慢性效應(yīng)。在這兩個時間點，均獲取每只動物的體重。此外，還應(yīng)檢查注射部位的大體病理和外觀。在每個時間點，抽取血液用于血液化學(xué)檢查,并進行內(nèi)臟和注射部位的組織病理學(xué)檢查。其他動物在第O、14和60天共給予3劑疫苗，并且利用每10天從動物中收集的血清，通過ELISA測量其對血凝素的免疫應(yīng)答。例如，在首次接種后80天，測量所收集血清中的流感病毒中和率。應(yīng)當(dāng)理解，對本文所描述的優(yōu)選實施例作出的變化和修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。這些變化和修改可在不脫離當(dāng)前主題的指導(dǎo)思想與范圍情況下，且不降低其預(yù)期優(yōu)勢的條件下進行。因此，將這些變化與修飾包括在所附的權(quán)利要求內(nèi)。本文引用的所有參考文獻均通過參考全文而引入本文。參考文獻Thomas Francis,Jr. in Proceedings of the American PhilosophicalSociety, Vol. 104, No. 6 (Dec. 15，1960)，pp. 572-578，according to The Swine FluEpisode and the Fog of Epidemics by Richard Krause in DCDis Emerging InfectiousDiseases Journal, Vol. 12, No. I, January 2006，published December 20,2005.
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權(quán)利要求
1.一種分離的成分包含一流感免疫原性表位，所述流感免疫原性表位在野生型病毒中無免疫優(yōu)勢。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分,其中包含一血球凝集素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，其中包含一神經(jīng)氨酸苷酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分,其中包含一流感病毒顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的成分，其中所述顆粒是滅活的、減毒的或非傳染性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，其中所述成分包含糖基化位點的添加或去除。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，其中所述成分包含氨基酸的增加、替換或刪除。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分,其中包含一病毒樣顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，其中所述成分在流感病毒表面表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，進一步包含一藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成分，其中所述流感為人流感、禽流感、豬流感、犬流感或馬流感。
全文摘要
本文公開了提供了為流感免疫原提供新成分的方法。這些成分能使宿主應(yīng)答其通常不識別的免疫原位點。新免疫原可以用作疫苗或研制抗體。
文檔編號C12N15/44GK102985107SQ201180015645
公開日2013年3月20日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月24日
發(fā)明者G·J·托賓, P·L·納拉, G·林 申請人:生物模仿公司