專利名稱：非特異性富集微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從復(fù)雜的起始材料非特異性地富集微生物的方法，其中使含有微生物的起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸，所述微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞結(jié)合，以及從所述復(fù)雜的起始材料中取出結(jié)合復(fù)合物。
背景技術(shù)：
微生物一般以非常低的濃度存在于復(fù)雜的起始材料例如食品或土壤樣品中。為了能夠從所述起始材料獲得足夠數(shù)量的供其檢測用的微生物，必須加工相對大量的起始材料。因為在大多數(shù)方法中不可能加工大量的其中含有微生物的起始材料，必須事先從所述起始材料富集微生物。起始材料例如食物和土壤樣品一般為很復(fù)雜的混合物，其中存在有很多不同的來自于不同物質(zhì)類別并具有多樣的物理和化學(xué)性質(zhì)的有機分子，這個事實使所述富集變得復(fù)雜化。
出于這個原因，從所述起始材料富集微生物而不共富集起始材料的其他成分是很困難的，所述其他成分可能干擾或抑制微生物的后續(xù)處理。
現(xiàn)有技術(shù)中已知有多種方法使得有可能從復(fù)雜的起始材料富集微生物。
例如，化學(xué)方法包括離子交換基質(zhì)對微生物的吸附。因為在pH大于5時，大部分微生物具有負的表面電荷，因此，很多微生物可以結(jié)合到陰離子交換基質(zhì)上。但是，另一方面，因為在復(fù)雜的起始材料中存在的很多物質(zhì)也具有負的表面電荷，因此，它們也與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合，這極大地限制了所述基質(zhì)對微生物的結(jié)合能力，結(jié)果是在極端情況下，沒有微生物可以結(jié)合到基質(zhì)上，因為所有的結(jié)合位點都已經(jīng)被起始材料的其它成分飽和了。
另一種化學(xué)方法是微生物與外源凝集素的結(jié)合。外源凝集素是糖結(jié)合蛋白，其選擇性地識別并結(jié)合細菌的表面組分。此方法的缺點是，外源凝集素優(yōu)先與革蘭氏陽性菌結(jié)合。盡管也結(jié)合革蘭氏陰性菌，但是親和力較低，而其它微生物例如真菌或病毒則不能被外源凝集素結(jié)合。因此，微生物與外源凝集素的結(jié)合僅限于細菌，更具體而言為革蘭氏陽性菌。
另一種化學(xué)方法是通過水性兩相系統(tǒng)分離微生物。在這種方法中,將微生物與起始材料的剩余成分在兩個流體相之間分開，所述兩個流體相彼此不混溶而且分子量彼此不同。此方法的缺點是，非常多的起始材料成分富集在微生物的相同相中，即，無法將微生物從起始材料的所有成分中取出。另外，分離進入單獨的相中往往是不徹底的，并導(dǎo)致一些微生物在第二相中損失。
已描述的用于富集微生物的物理方法包括例如離心。如果在相對低的G力下進行離心，這會導(dǎo)致起始材料的大部分成分沉降，而微生物保留在上清液中。然而，與起始材料的較重的成分相聯(lián)系的微生物也經(jīng)歷沉降并因此丟失。另一方面，通過在低的G力下離心， 無法從微生物中移除比微生物輕的起始材料的成分，所以通過此方法只能實現(xiàn)微生物的粗富集。
另一種用于富集微生物的物理方法是通過合適的濾器過濾。已發(fā)現(xiàn)過濾是一種相對不適合的方法，因為起始材料的相對大的成分快速阻塞濾器，使分離很快結(jié)束。另外，起始材料的很多可能使微生物的檢測復(fù)雜化的成分，也和微生物一起得到濃縮。
另一種用于富集微生物的方法利用微生物的免疫親和性。在這種方法中，將可以與特定的微生物物種特異性結(jié)合的抗體固定在固相上。盡管這種方法具有高度特異性，而且沒有其他起始材料成分與抗體結(jié)合，但這種方法不是一種通用方法，因為只有一種特定的微生物物種或一種特定的微生物群可以與抗體結(jié)合，而在樣品中存在的其它微生物無法與所述抗體結(jié)合。另外，由于需要提供大量抗體，這種方法是相當昂貴的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中已知方法的缺點，并提供從復(fù)雜的起始材料富集微生物的通用方法，在所述方法中，從復(fù)雜的起始材料中取出后，微生物以更高的濃度存在。
通過從復(fù)雜的起始材料非特異性地富集微生物的方法，該目的得以實現(xiàn)，所述方法包括以下方法步驟
a)使含有微生物的復(fù)雜的起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸；
b)在微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞之間形成結(jié)合復(fù)合物；
c)從復(fù)雜的起始材料中取出來自步驟b)的結(jié)合復(fù)合物。
本發(fā)明的方法適合用于從很廣泛的各種不同的復(fù)雜起始材料非特異性地富集微生物。
在這方面，富集應(yīng)被理解為指的是，從復(fù)雜的起始材料中取出結(jié)合復(fù)合物之后，所存在的微生物的濃度高于其在復(fù)雜的起始材料中的濃度，這可以通過例如其中存在微生物的體積在本方法之后縮小來實現(xiàn)。
微生物應(yīng)被理解為指的是被高等生物體的先天免疫系統(tǒng)識別為外來的所有生物體。它們包括例如但不僅僅是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及其持久性狀態(tài)，還包括真菌及其持久性狀態(tài)、病毒和古細菌及這些生物體的成分。對于本發(fā)明的方法來說，這些微生物是顯示出代謝活性還是死亡的，或者是否涉及這些微生物的成分，這些都不重要，只要它們能夠被先天免疫系統(tǒng)識別為外來的即可。
在優(yōu)選實施方式中，待富集的微生物為革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌。
原則上，有待從中富集微生物的合適的復(fù)雜起始材料為其中存在或可能存在微生物的任何起始材料。這些起始材料包括例如有待測試微生物的不存在的食品。它們包括例如果汁、奶、肉類、水果、香腸制品、奶酪和其他乳制品。但是，其它有待從中檢測出微生物的復(fù)雜的起始材料也可以被用作本發(fā)明的方法中的起始材料。它們包括例如土壤樣品或污泥樣品又或者血液和其它體液以及化妝品。
根據(jù)復(fù)雜的起始材料是如何被提供的，可能有必要在本發(fā)明方法的步驟a)中使起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸之前，使起始材料經(jīng)歷預(yù)處理。
例如，可以事先在一定條件下離心起始材料，在所述條件下，微生物保留在溶液中，而起始材料的成分在該條件下成團。在這種情況下，對在溶液中含有微生物的上清液進行進一步處理。
然而，也可以在這些條件下使微生物成團，而起始材料的成分保留在溶液中。在這種情況下，對含有位于其中的微生物的團塊進行進一步處理。
在復(fù)雜的起始材料主要為固體例如土壤樣品或肉類的情況下，可能有必要在本發(fā)明方法的步驟a)中使起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸之前，事先將起始材料粉碎、均質(zhì)化和/或與液體混合。用于將起始材料粉碎和/或均質(zhì)化的手段是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
即便起始材料已經(jīng)事先被粉碎、均質(zhì)化和/或與液體混合，在它們與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸之前，可能還有必要使起始材料接受進一步的預(yù)處理，例如離心。
關(guān)于如何預(yù)處理復(fù)雜的起始材料的其他方法和手段是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
在本發(fā)明的方法的步驟a)中，含有微生物的復(fù)雜的起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸。
在這方面，先天免疫系統(tǒng)的細胞可以源自任何需要的生物體，所述生物體具有的先天免疫系統(tǒng)能夠識別出微生物對于該生物體而言是外來的。實際上，所有多細胞生物體都能夠識別出微生物是外來的而且都具有先天免疫系統(tǒng)。這些具有先天免疫系統(tǒng)的細胞的生物體包括例如人類、其他哺乳動物和其他脊椎動物、植物、昆蟲以及其他無脊椎動物。
在優(yōu)選實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞源自哺乳動物。在特別優(yōu)選的實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞是人類來源的。
先天免疫系統(tǒng)的細胞可以作為分離的單個的細胞存在，又或者它們可以形成由先天免疫系統(tǒng)的細胞構(gòu)成的細胞團塊或組織塊。而且，先天免疫系統(tǒng)的細胞有可能位于不屬于先天免疫系統(tǒng)的一部分并且其中存在其他細胞的細胞團塊或組織塊中。
在一個實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞是從生物體中作為單個的細胞、作為細胞團塊或作為組織塊取出的原代細胞。所述原代細胞可以直接引入到本發(fā)明的方法中，又或者可以在將它們用于本發(fā)明的方法之前，對它們進行進一步體外培養(yǎng)。
在優(yōu)選實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的原代細胞是骨髓細胞。它們包括例如單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞以及自然殺傷細胞?？梢詫⑺鼈冏鳛閱蝹€的細胞類型的混合物使用，又或者可以僅使用一種細胞類型。
在特別優(yōu)選的實施方式中，所述骨髓細胞是巨噬細胞。
在又一個實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞是保持在細胞培養(yǎng)物中的一種或多種合適的細胞系的永生化細胞。
在優(yōu)選實施方式中，所述永生化細胞源自循環(huán)系統(tǒng)，例如白血病細胞、淋巴瘤細胞或骨髓瘤細胞。
在特別優(yōu)選的實施方式中，所述永生化細胞是細胞系THP1、U937、K562或其混合物的細胞。
其他有用的細胞系是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
在本發(fā)明的方法的步驟b)中，微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞結(jié)合并因此形成結(jié)合復(fù)合物。出于本發(fā)明的目的，結(jié)合應(yīng)被理解為指的是在微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞之間的任何相互作用。先天免疫系統(tǒng)的細胞能夠在分子水平識別外源性細胞、細胞成分和生物體，并能夠參與和它們的相互作用。在這方面，先天免疫系統(tǒng)的細胞并不像例如在抗體_抗原的相互作用中一樣特異性地識別特定的外源性微生物或外源性微生物的一部分。相反，該相互作用是非特異性的，所以先天免疫系統(tǒng)的細胞可以在分子水平識別廣譜的不同微生物或所述微生物的一部分。
細胞和微生物之間的相互作用從狹義上講可以例如由細胞和微生物之間的結(jié)合組成，包括這兩個伙伴之間的分子相互作用，又或者所述相互作用可以存在于先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬微生物或以另一種方式將它引入到細胞內(nèi)部的過程中。
細胞和微生物之間的相互作用的其他方式是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
在一個實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞顯示出代謝活性。在這方面，所述細胞能夠進行某些或大多數(shù)的代謝途徑和/或生物過程。它們包括例如與其它細胞、細胞團塊或組織的相互作用，又或者是吞噬被識別為外源性的物質(zhì)和微生物。取決于細胞的分化程度， 只要細胞尚能分裂，細胞分裂的能力也被包括在內(nèi)。
在另一個實施方式中，先天免疫系統(tǒng)的細胞不再顯示出代謝活性。所述細胞例如可以是被固定的，并因此受到保護不發(fā)生自溶，從而使得它們的細胞結(jié)構(gòu)在很大程度上得以保留。例如，細胞的固定通過用醛如甲醛或戊二醛交聯(lián)細胞成分來實現(xiàn)。另一種用于固定的方法是例如通過脫水的方式固定，所述脫水可以通過化學(xué)物質(zhì)例如丙酮或醇來實現(xiàn)， 所述醇例如為乙醇或甲醇。用于在很大程度上保留細胞結(jié)構(gòu)的固定細胞的其他方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
無論所述細胞是否仍然顯示出代謝活性，它們都可以被固定在固相上。所述固定的實現(xiàn)可以通過共價結(jié)合或通過其它機理，例如范德華力、通過官能團的結(jié)合、受體-配體的結(jié)合、抗體-抗原的結(jié)合或靜電相互作用。將細胞固定到固相上的其他方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
原則上，適合的固相為所有可能的形狀和材料。固相的實例為平的、凸的或凹的表面，磁性和非磁性粒子，反應(yīng)容器的涂層，微量滴定板，顯微鏡載片等?？梢詮娜魏蜗胍牟牧仙a(chǎn)固相，只要先天免疫系統(tǒng)的細胞可以被直接或間接地固定在所述固相上?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的很多其它合適的固相是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
無論先天免疫系統(tǒng)的細胞是否被固定在固相上，在特定實施方式中，所述細胞在細胞內(nèi)含有磁性粒子。所述磁性粒子可以為鐵磁性的、亞鐵磁性的或超順磁性的粒子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉關(guān)于如何使這樣的磁性粒子到達細胞內(nèi)部的很多不同的方法?？赡艿姆椒槔缤ㄟ^吞噬作用摻入、用各種轉(zhuǎn)染方法引入、或使用粒子槍轟擊細胞。
在本發(fā)明方法的步驟c)中，從復(fù)雜的起始材料中取出來自步驟b)的結(jié)合復(fù)合物。
從現(xiàn)有技術(shù)中已充分知道從復(fù)雜的起始材料分離結(jié)合復(fù)合物的方法。如果結(jié)合復(fù)合物的密度不同于復(fù)雜的起始材料的密度，可以通過離心從復(fù)雜的起始材料中簡單地取出結(jié)合復(fù)合物。取出的另一種方法是過濾，如果結(jié)合復(fù)合物的大小不同于復(fù)雜的起始材料的大小的話。取出的另一種方法在于使用抗體，所述抗體針對先天免疫系統(tǒng)的細胞表面上的表位。
如果將先天免疫系統(tǒng)的細胞連接到固相，則有助于復(fù)雜的起始材料的移除，因為可以容易地將所述固相從復(fù)雜的起始材料的剩余成分中取出，而所述固相上帶有先天免疫系統(tǒng)的細胞和微生物的復(fù)合物。取出的實現(xiàn)可以例如通過簡單地從含有復(fù)雜的起始材料的結(jié)合反應(yīng)物中撤出固相，又或者例如通過潷去結(jié)合反應(yīng)物，在這種情況下，先天免疫系統(tǒng)的細胞和與其結(jié)合的微生物的結(jié)合復(fù)合物被保留在反應(yīng)容器中。
如果所述固相是磁性的，或者如果先天免疫系統(tǒng)的細胞摻有磁性粒子，那么通過磁性分離可以容易地實現(xiàn)將結(jié)合復(fù)合物與含有復(fù)雜的起始材料的結(jié)合反應(yīng)物的剩余成分分開。
從結(jié)合反應(yīng)物中分離結(jié)合復(fù)合物的其他方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
在步驟c)中從復(fù)雜的起始材料中取出結(jié)合復(fù)合物之后，如果有必要，可以洗滌先天免疫系統(tǒng)的細胞和微生物的結(jié)合復(fù)合物，這樣就從結(jié)合復(fù)合物中清除了可能仍然存在的復(fù)雜的起始材料的殘留。
在通過本發(fā)明的方法非特異性地富集微生物以后，然后可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法以特定的方式對所述微生物進行檢測和/或定量。
例如，可以通過微生物表面上的特定蛋白質(zhì)來檢測微生物。實現(xiàn)對所述蛋白質(zhì)的檢測可以通過例如免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、FACS、流式細胞儀以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他蛋白質(zhì)檢測方法。
或者，還可以通過微生物的核酸來檢測和定量微生物。這樣的方法例如為核酸雜交技術(shù)，其包括例如RNA印跡(Northern blot)、DNA印跡(Southern blot)、微陣列和斑點印跡。
通過微生物的核酸序列來特異性檢測微生物的其他方法包括擴增技術(shù)，例如PCR 及其可能的變體例如終點PCR或?qū)崟rPCR，以及等溫擴增方法例如滾環(huán)擴增(RCA)及其可能的變體。
通過微生物的核酸來檢測微生物的其他方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。


圖I :通過流式細胞儀分析各種熒光標記的各種數(shù)量的微生物與THP I細胞的結(jié)合。填充區(qū)域代表零對照，實線代表IO6個微生物，短劃線代表IO7個微生物，點線代表IO8 個微生物。
圖2 :通過流式細胞儀分析熒光標記的各種數(shù)量的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與THP1、U937或K562細胞的結(jié)合。填充區(qū)域代表零對照，實線代表IO5個微生物，短劃線代表IO7個微生物。
圖3 :通過流式細胞儀分析熒光標記的各種數(shù)量的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與固定后的THPl細胞的結(jié)合。填充區(qū)域代表零對照，實線代表IO5個微生物，短劃線代表IO7個微生物。
圖4 :通過流式細胞儀分析熒光標記的各種數(shù)量的在奶中的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)與THPl細胞在不同時間的結(jié)合。填充區(qū)域代表零對照，實線代表IO6 個微生物，短劃線代表IO8個微生物。
圖5 :通過RT-PCR檢測結(jié)合于THPl的細菌。X軸指出使用的細菌的不同數(shù)量以及從起始材料中取出結(jié)合復(fù)合物的方式。Y軸指出CT值。
具體實施方式
以下實施例的用意在于進一步闡釋本發(fā)明而不是將本發(fā)明限制于示例性的實施方式。7
使用了下面的寡核苷酸或引物/探針序列
BacSub-探針
5’-6-FAM-GGAGGCGATCTATGTCTTGTCCA-BHQ1
BacSub-FffD :5’ -ACATCTTACCGCAACTACGACCAT
BacSub-REV :5’ -TAGCATAGTCTTTGTCCCACCGTA
實施例I
各種細菌與THPl細胞的結(jié)合
向Iml的PBS中加入大腸桿菌(Escherichia coli)(革蘭氏陰性菌)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)(兩者均為革蘭氏陽性細菌)(各為IO9個)，用細菌計數(shù)試劑盒(Invitrogen，Carlsbad, USA)中的SYTO BC 熒光染料在室溫下在黑暗中旋轉(zhuǎn)IOmin對上述細菌染色。隨后，使細菌在HOOOrpm離心下來5min，并用Iml的PBS洗滌。將106、IO7或IO8個的這些熒光標記后的細菌各自加入到 2x IO5個的人類單核細胞系THPl的細胞中，并在37° C攪拌溫育30min。在IOOOrpm離心 5min后，用PBS洗滌結(jié)合復(fù)合物，并在再次離心后，在流式細胞儀中進行分析。
如圖I所示，在所使用的不同的微生物的量下，所述三種不同的微生物以相同的程度與THPl細胞結(jié)合，這說明先天免疫系統(tǒng)的細胞與微生物之間的相互作用為一般性的相互作用，并沒有特異性地限制于某一種或某一群微生物。
實施例2
枯草芽孢桿菌與各種細胞系的結(jié)合
所進行的程序如實施例I中所述，但這次僅使用枯草芽孢桿菌作為微生物，而且使用的量為IO5和IO7個細菌。不同于實施例1，實施例2中使用的先天免疫系統(tǒng)的細胞不僅有單核細胞系THP1，還有類似的人類單核細胞系U937和人類B細胞系K562。圖2顯示 THPl和U937細胞以大約一樣的效率與枯草芽孢桿菌結(jié)合。相反，對于K562細胞而言的效率明顯更低。在IO5個枯草芽孢桿菌(連續(xù)的線)的量下，與不含任何枯草芽孢桿菌的對照 (填充區(qū)域)相比，在FACS中幾乎沒有差別。相比之下，當使用IO7個枯草芽孢桿菌時，觀察到細胞系K562與THPl和U937具有大約一樣的效率。這個實驗說明不僅細胞系THPl的細胞能夠非特異性地結(jié)合微生物，而且先天免疫系統(tǒng)的其他細胞類型也能夠非特異性地結(jié)合微生物。
實施例3
枯草芽孢桿菌與固定后的THPl細胞的結(jié)合
盡管實施例I和2使用的THPl細胞顯示出代謝活性，實施例3使用的THPl細胞是經(jīng)過固定的。使用兩種不同的方法來固定。在第一種固定程序中，在室溫下使2x IO5個 THPl細胞在4%的多聚甲醛(PFA)中溫育IOmin ;在第二種固定程序中，溫育是在室溫下在 100%的乙醇中進行l(wèi)Omin。其中，多聚甲醛連接蛋白質(zhì)中的氨基殘基，乙醇引起細胞的快速脫水。實驗的其余部分如實施例2中所描述的進行，使用枯草芽孢桿菌作為微生物。
圖3顯示不僅具有代謝活性的先天免疫系統(tǒng)的細胞可以與微生物結(jié)合，固定后的先天免疫系統(tǒng)的細胞也可以與微生物結(jié)合。盡管在該實驗中檢測IO5個微生物時的效率低于用仍顯示出代謝活性的細胞檢測時的效率，但是在使用先天免疫系統(tǒng)的固定后的細胞從起始材料富集微生物之后，即使使用固定后的細胞也有可能在FACS中對IO5個微生物作出可靠的檢測。
實施例4
從復(fù)雜的起始材料富集微生物
所進行的程序基本上如實施例I中所述，但在這個實驗中，在實驗中引入IO6和IO8 個枯草芽孢桿菌，并將它們從復(fù)雜的起始材料即脂肪含量為I. 5%的全脂奶中清理出來。出于該目的，將微生物加入到25ml的全脂奶中，隨后離心5min以使不溶物包括細菌成團。隨后將所述團收集到25ml的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中，并加入到2x IO5個THPl細胞中。 在室溫下旋轉(zhuǎn)進行溫育I或3小時。
圖4顯示當細菌在復(fù)雜的起始材料例如奶中存在的濃度相對低時，使用本發(fā)明的方法也可以富集并檢測所述細菌。當微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸I或3小時時，所得結(jié)果具有可比性。
實施例5
RT-PCR檢測枯草芽孢桿菌的富集
在含有10%胎牛血清(PAA，Pasching, Austria)的細胞培養(yǎng)基(RPMI (Invitrogen))中，使ΙΟ2、104、IO6或IO8個枯草芽孢桿菌與2x IO5個THPl細胞溫育。未結(jié)合的微生物通過以下方法從結(jié)合復(fù)合物中移除通過2μπι的PCTE濾器 (Sterlitech, Kent, USA)過濾，或者通過使用生物素標記的CD14抗體和BiotinBinder 磁性粒子(Invitrogen)進行免疫磁性分離。使用針對細菌gDNA的QIAamp試劑盒 (QIAGEN, Hilden, Germany)從結(jié)合復(fù)合物中分離基因組DNA。分離的gDNA含有THPl細胞和枯草芽孢桿菌兩者的遺傳物質(zhì)。
將該洗脫液的5 μ I引入到接下來的RT-PCR中，其中枯草芽孢桿菌的gDNA的亞區(qū)得到擴增。RT-PCR的總體積為含有以下其他組分的20μ I :
10 μ I Quantitect Multiplex PCR Mix (QIAGEN)
0. 4 μ M BacSub-FffD 弓丨物
O. 4 μ M BacSub-REV 弓丨物
O. 2 μ M BacSub-探針
反應(yīng)混合物的剩余體積由水補充。
以384-孔樣式在執(zhí)行以下程序的ABI 7900ΗΤ中進行RT-PCR
I) 15min 95° C
2) 40 個循環(huán)
15s 94。C
30s 55。C
30s 72。C
所用對照為IO6個枯草芽孢桿菌(100%對照)和2x IO5個THPl (0%對照)。
圖5顯示，在用本發(fā)明的方法將微生物富集后，也可以通過RT-PCR檢測和定量所述微生物。可以檢測出低至10000個的從起始材料富集的微生物。
權(quán)利要求
1.從復(fù)雜的起始材料非特異性地富集微生物的方法，其包括以下方法步驟a)使含有微生物的復(fù)雜的起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸；b)在微生物與先天免疫系統(tǒng)的細胞之間形成結(jié)合復(fù)合物；c)從復(fù)雜的起始材料中取出來自步驟b)的結(jié)合復(fù)合物。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于先天免疫系統(tǒng)的細胞源自哺乳動物。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于先天免疫系統(tǒng)的細胞是人類來源的。
4.權(quán)利要求I至3任一項的方法，其特征在于細胞是原代細胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于原代細胞是骨髓細胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于骨髓細胞是巨噬細胞。
7.權(quán)利要求I至3任一項的方法，其特征在于細胞是細胞系的永生化細胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于細胞系的永生化細胞源自循環(huán)系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求7的方法，其特征在于細胞系的永生化細胞是THP1、U937或K562，或其混合物。
10.權(quán)利要求I至9任一項的方法，其特征在于先天免疫系統(tǒng)的細胞顯示出代謝活性。
11.權(quán)利要求I至10任一項的方法，其特征在于先天免疫系統(tǒng)的細胞被固定在固相上。
12.權(quán)利要求I至11任一項的方法，其特征在于先天免疫系統(tǒng)的細胞在細胞內(nèi)包含磁性粒子。
全文摘要
本發(fā)明涉及從復(fù)雜的起始材料非特異性地富集微生物的方法，其中使含有微生物的起始材料與先天免疫系統(tǒng)的細胞接觸，微生物結(jié)合于先天免疫系統(tǒng)的細胞，以及從復(fù)雜的起始材料中取出結(jié)合復(fù)合物。
文檔編號C12Q1/04GK102939373SQ201180019118
公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者弗蘭克·納茲 申請人:凱杰有限公司