專利名稱：：活的減毒嵌合豬圓環(huán)病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒(PCV)(特別是PCVl和PCV2(特別是亞型PCV2b)的嵌合病毒)的感染性DNA克隆、活的減毒疫苗和滅活疫苗以及用于針對(duì)PCV感染和豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病(PCVAD)進(jìn)行保護(hù)的方法。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種小的、無(wú)包膜的DNA病毒,其屬于圓環(huán)病毒科{Circoviridae)·(Todd,D.等，2005，Circoviridae,第327-334頁(yè)載于C.M.Fauquet等(主編)，VirusTaxonomy:EighthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ElsevierAcademicPress,SanDiego)。I型PCV(PCVl)在七十年代中期作為豬腎PK-15細(xì)胞系的污染物被發(fā)現(xiàn)(Tischer,I.等，1974，Characterizationofpapovavirus-andpicornavirus-likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines(永久豬腎細(xì)胞系中的乳多空病毒和小RNA病毒樣顆粒的表征)，ZentralblBakteriolOrigA226:153-67)。PCVl被認(rèn)為是非致病的病毒，因?yàn)橛脕?lái)源于PK-15細(xì)胞系的PCVl病毒接種豬不引起豬的任何疾病(Tischer，I.等，1986，Studiesonepidemiologyandpathogenicityofporcinecircovirus(對(duì)豬圓環(huán)病毒的流行病學(xué)和致病性的研究)，ArchViroi91:271-6)。在1997年，在加拿大的患有萎縮病的小豬中發(fā)現(xiàn)了PCV的變異株(命名為2型PCV(PCV2))(Allan,G.M.等，1998，Isolationofporcinecircovirus-likevirusesfrompigswithawastingdiseaseintheUSAandEurope(從美國(guó)和歐洲的患有萎縮病的豬中分離豬圓環(huán)病毒樣病毒).JVetDiagnInvest10:3-10;Clark，E.G.，1997，報(bào)告于美國(guó)豬醫(yī)師協(xié)會(huì)(AmericanAssociationofSwinePractitioners)第28屆年會(huì)；Ellis，J.等，1998，Isolationofcircovirusfromlesionsofpigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(從患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的損害中分離圓環(huán)病毒)，CanVetJ39:44-51;Meehan，B.M.等，1998，CharacterizationofnovelcircovirusDNAsassociatedwithwastingsyndromesinpigs(與豬的衰竭綜合征相關(guān)的新的圓環(huán)病毒DNA的表征)，JGenVirol79(Pt9):2171-9)。目前，PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病(PCVAD)的主要病原體，豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病包括消痩、死亡、呼吸征、腸炎、不能繁殖和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)(Opriessnig,T.等，2007，Porcinecircovirustype2associateddisease:updateoncurrentterminology,clinicalmanifestations,pathogenesis,diagnosis,andinterventionstrategies(2型豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病對(duì)目前術(shù)語(yǔ)、臨床表現(xiàn)、病理、診斷和介入策略的更新)，JVetDiagnInvest19:591-615)。PCV2目前被認(rèn)為是全球豬群中最經(jīng)濟(jì)上重要的病毒病原體之一，并在世界的每個(gè)主要產(chǎn)豬國(guó)家發(fā)現(xiàn)(Gillespie，J.等，2009，PorcinecircovirusType2andporcineCircovirus-AssociatedDisease(2型豬圓環(huán)病毒和豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病)，JVetInternMed)。在用PCV2單獨(dú)實(shí)驗(yàn)感染的常規(guī)豬中觀察到重度臨床PCVAD是不常見(jiàn)的，并通常需要與其他豬病原體(例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)或豬細(xì)小病毒(PPV))共感染以誘導(dǎo)全譜的臨床PCVAD(Allan,G.M.等，2000，Experimentalinfectionofcolostrumdeprivedpigletswithporcinecircovirus2(PCV2)andporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)potentiatesPCV2replication(用豬圓環(huán)病毒2(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)實(shí)驗(yàn)感染剝奪初乳的小豬增強(qiáng)PCV2復(fù)制)，ArchVirol145:2421-9；0priessnig,T.等2007.同上；Roca，M.等，2004，InvitroandinvivocharacterizationofaninfectiouscloneofaEuropeanstrainofporcinecircovirustype2(2型豬圓環(huán)病毒歐洲株的感染性克隆的體外和體內(nèi)表征)，JGenVirol85:1259-66;Rovira，A.等，2002，Experimentalinoculationofconventionalpigswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcinecircovirus2(用豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬圓環(huán)病毒2實(shí)驗(yàn)接種常規(guī)豬)，JVirol76:3232-9;Tomas，A.等，2008，Ameta-analysisonexperimentalinfectionswithporcinecircovirustype2(PCV2)(對(duì)2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)實(shí)驗(yàn)感染的綜合分析)，VetMicrobiol132:260-73)。然而，用PCV2單獨(dú)感染剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(CD/CD)豬已引起重度臨床PCVAD和死亡(Allan，G.等2003，ReproductionofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigsexperimentallyinoculatedwithaSwedishporcinecircovirus2isolate(在用瑞典豬圓環(huán)病毒2隔離群實(shí)驗(yàn)接種的豬中再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征)，JVetDiagnInvest15:553-60;Allan，G.M.等，2004，PMWS:experimentalmodelandco-infections(PMWS:實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c共感染)，VetMicrobiol98:165-8;Bolin，S.R.等，2001，Postweaningmuitisystemicwastingsyndromeinducedafterexperimentalinoculationofcesarean-derived,colostrum-deprivedpigletswithtype2porcinecircovirus(在用2型豬圓環(huán)病毒實(shí)驗(yàn)接種剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的小豬后誘導(dǎo)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征)，JVetDiagnInvest13:185-94;Harms，P.A.等，2001，ExperimentalreproductionofseverediseaseinCD/CDpigsconcurrentlyinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(在用2型豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒同時(shí)感染的⑶/⑶豬中實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)重度疾病)，VetPathol38:528-39；Kennedy,S.等，2000，Reproductionoflesionsofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromebyinfectionofconventionalpigswithporcinecircovirustype2aloneorincombinationwithporcineparvovirus(通過(guò)用2型豬圓環(huán)病毒單獨(dú)或與豬細(xì)小病毒聯(lián)合感染常規(guī)豬來(lái)再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的損害)，JCompPathol122:9-24)。PCV2的數(shù)篇病理、免疫學(xué)和分子生物學(xué)綜合綜述是可得的(Allan，G.M.和J.A.Ellisj2000，Porcinecircoviruses:areview(豬圓環(huán)病毒綜述)JVetDiagnInvest12:3-14;Ellis，J.等，2004，Porcinecircovirus-2andconcurrentinfectionsinthefield(豬圓環(huán)病毒_2和野外并發(fā)感染)，VetMicrobiol98:159-63;Finsterbusch，T.和A.Mankertz,2009，Porcinecircoviruses-smallbutpowerful(豬圓環(huán)病毒-小但有力)，VirusRes143:177-83;Gillespie，J.等，2009，同上；Mankertz，A.等，2004，MolecularbiologyofPorcinecircovirus:analysesofgeneexpressionandviralreplication(豬圓環(huán)病毒的分子生物學(xué)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的分析)，VetMicrobiol98:81-8；Opriessnig,T.等2007，同上；Ramamoorthy,S.和X.J.Mengj2009，Porcinecircoviruses:aminusculeyetmammothparadox(豬圓環(huán)病毒一個(gè)微小但龐大的悼論)，AnimHealthResRev10:1-20;Segales，J.等，2005，porcinecircovirusdiseases(豬圓環(huán)病毒疾病)，AnimHealthResRev6:119-42)。雖然致病的PCV2與非致病的PCVl的基因組組構(gòu)類似，但是PCVl與PCV2的基因組享有僅大約68-76%的核苷酸序列同一性(Fenaux，M.等，2004，DetectionandinvitroandinvivocharacterizationofporcinecircovirusDNAfromaporcine-derivedcommercialpepsinproduct(來(lái)自豬來(lái)源的商業(yè)胃蛋白酶產(chǎn)品的豬圓環(huán)病毒DNA的檢測(cè)以及體外和體內(nèi)表征)，JGenVirol85:3377-82;Hamel，A.L等，1998，Nucleotidesequenceofporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigs(與豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征有關(guān)的豬圓環(huán)病毒的核音酸序列)，JVirol72:5262-7;Tischer，I.等，1982，Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA(具有圓形單鏈DNA的非常小的豬病毒)，Nature295:64-6)，并且已報(bào)道了轉(zhuǎn)錄模式和衣殼蛋白的抗原概況中的差異(Cheung,A.K.2003，Comparativeanalysisofthetranscriptionalpatternsofpathogenicandnonpathogenicporcinecircoviruses(致病與非致病的豬圓環(huán)病毒的轉(zhuǎn)錄模式的比較分析)，Virology310:41-9;Lekcharoensuk，P.等，2004，Epitopemappingofthemajorcapsidproteinsoftype2porcinecircovirus(PCV2)byusingchimericPCVlandPCV2(通過(guò)使用嵌合PCVl和PCV2來(lái)對(duì)2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的主要衣殼蛋白進(jìn)行表位作圖)，JVirol78:8135-45；Shang,S.B.等，2009，F(xiàn)inemappingofantigenicepitopesoncapsidproteinofporcinecircovirus,andantigenicphenotypeofporcinecircovirustype2(豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白上的抗原表位的優(yōu)良作圖和2型豬圓環(huán)病毒的抗原表型)，MolImmunol46:327-34)。由病毒基因組編碼的兩個(gè)主要基因包括942bp復(fù)制酶(rep)基因(Mankertz,A.和B.Hillenbrandj2001，ReplicationofporcinecircovirustypeIrequirestwoproteinsencodedbytheviralrepgene(I型豬圓環(huán)病毒的復(fù)制需要由病毒rep基因編碼的兩種蛋白)，Virology279:429-38)和702bp衣殼基因(cap)(NawagitguI,P.等，2000，Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein(2型豬圓環(huán)病毒的開(kāi)放閱讀框2編碼一種主要的衣殼蛋白)，JGenVirol81:2281-7)0Rep基因在PCVl與PCV2之間是高度保守的，具有約83%的核苷酸序列同一性，而cap基因享有僅約67-70%的同一性(Mankertz，A.等，2004，同上)。目前，在全世界豬群中已鑒定了至少3種PCV2的亞型PCV2a、PCV2b和PCV2c(Dupont,K.等，2008，GenomicanalysisofPCV2isolatesfromDanisharchivesandacurrentPMWScase—controlstudysupportsashiftingenotypeswithtime(來(lái)自丹麥檔案與當(dāng)前PMWS病例的PCV2隔離群的基因組分析-對(duì)照研究支持基因型隨時(shí)間轉(zhuǎn)變)，VetMicrobiol128:56-64；Segales,J.等，2008，PCV-2genotypedefinitionandnomenclature(PCV-2基因型定義和命名)，VetRec162:867_8)。PCV2a和PCV2b兩者都與不同嚴(yán)重程度的臨床PCVAD相關(guān)(An,D.J.等，2007，Phylogeneticcharacterizationofporcinecircovirustype2inPMWSandPDNSKoreanpigsbetween1999and2006(1999-2006年之間的PMWS和TONS韓國(guó)豬的2型豬圓環(huán)病毒的系統(tǒng)發(fā)育表征)，VirusRes129:115-22；Ciacci-ZanellajJ.R.等，2009，DetectionofPorcineCircovirustype2(PCV2)variantsPCV2-1andPCV2-2inBrazilianpigpopulation(巴西豬群的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)變體PCV2-1和PCV2-2的檢測(cè))，ResVetSci87:157-60；Lager,K.M等，2007，Mortalityinpigsgivenporcinecircovirustype2subgroupIand2virusesderivedfromDNAclones(給予來(lái)源于DNA克隆的2型豬圓環(huán)病毒亞型I和2病毒的豬的死亡率)，VetRec161:428-9;Madson，D.M.等，2008，CharacterizationofsheddingpatternsofPorcinecircovirustypes2aand2binexperimentallyinoculatedmatureboars(實(shí)驗(yàn)接種的成熟野豬中的2a和2b型豬圓環(huán)病毒的釋放模式表征)，JVetDiagninvest20:725-34;Opriessnig，T.等，2006，Geneticandexperimentalcomparisonofporcinecircovirustype2(PCV2)isolatesfromcaseswithandwithoutPCV2_associatedlesionsprovidesevidencefordifferencesinvirulencd來(lái)自有和沒(méi)有PCV2相關(guān)損害的病例的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)隔離群的基因和實(shí)驗(yàn)比較為毒力差異提供證據(jù))，JGenVirol87:2923-32；0priessnig,T.等，2008，Differencesinvirulenceamongporcinecircovirustype2isolatesareunrelatedtoclustertype2aor2bandpriorinfectionprovidesheterologousprotection(2型豬圓環(huán)病毒隔離群之間的毒力差異與簇類型2a或2b不相關(guān)且感染之前提供異種保護(hù))，JGenVirol89:2482-91)。2005年之前，在美國(guó)和加拿大的豬群中僅發(fā)現(xiàn)PCV2a，而在歐洲和中國(guó)存在PCV2a和PCV2b兩者(Chae，J.S.andK.S.Choi,2009，Geneticdiversityofporcinecircovirustype2frompigsinRepublicofKorea(來(lái)自韓國(guó)的豬的2型豬圓環(huán)病毒的遺傳多樣性)，ResVetSci；Dupont,K.等，2008，同上)。自2005年以來(lái)，新的PCV2b株在美國(guó)被識(shí)別，且在豬群中存在的全球性變化是PCV2b的占優(yōu)勢(shì)盛行，同時(shí)臨床PCVAD的嚴(yán)重性增加(Cannan，S.等，2008，Theemergenceofanewstrainofporcinecircovirus-2inOntarioandQuebecswineanditsassociationwithsevereporcinecircovirusassociateddisease-2004-2006(安大略和魁北克豬中出現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒-2的新毒株及其與重度豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病的關(guān)系-2004-2006)，CanJVetRes72:259-68;Chae，J.S.和K.S.Choij2009，同上；Cheung,A.K等，2007，Detectionoftwoporcinecircovirustype2genotypicgroupsinUnitedStatesswineherds(在美國(guó)豬群中檢測(cè)到兩種2型豬圓環(huán)病毒基因型的類型)，ArchVirol152:1035-44;Ciacci_Zanella，J.R.等，2009，同上；Dupont，K.等，2008，同上；Gagnon，C.A.等，2007，Theemergenceofporcinecircovirus2bgenotype(PCV_2b)inswineinCanada(在加拿大的豬中出現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2b基因型(PCV_2b))，CanVetJ48:811-9;Lipej，Z.等，2005，Postweaningmuitisystemicwastingsyndrome(PMWS)inpigsinCroatia:detectionandcharacterisationofporcinecircovirustype2(PCV2)(克羅地亞豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)檢測(cè)和表征2型豬圓環(huán)病毒(PCV2))，ActaVetHung53:385-96;Wang，F(xiàn).等，2009，GeneticvariationanalysisofChinesestrainsofporcinecircovirustype2(2型豬圓環(huán)病毒的中國(guó)株的遺傳變異分析)，VirusRes145:151-6；Wiederkehr,D.D.等，2009，AnewemerginggenotypesubgroupwithinPCV_2bdominatesthePMWSepizootyinSwitzerland(PCV_2b中新出現(xiàn)的基因型亞型控制瑞士的PMWS病)，VetMicrobiol136:27-35)。PCV2c的致病性不清楚，因?yàn)樗鼉H在1980、1987和1990年在丹麥的無(wú)疾病豬群中被報(bào)道(Dupont，K.等，2008，同上)。目前可得的商業(yè)疫苗都為基于PCV2a亞型的死疫苗或重組疫苗(Opriessnig，T.等2007，同上；Ramamoorthy，S.和X.J.Mengj2009，同上)。發(fā)明人之前已成功開(kāi)發(fā)了基于PCVl-2a嵌合病毒(在PCVl的骨架中具有PCV2a的衣殼基因)的滅活疫苗SuvaxynPCV2@Onedose(Fenaux,M.等，2004A，Achimeticporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVlinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs(致病的2型PCV(PCV2)的免疫原性衣殼基因克隆到非致病的PCVl的基因組骨架中的嵌合豬圓環(huán)病毒(PCV)誘導(dǎo)針對(duì)豬的PCV2感染的保護(hù)性免疫)，JVirol78:6297-303；Fenaux,M.等，2003，ImmunogenicityandpathogenicityofchimericinfectiousDNAclonesofpathogenicporcinecircovirustype2(PCV2)andnonpathogenicPCVlinweanlingpigs(斷奶豬的致病的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)和非致病的PCVl的嵌合感染性DNA克隆的免疫原性和致病性)，JVirol77:11232-43；Gillespie,J.等，2008，Ageneticallyengineeredchimericvaccineagainstporcinecircovirustype2(PCV2)isgeneticallystableinvitroandinvivo(針對(duì)2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的基因工程嵌合疫苗在體外和體內(nèi)遺傳穩(wěn)定)，Vaccine26:4231-6)。然而，因?yàn)镻CV2b亞型現(xiàn)在在商品豬中已成為與重度臨床PCVAD相關(guān)的全球主要基因型，且因?yàn)镻CV2a和PCV2b有多達(dá)10%核苷酸序列同一性的差異(Fenaux，M.等，2000，Geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirus(PCV-2)frompigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofNorthAmericaanddevelopmentofadifferentialPCR—restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCV-IandPCV-2(遺傳表征來(lái)自北美不同地理區(qū)域的患斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的2型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)以及開(kāi)發(fā)差異PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定以檢測(cè)和區(qū)分PCV-I與PCV-2之間的感染)，JClinMicrobiol38:2494-503；01vera,A.等，2007，Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:phylogenyandclonality(2型豬圓環(huán)病毒基因組的分子進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育和克隆形成能力)，Virology357:175-85)，所以是否當(dāng)前基于PCV2a亞型的死疫苗或重組疫苗針對(duì)全新識(shí)別的PCV2b亞型提供全面保護(hù)是未知的。一些研究已證明目前市售疫苗針對(duì)PCV2b攻擊的有效性(Fort，M.等，2008，Porcinecircovirustype2(PCV2)vaccinationofconventionalpigspreventsviremiaagainstPCV2isolatesofdifferentgenotypesandgeographicorigins(2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)疫苗接種常規(guī)豬針對(duì)不同基因型和地理來(lái)源的PCV2隔離群預(yù)防病毒血癥)，Vaccine26:1063-71；Fort,M.等，2009，Onedoseofaporcinecircovirus2(PCV2)sub-unitvaccineadministeredto3-week-oldconventionalpigletselicitscell-mediatedimmunityandsignificantlyreducesPCV2viremiainanexperimentalmodel(將單劑量的豬圓環(huán)病毒2(PCV2)亞單位疫苗給予3周齡常規(guī)小豬引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫并顯著降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械腜CV2病毒血癥)，Vaccine27:4031-7；Opriessnig,T.等，2009,ComparisonofefficacyofcommercialonedoseandtwodosePCV2vaccinesusingamixedPRRSV-PCV2-SIVclinicalinfectionmodel2-3-monthspostvaccination(疫苗接種后2-3月使用混合的PRRSV-PCV2-SIV臨床感染模型來(lái)比較商業(yè)單劑量和雙劑量PCV2疫苗的功效)，Vaccine27:1002-7)，然而開(kāi)發(fā)針對(duì)PCVAD的基于PCV2b亞型的疫苗是必要的，優(yōu)選為活減毒疫苗?；谛碌腜CV2b亞型的活減毒疫苗在本領(lǐng)域可能比當(dāng)前可得的基于PCV2a亞型的死疫苗和亞單位疫苗提供更大的保護(hù)。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子，其包含編碼非致病的嵌合PCV的核酸·分子，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型PCV2a、PCV2b和PCV2c。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為PCV2(優(yōu)選為亞型PCV2b)的至少一部分開(kāi)放閱讀框2(0RF2)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子編碼超過(guò)一份拷貝的非致病的嵌合PCV，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發(fā)明還提供一種生物功能質(zhì)?；虿《据d體，其包含編碼非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發(fā)明還提供一種被載體轉(zhuǎn)染的合適宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發(fā)明還提供一種由合適宿主細(xì)胞產(chǎn)生的無(wú)毒感染性嵌合PCV，所述宿主細(xì)胞被包含編碼非致病的嵌合PCV的核酸分子的載體轉(zhuǎn)染，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發(fā)明還提供一種滅活的嵌合PCV，其包含2型PCV(PCV2)(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型PCV2a、PCV2b和PCV2c。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為PCV2的至少一部分開(kāi)放閱讀框2(0RF2)。本發(fā)明還提供一種病毒疫苗，其包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員(a)豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質(zhì)?；虿《据d體，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無(wú)毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合PCV，其包含PCV2(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含活的嵌合PCV病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含滅活的嵌合PCV病毒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗另外包含佐劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗針對(duì)PCV2a和PCV2b感染保護(hù)。本發(fā)明還提供一種針對(duì)PCV2病毒感染免疫豬的方法，其包括將免疫有效量的病毒疫苗給予豬，所述病毒疫苗包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員(a)豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質(zhì)粒或病毒載體，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無(wú)毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合PCV，其包含PCV2(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將核酸分子或活的減毒嵌合PCV病毒給予豬。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將滅活的嵌合PCV病毒給予豬。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將將疫苗胃腸外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮給予豬。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將疫苗淋巴內(nèi)或肌內(nèi)給予豬。本發(fā)明還提供一種針對(duì)豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病(PCVAD)保護(hù)豬的方法，其包括將免疫有效量的病毒疫苗給予豬，所述病毒疫苗包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員(a)豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質(zhì)粒或病毒載體，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無(wú)毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合PCV，其包含PCV2(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼蛋白的至少一部分。附圖簡(jiǎn)述結(jié)合附圖閱讀下述發(fā)明詳述，可更清楚地理解本發(fā)明的上述特征，其中圖I闡明全長(zhǎng)PCV2b和嵌合PCVl-2bDNA克隆的結(jié)構(gòu)和基因組組構(gòu)。圖I(A)顯示PCV2b單體DNA克隆。在用PCR引物A(SEQIDNo:3)和B(SEQIDNo:4)(表I)擴(kuò)增后，使用獨(dú)特的SacII位點(diǎn)，在pBSK+載體中克隆野生型PCV2b的完整基因組。圖I(B)顯示嵌合PCVl-2b單體DNA克隆。使用PCR引物C-H(SEQIDNo:5-10)(表I)，通過(guò)重疊延伸PCR來(lái)構(gòu)建嵌合PCVI-2bDNA克隆。圖2闡明用嵌合PCVl_2b病毒和野生型PCV2b病毒實(shí)驗(yàn)接種的剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(CD/CD)豬中的PCV2衣殼特異性抗體反應(yīng)。貫穿實(shí)驗(yàn)對(duì)各處理組繪制平均值血清S/P比+/-SEM，其中(*)表示在那天顯著不同。由于死亡或早期安樂(lè)死一些PCV2b感染的豬，在35-42dpi的組中采樣的豬少于5只。具有不同字母的組在那天為顯著不同。圖3顯示用PBS緩沖液、嵌合PCVl_2b病毒和野生型PCV2b病毒接種的剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(⑶/⑶)豬中的總體淋巴損害評(píng)分在21dpi的比較。比較處理之間的淋巴結(jié)、脾和扁桃體的組合的淋巴萎縮(lymphoiddepletion)、組織細(xì)胞置換和PCV2特異性抗原評(píng)分。在18dpi死亡的PCV2b接種的豬包括在該分析中。圓圈表示中位數(shù)，箱是第I和第3四分位數(shù)，和箱須(whisker)表示全部的數(shù)據(jù)范圍。具有不同字母的處理是顯著不同的。圖4闡明用嵌合PCVl_2b病毒和PCV2b病毒實(shí)驗(yàn)接種的剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(⑶/⑶)豬的血清和淋巴組織中的病毒DNA載量的定量。圖4(A)顯示使用qPCR來(lái)定量血清中的病毒血癥和病毒DNA載量。對(duì)各處理組繪制每ml血清的組平均值log病毒基因組拷貝+/-SEM，其中(*)表示在那天顯著不同。0dpi的所有樣品以及來(lái)自PBS接種的豬的所有樣品為陰性。由于死亡或早期安樂(lè)死一些PCV2b感染的豬，在35-42dpi的組中采樣的豬少于5只。圖4(B)顯示使用qPCR來(lái)定量TBLN組織中的病毒DNA載量。在豬死亡或被安樂(lè)死的那天繪制對(duì)各豬所測(cè)定的淋巴結(jié)組織病毒DNA載量，其中在21和42dpi繪制組平均值+/-SEM。來(lái)自PBS接種的豬的所有樣品為陰性，由于PCVAD而死亡或被早期安樂(lè)死的PCV2b感染的豬(實(shí)心圓圈)不包括在組平均值的分析中。(*)表示在那天顯著不同。圖5闡明用嵌合PCVl_2b病毒疫苗接種并隨后用PCV2a或PCV2b野生型病毒攻擊的常規(guī)無(wú)特異性病原體豬中的PCV2特異性抗體反應(yīng)。貫穿實(shí)驗(yàn)對(duì)各處理組繪制平均值血清S/P比+/-SEM,其中(*)表示接種疫苗組(vax)與未接種疫苗組(PBS)之間顯著不同。用PCV2a或PCV2b在56dpv攻擊所有豬。77dpv(或21dpc)的具有不同字母的組在那天是顯著不同的。圖6顯示用PCVl_2b疫苗或PBS緩沖液接種并隨后用PCV2a或PCV2b攻擊的常規(guī)SPF豬中的總體淋巴損害評(píng)分的比較。通過(guò)攻擊PCV2病毒亞型，比較接種疫苗豬與未接種疫苗豬之間的淋巴結(jié)、脾和扁桃體的組合的淋巴萎縮、組織細(xì)胞置換和PCV2特異性抗原評(píng)分。圓圈表示中位數(shù)，箱是第I和第3四分位數(shù)，和箱須表示數(shù)據(jù)范圍。具有(*)的處理對(duì)為顯著不同。圖7闡明用PBS緩沖液或PCVl_2b疫苗接種并隨后用PCV2a或PCV2b攻擊的常規(guī)豬的血清和淋巴組織樣品中的PCV2病毒DNA載量的檢測(cè)和定量。圖7(A)顯示使用qPCR來(lái)定量血清中的病毒血癥和病毒載量。對(duì)各處理組繪制每ml血清的組平均值log病毒基因組拷貝+/-SEM056dpv(或0dpc)的所有樣品以及來(lái)自接種疫苗豬的所有樣品對(duì)PCV2a或PCV2bDNA為陰性。圖7(B)顯示使用qPCR來(lái)定量TBLN組織中的病毒DNA載量。繪制對(duì)各豬所測(cè)定的淋巴組織中的中位數(shù)病毒DNA載量。圓圈表示中位數(shù)，箱是第I和第3四分位數(shù)，和箱須表示全部的數(shù)據(jù)范圍。在用PCV2a或PCV2b攻擊時(shí)，在所有未接種疫苗的豬的淋巴結(jié)中檢測(cè)到病毒DNA，但是僅1/10的vax/PCV2b豬和5/10的vax/PCV2a豬具有可檢測(cè)的病毒DNA。(*)表示基于攻擊病毒亞型，接種疫苗對(duì)與未接種疫苗對(duì)之間顯著不同。發(fā)明詳述PCV2感染和PCVAD持續(xù)對(duì)全球豬群形成主要威脅。PCVAD可能是如今豬工業(yè)面臨的最經(jīng)濟(jì)上重要的疾病。消瘦、淋巴萎縮與組織細(xì)胞浸潤(rùn)的顯微損害以及損害中存在PCV2抗原或DNA是診斷豬的PCVAD的三個(gè)特征標(biāo)準(zhǔn)(Segales，J.等，2005，同上)。然而，據(jù)知不是所有感染PCV2的豬將發(fā)生臨床PCVAD，共感染病毒和細(xì)菌病原體對(duì)誘導(dǎo)全譜的臨床PCVAD通常是必需的(Albina,E.等，2001，Anexperimentalmodelforpost-weaningmuitisystemicwastingsyndrome(PMWS)ingrowingpiglets(一種發(fā)育小豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，JCompPathol125:292-303；Magar,R.等，2000,Experimentaltransmissionofporcinecircovirustype2(PCV2)inweanedpigs:asequentialstudy(斷奶豬的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的實(shí)驗(yàn)傳遞序貫研究)，JCompPathol123:258-69)。在2005年之前，從美國(guó)和加拿大的PCVAD病例中檢測(cè)的病毒幾乎排他地為PCV2a亞型。因此，四種全部基于PCV2a亞型的商業(yè)疫苗被開(kāi)發(fā)且目前在全世界豬群中使用。全世界分離的PCV2a株是密切相關(guān)的并享有95-99%的核苷酸序列同一性，并因此這些商業(yè)疫苗已有效針對(duì)全球豬群中的PCV2a和PCVAD。最近，美國(guó)和加拿大的某些地區(qū)爆發(fā)的更嚴(yán)重的PCVAD病例已歸因于出現(xiàn)的一種新PCV2b亞型(Gagnon,C.A.等，2007，同上)。PCV2a與PCV2b亞型之間的核苷酸序列相差多達(dá)10%，并已鑒定區(qū)分兩種亞型的獨(dú)特氨基酸序列基序(Cheung，A.K.等，2007,同上)，從而提出是否目前完全基于PCV2a亞型的商業(yè)疫苗可針對(duì)新的PCV2b亞型感染進(jìn)行全面保護(hù)的問(wèn)題。在最近幾年，全球豬群的PCV2盛行已主要轉(zhuǎn)移至PCV2b亞型，事實(shí)上，美國(guó)大多數(shù)的最近PCVAD病例與新的PCV2b亞型相關(guān)(Cheung，A.K.等，2007，同上；Firth,C等，2009,Insightsintotheevolutionaryhistoryofanemerginglivestockpathogen:porcinecircovirus2(洞察新興家畜病原體的進(jìn)化史豬圓環(huán)病毒2)，JVirol83:12813-21)。基于PCV2a亞型的疫苗仍在全世界使用，因?yàn)镻CV2a疫苗已顯示提供交叉保護(hù)(Fort,M.等，2008，同上；Fort,M.等2009，同上；0priessnig,T.等，2009，同上；Segales，J.等，2008，同上)。然而，基于PCV2a的疫苗所提供的針對(duì)流通的新PCV2b亞型的交叉保護(hù)程度是未知的，全球豬工業(yè)將必定獲益于能夠使用基于目前流通的主要PCV2b亞型的疫苗。因此，本發(fā)明的目的之一在于開(kāi)發(fā)一種基于新的PCV2b亞型的新一代疫苗并評(píng)價(jià)基于PCV2b的疫苗針對(duì)PCV2a和PCV2b攻擊兩者的功效。本發(fā)明提供一種減毒的活的PCVl和PCV2的嵌合病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，構(gòu)建了表達(dá)PCV2亞型PCV2b的衣殼蛋白的PCVl病毒。作為例示性方法，發(fā)明人首先產(chǎn)生了PCV2b亞型的感染性DNA克隆，然后構(gòu)建了新的嵌合病毒PCVl-2b，其在非致病的PCVl的基因組骨架中包含PCV2b亞型的免疫原性衣殼基因。首先在⑶/⑶豬中評(píng)價(jià)新的嵌合PCVl-2b病毒的致病性和免疫原性。隨后，在常規(guī)豬中進(jìn)行攻擊和交叉攻擊研究以確定PCVl-2b嵌合疫苗病毒的疫苗功效。發(fā)明人證實(shí)，嵌合PCVl-2b疫苗病毒在豬中是減毒的并誘導(dǎo)針對(duì)PCV2b的保護(hù)性免疫和針對(duì)PCV2a的交叉保護(hù)性免疫。因此，該新的嵌合PCVl-2b疫苗應(yīng)該是作為針對(duì)PCV2b和PCV2a感染兩者以及PCVAD的活的減毒疫苗的優(yōu)秀候選物。下述實(shí)施例展示本發(fā)明的某些方面。然而，將理解，這些實(shí)施例僅是為了例示說(shuō)明，并不意在完全限制本發(fā)明的條件和范圍。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)給出典型的反應(yīng)條件(例如，溫度、反應(yīng)時(shí)間等)時(shí)，盡管通常較不合宜，但還是可使用高于和低于特定范圍的條件。在室溫(約23°C-約28°C)和大氣壓下進(jìn)行實(shí)施例。除非另外指定，否則本文涉及的所有份數(shù)和百分比以重量為基礎(chǔ)，所有溫度以攝氏度表示。實(shí)施例IPCVl和PCV2病毒隔離群在之前的研究中構(gòu)建了PCVl感染性DNA克隆并在豬中顯示為非致病的(Fenaux，M.等，2002，ClonedgenomicDNAoftype2porcinecircovirusisinfectiouswheninjecteddirectlyintotheliverandlymphnodesofpigs:characterizationofclinicaldisease,virusdistribution,andpathologiclesions(當(dāng)直接注身寸到豬的肝和淋巴結(jié)中時(shí)，2型豬圓環(huán)病毒的克隆的基因組DNA是感染性的臨床疾病、病毒分布和病理?yè)p害的表征)，JVirol76:541-51；Fenaux,M.等2004A，同上；Fenaux，M_等，2003，同上)隔離群ISU-40895(SEQIDNo:I,Genbank登錄號(hào)AF264042)于1998年在愛(ài)荷華州農(nóng)場(chǎng)的患有PCVAD的豬中發(fā)現(xiàn)(Fenaux，M.等，2000，同上)，并已廣泛用于PCV2致病性研究(Fenaux，M.等，2002，同上；Fenaux，M.等，2004，同上；Fenaux，M.等，2003，同上；0priessnig，T.等，2006，Evidenceofbreed-dependentdifferencesinsusceptibilitytoporcinecircovirustype-2-associateddiseaseandlesions(易患2型豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病和損害的品種依賴性差異的證據(jù))，VetPathol43:281-93;0priessnig，T.等，2006，EffectsofthetimingoftheadministrationofMycoplasmahyopneumoniaebacterinonthedevelopmentoflesionsassociatedwithporcinecircovirustype2(豬肺炎支原體菌苗的給藥時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)生與2型豬圓環(huán)病毒相關(guān)的損害的影響)，VetRec158:149-54；Opriessnig,T.等，2004，ExperimentalreproductionofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigsbydualinfectionwithMycoplasmahyopneumoniaeandporcinecircovirustype2(通過(guò)用豬肺炎支原體和2型豬圓環(huán)病毒雙重感染來(lái)實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征)，VetPathol41:624-40;0priessnig，T.等，2003，Effectofvaccinationwithselectivebacterinsonconventionalpigsinfectedwithtype2porcinecircovirus(用選擇性菌苗接種對(duì)用2型豬圓環(huán)病毒感染的常規(guī)豬的影響)，VetPathol40:521-9)oPCV2a_40895在實(shí)驗(yàn)條件下能夠引起PCVAD顯微損害和臨床疾病(Opriessnig，T.等，2006，同上；0priessnig，T.等，2004，EffectofporcineparvovirusvaccinationonthedevelopmentofPMWSinsegregatedearlyweanedpigscoinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcineparvovirus(豬細(xì)小病毒疫苗接種對(duì)在用2型豬圓環(huán)病毒和豬細(xì)小病毒共感染的隔離早期斷奶豬中發(fā)生PMWS的影響)，VetMicrobiol98:209-20；Opriessnig,T.等，2004，同上)。通過(guò)測(cè)序完整的病毒基因組(SEQIDNo:2，Genbank登錄號(hào)⑶799576)，證實(shí)了研究中使用的PCV2b株為真正的PCV2b亞型。PCV2b的基因組DNA被用作用于構(gòu)建PCV2b的感染性DNA克隆以及嵌合PCVl-2b感染性DNA克隆的來(lái)源。在本發(fā)明之前，未在實(shí)驗(yàn)感染中測(cè)定PCV2b病毒的致病性。實(shí)施例2PCV2b和嵌合PCVl-2b的感染性DNA克隆的產(chǎn)生之前已報(bào)道了用于構(gòu)建PCV2a-40895的感染性DNA克隆的方法(Fenaux，M.等，2002，同上)，在本發(fā)明中使用類似的方法來(lái)產(chǎn)生PCV2b的感染性DNA克隆(圖Ia)。簡(jiǎn)言之，使用一對(duì)具有包含存在于所有PCV2株中的SacII限制酶位點(diǎn)的重疊區(qū)的引物A(SEQIDNo:3)和B(SEQIDNo:4)(表I)，通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增PCV2b的全長(zhǎng)基因組。然后用SacII(NewEnglandBiolabs)消化PCR產(chǎn)物并連接到pBluescriptIISK(+)(pBSK+)(Stratagene)中以產(chǎn)生PCV2b的感染性DNA克隆?！榱水a(chǎn)生嵌合PCVl_2b感染性DNA克隆，使用重疊延伸PCR來(lái)將PCVl感染性克隆的骨架中的PCVl衣殼基因代替為來(lái)自PCV2b的衣殼基因(圖lb)。從3個(gè)重疊PCR片段(表I)裝配全長(zhǎng)嵌合PCVl-2b基因組。使用具有相同擴(kuò)增參數(shù)(95°C3分鐘；40個(gè)循環(huán)的95°C30秒、55°C30秒、68°CI分鐘)的PlatinumTaqHiFimastermix(Invitrogen)來(lái)產(chǎn)生各擴(kuò)增子。使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAquickGelExtractionKit,Qiagen)來(lái)純化PCR產(chǎn)物。將由兩步組成的融合PCR用于裝配嵌合PCVl-2bDNA克隆使用50ng的各片段作為模板的不需要引物的裝配反應(yīng)(20個(gè)循環(huán)的95°C30秒、55°C30秒、68°CI分鐘)，然后使用外部引物擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán)的95°C30秒、55°C30秒、68°CI分鐘)。將用引物G(SEQIDNo:9)和H(SEQIDNo:10)(表I)從PCVl克隆擴(kuò)增的1，043bp片段首先與包含用引物C(SEQIDNo:5)和D(SEQIDNo:6)(表I)從PCV2b擴(kuò)增的完整衣殼基因的718bp片段融合。然后加入用引物E(SEQIDNo:7)和F(SEQIDNo:8)(表I)從PCVl擴(kuò)增的122bp片段，得到側(cè)翼為KpnI限制性位點(diǎn)的完整嵌合PCVl_2b基因組。隨后用KpnI(NewEnglandBiolabs)消化嵌合融合產(chǎn)物并克隆到pBSK+中。對(duì)單體DNA克隆進(jìn)行完整測(cè)序以確認(rèn)在PCR擴(kuò)增步驟期間沒(méi)有引入不需要的突變。實(shí)施例3PCV2b和PCVl-2bDNA克隆的二聚化之前的研究顯示，二聚化PCV2a克隆在PK-15細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染和豬的體內(nèi)轉(zhuǎn)染兩者中更有效地產(chǎn)生感染性病毒，其中2份拷貝的全長(zhǎng)PCV2a基因組通過(guò)首尾串連來(lái)連接(Fenaux,M.等，2002，同上；Fenaux,M.等，2004A,同上；Fenaux,M.等，2003，同上)。因此，在本發(fā)明中，將PCV2b和PCVl-2b克隆兩者二聚化以產(chǎn)生更健壯(robust)和有效的感染性克隆。簡(jiǎn)言之，使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)來(lái)提取包含PCV2b和PCVl-2b單體基因組的質(zhì)粒DNA。使用ScaI(NewEnglandBiolabs)來(lái)線性化純化的質(zhì)粒DNA并通過(guò)在37°C孵育30秒來(lái)使其經(jīng)受KpnI的部分消化以產(chǎn)生大約3，100和3,700bp的兩個(gè)片段，這些片段然后通過(guò)凝膠提取來(lái)純化。使用T4DNA連接酶(Promega)來(lái)組合和連接兩個(gè)片段以產(chǎn)生PCV2b和PCVl-2b兩者的串聯(lián)二聚化感染性DNA克隆。實(shí)施例4PCV2b和PCVl-2b感染性DNA克隆在PK-15細(xì)胞中的生存力測(cè)試如之前所述，在使用間接熒光測(cè)定(IFA)來(lái)轉(zhuǎn)染后，體外測(cè)試PCV2b和嵌合PCVl-2bDNA克隆的生存力和感染性(Fenaux，M.等，2002，同上)。簡(jiǎn)言之，將6.5吒的各二聚化DNA克隆加入1,250mOPTMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)和6.25PLUS試劑(Invitrogen)中，并在室溫孵育5分鐘。加入16MlLipofectamineLTX(Invitrogen)后,將混合物在室溫孵育30分鐘，再加入250WOPTMEM培養(yǎng)基。將包含60-70%匯合的PK-15細(xì)胞的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)用MEM培養(yǎng)基(Invitix)gen)洗滌，加入轉(zhuǎn)染混合物，然后將瓶在37°C孵育6小時(shí)。孵育后，將8ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清和2x抗生素/抗真菌溶液的MEM[Invitrogen])加入各瓶中，并在37°C孵育另外的72小時(shí)。然后將各T25瓶中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在_80°C冷凍和解凍3次，將細(xì)胞裂解物在4°C以2，500xg離心10分鐘以移除細(xì)胞碎片。收獲上清液并用于感染以50%匯合接種于48孔板(BD-Falcon)的新鮮PK-15細(xì)胞。每孔加入loom的轉(zhuǎn)染上清液后，將板在37°c孵育I小時(shí)，之后向各孔加入500m生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在37°C孵育72小時(shí)。如之前所述，使用IFA來(lái)可視化感染的PK-15細(xì)胞的核中的衣殼蛋白(Fenaux，M.等2002，同上)。簡(jiǎn)言之，使用PBS中的80%丙酮在4°C固定細(xì)胞30分鐘，用PBS緩沖液洗滌I次，用1:1，000稀釋的PCV2單特異性小鼠單克隆抗體(RuralTechnologies,Inc.；Brookings,SouthDakota)在37°C孵育45分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次后，將細(xì)胞用1:50稀釋的FITC標(biāo)記的第二山羊抗小鼠IgG(KPL)在37°C孵育45分鐘。用PBS緩沖液洗滌后，然后用FluoromountG(SouthernBiotech)蓋上細(xì)胞并在突光顯微鏡下檢查。當(dāng)轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中時(shí)，PCV2b和嵌合PCVl_2bDNA克隆是感染性的PCV2b和嵌合PCVl-2b的全長(zhǎng)單拷貝和串聯(lián)二聚化DNA克隆被構(gòu)建并由全長(zhǎng)測(cè)序證實(shí)。用兩種DNA克隆的二聚體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞引起感染性子代病毒體的產(chǎn)生，如通過(guò)IFA與PCV2衣殼特異性單克隆抗體來(lái)檢測(cè)的。PCV2b和嵌合PCVl-2b病毒貯液兩者的感染效價(jià)為大約IO45TCID50/ml。實(shí)施例5感染性PCV2a、PCV2b和PCVl-2b病毒貯液的產(chǎn)生和滴定為了制備用于豬體內(nèi)研究的接種物，通過(guò)用二聚化感染性DNA克隆轉(zhuǎn)染T25瓶中的PK-15細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生PCV2a-40895、PCV2b和PCVl_2b的感染性病毒貯液(參見(jiàn)上文)(Fenaux,M.等2002.同上；Fenaux,M.等2003，同上)。基本上如之前所述進(jìn)行,通過(guò)IFA來(lái)滴定這些感染性病毒貯液(Fenaux，M.等2002，同上)。簡(jiǎn)言之，將PK-15細(xì)胞以60%匯合接種于48孔板(BD-Falcon)，并在37°C孵育3小時(shí)。在MEM中產(chǎn)生各病毒貯液的系列10倍稀釋液，并將各稀釋液以100W每孔接種于四個(gè)單獨(dú)的孔。將板在37°C孵育I小時(shí)，之后向各孔加入500m生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在37°C繼續(xù)孵育72小時(shí)。使用IFA來(lái)可視化各孔中感染細(xì)胞的核的陽(yáng)性信號(hào)(參見(jiàn)上文)。根據(jù)Reed&Muench的方法來(lái)計(jì)算每ml的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)。實(shí)施例6PCV2b和嵌合PCVl-2b在剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(CD/CD)豬中的致病性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)CD/CD豬被認(rèn)為是用于研究PCV2致病性的優(yōu)秀模型系統(tǒng)，因?yàn)榭稍谠撃Ｐ椭性佻F(xiàn)典型的病理?yè)p害和臨床PCVAD(Allan,G.等，2003，同上；Bolin,S.R.等，2001，同上；Harms,P.A.等，2001，同上；Kennedy,S.等，2000，同上；Tomas,A.等，2008，同上)。為了測(cè)定嵌合PCVl-2b病毒的致病性并將其與野生型PCV2b病毒比較，將大約9周齡的總計(jì)30只⑶/⑶豬(StruveLabs,Manning,IA)以每個(gè)房間10只動(dòng)物的形式隨機(jī)分配成三組。接種之前，對(duì)各豬稱重、出血并確認(rèn)其對(duì)PCV2抗體的存在為陰性。將組I豬用3mlPBS緩沖液各自模擬接種(2ml鼻內(nèi)和Iml肌內(nèi))，并充當(dāng)未感染的對(duì)照。將組2中的豬用3ml的包含2XIO45TCID5tl嵌合PCVl-2b病毒的接種物各自接種(2ml鼻內(nèi)和Iml肌內(nèi))。將組3中的豬用2XIO45TCID5tl野生型PCV2b病毒各自類似接種。接種之前和在此之后每周從各豬中收集血液樣品直至21或42天的接種后天數(shù)(dpi)尸體解剖。在21dpi，尸體解剖來(lái)自各組的5只隨機(jī)分配的豬。在42dpi，尸體解剖各組中剩下的5只豬。實(shí)施例IPCV2b和嵌合PCVl-2b在剖腹產(chǎn)來(lái)源剝奪初乳的(CD/CD)豬中的致病性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)CD/CD豬被認(rèn)為是用于研究PCV2致病性的優(yōu)秀模型系統(tǒng)，因?yàn)榭稍谠撃Ｐ椭性佻F(xiàn)典型的病理?yè)p害和臨床PCVAD(Allan,G.等，2003，同上；Bolin,S.R.等，2001，同上；Harms,P.A.等，2001，同上；Kennedy,S.等，2000，同上；Tomas,A.等，2008，同上)。為了測(cè)定嵌合PCVl-2b病毒的致病性并將其與野生型PCV2b病毒比較，將大約9周齡的總計(jì)30只⑶/⑶豬(StruveLabs,Manning,IA)以每個(gè)房間10只動(dòng)物的形式隨機(jī)分配成三組。接種之前，對(duì)各豬稱重、出血并確認(rèn)其對(duì)PCV2抗體的存在為陰性。將組I豬用3mlPBS緩沖液各自模擬接種(2ml鼻內(nèi)和Iml肌內(nèi))，并充當(dāng)未感染的對(duì)照。將組2中的豬用3ml的包含2XIO45TCID5tl嵌合PCVl-2b病毒的接種物各自接種(2ml鼻內(nèi)和Iml肌內(nèi))。將組3中的豬用2XIO45TCID5tl野生型PCV2b病毒各自類似接種。接種之前和在此之后每周從各豬中收集血液樣品直至21或42天的接種后天數(shù)(dpi)尸體解剖。在21dpi，尸體解剖來(lái)自各組的5只隨機(jī)分配的豬。在42dpi，尸體解剖各組中剩下的5只豬。嵌合PCVl_2b病毒在⑶/⑶豬中是減毒的，而野生型PCV2b病毒誘導(dǎo)PCVAD的病理?yè)p害和臨床疾病特征為了明確評(píng)估嵌合PCVl-2b病毒的致病潛能，在CD/CD豬模型中進(jìn)行致病性研究，該模型已顯示為最可重現(xiàn)和高度靈敏的PCVAD疾病模型(Allan，G.等，2003，同上；Bolin,S.R.等，2001，同上；Harms,P.A.等，200,1同上；Kennedy,S.等2000，同上)。臨床體征和肉眼損害:用嵌合PCVl_2b病毒或PBS緩沖液實(shí)驗(yàn)接種的CD/CD豬貫穿整個(gè)研究沒(méi)有PCVAD的明顯臨床體征，而用野生型PCV2b實(shí)驗(yàn)接種⑶/CD豬在10只PCV2b感染的豬的4只中引起PCVAD相關(guān)的死亡或早期安樂(lè)死1只豬在18dpi死亡，另一只在27dpi死亡，其余兩只由于進(jìn)行性體重減輕在34dpi不得不被安樂(lè)死。來(lái)自3個(gè)處理組的每一個(gè)的豬直至21dpi都具有類似的體重增加，但野生型PCV2b感染的豬在21dpi后在5只豬中的4只中具有體重增加的下降(由于體重減輕3只豬死亡或被早期安樂(lè)死)。在用嵌合PCVl-2b病毒接種的豬中未觀察到肉眼可見(jiàn)的肺損害，而在27dpi和34dpi尸體解剖的3只PCV2b接種的豬顯示中等的肺損害。與PBS對(duì)照相t匕，PCVI-2b和PCV2b兩者感染的豬中的淋巴結(jié)擴(kuò)大。然而，PCVl-2b感染的豬中具有擴(kuò)大淋巴結(jié)的豬數(shù)量與擴(kuò)大量比野生型PCV2b豬中的少(數(shù)據(jù)未顯示)。顯微損実:通過(guò)以下兩組中的處理來(lái)分析顯微損害在21dpi或之前尸體解剖的所有豬(包括在18dpi死亡的PCV2b感染的豬)，和在42dpi尸體解剖的所有豬(包括在27dpi和34dpi死亡或被安樂(lè)死的3只PCV2b感染的豬)。肺、肝、胸腺、心、腎、回腸、結(jié)腸、淋巴結(jié)、脾和扁桃體中的顯微損害在表2中概述。正如預(yù)期的，用PBS緩沖液接種的豬中沒(méi)有顯著的顯微損害。在21和42dpi，與用野生型PCV2b實(shí)驗(yàn)接種的豬相比，用嵌合PCVl-2b病毒接種的豬的淋巴組織中的典型的PCV2相關(guān)顯微損害的發(fā)生率和嚴(yán)重性都下降(表2)。其他非淋巴組織中的顯微損害包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的輕度至嚴(yán)重浸潤(rùn)(表2)。在野生型PCV2b感染的豬中幾乎排他地發(fā)現(xiàn)了小腸和大腸中的損害。在21dpi，用嵌合PCVl_2b病毒接種的豬的平均值組總體淋巴損害評(píng)分顯著(p=0.045)低于用野生型PCV2b病毒接種的豬的評(píng)分，并與用PBS緩沖液接種的豬沒(méi)什么不同(圖3)。仏泛差羞堂將從死亡或被早期安樂(lè)死的豬中獲得的血清樣品與來(lái)自下一步預(yù)定尸體解剖的血清樣品一起分析(例如，在分析來(lái)自21dpi尸體解剖的樣品時(shí)包括來(lái)自在18dpi死亡的豬的血清)。早在7dpi就在一些PCVl-2b感染的豬的血清中檢測(cè)到PCV2衣殼特異性IgG抗體，其中9/10的豬至21dpi血清轉(zhuǎn)變(圖2)。嵌合PCVl-2b病毒接種的豬中的PCV2IgG抗體效價(jià)至28dpi達(dá)到穩(wěn)定并直至研究結(jié)束(42dpi)保持高的。在用野生型PCV2病毒實(shí)驗(yàn)接種的豬中，血清轉(zhuǎn)變較不一致僅3/10的豬至21dpi血清轉(zhuǎn)變，而5/10的豬在該研究中不具有可檢測(cè)的血清轉(zhuǎn)變。然而，僅2/5的PCV2b感染的豬活到dpi42的預(yù)定尸體解剖，且兩者在28dpi進(jìn)行血清轉(zhuǎn)變，直至研究結(jié)束都具有增加的IgG抗體效價(jià)。由于臨床PCVAD而死亡或被早期安樂(lè)死的豬中，在任何時(shí)間僅1/4具有可檢測(cè)的PCV2特異性抗體，沒(méi)有豬在它們被尸體解剖的那天具有可檢測(cè)的血清抗PCV2抗體。貫穿該研究在任何PBS緩沖液接種的豬中都未檢測(cè)到PCV2衣殼特異性抗體。通過(guò)IHC確定的組織中的患病率和PCV2特異件抗原的暈不同組織中的患病率和PCV2抗原的平均值組量在表3中概述。一起分析在21dpi或之前尸體解剖的所有豬(包括在18dpi死亡的PCV2b感染的豬)，并一起分析在42dpi尸體解剖的所有豬(包括在27dpi和34dpi死亡或被安樂(lè)死的3只PCV2b感染的豬)。通常，與用野生型PCV2b病毒接種的豬相比，用嵌合PCVl-2b病毒接種的豬的發(fā)病率和PCV2抗原的量都較低(表3)。在除了扁桃體外的所有21dpi組織中有I只PCVl-2b接種的豬引起陽(yáng)性結(jié)果，在扁桃體中5只豬中的4只為陽(yáng)性。來(lái)自PCVl-2b接種的豬的組織在42dpi大部分為陰性，其中淋巴結(jié)除外，在淋巴結(jié)中5只豬中的4只檢測(cè)到少量的PCV2抗原。PCV2病毒血癥和血清病毒載量:使用擴(kuò)增部分PCV2b衣殼基因的改良qPCR測(cè)定來(lái)測(cè)定感染的動(dòng)物的血清中的PCV2病毒載量，已知qPCR測(cè)定對(duì)PCV2b和PCVl_2b兩者起作用(Yang,Z.Z.等，2007，DetectionofPCV2DNAbySYBRGreenI-basedquantitativePCR(通過(guò)基于SYBR綠I的定量PCR來(lái)檢測(cè)PCV2DNA).JZhejiangUnivSciB8:162-9)。確認(rèn)在接種前0天和貫穿該研究從PBS緩沖液接種的豬中取得的所有血清樣品不具有可檢測(cè)的PCV2DNA0將從由于PCVAD疾病而死亡或被早期安樂(lè)死的豬中取得的血清樣品與來(lái)自下一步預(yù)定尸體解剖的血清樣品一起分析(例如，在分析來(lái)自21dpi的樣品時(shí)包括來(lái)自在18dpi死亡的豬的血清)。從14dpi直至研究結(jié)束，用嵌合PCVl_2b病毒接種的豬中存在的血清病毒載量顯著(p<0.009)低于PCV2b接種的豬中的血清病毒載量(圖4a)。PCVl_2b感染的豬中的平均血清病毒載量在14dpi達(dá)到峰值IO7基因組拷貝/ml，并平穩(wěn)下降直至研究結(jié)束。對(duì)于任何單個(gè)PCVl-2b感染的豬所實(shí)現(xiàn)的最大值為在14dpi的IO8基因組拷貝/ml。與此相比，PCV2b感染的豬中的平均值血清病毒載量從14dpi直到28dpi后都保持高于IO8基因組拷貝/ml，其中單個(gè)豬所實(shí)現(xiàn)的最大值為1012。由于PCVAD而早期死亡或被安樂(lè)死的4只豬比其他PCV2b接種的豬具有較高水平的血清病毒載量。7dpi后，PCV2b感染的豬的每ml血清的病毒基因組拷貝是PCVl-2b感染的豬的至少10倍，并在21dpi和28dpi為100倍。淋巴組織中的PCV2病毒載暈:使用如上文的相同qPCR測(cè)定來(lái)測(cè)定在尸體解剖各豬時(shí)所收集的TBLN組織中的PCV2病毒DNA的量。確認(rèn)來(lái)自PBS緩沖液接種的豬的所有TBLN組織樣品對(duì)PCV2DNA為陰性。為了能夠進(jìn)行21dpi與42dpi的組平均值病毒載量的有意義比較，測(cè)試但在分析中不包括由于PCVAD疾病而早期死亡或被安樂(lè)死的豬。發(fā)現(xiàn)在21dpiPCVl-2b接種的豬中的每mg的TBLN組織中存在的病毒載量顯著低于PCV2b接種的豬中的病毒載量(P=O.005)(圖4b)。在所有被測(cè)試的TBLN組織中，由于PCVAD而死亡或被早期安樂(lè)死的豬在TBLN組織中都具有最高的病毒載量。實(shí)施例8嵌合PCVl-2b病毒在常規(guī)無(wú)特異性病原體(SPF)豬中的疫苗接種和免疫原性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從商業(yè)農(nóng)場(chǎng)(VirginiaTechSwineCenter,Blacksburg,VA)購(gòu)買總計(jì)40只3周齡雜交種SPF豬，已知這些豬不含PCV、PRUSV、PPV、豬肺炎支原體和豬戊型肝炎病毒。將小豬隨機(jī)分配成2組，每組20只豬并單獨(dú)圈養(yǎng)。接種之前，對(duì)各豬稱重、出血并確認(rèn)其對(duì)PCV2抗體為陰性。將組I豬用Iml的嵌合PCVl-2b病毒各自肌內(nèi)(IM)接種疫苗(每只豬IO35TCID50感染性病毒)。將組2豬用ImlPBS緩沖液各自IM模擬接種疫苗并充當(dāng)未接種疫苗的對(duì)照。每天監(jiān)控所有動(dòng)物的臨床體征，并在接種之前和在此之后直至56天的接種疫苗后天數(shù)(dpv)每周從各豬中收集血液樣品。實(shí)施例9用野生型PCV2b亞型和PCV2a亞型分別攻擊和交叉攻擊接種疫苗的豬的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在56dpv,將20只接種疫苗的豬進(jìn)一步分為每組10只豬的兩組，并在單獨(dú)的房間中圈養(yǎng)將10只接種疫苗的豬各用2XIO45TCID5tl野生型PCV2b病毒攻擊(2ml鼻內(nèi)和Iml頂)，將另外10只接種疫苗的豬各用2XIO45TCID5tl野生型PCV2a病毒類似地交叉攻擊。亦將20只未接種疫苗的對(duì)照豬進(jìn)一步分為兩組，每組10只豬，并分別用PCV2b和PCV2a類似地接種。每周收集血液樣品直至21天的攻擊后天數(shù)(dpc)(或77dpv)，在那時(shí)將所有豬尸體解剖。用嵌合PCVl_2b病毒疫苗接種針對(duì)PCV2b亞型攻擊和PCV2a亞型交叉攻擊賦予常規(guī)豬的保護(hù)性免疫因?yàn)榍逗螾CVl-2b疫苗旨在常規(guī)豬的領(lǐng)域使用，所以發(fā)明人使用常規(guī)SPF豬來(lái)進(jìn)行該疫苗功效和攻擊研究。臨床體征和肉眼損害:貫穿該研究沒(méi)有豬發(fā)生與PCVAD—致的臨床體征，且在處理組之間未觀察到體重增加的差異。分配到未接種疫苗/PCV2b攻擊組的I只豬在2dpc死于與PCVAD不相關(guān)的細(xì)菌性敗血癥，且不包括在分析中。在尸體解剖時(shí)，在任何處理組中都未觀察到肉眼可見(jiàn)的肺損害。在所有處理組中都看到了輕微至中等擴(kuò)大的淋巴結(jié)，其中處理之間未觀察到顯著差異。血清學(xué):研究之前確定所有豬對(duì)針對(duì)PCV2、PRRSV,PPV和SIV的抗體為陰性。早在14dpv就在PCVl-2b疫苗接種的豬的血清中檢測(cè)到了PCV2衣殼特異性抗體，其中在21dpv15/20的豬發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，并至28dpv20/20的豬發(fā)生血清轉(zhuǎn)變(圖5)。PCV2IgG抗體效價(jià)至35dpv達(dá)到穩(wěn)定并在56dpv攻擊時(shí)保持高的。直到在14dpc攻擊后，在未接種疫苗的對(duì)照豬中未檢測(cè)到抗PCV2的抗體(圖5):在14dpc,與僅2/9血清陽(yáng)性的PCV2b攻擊的豬相比，10/10PCV2a攻擊的豬為血清陽(yáng)性的。至21dpc，7/9未接種疫苗的PCV2b攻擊的豬血清轉(zhuǎn)變。顯微損害:攻擊后，與接種疫苗的豬相比，未接種疫苗的豬的淋巴組織中的顯微損害評(píng)分的發(fā)生率和嚴(yán)重性較高(表4)。大體上，與未接種疫苗的對(duì)照相比，接種疫苗的豬的典型淋巴萎縮和組織細(xì)胞置換評(píng)分較低(表4)。對(duì)于PCV2a(p=0.0001)和PCV2b(p=0.04)攻擊組兩者，接種疫苗的豬的總體淋巴損害評(píng)分都顯著低于未接種疫苗的豬的評(píng)分(圖·6)。通過(guò)IHC確定的組織中的PCV2抗原的暈:將IHC用于檢測(cè)各組織類型(表4)中的PCV2特異性抗原。與組織損害類似，與未接種疫苗的對(duì)照相比，大體上接種疫苗的豬的組織中的發(fā)生率和PCV2抗原的量都降低(表4)。病毒血癥和血清病毒載量:使用改良qPCR測(cè)定來(lái)定量攻擊后血清中的PCV2a或PCV2b病毒DNA的量，該測(cè)定對(duì)檢測(cè)PCV2a或PCV2brep基因特異但不能夠擴(kuò)增疫苗病毒PCVI-2b(Mcintosh,K.A.等2009.DevelopmentandvalidationofaSYBRgreenreal-timePCRforthequantificationofporcinecircovirustype2inserum,buffycoat,feces,andmultipletissues(開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證用于定量血清、棕黃層、排泄物和多種組織中的2型豬圓環(huán)病毒的SYBR綠實(shí)時(shí)PCR).VetMicrobiol133:23-33)。確認(rèn)在56dpv攻擊之前收集的血清樣品不具有可檢測(cè)的PCV2DNA。在攻擊后的任何時(shí)間點(diǎn)在接種疫苗的豬中沒(méi)有可檢測(cè)的PCV2a或PCV2b病毒血癥。與此相比，在攻擊后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在所有未接種疫苗的豬中都檢測(cè)到了PCV2a或PCV2b病毒血癥(圖7a)。用PCV2a或PCV2b病毒攻擊的未接種疫苗的豬之間在血清病毒載量方面無(wú)統(tǒng)計(jì)上顯著差異。淋巴組織中的PCV2a或PCV2b病毒載暈:尸體解剖時(shí)TBLN組織中所收集的PCV2a或PCV2b病毒DNA的量在圖7b中概述。在PCV2a(p=0.0001)和PCV2b(p<0.0001)攻擊組兩者中，與未接種疫苗的豬相比，發(fā)現(xiàn)接種疫苗的豬中每mg的TBLN組織中的病毒載量顯著較低(圖7b)。僅1/10的接種疫苗的且PCV2b攻擊的豬在TBLN組織中具有可檢測(cè)的PCV2b病毒DNA，其中病毒載量為IO5基因組拷貝/mg。5/10的接種疫苗的且PCV2a攻擊的豬在TBLN組織中具有可檢測(cè)的PCV2a病毒DNA，其中各自的病毒載量為IO5-IO6基因組拷貝/mg。未接種疫苗的豬的TBLN組織中的病毒載量范圍為IO8-IOltl基因組拷貝/mg，而不管PCV2a抑或PCV2b攻擊。實(shí)驗(yàn)材料和方法細(xì)胞之前通過(guò)終點(diǎn)稀釋PK-15細(xì)胞(ATCCCCL-33)來(lái)產(chǎn)生無(wú)PCVl污染的PK-15細(xì)胞系的亞克隆(Fenaux,M.等，2000，同上；Fenaux,M.等，2002，同上)。將無(wú)PCVl的PK-15細(xì)胞系用于產(chǎn)生感染性病毒貯液和本發(fā)明使用的病毒貯液的感染性滴定。血清學(xué)如之前所述，將ELISA用于檢測(cè)各血清樣品中的抗PCV2IgG(NawagitguI,P.等,2002,Modifiedindirectporcinecircovirus(PCV)type2-basedandrecombinantcapsidprotein(0RF2)-basedenzyme-linkedimmunosorbentassaysfordetectionofantibodiestoPCV(用于檢測(cè)抗PCV的抗體的改良的間接的基于2型豬圓環(huán)病毒(PCV)和基于重組衣殼蛋白(0RF2)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，ClinDiagnLabImmunol9:33-40)。血清樣品具有樣品陽(yáng)性(S:P)比大于0.2被認(rèn)為對(duì)抗PCV2抗體陽(yáng)性。在開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之前通過(guò)ELISA來(lái)確認(rèn)所有豬為PCV2血清陰性的。臨床評(píng)價(jià)接種、接種疫苗或攻擊后，每天評(píng)價(jià)豬的PCVAD的臨床體征，PCVAD的臨床體征包括消瘦、呼吸窘迫和行為變化(例如嗜睡和食欲不振)。肉眼可見(jiàn)病理學(xué)和組織病理學(xué)以盲方式在指定時(shí)間對(duì)所有豬進(jìn)行尸體解剖用于致病性(dpi21和42)或攻擊實(shí)驗(yàn)(dpc21或dpv77)。進(jìn)行肉眼可見(jiàn)的肺損害(感染的肺范圍為0-100%)和淋巴結(jié)大小(范圍為0[正常]-3[4倍正常大小])的估算，并對(duì)各豬評(píng)分(Halbur,P.G.等，1995,ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus(兩種US豬繁殖與呼吸綜合征病毒隔離群與萊利斯塔德病毒的致病性的比較)，VetPathol32:648-60；0priessnig,T.等，2004，同上)。在各尸體解剖期間收集肺、淋巴結(jié)(腹股溝表面的、縱膈的、氣管支氣管的和腸系膜的)、扁桃體、心、胸腺、回腸、腎、結(jié)腸、脾和肝的切片，并固定在10%中性緩沖福爾馬林中和常規(guī)處理用于組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)(IHC)。同樣，從各豬收集氣管支氣管淋巴結(jié)(TBLN)樣品用于DNA提取并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量病毒基因組。如之前所述，以盲的方式對(duì)肺、心、肝、腎、回腸和結(jié)腸中的顯微損害評(píng)分(Opriessnig，T.等，2004，同上)。基于淋巴萎縮和濾泡的組織細(xì)胞置換評(píng)價(jià)了包括淋巴結(jié)、脾和扁桃體在內(nèi)的淋巴組織，范圍為0(正常)_3(嚴(yán)重)(Opriessnig,T.等，2004，同上)。免疫組織化學(xué)(IHC):使用兔多克隆抗血清對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋的肺、淋巴結(jié)(腹股溝表面的、縱膈的、氣管支氣管的和腸系膜的)、扁桃體、心、胸腺、回腸、腎、結(jié)腸、脾和肝的切片進(jìn)行用于檢測(cè)PCV2特異性抗原的IHC(Sorden,S.D.等1999.Developmentofapolyclonal-antibody-basedimmunohistochemicalmethodforthedetectionoftype2porcinecircovirusinformalin-fixed,paraffin-embeddedtissue(開(kāi)發(fā)基于多克隆抗體的免疫組織化學(xué)方法用于檢測(cè)福爾馬林固定石蠟包埋的組織中的2型豬圓環(huán)病毒).JVetDiagnInvest11:528-30)。以盲的方式估算各組織中的PCV2抗原的評(píng)分，評(píng)分范圍為0(無(wú)抗原)-3(淋巴組織中超過(guò)50%淋巴濾泡含有陽(yáng)性PCV2抗原染色的細(xì)胞或者其他組織切片中的PCV2抗原量高)(Opriessnig，T.等，2004，同上)?？傮w顯微淋巴損害評(píng)分如之前所述，對(duì)各豬計(jì)算總體顯微淋巴損害的平均評(píng)分(Opriessnig,T.等，2004，同上)。這些損害評(píng)分是基于淋巴組織中存在的組合的淋巴萎縮(LD)、組織細(xì)胞置換(HR)和PCV2抗原，如通過(guò)IHC測(cè)定的。定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定病毒DNA載量根據(jù)由制造商提供的“血液和體液”方案，使用QIAampDNAminikit(QiagenInc)來(lái)從血清樣品中提取總DNA。將尸體解剖期間所收集的TBLN組織勻漿化以產(chǎn)生無(wú)菌PBS緩沖液中的10%組織勻漿懸浮液，并根據(jù)制造商(QiagenInc)提供的“組織”方案，使用QIAampDNAminikit來(lái)提取總DNA。將所有TBLNDNA提取物在無(wú)菌水中至少以1:100稀釋，以便消除來(lái)自與豬基因組DNA結(jié)合的SYBR綠的背景熒光。由于一些樣品中極其高的病毒DNA濃度，將一些血清和TBLN提取物稀釋達(dá)1:106，以便使它們?cè)趒PCR檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。將兩種基于SYBR綠I的qPCR測(cè)定改良用于本發(fā)明，以定量TBLN和血清DNA提取物中存在的PCV2基因組(Mcintosh,K.A.等，2009，DevelopmentandvalidationofaSYBRgreenreal-timePCRforthequantificationofporcinecircovirustype2inserum,buffycoat,feces,andmultipletissues(開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證用于定量血清、棕黃層、排泄物和多種組織中的2型豬圓環(huán)病毒的SYBR綠實(shí)時(shí)PCR)，VetMicrobiol133:23-33；Yang,Z.Z.等，2007，同上)。在CD/CD豬致病性研究中，發(fā)明人使用一種之前公布的qPCR測(cè)定，該測(cè)定擴(kuò)增部分PCV2b衣殼基因以定量血清和TBLN中存在的病毒基因組(Yang，Z.Z.等，2007，同上)。修改方案以使得能夠使用SensimixSYBR和熒光素試劑盒(Quantace)。各25耵反應(yīng)包括200nM各引物(PI(SEQIDNo:11):5，-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3，)；P2(SEQIDNo:12):5’-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3’)、200剛dNTP、3mMMgCljP5DNA提取物。使用修改的程序(95°C10分鐘；35個(gè)循環(huán)的95°C15秒、59°C30秒、72°C30秒)，在MyIQqPCR循環(huán)變溫器(BioRad)中對(duì)各樣品運(yùn)行一式三份的反應(yīng)。使用相對(duì)Ct法，針對(duì)PCV2b感染性DNA克隆的重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品定量病毒基因組，具有6-log線性范圍的定量(IO3-IO8拷貝)。在攻擊和交叉攻擊常規(guī)SPF豬研究中，發(fā)明人使用一種之前公布的qPCR測(cè)定，該測(cè)定擴(kuò)增PCV2復(fù)制酶基因區(qū)的高度保守區(qū)以定量血清和TBLN組織中存在的病毒基因組的量(Mcintosh，K.A.等，2009，同上)。該測(cè)定不檢測(cè)疫苗接種中所使用的嵌合PCVl-2b疫苗病毒，并因此允許僅精確定量攻擊PCV2a或PCV2b病毒。修改該方案以使得能夠使用SensimixSYBR和熒光素試劑盒。各25耵反應(yīng)包括200nM各引物(PCV2-83F(SEQIDNo:13):5’-AAAAGCAAATGGGCTGCTAA-3’；PCV2-83R(SEQIDNo:14):5’-TGGTAACCATCCCACCACTT-3’)、200MMdNTP、5mMMgCl2和5DNA提取物。使用修改的程序(95°C10分鐘；35個(gè)循環(huán)的95°C15秒、60°C15秒、72°C15秒)，在MyIQqPCR循環(huán)變溫器中對(duì)各樣品運(yùn)行一式三份的反應(yīng)。使用相對(duì)Ct法，針對(duì)PCV2b感染性DNA克隆的重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品定量病毒DNA基因組，具有5-log線性范圍的定量(5xl02-5xl06拷貝)。通過(guò)qPCR檢測(cè)的病毒的序列確認(rèn)測(cè)試從各組所選擇的豬中提取的TBLN組織DNA提取物，以確認(rèn)由qPCR檢測(cè)的病毒與各研究開(kāi)始時(shí)接種到豬中的病毒相同。使用對(duì)PCVl-2b特異的引物(PCV2F(SEQIDNo:15):5’-TGITGAAGATGCCAnTTTCC-3’；PCVlR(SEQIDNo:16):5’-GAGGAGTTCTACCCTCTTCC-3’)，通過(guò)PCR擴(kuò)增和部分測(cè)序來(lái)確認(rèn)⑶/⑶致病性研究中的PCVI-2b。使用對(duì)PCV2特異的引物(PCV2F(SEQIDNo:17):5’-TGTTGAAGATGCCATTTTTCC-3’；PCV2R(SEQIDNo:18):5’-GAGGTGITCGTCCTTCCTCA-3’)，擴(kuò)增和測(cè)序PCV2a和PCV2b。統(tǒng)計(jì)分析使用重復(fù)措施方差分析(ANOVA)來(lái)分析血清學(xué)和血清qPCR。使用簡(jiǎn)單ANOVA來(lái)分析來(lái)自⑶/⑶致病性研究的TBLNqPCR。對(duì)于所有ANOVA模型，使用Glimmix程序的切片選項(xiàng)來(lái)研究簡(jiǎn)單的效果比較，之后使用Tukey的程序用于多重比較。使用精確Wilcoxon2樣品測(cè)試來(lái)分析來(lái)自攻擊研究的TBLNqPCR結(jié)果。用精確Kruskal-WalIis單向ANOVA評(píng)估來(lái)自兩組實(shí)驗(yàn)的淋巴損害、組織病理學(xué)損害和IHC的評(píng)分，之后將精確Wilcoxon2樣品測(cè)試用于所關(guān)注的雙向比較。使用Bonfeironi的程序來(lái)調(diào)整雙向比較用于多重比較。將統(tǒng)計(jì)顯著性設(shè)為a=0.05。使用市售軟件(SAS版本9.2，Cary,NC,USA)來(lái)進(jìn)行所有分析。發(fā)明人之前基于從PCV2a亞型制備的嵌合疫苗已開(kāi)發(fā)了滅活疫苗SuvaxynPCV2Onedose(Fenaux,M.等2004，同上；Fenaux,M.等2003，同上)，該死疫苗是有效的且目前在全球市場(chǎng)上可得。通過(guò)使用類似地策略，在本研究中，發(fā)明人首先開(kāi)發(fā)了一種新的嵌合病毒PCVl-2b，其中PCV2b亞型的衣殼基因克隆到非致病PCVl的基因組骨架中。在CD/CD和常規(guī)豬模型中針對(duì)PCV2和PCVAD充分研究了使用該嵌合PCVl-2b病毒作為活減毒的新一代疫苗。對(duì)于使用嵌合PCVl_2b病毒作為活減毒疫苗，重要的是確定疫苗病毒是減毒的。雖然PCV2單獨(dú)很少引起實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械娜V臨床疾病，但是使用CD/CD豬已引起臨床PCVAD的成功再現(xiàn)(Allan,G.等，2003，同上；Bolin,S.R.等，2001，同上；Harms,P.A.等，2001，同上；Kennedy,S.等，2000，同上；Tomas,A.等，2008，同上)。因此，在本發(fā)明中，為了明確確定嵌合PCVl-2b病毒的致病性并將它與其親代野生型PCV2b病毒比較，發(fā)明人選擇CD/CD豬模型用于致病性研究。正如預(yù)期的，野生型PCV2b單獨(dú)引起CD/⑶豬的重度臨床PCVAD，導(dǎo)致4/10的PCV2b感染的豬由于PCVAD的臨床表現(xiàn)而死亡或早期安樂(lè)死。這與之前的顯示PCV2感染的⑶/⑶豬的25%的死亡率和顯著的臨床PCVAD的研究一致(Allan,G.等，2003，同上；Bolin,S.R.等，2001，同上；Harms,P.A.等，2001，同上)。PCV2b感染的豬的總體淋巴損害評(píng)分與中等至重度全身性PCVAD—致(Opriessnig,T.等2007，同上)。雖然宿主變異阻止單獨(dú)明確的診斷截止值(cut-off),但是重度PCVAD病例的病毒血癥的一般可接受閾值為每ml的血清IO7病毒基因組拷貝(Brunborg,I.M.等，2004,Quantitationofporcinecircovirustype2isolatedfromserum/plasmaandtissuesamplesofhealthypigsandpigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeusingaTaqMan-basedreal-timePCR(使用基于TaqMan的實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量從健康豬和患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的血清/血漿和組織樣品中分離的2型豬圓環(huán)病毒)，JVirolMethods122:171-8；01vera,A.等，2004，Comparisonofporcinecircovirustype2loadinserumquantifiedbyarealtimePCRinpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeandporcinedermatitisandnephropathysyndromenaturallyaffectedpigs(由實(shí)時(shí)PCR定量的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征和豬皮炎腎病綜合征天然感染的豬的血清中2型豬圓環(huán)病毒載量的比較)，JVirolMethods117:75-80;Segales,J.等，2005,Quantificationofporcinecircovirustype2(PCV2)DNAinserumandtonsillar,nasal,tracheo^bronchial,urinaryandfaecalswabsofpigswithandwithoutpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(PMWS)(定量患有和不患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬的血清以及扁桃體、鼻、氣管-支氣管、尿和糞便的化驗(yàn)標(biāo)本中的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)DNA),VetMicrobiol111:223-9)。至21dpi，與僅1/10的嵌合PCVl_2b病毒感染的豬相比，9/10的PCV2b感染的豬超過(guò)該閾值。由于PCVAD而死亡或被較早安樂(lè)死的4只豬都在血清和淋巴組織中具有較高的PCV2DNA病毒載量，但不具有可檢測(cè)的PCV2IgG抗體，這表明這些PCV2b感染的豬死于不足的免疫反應(yīng)和較高水平的病毒復(fù)制。該結(jié)果與之前報(bào)道的低抗體反應(yīng)與增加的PCVAD嚴(yán)重性之間的相關(guān)性一致(Meerts,P.等，2006，Correlationbetweenthepresenceofneutralizingantibodyagainstporcinecircovirus2(PCV2)andprotectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2_associateddisease(存在針對(duì)2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的中和抗體與針對(duì)病毒復(fù)制和發(fā)生PCV2相關(guān)疾病的保護(hù)之間的相關(guān)性)，BMCVetRes2:6)。數(shù)據(jù)清楚表明本發(fā)明中使用的PCV2b亞型是高毒力的。盡管用至少20倍正常疫苗接種劑量的劑量來(lái)接種CD/CD豬，還是發(fā)現(xiàn)嵌合PCVl-2b病毒在CD/CD豬模型中為顯著減毒的(Fenaux,M.等，2004，同上)。嵌合PCVI-2b病毒的減毒由用于比較嵌合PCVl-2b和野生型PCV2b病毒的所有定量和定性參數(shù)清楚證明。與約一半的PCV2b感染的豬中看到的死亡和消瘦相比，用嵌合PCVl-2b病毒感染的豬中未看到死亡或發(fā)病。嵌合PCVl-2b感染的豬的淋巴組織中的顯微損害評(píng)分和PCV2特異性抗原的量顯著低于用野生型PCV2b感染的豬，表明嵌合PCVl-2b病毒僅引起亞臨床感染?？傮w上，嵌合PCVl-2b感染的豬的淋巴損害評(píng)分與用PBS緩沖液接種的對(duì)照豬無(wú)顯著不同。此外，血清和淋巴組織中較低的PCV2b病毒載量與嵌合PCVl-2b感染的豬中顯著較低的典型損害或疾病嚴(yán)重性直接相關(guān)，如之前的研究中所觀察的(Brunborg,I.M.等，2004，同上；Dupont,K.等，2009,TransmissionofdifferentvariantsofPCV2andviraldynamicsinaresearchfacilitywithpigsmingledfromPMWS-affectedherdsandnon-affectedherds(PMWS感染的豬群與未感染的豬群混合的研究設(shè)施中的不同PCV2變體的傳遞和病毒動(dòng)力學(xué))，VetMicrobiol139:219-26;Fenaux,M.等，2004，同上；Harding,J.C等，2008,Porcinecircovirus-2DNAconcentrationdistinguisheswastingfromnonwastingpigsandiscorrelatedwithlesiondistribution,severity,andnucleocapsidstainingintensity(豬圓環(huán)病毒_2DNA濃度區(qū)分消瘦豬和非消瘦豬，且與損害分布、嚴(yán)重性和核衣殼染色強(qiáng)度相關(guān))，JVetDiagninvest20:274-82；Krakowka,S.等，2005,Featuresofporcinecircovirus-2disease:correlationsbetweenlesions,amountanddistributionofvirus,andclinicaloutcome(豬圓環(huán)病毒-2疾病的特征損害、病毒的量和分布與臨床結(jié)果的相關(guān)性)，JVetDiagnInvest17:213-22;Mcintosh,K.A.等，2009，同上；Olvera,A.等，2004，同上；Yang,Z.Z.等，2007，同上)。在證明嵌合PCVl_2b病毒在易受感染和敏感性CD/CD豬模型中為減毒的后，發(fā)明人然后在常規(guī)SPF豬中進(jìn)行了組合免疫原性和攻擊研究。選擇3周齡常規(guī)雜交種SPF豬用于免疫原性/攻擊實(shí)驗(yàn)以便更加密切模擬野外疫苗接種條件，因?yàn)檫@樣的活減毒疫苗將最終用于常規(guī)豬。雖然基于我們較早公布的研究，在該常規(guī)SPF模型中不預(yù)期臨床PCVAD(Fenaux,M.等，2002，同上；Fenaux,M.等，2004，同上；Fenaux,M.等，2004,同上；Fenaux,M.等，2003，同上，F(xiàn)enaux,M.等，2004A.同上；0priessnig，T,等，2009，Differenceinseverityofporcinecircovirustypetwo-inducedpathologicallesionsbetweenLandraceandPietrainpigs(2型豬圓環(huán)病毒誘導(dǎo)的病理學(xué)損害的嚴(yán)重性在蘭德瑞斯豬與皮特蘭豬之間的差異)，JAnimSci87:1582-90；Opriessnig,T.等，2008，同上)，但是預(yù)期由PCV2誘導(dǎo)的常規(guī)豬模型的淋巴組織中的病毒血癥、病毒載量和典型組織學(xué)損害的水平是用于評(píng)價(jià)疫苗功效的充分參數(shù)(Fenaux，M.等，2004，同上)。作為活減毒疫苗，重要的是確定是否嵌合PCVl-2b病毒在對(duì)豬接種疫苗時(shí)可誘導(dǎo)足夠水平的保護(hù)性抗體反應(yīng)。4種目前可得的疫苗中的2種是基于重組PCV2a衣殼蛋白，因此已知PCV2衣殼特異性體液免疫反應(yīng)對(duì)保護(hù)重要。本發(fā)明的結(jié)果顯示，早在14dpv就在PCVl-2b疫苗接種的豬的血清中檢測(cè)到PCV2衣殼特異性抗體，并至28dpv所有的20只接種疫苗的豬都血清轉(zhuǎn)變?yōu)榭筆CV2衣殼特異性抗體?？贵w效價(jià)至35dpv達(dá)到穩(wěn)定并在56dpv攻擊時(shí)保持高的，表明嵌合PCVl-2b疫苗病毒能夠引起常規(guī)豬中的強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。在用野生型PCV2a或PCV2b亞型攻擊時(shí)，與未接種疫苗的對(duì)照相比，用減毒的嵌合PCVI-2b病毒疫苗接種的常規(guī)SPF豬具有在血清和TBLN組織中顯著較低的病毒DNA載量、顯著減少的典型顯微損害的嚴(yán)重性和發(fā)生率水平和顯著較低的淋巴組織中的PCV2特異性抗原的量，表明嵌合PCVl-2b病毒誘導(dǎo)針對(duì)野生型病毒攻擊的保護(hù)性免疫。結(jié)果亦顯示，與未接種疫苗的對(duì)照相比，用嵌合PCVl-2b病毒疫苗接種的豬針對(duì)PCV2b亞型的同源攻擊和PCV2a亞型的異源攻擊被同等地保護(hù)，這由完全沒(méi)有PCV2a或PCV2b病毒血癥、淋巴組織中的病毒7載量的顯著減少和接種疫苗的豬中的顯著較低的總體淋巴損害評(píng)分所證實(shí)，而不管攻擊病毒亞型。因此，似乎新的活減毒嵌合PCVl-2b疫苗候選物誘導(dǎo)針對(duì)兩種PCV2亞型的保護(hù)性免疫和交叉保護(hù)性免疫。一些最近的研究已報(bào)道，當(dāng)與PCV2a亞型相比時(shí)，通常PCV2b亞型與更嚴(yán)重的臨床疾病相關(guān)(Carman,S.等，2008，同上；Chae,J.S.andK.S.Choi,2009，同上；Grau-Roma,L等，2008,Aproposalonporcinecircovirustype2(PCV2)genotypedefinitionandtheirrelationwithpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(PMWS)occurrence(對(duì)2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)基因型定義及其與斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)發(fā)生的關(guān)系的建議)，VetMicrobiol128:23-35)。然而，是否PCV2b亞型比PCV2a亞型更加有毒力仍然有爭(zhēng)議，因?yàn)槠渌芯坎荒苊鞔_顯示PCV2a與PCV2b在毒力方面的顯著差異(An,D.J.等，2007，同上；Lager,K.M.等，2007，同上；Madson,D.M.等，2008，同上；Opreissnig,T.等，2006，同上；Opreissnig,T.等，2008，同上)。由于PCV2a與PCV2b之間的序列趨異，PCV2的兩種亞型在致病性方面可不同是可能的，因?yàn)橐扬@示，cap基因中僅兩個(gè)氨基酸變化足以改變PCV2a的致病性(Fenaux，M.等，2004，Twoaminoacidmutationsinthecapsidproteinoftype2porcinecircovirus(PCV2)enhancedPCV2replicationinvitroandattenuatedthevirusinvivo(2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的衣殼蛋白中的2個(gè)氨基酸突變?cè)鰪?qiáng)體外PCV2復(fù)制和體內(nèi)使病毒減毒)，JViol78:13440-6)。在當(dāng)前研究的未接種疫苗的對(duì)照組中，其中一半的豬用PCV2a或PCV2b攻擊，發(fā)明人未觀察到組之間在毒力方面的任何顯著差異。PCV2a與PCV2b的攻擊劑量是等效的，但是血清和TBLN組織中的PCV2病毒載量、典型的顯微損害評(píng)分或淋巴組織中的PCV2抗原的量在PCV2a與PCV2b攻擊組之間無(wú)顯著差異。在未接種疫苗的豬中，與PCV2a相比，對(duì)PCV2b的抗體反應(yīng)有一些較小的差異，包括稍延遲的血清轉(zhuǎn)變(圖5)。在接種疫苗的豬中，PCV2b攻擊引起稍高的總體淋巴損害評(píng)分，而PCV2a攻擊引起較高數(shù)量的qPCR陽(yáng)性的TBLN組織。總體上，結(jié)果與其他發(fā)現(xiàn)PCV2a與PCV2b致病性在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)顯著差異的研究一致(An,D.J.等，2007，同上；Lager,K.M等，2007，同上；Madson,D.M.等，2008，同上；Opriessnig,T.等，2006，同上；Opriessnig,T.等，2008，同上)。已報(bào)道了PCV2a與PCV2b亞型之間的抗原概況的差異，推測(cè)目前基于PCV2a的商業(yè)疫苗所缺失的足夠的交叉保護(hù)水平可歸因于全球豬群中與PCV2b亞型相關(guān)的PCVAD嚴(yán)重性的增加(Cheung,A.K.等，2007，同上；Dupont,K.等，2008，同上；Lekcharoensuk,P.等，2004，同上；Shang,S.B.等，2009，同上)。PCV2a與PCV2b之間的多數(shù)序列變異似乎在衣殼基因(包括信號(hào)獨(dú)特的氨基酸基序)中(Cheung，A.K.等，2007，同上；Olvera,A.等，2004，同上)。針對(duì)該基序產(chǎn)生的抗體能夠體外區(qū)分PCV2a和PCV2b，表明抗原性可能不同(Beach等，未公布數(shù)據(jù))。本發(fā)明的結(jié)果顯示，基于新的PCV2b亞型的衣殼的活減毒疫苗PCVl-2b的確針對(duì)PCV2a的異源攻擊保護(hù)，因此支持之前基于PCV2a的滅活商業(yè)疫苗所賦予的PCV2b亞型的交叉保護(hù)的證據(jù)(Fort，M.,等，2008,同上；Fort,M.等，2009，同上；Opriessnig,T.等，2009，同上；Opriessnig,·T.等，2008，同上)?？傊?，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，基于新的PCV2b亞型的嵌合PCVl_2b疫苗候選物在⑶/CD豬中是減毒的，并針對(duì)PCV2b和PCV2a攻擊分別在接種疫苗的常規(guī)豬中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫和交叉保護(hù)性免疫。本發(fā)明的結(jié)果將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該嵌合PCVl-2b病毒作為第一個(gè)針對(duì)PCV2感染和PCVAD的活減毒疫苗提供基礎(chǔ)。雖然PCVl-2b疫苗病毒單獨(dú)提供針對(duì)PCV2a和PCV2b亞型的交叉保護(hù)，但是組合本發(fā)明的PCVl-2b疫苗與目前基于PCV2a的商業(yè)疫苗用于更完全的保護(hù)將來(lái)可為更有利。感染性病毒和分子DNA克隆的疫苗以及使用它們的方法亦包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。接種的豬被保護(hù)免受嚴(yán)重的病毒感染和由PCV2感染或共感染引起的其他疾病。新的方法通過(guò)向豬給予免疫有效量的本發(fā)明疫苗(例如，包含免疫原性量的感染性PCVDNA、含有PCV的感染性DNA克隆的質(zhì)?；虿《据d體、重組PCVDNA、多肽表達(dá)產(chǎn)物等的疫苗)來(lái)針對(duì)病毒感染保護(hù)需要保護(hù)的豬?？上蜇i同時(shí)給予其他抗原(例如PRRSV、PPV)、其他感染性豬病原體和免疫刺激物以針對(duì)病毒感染提供廣譜的保護(hù)。疫苗包含，例如與無(wú)毒的生理上可接受的載體和任選一種或多種佐劑組合的感染性病毒和分子DNA克隆、合適質(zhì)?；蜉d體(例如pSCK載體)中的克隆的PCV感染性DNA基因組、無(wú)毒的活病毒、滅活的病毒等。疫苗亦可包含本文所述的感染性PCV2分子DNA克隆。感染性PCVDNA、包含感染性病毒基因組的質(zhì)粒DNA和活病毒是優(yōu)選的，其中活病毒是最優(yōu)選的。本發(fā)明的無(wú)毒的活病毒疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)病毒疫苗提供優(yōu)勢(shì)，傳統(tǒng)病毒疫苗使用有回到有毒狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的減毒活病毒或死的細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖的完整病毒，其可能不誘導(dǎo)足夠的抗體免疫反應(yīng)用于針對(duì)病毒疾病保護(hù)。疫苗和使用它們的方法亦包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。接種的哺乳動(dòng)物物種被保護(hù)免于嚴(yán)重的病毒感染，亦可對(duì)涉及PCV共感染的疾病提供保護(hù)，所述疾病例如PCVAD和豬皮炎腎病綜合征(TONS)以及其他相關(guān)疾病。疫苗包含例如滅活的或減毒的豬TTV病毒、無(wú)毒的生理上可接受的載體和任選一種或多種佐劑。佐劑是增加豬對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)的物質(zhì)，其可與本發(fā)明的疫苗共同給予。可與疫苗同時(shí)并在相同的位點(diǎn)上或者在不同時(shí)間(例如，作為加強(qiáng)免疫)給予佐劑。亦可將佐劑以與給予疫苗的方式不同的方式或在與給予疫苗的位點(diǎn)不同的位點(diǎn)上有利地給予豬。合適的佐劑包括但不限于氫氧化鋁(alum)、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、非離子型嵌段聚合物或共聚物、細(xì)胞因子(像IL-1、IL-2、IL-7、IFN-a、IFN-^,IFN-y等)、皂苷、單磷酰脂質(zhì)A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等。其他合適的佐劑包括，例如硫酸鉀鋁、分離自大腸桿菌(Escherichiacoif)的熱不穩(wěn)定或熱穩(wěn)定的腸毒素、霍亂毒素或其B亞基、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐劑等?？蓪⒒诙舅氐淖魟?例如白喉毒素、破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素)在使用之前滅活，例如通過(guò)用甲醛處理。疫苗可進(jìn)一步包含另外的抗原以促進(jìn)感染性PCVDNA克隆的免疫活性，所述抗原例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、其他感染性豬病原體和免疫刺激物。本發(fā)明的新疫苗不限于任何特定類型或制備方法?？寺〉牟《疽呙绨ǖ幌抻诟腥拘訢NA疫苗(即使用質(zhì)粒、載體或其他常規(guī)載體來(lái)直接注射DNA到豬中)、活疫苗、改良的活疫苗、滅活疫苗、亞基疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗等。這些疫苗由本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備。作為另外的益處，本發(fā)明的優(yōu)選活疫苗提供一種遺傳穩(wěn)定的疫苗，其比其他類型的減毒疫苗更容易制備、保存和遞送。本發(fā)明的另一優(yōu)選疫苗使用合適的質(zhì)粒來(lái)遞送非致病的DNA克隆至豬中。與使用活病毒或者死的細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖的完整病毒的傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明提供用包含感染性病毒基因組的質(zhì)粒DNA直接接種豬。本發(fā)明所期需的另外的基因工程疫苗由本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生。這樣的技術(shù)包括但不限于重組DNA的另外操作、重組蛋白的氨基酸序列的修飾或置換等?；谥亟MDNA技術(shù)的基因工程疫苗例如是通過(guò)鑒定編碼負(fù)責(zé)誘導(dǎo)豬中的較強(qiáng)免疫反應(yīng)或保護(hù)性反應(yīng)的蛋白(例如來(lái)源于0RF3、0RF4等的蛋白)的病毒基因的備選部分來(lái)制備。這樣鑒定的基因或免疫顯性片段可被克隆到標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)載體(例如桿狀病毒載體)中，并用于感染合適的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)例如，O’Reilly等，“BaculovirusExpressionVectors:ALabManual(桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，”Freeman&Co.,1992)。宿主細(xì)胞被培養(yǎng)，因此表達(dá)所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被純化至所需的程度并配制成合適的疫苗產(chǎn)品。如果克隆保留引起疾病的任何不合乎需要的本能，那么查明病毒基因組中負(fù)責(zé)任何殘留毒力的核苷酸序列并通過(guò)例如定點(diǎn)誘變來(lái)將病毒基因改造為無(wú)毒的亦是可能的。定點(diǎn)誘變能夠增加、缺失或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸(參見(jiàn)例如，Zoller等，DNA3:479-488,1984)。合成包含所需突變的寡核苷酸并退火為單鏈病毒DNA的一部分。將從該步驟得到的雜交分子用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。然后，將分離的包含合適突變的雙鏈DNA用于通過(guò)與隨后轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞培養(yǎng)物中的全長(zhǎng)DNA的限制性片段連接來(lái)產(chǎn)生全長(zhǎng)DNA。將基因組連接到用于轉(zhuǎn)移的合適載體中可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)方法將載體轉(zhuǎn)染到用于產(chǎn)生病毒子代的宿主細(xì)胞中，所述常規(guī)方法例如磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、原生質(zhì)體融合和其他公知技術(shù)(例如，Sambrook等，“MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，”ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。克隆的病毒于是顯示所需的突變。備選地，可合成包含合適突變的兩條寡核苷酸。這些核苷酸可退火來(lái)形成可插入到病毒DNA中以產(chǎn)生全長(zhǎng)DNA的雙鏈DNA。將免疫有效量的本發(fā)明疫苗給予需要針對(duì)病毒感染保護(hù)的豬。通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)可容易測(cè)定或容易滴定接種豬的免疫有效量或免疫原性量。有效量是實(shí)現(xiàn)足夠的針對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)以保護(hù)暴露于PCV病毒的豬的量。優(yōu)選地，保護(hù)豬至病毒疾病的一種至全部不良生理癥狀或作用被顯著降低、減輕或完全阻止的程度?？梢詥蝿┝炕蛑貜?fù)劑量給予疫苗。劑量范圍可為例如約I微克-約1，000微克的包含感染性嵌合DNA基因組的質(zhì)粒DNA(取決于疫苗的免疫活性成分的濃度)，優(yōu)選為100-200微克的嵌合PCV1-2DNA克隆，但不應(yīng)該包含足以引起不良反應(yīng)或病毒感染的生理癥狀的基于病毒的抗原量。用于測(cè)定或滴定活性抗原物質(zhì)的合適劑量以發(fā)現(xiàn)基于豬的體重、抗原的濃度和其他典型因素的最小有效劑量的方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選地，感染性病毒DNA克隆被用作疫苗，或者可在體外產(chǎn)生活的感染性病毒并接著將該活病毒用作疫苗。在這種情況下，例如可將活病毒的約50-約10，000的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)給予豬。本發(fā)明的新疫苗不限于任何特定類型或制備方法。疫苗包括但不限于改良的活疫苗、滅活疫苗、亞基疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗等?；钜呙绲膬?yōu)點(diǎn)在于激活疫苗受者的所有可能免疫反應(yīng)，包括全身、局部、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)?；畈《疽呙绲娜秉c(diǎn)在于有被活的外來(lái)病毒物質(zhì)污染的可能或者病毒可在野外回復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)，該缺點(diǎn)可能超過(guò)優(yōu)點(diǎn)。為了制備滅活的病毒疫苗，例如，可在培養(yǎng)的豬細(xì)胞系(例如但不限于PK-15細(xì)胞)中發(fā)生病毒繁殖和病毒生產(chǎn)。然后通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所知的方案或優(yōu)選通過(guò)本文所述的方法來(lái)優(yōu)化連續(xù)的病毒滅活?？赏ㄟ^(guò)用滅活劑(例如福爾馬林或疏水溶劑、酸等)、通過(guò)用紫外線或X射線輻射、通過(guò)加熱等處理豬圓環(huán)病毒來(lái)制備滅活的病毒疫苗。以本領(lǐng)域理解的方式進(jìn)行滅活。例如，在化學(xué)滅活中，將包含病毒的合適病毒樣品或血清樣品用足夠量或濃度的滅活劑在足夠高(或低，取決于滅活劑)的溫度或PH下處理足夠長(zhǎng)的時(shí)間以滅活病毒。通過(guò)加熱滅活是在足以滅活病毒的溫度和時(shí)間長(zhǎng)度下進(jìn)行。通過(guò)輻射滅活是使用一定波長(zhǎng)的光或其他能量源輻射足以滅活病毒的時(shí)間長(zhǎng)度來(lái)進(jìn)行。如果病毒不能感染易受感染的細(xì)胞，那么該病毒被認(rèn)為是滅活的。在本發(fā)明中亦是合意的基因工程疫苗由本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。這樣的技術(shù)包括但不限于使用RNA、重組DNA、重組蛋白、活病毒等。例如，純化后，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從合適的臨床、生物學(xué)樣品(例如血清、排泄物、唾液、精液和組織樣品)中分離野生型病毒，優(yōu)選通過(guò)本文教導(dǎo)的方法，使用感染的豬或感染的合適細(xì)胞系。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從生物純病毒或傳染原提取DNA，并通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)純化,優(yōu)選通過(guò)CsCl梯度超速離心法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)將病毒基因組的cDNA克隆到合適的宿主中(參見(jiàn)Maniatis等，id.)，然后分析病毒基因組以確定用于產(chǎn)生病毒抗原部分的基因組的必要區(qū)域。其后，步驟通常與改良活疫苗、滅活疫苗或亞基疫苗的步驟相同。例如，通過(guò)鑒定編碼負(fù)責(zé)誘導(dǎo)豬的較強(qiáng)免疫反應(yīng)或保護(hù)性反應(yīng)的蛋白(例如免疫病毒蛋白，如來(lái)源于0RF2的衣殼蛋白)的病毒基因的一部分來(lái)制備基于重組DNA技術(shù)的基因工程疫苗?？蓪⑦@種鑒定的基因或免疫顯性片段克隆到標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)載體(例如桿狀病毒載體)中，并用于感染合適的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)例如，O’Reilly等，“BaculovirusExpressionVectors:ALabManual(桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，”Freeman&Co.,(1992))。宿主細(xì)胞被培養(yǎng)，因此表達(dá)所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被純化至所需的程度并配制成合適的疫苗產(chǎn)品。備選地，可將編碼一種或多種衣殼蛋白的來(lái)自分離的豬PCV的DNA插入活的載體(例如痘病毒或腺病毒)中并用作疫苗。將免疫有效量的本發(fā)明疫苗給予需要針對(duì)所述感染或綜合征保護(hù)的豬或哺乳動(dòng)物物種。通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)可容易測(cè)定或容易滴定“免疫有效量”。有效量是實(shí)現(xiàn)足夠的針對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)以保護(hù)暴露于豬TTV病毒的豬或其他哺乳動(dòng)物的量，豬TTV病毒可引起PCVAD、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)或相關(guān)的疾病。優(yōu)選地，保護(hù)豬或其他哺乳動(dòng)物物種至病毒疾病的一種至全部不良生理癥狀或作用被發(fā)現(xiàn)顯著降低、減輕或完全阻止的程度?？梢詥蝿┝炕蛑貜?fù)劑量給予疫苗。劑量可包含，例如1-1，000微克的基于病毒的抗原(取決于疫苗的免疫活性組分的濃度)，但不應(yīng)該包含足以引起不良反應(yīng)或病毒感染的生理癥狀的基于病毒的抗原量。用于測(cè)定或滴定活性抗原物質(zhì)的合適劑量的方法是本領(lǐng)域已知的，其基于鳥類或哺乳動(dòng)物的體重、抗原的濃度和其他典型因素?？蓪⒁呙缃o予豬。同樣，可將疫苗給予有高風(fēng)險(xiǎn)被病毒劑感染的人(例如養(yǎng)豬場(chǎng)主)?？煽诜?、頰內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、胃腸外等合宜地給予疫苗。胃腸外給予途徑包括但不限于肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑。當(dāng)作為液體給予時(shí)，可將本疫苗以水性溶液劑、糖漿劑、酏劑、酊劑等的形式制備。這樣的制劑是本領(lǐng)域已知的并通過(guò)將抗原與其他典型的添加劑溶解在合適的載體或溶劑體系中來(lái)典型地制備。合適的載體或溶劑包括但不限于水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加劑是，例如認(rèn)證染料(certifieddye)、食用香料、甜味劑和抗菌性防腐劑(例如硫柳汞(乙汞硫基水楊酸鈉))?？衫缤ㄟ^(guò)加入部分水解的明膠、山梨糖醇或細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)穩(wěn)定這樣的溶液，并可使用本領(lǐng)域已知的試劑(例如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、它們的混合物等)，通過(guò)常規(guī)的方法來(lái)緩沖這樣的溶液。液體制劑亦可包括混懸劑和乳劑,其包含與其他標(biāo)準(zhǔn)助劑(coformulant)組合的助懸劑或乳化劑。這些類型的液體制劑可通過(guò)常規(guī)方法來(lái)制備?；鞈覄├缈墒褂媚z體磨來(lái)制備。乳劑例如可使用勻漿器來(lái)制備。設(shè)計(jì)用于注射到體液系統(tǒng)的胃腸外制劑需要合適的等張性和緩沖至哺乳動(dòng)物體液的相應(yīng)水平的PH值?？梢曅枰寐然c和其他鹽來(lái)合適地調(diào)節(jié)等張性。合適的溶劑(例如乙醇或丙二醇)可用于增加制劑中的成分的溶解度和液體制劑的穩(wěn)定性。可在本疫苗中使用的另外添加劑包括但不限于葡萄糖、常規(guī)抗氧化劑和常規(guī)螯合劑(例如乙二胺四乙酸)(EDTA)。胃腸外劑型使用之前也必須是無(wú)菌的。權(quán)利要求1.一種嵌合豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子,其包含編碼非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。2.權(quán)利要求I的核酸分子，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型PCV2a、PCV2b和PCV2c03.權(quán)利要求2的核酸分子，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的。4.權(quán)利要求I的核酸分子，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為PCV2的至少一部分開(kāi)放閱讀框2(0RF2)。5.權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的至少一部分0RF2。6.權(quán)利要求I的核酸分子，其中所述核酸分子編碼超過(guò)一份拷貝的非致病的嵌合PCV,所述嵌合PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。7.一種生物功能質(zhì)?；虿《据d體，其包含權(quán)利要求I的核酸分子。8.一種合適的宿主細(xì)胞,其被權(quán)利要求7的包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)染。9.一種無(wú)毒感染性嵌合PCV，其由權(quán)利要求8的包含核酸分子的細(xì)胞產(chǎn)生。10.權(quán)利要求9的無(wú)毒感染性嵌合PCV，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型PCV2a、PCV2b和PCV2c。11.權(quán)利要求10的無(wú)毒感染性嵌合PCV，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的。12.權(quán)利要求9的無(wú)毒感染性嵌合PCV，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為PCV2的至少一部分開(kāi)放閱讀框2(ORF2)。13.權(quán)利要求11的無(wú)毒感染性嵌合PCV，其中所述PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為PCV2b的至少一部分ORF2。14.一種滅活的嵌合PCV，其由權(quán)利要求8的包含核酸分子的細(xì)胞產(chǎn)生。15.權(quán)利要求14的滅活嵌合PCV，其中PCV2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型PCV2b的。16.一種病毒疫苗，其包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員(a)豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于I型PCV(PCVl)的基因組序列和2型PCV(PCV2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列；(b)生物功能質(zhì)?；虿《据d體，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列；(c)無(wú)毒感染性嵌合PCV，其包含含有編碼嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV來(lái)源于PCVl的基因組序列和PCV2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列；和(d)滅活的嵌合PCV，其包含PCV2的衣殼蛋白的至少一部分。17.權(quán)利要求16的病毒疫苗，其中所述疫苗包含活的嵌合PCV病毒。18.權(quán)利要求16的病毒疫苗，其中所述疫苗包含滅活的嵌合PCV病毒。19.權(quán)利要求16的病毒疫苗，其中所述PCV2的衣殼蛋白為亞型PCV2b的。20.權(quán)利要求16的病毒疫苗，其另外包含佐劑。21.權(quán)利要求16的病毒疫苗，其中所述疫苗針對(duì)PCV2a和PCV2b感染保護(hù)。22.—種針對(duì)PCV2病毒感染免疫豬的方法，其包括將免疫有效量的權(quán)利要求16的疫苗給予豬。23.權(quán)利要求22的方法，其包括將所述核酸分子或活的減毒嵌合PCV病毒給予豬。24.權(quán)利要求22的方法，其包括將所述滅活的嵌合PCV病毒給予豬。25.權(quán)利要求22的方法，其包括將所述疫苗胃腸外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮給予豬。26.權(quán)利要求22的方法，其包括將疫苗淋巴內(nèi)或肌內(nèi)給予豬。27.—種針對(duì)豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病(PCVAD)保護(hù)豬的方法，其包括將免疫有效量的權(quán)利要求16的疫苗給予豬。全文摘要本發(fā)明提供一種新的嵌合豬圓環(huán)病毒感染性DNA克隆和活的減毒嵌合病毒，其中PCV2(優(yōu)選為亞型PCV2b)的衣殼基因整合到非致病的PCV1病毒基因組中。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，PCV2衣殼基因?yàn)閬喰蚉CV2b的，亞型PCV2b是全世界豬中流通的主要亞型。命名為PCV1-2b的減毒嵌合病毒，有效保護(hù)豬免受PCV2b攻擊并可用作針對(duì)PCV2b和PCV2a亞型感染提供保護(hù)和交叉保護(hù)的活疫苗以及滅活(死)疫苗。本發(fā)明的活的減毒疫苗亦有效保護(hù)豬免受豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病(PCVAD)。文檔編號(hào)C12N7/04GK102971425SQ201180024467公開(kāi)日2013年3月13日申請(qǐng)日期2011年3月16日優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日發(fā)明者X-J.蒙,N.比奇,S.拉馬穆?tīng)柕偕暾?qǐng)人:弗吉尼亞科技知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司