專利名稱：含有病毒去活化的生長因子且pdgf與vdgf耗盡的血小板裂解物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明關于血小板衍生物的領域，特別是關于得自人類或動物源血小板的生長因子濃厚液的領域。本發(fā)明還關于ー種制備這類含有生長因子的血小板裂解物的方法，及其在試管內(in vitro)、活體外(ex vivo)的細胞培養(yǎng)(例如干細胞擴增及分化)的用途、美容或臨床的應用，如與骨移植體的組合應用。
背景技術：
蛋白體學分析的證據(jù)顯示，人類血小板包含大量具有重要生理功能的分子，其中又以生長因子(GF)最受矚目。這些生長因子堆積在血小板的α-顆粒內，主要 包括三種血小板衍生的生長因子的異構體(H)GF-AA、-AB及-ΒΒ)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉形生長因子-β (TGF-β I及TGF12)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、以及ー些類胰島素生長因子(IGF)?，F(xiàn)已根據(jù)這些生長因子的治療標的，將復雜的人類血小板生長因子混合物以單ー捐輸者(single-donor)血小板凝膠生物材料的形式用于治療方面的應用，上述血小板凝膠生物材料是通過凝血酶對含血小板的血漿進行活化后得到。血小板活化通常會使包含在血小板內的生長因子釋出，在此同時，凝血酶會使纖維蛋白原轉變成纖維蛋白而形成凝膠基質(gel matrix)，這類凝膠基質會將生長因子抓在里面。這項生物材料一般會單獨施用或與移植材料(graft materials)共同施用在組織上，故可將含有生長因子的血小板凝膠(platelet gels)用于再生醫(yī)學(regenerativemedicine)，以促進軟組織及硬組織的愈合及再生。亦可將從血小板得到的生長因子濃厚液補充在試管內(in vitro)或活體外(ex vivo)的細胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基中。近來已證明，可能使用富含人類生長因子的血小板釋出物來取代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),而使間質干細胞(mesenchymal stem cells)或造血干細胞(hematopoietic stem cells)在活體外(ex vivo)中擴增。目前將富含生長因子的血小板釋出物應用于干細胞擴增一事倍受矚目，特別是在公認的新“廣效”細胞(即間質干細胞mesenchymal stem cells, MCS),或造血干細胞(hematopoietic stem cells))擴增中用來作為胎牛血清(FBS)或胎犢血清(fetal calfserum, FCS)的替代品,這些血清普遍被視為普利子蛋白(prion)及病毒的可能傳染源，也被視為在病患身上造成免疫問題的原因，這是胎牛血清或胎犢血清中殘余的牛蛋白和抗原所造成的。最近已發(fā)展出新的策略，包括在公知表現(xiàn)系統(tǒng)中生產重組血小板生長因子，如將某重組人類個體(Rh)生長因子用于治療用途。某些國家已核準將基因工程酵母菌所表現(xiàn)的Rh-PDGF-BB用于治療慢性神經病變型下肢糖尿病性潰瘍(chronicneuropathiclower-extremity diabetic ulcers),不過，要達到臨床成效需要施用高劑量的這種單一生長因子數(shù)周之久。同樣地，TGF-β超級家族中的Rh-骨型態(tài)發(fā)生蛋白(Rh-bonemorphogenetic proteins,BMP)BMP-2及BMP-7可從中國倉鼠卵巢細胞制得，并已核準用于治療某些骨折手術。然而，可用的重組生長因子數(shù)目仍然非常有限，部分是因為這些生長因子在分離、鑒定、選殖及表現(xiàn)方面的難度所致。進ー步言之，血小板衍生的制備物的優(yōu)點仍比使用單一重組因子要多，這是因為在某些應用中，生長因子的組合可達到優(yōu)勢協(xié)同作用(synergistic effect)。目前數(shù)據(jù)顯示生長因子TOGF及VEGF是直接與異常細胞增殖及/或分化有關(例如可參見 Ferrara et al. , Nature Medicine, vol. 9, no. 6, 2003, pp. 669-676 ;以及EuropeanMedical Agency 在 2010 年 2 月 18 日刊行的 EMA/92326/2010，和 FDA 于 2008 年3 月 27 日的通Tfi“an ongoing safety review of regranex(becaplermin)，'ノ。由十在以TOGF及VEGF個別進行的治療中，發(fā)展中癌癥的感受性(susceptibility)増加了，因此要避免將這兩種生長因子用于培養(yǎng)干細胞或治療病患，特別是當該病患已有罹癌風險的時候。因此，目前確有發(fā)展處理人類血小板材料的方法的需要，這些方法是用以制備已定性且具病毒安全性的エ業(yè)生長因子制備物，特別是其中I3DGF及VEGF耗盡的制備物。專利申請W02009/087560已揭露可使人類血小板濃厚液接受溶劑及清潔劑組合 (S/D)的處理來達到雙重目的(a)脂質包膜病毒的去活化，以及(b)從血小板α-顆粒大量釋出生長因子。之后可通過結合S/D處理、油萃取及疏水性交互作用層析(HIC)步驟而得到ー標準化復雜血小板生長因子混合物，其包含H)GF-AB、-BB及-AA、TGF-β、EGF、VEGF,以及類胰島素生長因子-β I (IGF-β I)，其中油萃取及HIC是用以移除S/D試劑而不會顯著影響PGF及蛋白的含量。所得血小板生長因子制備物顯示可在試管內刺激多種細胞株，并促使由抽脂取得的脂肪組織當中的干細胞擴增。此外，W02009/087560亦揭露了以SP-sepharose陽離子交換管柱來取代HIC,以制備經純化的FiDGF-VEGF流析物(fraction)。在這項方案中，PDGF及VEGF確實可被吸附在管柱上，但TGF-β、EGF、IGF則與在病毒去活化步驟中使用的S/D試劑一同在前緣部分(breakthrough)出現(xiàn)。反言之，W02009/087560揭露的是可通過DEAE-s印harose陰離子交換取代HIC的方式將TGF- β及EGF純化到一定的程度。在El-Ekiaby et al.所發(fā)表的文獻(El-Ekiaby et al ； , ^Solvent-detergentiiltered(b/D_F)iresh frozen plasma and cryoprecipitate minipools prepared in anewly designed integraldisposable processing bag system，，,Transfusion medicine,2010,20,48-61)當中，作者揭露了ー種方法，其可用于單ー來源(singulet)或迷你集池(mini-pools)的輸血用血漿及冷凍沉淀品的病毒去活化處理，包含下列主要步驟以TnBP及Triton X_45的混合物對新鮮冷凍血漿(FFP)、冷凍沉淀品貧乏的血漿(Cryo-PoorPlasma, CPP)或冷凍沉淀品進行S/D處理；對經S/D處理的血漿材料進行油萃?。灰约巴高^含有經活化的活性碳的S/D吸收過濾器來過濾經油萃取的血漿材料。如該文獻的討論所述，其所揭露的方法特別是能夠保存血漿蛋白(例如凝血因子)的功能活性，不會改變VWF多聚體組成物(VWF mu I timer composition),且會將TnBP及Triton X-45減少到可接受濃度以下，并可通過重力使所得的經純化血漿進行無菌過濾。然而這份文獻是針對血漿材料的純化，故未揭露或建議ー種可用于從血小板濃厚液純化出生長因子的方法。在密集研究后，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明包含對血小板濃厚液進行S/D處理、再進行油萃取及活性碳萃取或單以活性碳萃取的方法能夠簡便、快速、有效地制備出ー種含有病毒去活化的生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物，其中溶劑及清潔劑的濃度是符合主管機關有關經S/D處理的非經ロ血液衍生治療產品的核可標準。更特定言之，本發(fā)明的方法不會改變主要蛋白(如白蛋白及免疫球蛋白)的含量，且基本不影響I3DGF及VEGF以外的生長因子的濃度，如TGF-β I、EGF及IGF。進ー步來說，本發(fā)明的方法可溶解脂質膜，所以會將脂質包膜病毒及其它病原體(例如，細菌和寄生蟲如原蟲)等去活化，并可移除在起始血小板濃厚液中存在的血漿及血小板脂質。是以，本發(fā)明的方法使之可能提供ー種病毒去活化的血小板衍生的生長因子混合物，其可被有效地標準化而用于治療性處理、細胞療法或細胞培養(yǎng)。最后，臨床上在靜脈內使用血小板來矯治數(shù)量性或功能性血小板數(shù)量低下癥(thrombocytopenia)時，由于血小板的保存期限是5或7天(部分是因為細菌污染風險與止血功能活性喪失的問題)，所以毎年通常都會廢棄大量保存時間大于5或7天的血小板單位。本發(fā)明的方法允許使用過期血小板儲存液來制備血小板衍生的濃厚液，掲示了ー種極具有經濟目標的愿景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之ー是ー種制備含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時的時間，其PH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內，且其溫度是在從2°C至50°C的范圍內，優(yōu)選為在從25°C至40°C的范圍內；通過油萃取來移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將所述水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)，或通過將經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液單與活性碳共同培養(yǎng)來移除溶劑及/或清潔劑。在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中所使用的溶劑是選自由具有不同烷基鏈的ニ -或三烷基磷酸酯類所組成的群組，優(yōu)選為三正丁基磷酸酯(TnBP)。在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中所使用的清潔劑是選自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類(partial esters)、非離子性清潔劑、脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類(sulfobetaines)所組成的群組,更優(yōu)選為選自由Triton X-45、Triton X-100、Tween 80及Tween 20所組成的群組。在一優(yōu)選實施方式中，所述溶劑及/或所述清潔劑在將所述血小板濃厚液與溶劑/清潔劑共同培養(yǎng)的步驟中的個別濃度范圍為從0. 2至5體積％，優(yōu)選為從0. 2至2體積％，其是以所述起始血小板濃厚液的體積為基礎計算。在本發(fā)明的方法的一優(yōu)選實施方式中，所述起始血小板濃厚液是單與2% TnBP接觸，或與I % TnBP及I % Triton X-45接觸，其是以所述血小板濃厚液的體積為基礎計算。進ー步言之，在本發(fā)明ー優(yōu)選實施方式中，油萃取是以醫(yī)藥等級油來進行，且所述油的用量為從2至20重量％、或從5至15重量％、或從5至10重量％ ,其是以所述血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑的混合物的重量為基礎計算。在一優(yōu)選實施方式中，當在與經活化的活性碳共同培養(yǎng)之前進行油萃取時，經活化的活性碳的用量為在油萃取后回收的水性蛋白相的從50至250g/l，優(yōu)選為從55至200g/l、或從 60 至 150g/l、或從 65 至 100g/l。在另ー實施方式中，當在與經活化的活性碳共同培養(yǎng)之前不進行油萃取時，經活化的活性碳的用量為經溶劑及/或清潔劑處理一次的血小板濃厚液的從250至1250g/l，優(yōu)選為從 275 至 1000g/l、或從 300 至 750g/l、或從 325 至 500g/l。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法在油萃取后、及/或在與活性碳共同培養(yǎng)后包含另ー離心步驟。本發(fā)明的方法可進ー步包含另ー選自由層析、納米過濾(用以移除致病劑)及/或超濾所組成的群組的步驟來處理所得血小板裂解物。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟，所述起始血小板濃厚液是通過血小板分離術(apheresis)或通過血沉棕黃層(buffy-coat)分離法而從全血加已制備，且為新鮮、過期的儲存液體、或過期且冷凍的狀態(tài)。本發(fā)明的另ー目的是ー種含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小 板裂解物，或是ー種通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物。在一優(yōu)選實施方式中，這種血小板裂解物包含生長因子TGF-β、IGF及EGF。在另ー實施方式中，這種血小板裂解物進ー步包含bFGF。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物包含-PDGF-AB,其濃度為低于10ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為低于5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為低于3ng/ml的前述裂解物；及/或-VEGF,其濃度為低于O. lng/ml的前所述裂解物，更優(yōu)選為低于O. O lng/ml的所述裂解物 '及/或-TGF- β，其濃度為高于50ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于100ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于150ng/ml的前所述裂解物，更優(yōu)選為高于200ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于250ng/ml的所述裂解物；及/或-EGF,其濃度為高于O. 5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于lng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于I. 5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于2ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于2. 5ng/ml的所述裂解物；及/或-IGF，其濃度為高于20ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于50ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于100ng/ml的所述裂解物。本發(fā)明的又一目的是通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發(fā)明的含有病毒去活化且I3DGF及VEGF耗盡的生長因子的血小板裂解物的用途；其是用于促進骨骼再生或重建，或用于治療骨折骨。本發(fā)明的再一目的是通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途；其是用于試管內(in vitro)或活體外(ex vivo)的細胞培養(yǎng)；優(yōu)選為用于促進干細胞増殖及/或分化。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的含有生長因子的血小板裂解物是用于促進干細胞分化為成骨細胞系及/或軟骨細胞。


圖I :富含TGF- β I且TOGF-AB及VEGF耗盡的生長因子混合物的制備方法。圖2 S/D-PC-0(a)及每20mL的S/D_PC_0(即在油萃取后回收的水性蛋白相)以
I.5g (b)、3g (c)、3· 5g (d)及 4g (e)經活化的活性碳處理后的 PDGF-AB (A) ,VEGF (B)、EGF (C)、IGF-I (D)及 TGF- β I (E)含量。圖3 :在未還原(A)及還原(B)條件下對血小板流析物所進行的SDS-PAGE分析，包括起始PC(第I行)、經溶劑-清潔劑處理及一次油萃取后(S/D-PC-0 ;第2行)、經活性碳吸收后(S/D-PC-0C ;第3行)。Novex鮮明預染蛋白標記(M)。a :纖維蛋白原；b IgG ；c 白蛋白；d :纖維蛋白原次單兀；e IgG重鏈；f IgG輕鏈。圖4:在添加 10% (v/v) FBS (a)與未添加 FBS (b)、以及添加了 I % (c),3% (d),5%(e)及10% (f)的S/D-PC-0C的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MG63 (A)及SIRC⑶細胞株的MTS細 胞增殖數(shù)據(jù)。培養(yǎng)5天后測定細胞存活率。
具體實施例方式本發(fā)明的目的之ー是ー種制備含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時的時間，其pH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內，且其溫度是在從2°C至50°C的范圍內；通過油萃取來移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將所述水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)，或通過將經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液單與活性碳共同培養(yǎng)來移除溶劑及/或清潔劑。本發(fā)明使用了“病毒去活化的”的用語，其是指實質上不帶有感染性病毒的含有生長因子的血小板裂解物，特別是脂質包膜病毒，例如人類免疫不全病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、TT病毒、登革熱病毒、巨細胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人類皰疹病毒_8 (HHV-8)、猴泡沫病毒、嚴重急性呼吸道癥候群病毒(SARS冠狀病毒)、HlNI及其它流感病毒；以及其它脂質包膜病毒，例如反轉錄病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒、乳酸脫氫酶病毒、皰疫群病毒(Herpes group virus)、棒狀病毒(rhabdovirus)、白血病病毒(Ieukovirus)、黏液病毒、α病毒、蟲媒病毒(arbovirus)、苜Ij黏液病毒、沙狀病毒(arenavirus)及冠狀病毒?！皩嵸|上不帶有”是指血小板生長因子制備物的病毒去活化程度至少大于41ogl0，這是強力病毒減毒步驟所定出的標準，由歐洲醫(yī)藥產物評量機構(European Agencyfor the Evaluation of Medicinal Products, EMEA)的專利醫(yī)藥產物委員會(Committee forproprietary medicinal products, CPMP)在病毒批核研究基準(Note for guidance on virusvalidation studies)定出(參考文獻 CPMP/BWP/268/95)，且更優(yōu)選為大于51ogl0或更進ー步大于61ogl0，因此，它不大可能會在輸血給患者時造成脂質包膜病毒的血源性感染。本發(fā)明使用了 “TOGF及VEGF耗盡” ー詞，其是指該含有生長因子的血小板裂解物實質上不含 F1DGF(platelet derived growth factor)及 VEGF(vascular endothelialgrowthfactor)。 在ー特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的PDGF-AB濃度是低于10ng/ml的裂解物，優(yōu)選為低于5ng/ml的裂解物，更優(yōu)選為低于3ng/ml的裂解物。在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的VEGF濃度是低于O. lng/ml的裂解物，優(yōu)選為低于O. O lng/ml的裂解物。本發(fā)明亦使用了 “經活化的活性碳”、“經活化的碳”或“活性碳”幾個詞，其均是指ー經處理而非常多孔的形式的碳。因此，經活化的活性碳其有非常大的表面積，能提供非常重要的吸收能力。經活化的活性碳一般是制自碳源材料，如堅果殼、泥炭(peat)、木頭、椰棕(coir)、褐煤(lignite)、煤(coal)及石油浙青(petroleumpitch)。其可用多種方法得到，包含物理性再活化(使用氣體來使前趨物轉變?yōu)榻浕罨幕钚蕴?及化學性活化(在碳化作用前將特定化學物質注入原始材料，例如酸、強堿或鹽)。經活化的活性碳可以整塊使用，或包在市售濾筒中使用。在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明中使用的經活化的活性碳是由蒸氣及/或化學處理得到的經活化的活性碳粉末。活性碳的孔隙度可為微孔(孔徑范圍< 10nm)、中孔(孔徑 范圍10-25nm)或大孔(孔徑范圍> 25nm)、或其組合。來源與處理方式的不同可能會影響最后所得的孔隙度。在一優(yōu)選實施方式中，經活化的活性碳的等級及/或孔隙度要能夠留置溶劑、清潔劑、TOGF及VEGF。適用于本發(fā)明的方法的經活化的活性碳可能來自多個供貨商，如已預先包裝的活性碳濾筒、3M/CUN0(CUN0的經活化的活性碳)及Pall (經活化的活性碳AKS)。當使用3M/CUN0的經活化的活性碳時，優(yōu)選為使用(孔隙度)等級5的經活化的活性碳。進ー步言之，孔隙度為5的3M/CUN0等級5經活化的活性碳在移除溶劑、清潔劑、PDGF及VEGF的效果方面要比孔隙度為2、3及4的來得好。同樣地，當使用Pall的經活化的活性碳時，AKS等級6會比AKS 7和4來得好，因為它提供了較好的溶劑、清潔劑、PDGF及VEGF移除效果。在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的經活化的活性碳可吸收在從100g/m2至550g/m2范圍內的甲基藍，在ー實施方式中，可吸收在300g/m2至500g/m2,或在另ー實施方式中，可吸收100g/m2至300g/m2(甲基藍近來是用作測量經活化的活性碳的吸收能力的標準物質)。亦可依照待處理的流體的黏度來選擇活性碳；優(yōu)選為針對低黏度流體(如黏度低于20cp)設計的活性碳。ー種可使用的特殊活性碳為CUNO R55，其中第一個5是指過濾精度(filtrationrating,與黏度有關)，第二個5則是指碳的等級。“清除溶劑及/或清潔劑”的說法是指含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的溶劑及/或清潔劑的量極低，且優(yōu)選為無法偵測。確實，所屬領域一般技術人員已知溶劑及/或清潔劑濃度升高與長期毒性是有直接聯(lián)系的，且特別是與神經性病癥的發(fā)生有直接聯(lián)系(如揭不于J. P. R. Pelletier, S. Transue, E. L. Snyder. Pathogen inactivationtechniques. Best Practice&Research Clinical Haematology Vol. 19,No. l,pp. 205-242,
2006) o因此，溶劑量“極低”的說法是指在本發(fā)明中的溶劑量小于lOOppm，優(yōu)選為小于50ppm,優(yōu)選為小于20ppm,更優(yōu)選為小于lOppm、小于5ppm,且再更優(yōu)選為小于lppm。進ー步來說，清潔劑量“極低”的說法是指在本發(fā)明中的清潔劑量小于500ppm，優(yōu)選為小于250ppm,優(yōu)選為小于IOOppm,更優(yōu)選為小于50ppm,且再更優(yōu)選為小于lOppm。
本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物至少包含下列功能性生長因子轉形生長因子(TGF-β )超級家族，其特別包含TGF-β I及/或TGF-β 2 ;胰島素樣生長因子(IGF);表皮生長因子(EGF)。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的含有生長因子的血小板裂解物進ー步包含堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)。在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的TGF-β I濃度至少與起始血小板濃厚液中的類似，優(yōu)選為高于50ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于100ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于150ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于200ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于250ng/ml裂解物。在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的IGF濃度至少與起始血小板濃厚液中的類似，且優(yōu)選為高于20ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于50ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于100ng/ml裂解物。 在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的EGF濃度為高于O. 5ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于lng/ml裂解物，優(yōu)選為高于I. 5ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于2ng/ml裂解物，且優(yōu)選為高于2. 5ng/ml裂解物。在一特別實施方式中，本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物不會引起血液細胞相關的輸血反應?！把杭毎嚓P的輸血反應”是指這種含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物不帶有完整的活細胞(例如紅血球、血小板及白血球)，故可避免在患者身上引起一定范圍的已知輸血反應，包括免疫(如異體免疫(Alloimmunization))及溶血性并發(fā)癥(如參見Stroncek et Rebulla,“Platelettransfusions，，，The Lancet,August 4,2007 ；vol. 370 :427-438) 確實，免疫能力正常的受贈者通常會對捐贈者的血液細胞抗原表現(xiàn)出免疫反應，而引起多種取決于相關血液細胞及特異抗原的臨床結果。最普遍的相關抗原是選自下列種類(I)第一型HLA，血小板及白血球共有者；(2)第二型HLA，在某些白血球有表現(xiàn)者；(3)顆粒性白血球特異抗原；(4)血小板特異抗原(舉例來說，如人類血小板抗原HPA);以及(5)紅血球特異抗原。在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物是從AB血型供血者的血小板濃厚液制得，故不含抗-A血凝素或抗-B血凝素的抗體，從而特別是避免受血者可能會發(fā)生的溶血反應。在另ー特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物是從特定血型的血小板濃厚液制得，而用于與供血者相同血型的患者，其中所述血小板濃厚液是得自小族群的供血者(如A族群或B族群)的供血者。更特定言之，在本發(fā)明的制備方法中，活的血液細胞(紅血球、白血球及血小板)會被溶剤-清潔劑摧毀/溶胞，從而減少(且更佳為預防)患者暴露于外來抗原及完整血液細胞的風險。故本發(fā)明的方法可從由患者得到的血小板(用來治療患者本身)、或從同種異體的血小板來制備含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物。在另ー實施方式中，通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物進ー步包含免疫球蛋白，如IgG、IgM及/或IgA。在ー特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中免疫球蛋白IgG的濃度較佳為高于5g/L裂解物，且更佳為約8g/L裂解物。在另ー實施方式中，通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物可進ー步額外進行純化步驟，例如離子交換層析，以移除免疫球蛋白，例如IgG、IgM 及/或 IgA0在另ー實施方式中，本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物包含白蛋白、纖維蛋白原及凝血酶原當中至少ー種。在一特別實施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中的白蛋白濃度優(yōu)選為聞于30g/L裂解物。在另ー實施方式中，本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物進ー步包含α I-抗胰蛋白酶(α Ι-antitrypsin)、α2_抗胞楽;素(a 2-antiplasmin)、α 2-巨球蛋白(a 2-macroglobulin)、轉鐵蛋白(transferrin)、纖維黏連蛋白(fibronectin)及 C1-INH。在一優(yōu)選實施方式中，血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑于本發(fā)明的方法進行培養(yǎng)的時間范圍為從2至4小時，其是于生理pH值下進行，如在從pH 7. O至pH 7. 5范圍內·的PH值(當起始血小板為新鮮的血小板吋)、或在從pH 6. 8至8. 2范圍內的pH值(當起始血小板為過期及/或冷凍血小板吋)進行。有利的是，培養(yǎng)溫度為約31°C。在本發(fā)明的方法中所使用的合適溶劑為ニ -或三烷基磷酸酯類，如三-(η- 丁基)磷酸酯、三-(t-丁基)磷酸酯、三-(η-己基)磷酸酯、三-(2-こ基己基)磷酸酯、三-(η-癸基)磷酸酯、ニ-(η-丁基)磷酸酯、ニ-(t-丁基)磷酸酯、ニ-(η-己基)磷酸酯、ニ-(2-こ基己基)磷酸酯、ニ-(η-癸基)磷酸酯及具有不同烷基鏈的ニ烷基磷酸酯類?？墒褂镁哂胁煌榛湹磨嘶蛉榛姿狨ヮ悾绁?(η-丁基)磷酸こ酷。特別優(yōu)選的三烷基磷酸酯為三-(η- 丁基)磷酸酯(TnBP)。在本發(fā)明的方法中所使用的合適清潔劑包括脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類(partial esters)(例如品名為“Tween 80” (也稱為“聚山梨醇酯80(polysorbate80) ”)、“Tween 20”的市售產品)及非離子性清潔劑(如以下列品名販賣的氧こ基化的烷基酚“Triton X-100”或“Triton X_45”)。進ー步考慮的清潔劑是脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類，如N-十二基-N，N- ニ甲基-2-銨-I-こ烷磺酸鹽(N-dodecyl-N，N-dimethyl-2-ammonio-l-ethane sulphonate)。特別優(yōu)選的清潔劑為 “Triton X-45”、“TritonX-100，，、“Tween 80”及“Tween 20”。在本發(fā)明的特別實施方式中，起始血小板濃厚液是與溶劑及清潔劑共同培養(yǎng)，優(yōu)選為與TnBP及Triton X-45共同培養(yǎng)。有利的是，所述溶劑或所述清潔劑的最終濃度、或所述溶劑及所述清潔劑的個別最終濃度是包含于從0. 2至5體積％的范圍內，優(yōu)選為包含于從0. 2至2體積％的范圍內，其是以所述血小板濃厚液的體積為基礎計算。在一優(yōu)選實施方式中，所述起始血小板濃厚液是與2% TnBP共同培養(yǎng)。在另ー優(yōu)選實施方式中，所述起始血小板濃厚液是與1% TnBP及1% Triton X-45共同培養(yǎng)。所述溶劑及/或清潔劑可通過以醫(yī)藥等級油進行油萃取及活性碳萃取、或僅通過活性碳萃取而從生物性流體中萃出，如此則留存的裂解物中的溶劑及/或清潔劑已被耗盡。所述醫(yī)藥等級油可以是天然油(例如從植物或動物萃取出來的油)或結構類似的合成化合物。合適的天然油包括蓖麻油(castor oil,或稱ricinus oil)、大豆油、葵花油、棉籽油。優(yōu)選的合成化合物為合成性三酸甘油酷。合適的合成性三酸甘油酯范例包括三油精(triolein)、三硬脂精(tristearin)、三棕櫚精(tripalmitin)、三肉宣蘧精(trimyristin)、及其組合。醫(yī)藥等級油的量為可萃取至少80%脂溶性エ藝化學物質(process chemical)的量，所用油量為從2至20重量％，其是以血小板濃厚液的重量為基礎計算；優(yōu)選為從5至15重量％，且更優(yōu)選為從5至10重量％?；钚蕴驾腿】捎们拔乃龅慕浕罨幕钚蕴紒磉M行，所述活性碳可吸收并留置溶劑及/或清潔劑粒子?；钚蕴驾腿】煞峙M行(即將活性碳與油萃取后回收的水性蛋白相混合)或在管柱中進行(使水性蛋白相通過前置沉淀活性碳(preably sedimentedcharcoal))，或者透過預先填充的市售筒匣來進行。在一優(yōu)選實施方式中，活性碳萃取為分批進行。
在一優(yōu)選實施方式中，當在與經活化的活性碳共同培養(yǎng)之前進行油萃取時，用以進行活性碳萃取的經活化的活性碳用量為從50至250g/l水性蛋白相，優(yōu)選為從55至200g/l水性蛋白相，或從60至150g/l水性蛋白相，或從65至100g/l水性蛋白相。在一更一優(yōu)選實施方式中，用以進行活性碳萃取的經活化的活性碳用量為75g/l水性蛋白相，其中水性蛋白相是在油萃取后回收得到。在另ー優(yōu)選實施方式中，當在與經活化的活性碳共同培養(yǎng)之前不進行油萃取吋，用以進行活性碳萃取的經活化的活性碳用量為從250至1250g/l經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，優(yōu)選為從275至1000g/l經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，或從300至750g/l經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，或從325至500g/l經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液。在一優(yōu)選實施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或僅進行活性碳萃取后的溶劑量為小于IOOppm,優(yōu)選為小于50ppm,優(yōu)選為小于20ppm,更優(yōu)選為小于IOppm,小于5ppm,且再更優(yōu)選為小于lppm。在一優(yōu)選實施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或僅進行活性碳萃取后的清潔劑量為小于500ppm,優(yōu)選為小于250ppm,更優(yōu)選為小于IOOppm,更優(yōu)選為小于50ppm,且再更優(yōu)選為小于lOppm。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法可在油萃取后、或在與活性碳共同培養(yǎng)后進一歩包含至少ー離心步驟。優(yōu)選地，該離心步驟是在油萃取及活性碳萃取后進行，或在単獨施行活性碳萃取后進行，以移除細胞碎片。有利的是，所述離心步驟是于800至20000Xg進行10至30分鐘，且優(yōu)選為于IOOOOXg進行15分鐘。 在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法亦可進ー步包含至少ー額外步驟，其是選自層析純化及/或超濾、及/或納米過濾、及/或無菌過濾。在油及活性碳萃取、或活性碳萃取后接著可以進行層析純化。優(yōu)選地，是將活性碳與在油萃取后回收的水性蛋白相的混合物、或活性碳與經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液的混合物于培養(yǎng)后進行離心，收集上清液并將之加入層析支持物，以流析出混合物的成分，或移除某些成分?？捎玫暮线m層析管柱包含反相(疏水性交互反應)基質、或蛋白吸附基質如離子交換(陰離子及陽離子)基質及親和力(如免疫-親和カ或固定化肝素)基質、或尺寸排除(size-exclusion)基質。在一優(yōu)選實施方式中,血小板裂解物中所包含的生長因子會被留置在所用的層析支持物上，并進一歩被合適的洗提緩沖液洗提出來。優(yōu)選地，層析條件是選自例如使層析分離/純化在可與目標生長因子的穩(wěn)定性及生理功能兼容的PH值下進行，如實質為中性的PH值，如此則可避免生長因子變性。充填、清洗及洗提的條件是由發(fā)明所屬領域一般技術人員依其一般常識來決定。在通過油及活性碳萃取或單由活性碳萃取來移除溶劑及/或清潔劑后，可進ー步加入ー步驟，來使非包膜病毒(如小病毒B19、或者也可能是A型肝炎病毒(HAV))去活化或將之移除，例如納米過濾，且更特別是使用75-nm、35-nm、20-nm、15-nm或10-nm孔徑的濾膜來進行納米過濾。在一特別實施方式中，在本發(fā)明的方法中用作起始材料的血小板濃厚液是單ー或混合(pooled)的標準血小板濃厚液，例如制備作輸血用途的血小板濃厚液。血小板濃厚液亦可得自全血的血沉棕黃層分離法。一単位得自血沉棕黃層的血小板濃厚液一般為30至50ml。得自血沉棕黃層的血小板可用作起始材料，其為單ー単位或多個單ー單位的混合，如在形成一治療性單位時，其為4至6個單ー單位的混合(如Council of Europe 所編輯的 Guide to the preparation, use and quality assurance of bloodcomponents_13thedition (2007)中的揭不)。血小板濃厚液可通過血液分離術、細胞分離術(cytapheresis)或血小板分離術(plateletpheresis)標準程序(如參見 Council of Europe 所編輯的 Guide to thepreparation,use and quality assurance oi blood components,13th edition(2007),)得至1J，且可通過使用 MCS+(Haemonetics)、Trima Accell 或 COBE Spectra(Gambro)或Amicus(Baxter)而得到。與透過血沉棕黃層分離法程序所得者相較之下，血小板分離術ー般會從每個捐贈者身上得到較大的體積(相當于300ml血小板濃厚液)。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟。有利的是，制備起始血小板濃厚液的方法包括但不限于標準血庫程序(如血小板分離術或透過全血捐輸?shù)难“逯苽浞?及重點照護程序(如那些使用血球保存剤/分離器或桌上裝置者)。在本發(fā)明的方法中，用作起始材料的血小板濃厚液可以是新鮮(即收集后少于5或7天)、過期(即收集后多于5或7天)、或過期且冷凍于_20°C或以下數(shù)周的時間。在一特別實施方式中，在本發(fā)明的方法中用作起始材料的血小板濃厚液可進ー步包含白血球及/或紅血球。故該起始血小板濃厚液可能包含數(shù)種已分化且未活化的白血球,如淋巴細胞、嗜中性的顆粒性白血球及單核球。更特定言之,嗜中性球及單核球富含內有骨髓過氧化酶(myeloperoxidase)的顆粒,這種酶會催化氯化物的氧化作用，而生成次氯酸(hypochlorous acid)及其它反應性氧衍生物，其中所述反應性氧衍生物是作為殺菌氧化劑，對微生物及霉菌具有毒性。因此，當起始血小板濃厚液包含數(shù)種已分化且未活化的白血球時，通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物進ー步包含抗微生物成分及多種源自白血球的生長因子。在一優(yōu)選實施方式中，用作起始材料的血小板濃厚液中的白血球會被消滅，優(yōu)選為通過白血球去除作用(Ieukoreduction)來進行，以避免白血球中的蛋白酶及酸水解酶發(fā)生促發(fā)炎反應。白血球去除作用也可降低普利子蛋白(prion)污染的風險。健康人的正常血小板計數(shù)一般為每mm3血液中包含150000至400000個血小板，亦即150至400 X IO9個血小板/し這個“正?！毖“逵嫈?shù)在約95%健康人身上是如此，而剩下的5%可能會有統(tǒng)計上不正常的血小板計數(shù)(非常低或非常高)。當以血小板分離術收集血小板時，在一袋250ml當中的血小板計數(shù)一般是高于每ml有I. 2X IO9個血小板，其血小板計數(shù)相當于每袋(単位)有多于約3X IO11個血小板。在一優(yōu)選實施方式中，起始血小板濃厚液中血小板的數(shù)目比血液中通常的數(shù)目高出3至10倍。本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物可與人工支架(例如以膠原蛋白、幾丁聚醣(chitosan)、陶瓷所制造者)混合，或與得自血 漿的纖維蛋白黏膠或纖維蛋白密封劑混合；舉例來說，其可用于治療目的，即治療性或預防性的處理，用于在人類及/或動物身上治療適應癥，而透過醫(yī)藥、免疫或代謝效用來回復、修正或改變其生理功能。本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物特別適用于處理人類及/或動物的病癥、及/或用干與其身體的體表部分接觸，這是因為它的溶劑及清潔劑都已被清除，且具有病毒安全性。亦可在含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物中加入額外的化合物，其包含但不限于化療劑、抗生素及/或激素。本發(fā)明的另一目的是ー種本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物干治療性應用及于試管內或活體外的細胞培養(yǎng)的用途。當其用于在試管內或活體外的細胞培養(yǎng)時，本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物存在于培養(yǎng)基中的量是在培養(yǎng)基體積的從1%至30%范圍內，優(yōu)選為從2%至20%范圍內，又更優(yōu)選為從3%至10%范圍內。本發(fā)明的另一目的是ー種醫(yī)藥產品及/或美容產品，其包含本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物。“醫(yī)藥產品”是指血小板凝膠(platelet gel)、血小板黏膠(platelet glue)、富含生長因子的纖維蛋白黏膠及/或密封劑(sealant)、人工支架?！懊廊莓a品”是指數(shù)種施用于人體的制劑當中的任ー種，其用于美化、保存或改變外表、或清潔、著色、調理或保護皮膚、頭發(fā)、指甲、嘴唇、眼睛或牙齒。本發(fā)明的另一目的是ー種本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物于細胞培養(yǎng)的用途，其是適用于在試管內或活體外培養(yǎng)纖維母細胞、軟骨細胞、成骨細胞、角質細胞(keratinocytes)、干細胞及/或移植細胞(transplantscells)。本發(fā)明的另一目的是適用于在試管內或活體外培養(yǎng)纖維母細胞、軟骨細胞、成骨細胞、角質細胞、干細胞及/或移植細胞的培養(yǎng)基，且包含本發(fā)明或通過本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物的用途是用于促進干細胞的繁殖及/或分化，特別是間質干細胞。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物的用途是用于促進干細胞分化為成骨細胞系及/或軟骨細胞系。
本發(fā)明的另一目的為ー種本發(fā)明含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其是用于促進骨骼重建、骨骼再生或傷ロ療愈，以及美容用途。本發(fā)明的上述及其它目的、特征及優(yōu)點將因以下敘述、參考文獻及后附圖式而變得更加顯明。實施例I.材料與方法I.分離術血小板(apheresis platelet)的收集起始血小板濃厚液(PC)是征得志愿捐贈者同意后使用MCS+多成分系統(tǒng)(Haemonetics, Braintree, USA)收集而來。全血是透過使用間歇性流動(intermittent flow)的靜脈導管取得，并立即以1/9的比例用檸檬酸右旋葡萄糖溶液配方A(citratedextrosesolution Formula A)進行抗凝血處理。通過連續(xù)離心,使血小板與紅血球及其它血液成分分離，并懸浮于血漿中，再收集到無菌容器內。進行數(shù)個分離循環(huán)，直到所收集的PC的總體積達到在225及315mL之間的體積范圍為止，預定的血小板產量目標是等于或大于3. OX 1011。PC是于室溫緩慢混合儲存，并在收集的24至72小時內進行處理。2.細胞計數(shù)紅血球、血小板及白血球在起始PC中的含量是使用細胞計數(shù)器(ABC VetAutomaticBlood Counter, ABX Diagnostics, Franceノ 來測足。3.起始血小板濃厚液的處理a.研究設計起始血小板濃厚液是根據(jù)圖I的研究設計來處理。簡言之，將PC (300mL)移入塑料袋，并如EP 1，685，852所述進行處理。將血漿濃厚液(plasma concentrates)與 1% (v/v)(終濃度)三正丁基憐酸酯(TnBP) (MerckKGaA,Darmstadt, Germany)及 I % (v/v)(終濃度)Triton X-45 (Sigma, Missouri, USA)的組合于室溫(RT)恒定溫和攪拌(70rpm) (FINEPCR, Seoul, Korea)的條件下共同培養(yǎng)I小時。之后加入10% (v/v)(終濃度)大豆油(Sigma, Missouri, USA),先劇烈混合30秒，之后與經S/D處理的PC(S/D-PC)于室溫(RT)在70rpm混合15分鐘。之后將該油/S/D-PC混合物倒出45分鐘，以分離出清澈的油相(頂部)、濁相(turbidphase)(中間)及一清澈的水性蛋白相(底部)。通過重力從袋子底部回收水性蛋白相(約2701^)，并于20-25^在6000父8離心10分鐘使之澄清，并使細胞碎片或不溶材料沉淀成團塊狀。在離心后，回收上清液(S/D-PC-0，約265mL)并于RT在70rpm與回收19. 9g經活化的活性碳(3M，St. Paul, MN, USA)混合30分鐘，其對應比例為I. 5g/20mL的S/D-PC-0。之后將混合物離心(6000 X g，10分鐘，RT)而使活性碳沉淀成團塊狀，并回收澄清的上清液(S/D-PC-0C)。使樣本經此方法處理并于_80°C冷凍，直到要進行分析為止。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)為四次或五次重復的平均圖形。4.活性碳比例的影響進行小規(guī)模預先實驗，決定要用來移除TnBP及Triton X_45的活性碳的最適量，并評估它對GF及蛋白含量的影響。使用旋轉混合器將用量遞增的活性碳(1.5至4め與5/D-PC-O (20mL)于RT在70rpm混合30分鐘。之后將混合物離心(6000 X g, 10分鐘，RT)，使活性碳沉淀成團塊狀并回收澄清的上清液，再將之于-30°C冷凍，直到進行評估為止。
5.生長因子測定在程序的各個步驟中取出I-ml樣本。將之于10000 Xg離心15分鐘(Microfuge 22R, Beckman Coulter, Fullerton, CA),使血小板及/或細胞碎片沉淀成團塊狀,并得到無細胞的上清液來進行血小板源生長因子的測量。之后上清液立即于_80°C冷凍。樣本于37°C解凍，并在I小時內以敏感且具專一性的市售免疫測定法進行分析。標準品及樣本進行二重復測定，并計算平均值。結果乘以樣本所用的稀釋系數(shù)。PDGF-AB.TGF-β I、EGF、VEGF及 IGF-1 是特別使用 Quantikine 套組(R&D Systems ；Minneapolis, MN)來進行ELISA測定而進行量測。a. PDGF-AB使用Quantikine ELISA kit (#· DHD00B，R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)來測定PDGF-AB0樣本以Calibrator稀釋劑(RD6-11)稀釋100倍。將孔盤培養(yǎng)2小時、清洗、并和與酶共軛結合的I3DGF-AB抗體于室溫再共同培養(yǎng)3小吋。使用清洗緩沖液(WashBuffer)來清洗盤孔，之后于室溫加入基質溶液(Substrate Solution) 20-30分鐘。盤孔為避光保護。在各盤孔中加入停止溶液(Stop Solution)，并使用微滴定盤讀取儀來測定450nm的吸光值。最小可偵測的劑量為1.7pg/ml。b.TGF-βΙ使用Quantikine ELISA kit (DB100B，R&D SYSTEMs)來測定 TGF-β I。樣本以Calibrator稀釋劑(RD5-26)稀釋100倍。在涂覆有TGF-β -受器II的96孔微滴定盤中制備體積為100-μ I的TGF-β I標準品(890207)稀釋序列。在TGF-β I分析之前，進行酸活化及中和反應，以將潛性TGF-β I活化到免疫活性形成狀態(tài)。為達此目的，將0. 5ml樣本與0. Iml 的 IN HCl 混合，于室溫培養(yǎng) 10 分鐘，加入 0. Iml 的 I. 2N Na0H/0. 5MHEPES(N_[2_ 羥基こ基]哌-N0-[2-こ烷磺酸])(Sigma, H-7523)加以中和，再行離心。之后測定上清液部分的總TGF-βΙ含量。將各等分(50μ1)以二重復的方式加到微滴定盤中，之后蓋上蓋子，于室溫培養(yǎng)2小吋。之后清洗盤孔，加入與酶共軛結合的TGF-β I多株抗體，并于室溫持續(xù)培養(yǎng)I. 5小吋。如前述完成測量。TGF-β I的偵測限值為4. 61pg/ml。c. EGF使用Quantikine ELISA kit(#. DEG00, R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)來測定EGF。樣本以Calibrator稀釋劑(RD6N)稀釋20倍。將200 μ I的標準品、對照品或樣本加入盤孔中。將孔盤于室溫培養(yǎng)2小吋。各盤孔經過抽吸，并填入清洗緩沖液來加以清洗。在各盤孔中加入EGF共軛結合物，并于室溫培養(yǎng)2小吋。使用清洗緩沖液清洗盤孔，并在各盤孔中加入基質溶液(200 μ I)?；旌衔镉谑覝乇芄馀囵B(yǎng)20分鐘。在各盤孔中加入停止溶液(50 μ I)。各盤孔的光學密度是使用微孔盤讀取儀(VersaMax microplate reader,Molecular Devices, USA)在30分鐘內于450nm進行測定。最小可偵測的劑量為0. 7pg/ml οd. VEGF使用Quantikine ELISA kit (#DVE00, R&D Systems, Minneapolis, MN)來定量VEGF0樣本以Calibrator稀釋劑(RD6U)稀釋2倍。如制造商所說，其最小可偵測的劑量范圍為小于9. 0pg/ml，且平均MDD為50ng/ml。在各盤孔中加入100 μ I的測定稀釋劑(RDlW)，接著是100 μ I的標準品(VEGF標準品)。以黏膠條覆蓋孔盤，并于室溫培養(yǎng)2小吋。將盤孔清洗3次，之后和與酶共軛結合的VEGF于室溫共同培養(yǎng)2小吋。e. IGF-I·使用Quantikine ELISA kit (DG100，得自 R&D SYSTEMs)來定量 IGF-1。樣本以Calibrator稀釋劑(RD5-22)稀釋100倍。如制造商所說，其最小可偵測的劑量范圍為從O. 007至O. 056ng/ml，且平均MDD為O. 026ng/ml。在各盤孔中加入150 μ I的測定稀釋劑0 1-53)，接著是5(^1的標準品(890775)。以黏膠條覆蓋孔盤，并于2_8°C培養(yǎng)2小時。將盤孔清洗3次，之后和與酶共軛結合的IGF-I于2-8°C共同培養(yǎng)I小吋。如前述完成測量。6. P-選擇素測定使用Quantikine kits (R&D Systems)而以 ELISA 測定法來測量 P-選擇素。7.蛋白及脂質測定在油萃取后及在活性碳吸收后，用RocheP800分析儀來測定總蛋白、白蛋白、總膽固醇及三酸甘油酯(triglycerides, TG)在起始PC中的量。IgG、IgM及IgA是在 CobasIntegra 800(Roche COBAS INTEGRA 800, RocheDiagnostics, Mannheim,Germany)使用全自動乳膠增強免疫比池測定法(fully automatic latex-enhancedimmunoturbidimetricassay)來測重。8.十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDb—PAGEノSDS-PAGE是使用4_12 %梯度凝膠、反應試劑及Invitrogen電泳系統(tǒng)(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA)在未還原與還原的條件下進行。使用Novex Sharp Pre-Stained Protein Molecular Weight Standard (Invitrogen)來估
算分子量。9. TnBP 及 Triton X-45 測定如先前所述進行樣本的萃取，以測定殘余的TnBP及Triton X-45 (19)。以氣相層析(GC-17A, SHIMADZU, Tokyo, Japan)及火焰離子化偵測(flame ionization detection)來進行 TnBP 定量，另使用 LiChrospher 100RP-18 管柱(ID :4mm，長度250mm，P/N :724964,Merck KGaA, Darmstadt, Germany)以高效液相層析(SHIMADZU)來進行 TritonX-45 定量。10.細胞培養(yǎng)S/D-PC-0C在試管內刺激細胞生長及取代FBS的能力是使用下列細胞株來進行評估(a)人類成骨細胞MG63 (ATCC CRL 1427，購自中國臺灣新竹生物資源保存及研究中心，BCRC)及(b) StatensSeruminstitute 兔角膜上皮細胞(rabbit corneal epithelialcells, SIRC) (ATCC CCL-60，購自BCRC)。這些細胞株是維持在37°C且含有5% CO2的控制環(huán)境中。它們是以姆孔2X IO3個細胞的密度在平底96孔盤(Greiner bio-one,Tokyo, Japan)中使用最低必需培養(yǎng)基(minimum Essential medium,MEM) (Gibco, Invitrogen)進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有2. 2g的NaHC03、0. ImM非必須胺基酸、ImM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、2mM的L-麩酰胺酸(L-glutamine)、100U/mL青霉素及100 μ g/mL鏈霉素，且添加了 10 %(v/v) FBS (Gibco, Invitrogen)。在實驗中，ー開始是使細胞貼附18小時,之后在測試不同的GF添加物之前，于無血清培養(yǎng)基中使細胞處于饑餓狀態(tài)6小吋。用無血清培養(yǎng)基清洗兩次后，將細胞在添加了不同濃度(I至10% )的S/D-PC-OC的培養(yǎng)基(分別對應于TGF-β終濃度在O. 31及3. lng/ml之間的范圍)培養(yǎng)高達5天的時間。每輪實驗都以不添加任何蛋白/GF添加物或添加了 10% FBS的細胞培養(yǎng)物來作為對照組。11. MTS 測試在培養(yǎng)五天時，使用MTS四唑鎗[3-(4，5_ ニ甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)~2~ (4-橫苯基)-2H-四唑鐵，[3- (4, 5-dimethylthiazol_2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(^-sulfophenyjj-2H-tetrazolium)的內鹽 unner;(PromegaCorporation,Madison, Wisconsin, USA)依照制造商的指示來測定目視在增生的細胞。這項測定使用了MTS溶液及電子稱合試劑PMS (吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate))。MTS會被細胞生物還原(bioreduced)為不溶于組織培養(yǎng)基的產物甲膜(formazan)。具代謝活性的細胞 當中的去氫酶會將MTS轉換為甲臜。從96孔測定盤測量甲臜于490nm的吸光值，其與培養(yǎng)物中存活細胞的數(shù)目有直接的比例關系。制備后，將溶液保持在-20°C的避光保護管中。將MTS及PMS偵測試劑以20 KMTS PMS)比例混合后，立刻以I 5 (MTS+PMS/培養(yǎng)基)的比例加入細胞培養(yǎng)物中。12.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)是以平均值土標準差(SD)來表示。并以雙尾配對學生檢定(two-tailedpairedStudent test)來進行統(tǒng)計上的比較。P值小于0. 05是用來估算平均測試參數(shù)的明顯差異(the significance of the differences)。當p值< 0. 05時，則認為有明顯差異。II.結果I.細胞計數(shù)起始PC 平均含有 1216± 188. 6X IO6 個血小板/ml (范圍896-1388X IO6 個 /ml)。白血球及紅血球的平均計數(shù)分別為0. 32 ±0. 10 (范圍0. 20-0. 4) X IO6個/ml及
O.04 + 0. 01 (范圍0. 02-0. 06) X IO9個/ml。之后進行S/D處理的所有流析物中都偵測不到血球細胞。2.活性碳的最適比例測定預先實驗顯示活性碳處理在所測試的各個比例都會移除S/D試劑，但也會大幅降低TOGF-AB及VEGF的含量。因此進行下列測試將用量漸增的活性碳(I. 5、3、3. 5或4g)與20mL的S/D-PC-0混合。在所有進行評估的比例中，殘余的TnBP均< 2ppm，而殘余的TritonX-45則分別為9、3、2及I. 5ppm。圖2顯示S/D-PC-0流析物的活性碳處理對于PDGF-AB, TGF-β I、EGF、VEGF 及 IGF-I 含量的典型影響。TGF-β I、EGF 及 IGF-I 的濃度保持基本不變，而在所有進行評估的比例中，PDGF-AB及VEGF含量都大幅降低。每20mL的S/D-PC-O對I. 5g的活性碳的比例可讓TnBP及TritonX-45的量降低至少于IOppm,故在后續(xù)實驗中使用該比例。3.多種流析物的組成使用19. 9g的活性碳對265mL的P/D-PC-0萃取物(對應選擇率為I. 5g/20mL)進行活性碳處理，其對GF、p-選擇素、蛋白、膽固醇及TG含量的影響如表I所示(4次實驗的平均值)。在油萃取及活性碳吸收后，TGF-β I、IGF及EGF濃度保持基本恒定(分別為約368、55及2. 4ng/mL)。在S/D-PC-0C中的GF平均整體回收量相對于在S/D-PC-0中所偵測到的含量分別為TGF-e I為81. 5%，EGF為94%，而IGF為83. 8%。相對而言，PDGF及VEGF的平均濃度在活性碳處理當中顯著降低(P < O. 01)(分別為約2. 31ng/mL及< O. 009ng/mL)，確認了在小規(guī)模實驗中的觀察。P-選擇素含量不會受活性碳處理的影響太多，只有輕微的降低。白蛋白、IgG、IgA、IgM的平均濃度保持基本不變，但可觀察到纖維蛋白原含量有顯著的小幅降低(P < O. 05)。膽固醇及TG平均含量保持穩(wěn)定。TnBP平均量會從約738ppm降至 8. 7ppm,而 TritonX-45 則會從 2628ppm 降至 8. 8ppm(p < O. 001)。表I經S/D處理的血小板濃厚液在油萃取后的組成物(S/D-PC-0)及其在活性碳處理后的組成物(S/D-PC-0C) (N = 4)
權利要求
1.ー種含有病毒去活化的生長因子且roGF及VEGF耗盡的血小板裂解物。
2.如權利要求I所述的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物，其包含生長因子TGF-β、IGF 及 EGF。
3.如權利要求I或2所述的含有病毒去活化的生長因子的血小板裂解物，其中 -PDGF-AB在所述裂解物中的濃度為低于10ng/ml，更優(yōu)選為低于5ng/ml，更優(yōu)選為低于3ng/ml ;及/或 -VEGF在所述裂解物中的濃度為低于O. lng/ml，更優(yōu)選為低于0.01ng/ml ;及/或 -TGF-β在所述裂解物中的濃度為高于50ng/ml，更優(yōu)選為高于100ng/ml，更優(yōu)選為高于150ng/ml,更優(yōu)選為高于200ng/ml,更優(yōu)選為高于250ng/ml ;及/或 -EGF在所述裂解物中的濃度為高于O. 5ng/ml，更優(yōu)選為高于lng/ml，更優(yōu)選為高于I. 5ng/ml,更優(yōu)選為高于2ng/ml,更優(yōu)選為高于2. 5ng/ml ;及/或 -IGF在所述裂解物中的濃度為高于20ng/ml，更優(yōu)選為高于50ng/ml，更優(yōu)選為高于100ng/ml。
4.一種制備含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟 a)使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸； b)使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng) -一段至少5分鐘至6小時的時間， -其pH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內，且 -其溫度是在從2 °C至50°C的范圍內； c)通過油萃取來選擇性移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及 d)將步驟b)的經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液或步驟c)的水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述溶劑是選自由ニ-或三-烷基磷酸酯類、具有不同烷基鏈的ニ -或三-烷基磷酸酯類所組成的群組，優(yōu)選為三正丁基磷酸酯(TnBP)。
6.如權利要求4至5任一項所述的方法，其中所述清潔劑是選自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類、非離子性清潔劑、脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類所組成的群組，優(yōu)選為 Triton X-45> Triton X-100 或 Tween 80。
7.如權利要求4至6任一項所述的方法，其中步驟b)中所述溶劑及/或所述清潔劑的個別濃度范圍為從O. 2至5體積％，其是以所述起始血小板濃厚液的體積為基礎計算。
8.如權利要求4至7任一項所述的方法，其中，所得病毒去活化的生長因子血小板裂解物是權利要求I至3任一項所述的病毒去活化的生長因子血小板裂解物。
9.如權利要求4至8任一項所述的方法，其中油萃取是以醫(yī)藥等級油來進行，所述油的用量為從2至20重量％、或從5至15重量％或從5至10重量％ ,其是以所述血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑的混合物的重量為基礎計算。
10.如權利要求4至9任一項所述的方法，其中 -當進行步驟c)的油萃取時，亦對步驟c)的水性蛋白相進行活性碳萃取，其中活性碳的量為所述水性蛋白相的從50至250g/l，優(yōu)選為從55至200g/l、或從60至150g/l、或從65至100g/l ;以及-當不進行油萃取吋，則對步驟b)的經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液進行活性碳萃取，其中活性碳的量為所述水性蛋白相的從250至1250g/l，優(yōu)選為從275至IOOOg/I、或從 300 至 750g/l、或從 325 至 500g/l。
11.如權利要求4至10任一項所述的方法，其中經活化的活性碳所吸收的甲基藍為經活化的活性碳的從100至550g/m2范圍內，優(yōu)選為從300至500g/m2或從100至300g/m2范圍內。
12.如權利要求4至11任一項所述的方法，其在步驟c)油萃取之后、及/或在步驟d)與活性碳共同培養(yǎng)之后進ー步包含至少ー離心步驟。
13.如權利要求4至12任一項所述的方法，其進ー步包含步驟(e):層析純化及/或超濾及/或納米過濾。
14.如權利要求4至13任一項所述的方法,其在步驟a)之前進ー步包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟，優(yōu)選為通過血小板分離術或血沉棕黃層分離法而從全血加以制備。
15.如權利要求4至14任一項所述的方法，其中步驟a)的起始血小板濃厚液是從混合血小板濃厚液得到。
16.ー種通過權利要求4至15任一項所述的方法得到的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物、或權利要求I至3任一項所述的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其用于美容、促進骨骼再生或重建、或治療骨折。
17.—種通過權利要求4至15任一項所述的方法得到的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物、或權利要求I至3任一項所述的含有病毒去活化的生長因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其用于試管內或活體外的細胞培養(yǎng)，優(yōu)選為用于促進干細胞分化為成骨細胞系及/或軟骨細胞。
全文摘要
富含生長因子(PGF)的人類血小板萃取物可用于傷口療愈及干細胞擴增，近來日益受到關注。本發(fā)明關于一種含有病毒去活化的生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物，優(yōu)選為富含TGF、IGF及EGF者。本發(fā)明進一步關于一種得到上述血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與一溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時的時間，其pH值維持在從約6.0至約9.0的范圍內，且其溫度是在從2℃至50℃的范圍內；通過油萃取來選擇性移除上述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將該經溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液或該水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/00GK102985101SQ201180025490
公開日2013年3月20日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2010年5月25日
發(fā)明者席耶利·布諾夫, 蘇正堯 申請人:國維聯(lián)合科技股份有限公司