專利名稱：重編程細(xì)胞的制作方法
重編程細(xì)胞相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2010年3月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/319，494，于2010年10月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/393，724，和于2010年10月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/406，892的優(yōu)先權(quán)的利益，所述每個(gè)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用完整地結(jié)合。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)技術(shù)，即通過(guò)引入限定的因子將體細(xì)胞重編程為與胚胎干細(xì)胞(ESC)非常相似的多能細(xì)胞，在生物醫(yī)藥研究和再生醫(yī)學(xué)中具有很大的潛力(Takahashi, K.和 Yamanaka, S.，Cell(細(xì)胞)126,663-676 (2006) ；Takahashi 等，CelK 細(xì)胞)131,861-872(2007) ；Yu 等，Science318,1917-1920 (2007) ；Zhou 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)4,381-384(2009) ;Kim 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)4，472-476(2009) ；Maherali, N.和 Hochedlinger，Κ·，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)3，595-605 (2009a) ;Daley 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)4，200-201 (2009))。已經(jīng)開發(fā)出多種策略，以在較少或沒(méi)有外源基因操作的情況下產(chǎn)生iPSC，這表示iPSC應(yīng)用的主要障礙(Yamanaka 等,2009 ；Saha, K.，Jaenisch, R.，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)5,584-595 (2009))。為了實(shí)現(xiàn)相對(duì)于基因操作或更難以制造/使用的生物制劑提供顯著優(yōu)勢(shì)的通過(guò)限定的小分子混合物產(chǎn)生iPSC的最終目標(biāo)，在鑒別可以在功能上替代外源重編程轉(zhuǎn)錄因子(TF)和/或提高重編程效率和動(dòng)力學(xué)的化學(xué)化合物的方面已經(jīng)進(jìn)行了大量努力(Shi 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)2，525-528 (2008a) ;Shi 等，Cell StemCell (細(xì)胞干細(xì)胞)3,568-574 (2008b) ;Huangfu 等，NatBiotechnol (自然生物技術(shù))26，795-797 (2008a) ;Huangfu 等，Nat Biotechnol (自然生物技術(shù))26，1269-1275 (2008b)；Silva 等，Plos Bio6, e253. doi 10. 1371/journal, pbio. 0060253 (2008) ；Lyssiotis 等，PNAS106,8912-8917 (2009) ;Ichida 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)5，491-503 (2009)；Maherali, N. , Hochedlinger, K. , Curr Bioll9,1718-1723 (2009b) ；Esteban 等，CellStemCell (細(xì)胞干細(xì)胞)6,71-79(2010) ;Feng 等，Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)4，301-312(2009))。然而，進(jìn)一步減少外源TF的數(shù)目已經(jīng)成為極大的挑戰(zhàn)，原因在于(I)大多數(shù)允許或增強(qiáng)重編程的條件(例如，開發(fā)具體的細(xì)胞類型或使用小分子)是背景依賴的(context d印endent)，g卩，這樣的具體條件(例如，重編程小分子)通常在具有不同外源因子的不同細(xì)胞類型中無(wú)效的多或甚至是有害的并且用于不同的治療窗口 ；以及(2)當(dāng)重編程效率和速度由于更少的使用外源TF而進(jìn)一步按指數(shù)降低時(shí)，高通量篩選在技術(shù)上是有挑戰(zhàn)的。至今，僅有內(nèi)源高水平表達(dá)Sox2和cMyc的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)通過(guò)僅0ct4的外源表達(dá)顯示被重編程為 iPSC(Kim 等，Cell (細(xì)胞)136，411-419(2009a) ;Kim 等，Nature (自然)461，643-649 (2009b))。然而，人胎兒NSC很少并且實(shí)際中難以獲得(Nunes等，NatMed(自然醫(yī)學(xué))9,439-447(2003))。因此，有益的是開發(fā)可應(yīng)用于其他更容易獲取和豐富的體細(xì)胞的化學(xué)重編程條件。發(fā)明概述本發(fā)明提供將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下將非多能細(xì)胞與3’ -磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)激活劑接觸。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的I3DKl激活劑，例如，(Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS48" )、(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)_3_苯基戍_2_稀酸("PS08 " )、2_ (3_ (4_氣苯基)_3_氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸、(Z)-5-(萘-2-基)-3-苯基戊-2-烯酸("121")或(Z)-5-(1H-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與TGF0受體/ALK5抑制劑(例如，A-83-01)接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與MEK抑制劑(例如，PD0325901)接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如，丁酸鈉(NaB)或丙戊酸(VPA))接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下將·非多能細(xì)胞與3’-磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)激活劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述條件包括將至少一種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到非多能細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括多肽。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括Oct多肽。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽和Klf多肽組成的組的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述條件包括將至少兩種、三種或四種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到非多能細(xì)胞中，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子各自包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的不同蛋白。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將多核苷酸引入到非多能細(xì)胞中來(lái)引入外源轉(zhuǎn)錄因子，其中所述多核苷酸編碼所述外源轉(zhuǎn)錄因子，由此在非多能細(xì)胞中表達(dá)一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)將外源轉(zhuǎn)錄因子與非多能細(xì)胞接觸來(lái)引入。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄小Ｔ谝恍?shí)施方案中，非多能細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，roKi激活劑以這樣的濃度存在所述濃度足以在足以誘導(dǎo)非多能細(xì)胞到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的條件下將非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下將非多能細(xì)胞與3’-磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)激活劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在不存在MEK抑制劑的情況下將非多能細(xì)胞與TOKl激活劑接觸，之后將非多能細(xì)胞與TOKl激活劑和MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在不存在MEK抑制劑的情況下將非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑、TGFii受體/ALK5抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑接觸，之后將非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑、TGFii受體/ALK5抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括純化多能細(xì)胞從而產(chǎn)生同質(zhì)的多能細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，其中多個(gè)多能干細(xì)胞被誘導(dǎo)，所述方法還包括純化多能干細(xì)胞從而產(chǎn)生同質(zhì)的多能干細(xì)胞群。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供混合物，所述混合物包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞、PDKl激活劑和以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)(I)TGFP受體/ALK5抑制劑；(2)MEK抑制劑；(3)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或⑷選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種外源轉(zhuǎn)錄因子。
在一些實(shí)施方案中，在混合物中至少99%的細(xì)胞是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，基本上所有細(xì)胞是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑，例如，(Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS48" )，(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS08" )，2-(3_(4_ 氯苯基)_3_氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z)-5-(萘-2-基)-3-苯基戍-2-烯酸("121")，或(Z)-5-(1H-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。在一些實(shí)施方案中，混合物還包含TGFP受體/ALK5抑制劑，例如，A-83-01。在一些實(shí)施方案中，混合物還包含MEK抑制劑，例如，PD0325901。在一些實(shí)施方案中，混合物還包含組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，混合物還包含選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。在一些?shí)施方案中，在混合物中TOKl激活劑以這樣的濃度存在所述濃度足以 使在足以誘導(dǎo)細(xì)胞到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的條件下將混合物中的非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的試劑盒，所述試劑盒包括I3DKl激活劑，和以下各項(xiàng)中的一種或多種(I) TGF β受體/ALK5抑制劑；⑵MEK抑制劑；(3)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或⑷選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，I3DKl激活劑是變構(gòu)的I3DKl激活劑，例如，(Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS48")，(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS08" )，2-(3-(4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z) _5_(萘-2-基)_3_苯基戍-2-烯酸("12Z "),或(Z)-5-(1H-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括TGFP受體/ALK5抑制劑，例如，A-83-01。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括MEK抑制劑，例如，PD0325901。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物接觸，由此將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的I3DKl激活劑，例如，PS48，PS08，12Z，或13Z。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活劑，例如，果糖2，6- 二磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解的底物，例如，果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解中間體或其代謝前體，例如，煙酸，NADH，或果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑，例如，2，4-二硝基苯酚，或2-羥基戊二酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是低氧誘導(dǎo)因子激活劑，例如，N-草酰甘氨酸，或槲皮素(quercetin)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與TGFii受體/ALK5抑制劑(例如，A-83-01)接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與MEK抑制劑例如PD0325901接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將非多能細(xì)胞與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA))接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將非多能細(xì)胞促進(jìn)糖酵解代謝的化合物在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下與接觸。在一些實(shí)施方案中，所述條件包括將至少一種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到非多能細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括多肽。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括Oct多肽。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽和Klf多肽組成的組的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述條件包括將至少兩種、三種或四種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到非多能細(xì)胞中，其中外源轉(zhuǎn)錄因子各自包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的不同蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將多核苷酸引入到非多能細(xì)胞中來(lái)引入外源轉(zhuǎn)錄因子，其中所述多核苷酸編碼外 源轉(zhuǎn)錄因子，由此在非多能細(xì)胞中表達(dá)一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將外源轉(zhuǎn)錄因子與非多能細(xì)胞接觸來(lái)引入外源轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。在一些?shí)施方案中，非多能細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物以這樣的濃度存在所述濃度足以使在足以誘導(dǎo)非多能細(xì)胞到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的條件下將非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物和MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物在不存在MEK抑制劑的情況下接觸，之后將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物和MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物、TGF^受體/ALK5抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑在不存在MEK抑制劑的情況下接觸，之后將非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物、TGFii受體/ALK5抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括純化多能細(xì)胞從而產(chǎn)生同質(zhì)的多能細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，其中大量多能干細(xì)胞被誘導(dǎo)，所述方法還包括純化多能干細(xì)胞從而產(chǎn)生同質(zhì)的多能干細(xì)胞群。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供混合物，所述混合物包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，和以下各項(xiàng)中的一種或多種⑴TGF β受體/ALK5抑制劑；⑵MEK抑制劑；⑶組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或⑷選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種外源多肽。在一些實(shí)施方案中，混合物中至少99%的細(xì)胞最初是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，基本上所有細(xì)胞最初是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的PDKl激活劑，例如，PS48，PS08,12Ζ或13Ζ。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活劑，例如，果糖2，6_ 二磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解的底物，例如，果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解中間體或其代謝前體，例如，煙酸，NADH,或果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑，例如，2，4- 二硝基苯酚，或2-羥基戊二酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是低氧誘導(dǎo)因子激活劑，例如，N-草酰甘氨酸，或槲皮素。在一些實(shí)施方案中，該混合物還包含TGF β受體/ALK5抑制劑，例如，Α-83-01。在一些實(shí)施方案中，該混合物還包含MEK抑制劑，例如，PD0325901。在一些實(shí)施方案中，該混合物還包含組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。在一些?shí)施方案中，混合物中的促進(jìn)糖酵解代謝的化合物以這樣的濃度存在所述濃度足以使在 足以誘導(dǎo)細(xì)胞到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的條件下將混合物中的非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的試劑盒，所述試劑盒包括促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，和以下各項(xiàng)中的一種或多種(l)TGFi3受體/ALK5抑制劑；⑵MEK抑制劑；(3)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或⑷選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子；或編碼選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的轉(zhuǎn)錄因子的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑，例如，PS48，PS08，12Z或13Z。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活劑，例如，果糖2，6- 二磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解的底物，例如，果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解中間體或其代謝前體，例如，煙酸，NADH，或果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑，例如，2，4-二硝基苯酚，或2-羥基戊二酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是低氧誘導(dǎo)因子激活劑，例如，N-草酰甘氨酸，或槲皮素。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括TGFii受體/ALK5抑制齊[J，例如，A-83-01。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括MEK抑制劑，例如，PD0325901o在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。定義“Oct多肽”是指Octamer轉(zhuǎn)錄因子家族的任一天然存在成員，或者與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比保留例如至少50%、80%或90%的活性之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性的其變體，或至少包括天然存在的家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多妝。不范性 Oct 多妝包括 Oct-1, Oct-2, 0ct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, 0ct-9 和Oct-11。例如，0ct3/4(本文中稱為"0ct4")包含 POU 結(jié)構(gòu)域(在 Pit_l，0ct_l，0ct_2 和uric-86 之間保守的 150 個(gè)氨基酸的序列)。參見(jiàn) Ryan,A. K. &Rosenfeld,M. G Genes Dev.
(基因發(fā)育)11，1207-1225 (1997)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的Oct多肽家族成員諸如以上列出的那些或諸如在Genbank登記號(hào)NP_002692. 2(人0ct4)或NP_038661. 1(小鼠0ct4)中列出的相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85 %、90%或95 %的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如，Oct3/4)可以來(lái)自人、小鼠，大鼠，牛，豬，或其他動(dòng)物。通常，相同物種的蛋白將與該物種的被操作的細(xì)胞一起使用?！癒lf多肽”是指Krilppel樣因子(Klfs)家族的任一天然存在成員，含有與果蠅(Drosophila)胚胎模式調(diào)控子Kriippel類似的氨基酸序列的鋅指蛋白，或者與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比保留相似的例如至少50%、80%或90%的活性之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性的其變體，或至少包括天然存在的家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。參見(jiàn)，Dang, D. T. , Pevsner, J. &Yang, V. ff. . Cell Biol.(細(xì)胞生物學(xué))32，1103-1121 (2000)。示范性 Klf 家族成員包括 Klf 1，Klf2，Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6,Klf7,Klf8,Klf9,Klfl0,Klfll,Klfl2,Klfl3,Klfl4,Klfl5,Klfl6 和 Klfl7。發(fā)現(xiàn) Klf2 和 Klf-4是能夠在小鼠中產(chǎn)生iPS細(xì)胞的因子，并且相關(guān)的基因Klfl和Klf5也是如此，雖然效率降低。參見(jiàn),Nakagawa等,Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))26 :101-106 (2007)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Klf多肽家族成員諸如以上列出的那些或諸如在Genbank登記號(hào)CAX16088 (小鼠Klf4)或CAX14962 (人Klf4)中列出的相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klfl, Klf4，和Klf5)可以來(lái)自人、小鼠，大鼠，牛，豬，或其他動(dòng)物。通常，相同物種的蛋白將與該物種的被操作的細(xì)胞一起使用。就本文中描述的Klf多肽而言，其可以用雌激素相關(guān)受體β (Essrb)多肽替換。因此，意圖是對(duì)于本文中所述的各種Klf多肽實(shí)施方案，同等地描述使用Essrb替代Klf4多肽的對(duì)應(yīng)的實(shí)施方案?！癕yc多肽”是指Myc家族的任一天然存在成員(參見(jiàn),例如Adhikary, S. &Eilers,M. Nat. Rev. Mol Cell Biol.(自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述)6 :635-645 (2005))，或者與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比保留例如至少50 %、80 %或90 %的活性之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性的其變體，或至少包括天然存在的家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。示例性的Myc多肽包括，例如，c-Myc、N-Myc和L-Myc。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Myc多肽家族成員諸如以上列出的那些或諸如在Genbank登記號(hào)CAA25015(人Myc)中列出的相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85 %、90 %或95 %的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如，c-Myc)可以來(lái)自人、小鼠，大鼠，牛，豬，或其他動(dòng)物。通常,相同物種的蛋白將與該物種的被操作的細(xì)胞一起使用。就本文中描述的Myc多肽而言，其可以用Wnt多肽(例如Wnt3A(例如，ΝΡ_149122· I))或刺激Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的試劑(例如，糖原合成激酶α或β抑制劑)替換。因此，意圖是對(duì)于本文中所述的各種Myc多肽實(shí)施方案，同等地描述使用用fct多肽或刺激Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的試劑替代Myc多肽的對(duì)應(yīng)的實(shí)施方案。" Sox多肽"是指SRY相關(guān)HMG-盒(Sox)轉(zhuǎn)錄因子(其特征為存在高遷移率組(HMG)結(jié)構(gòu)域)的任一天然存在成員，或者與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比保留例如至少50 %、80 %或90 %的活性之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性的其變體，或至少包括天然存在的家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。參見(jiàn)，例如，Dang,D.T.等，Int. J. Biochem. Cell Biol. 32 :1103-1121 (2000)。示例性的 Sox 多肽包括，例如，Soxl, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, SoxlO, Soxll, Soxl2, Soxl3,Soxl4, Soxl5, Soxl7, Soxl8, Sox-21 和 Sox30。Soxl 已經(jīng)顯示以與 Sox2 相似的效率產(chǎn)生iPS細(xì)胞，并且基因Sox3，Soxl5和Soxl8也已經(jīng)顯示產(chǎn)生iPS細(xì)胞，盡管效率比Sox2稍低。參見(jiàn)，Nakagawa 等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))26 :101-106 (2007)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Sox多肽家族成員諸如以上列出的那些或諸如在Genbank登記號(hào)CAA83435 (人Sox2)中列出的相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85 %、90 %或95 %的氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如，Soxl, Sox2, Sox3, Soxl5或Soxl8)可以來(lái)自人、小鼠，大鼠，牛，豬，或其他動(dòng)物。通常，相同物種的蛋白將與該物種的被操作的細(xì)胞一起使用。"外源轉(zhuǎn)錄因子"當(dāng)用于本文中時(shí)是指不是天然地(即，內(nèi)源地)在目的細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。因此，外源轉(zhuǎn)錄因子可以從引入的表達(dá)盒中表達(dá)(例如，在除天然轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子的控制下)或者可以作為來(lái)自細(xì)胞外的蛋白引入。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包括Oct多肽(例如，0ct4)，Klf多肽(例如，Klf4)，Myc多肽(例如，c-Myc),或 Sox 多肽(例如，Sox2)。" H3K9"是指組蛋白H3賴氨酸9。與基因活性相關(guān)的H3K9修飾包括H3K9乙?；?，而與異染色質(zhì)相關(guān)的H3K9修飾包括H3K9雙甲基化或三甲基化。參見(jiàn)，例如，Kubicek等，Mol.Cell473-481(2007)。" H3K4"是指組蛋白 H3 賴氨酸 4。參見(jiàn)，例如，Ruthenburg·等，Mol. Cell25 :15-30(2007)。術(shù)語(yǔ)“多能”或“多能性”是指具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細(xì)胞，所述后代能夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞可以形成出生前、出生后或成年動(dòng)物的許多或全部組織。標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公認(rèn)測(cè)試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于確定細(xì)胞群的多能性，然而，不同多能干細(xì)胞特征的鑒定也可以用于檢測(cè)多能細(xì)胞?！岸嗄芨杉?xì)胞特征”是指將多能干細(xì)胞與其他細(xì)胞相區(qū)別的細(xì)胞特征。產(chǎn)生能夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)細(xì)胞譜系相關(guān)特征的細(xì)胞類型后代的能力是多能干細(xì)胞特征。表達(dá)或不表達(dá)某些分子標(biāo)記物組合也是多能干細(xì)胞特征。例如，人多能干細(xì)胞表達(dá)至少一種、兩種或三種，且任選地全部，來(lái)自以下非限制性列表的標(biāo)記物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP,Sox2、E-鈣黏著蛋白、UTF-I、0ct4，Rexl和Nanog。與多能干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)也是多能干細(xì)胞特征?！爸亟M”多核苷酸是不以其天然狀態(tài)存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸處于除其天然存在的背景以外的背景中，例如，與其在自然界中典型接近的核苷酸序列分開，或與其典型不接近的核苷酸序列相鄰(或相連)。例如，目的序列可以克隆至載體中，或否則與一種或多種另外的核酸重組?！氨磉_(dá)盒”是指包括與編碼蛋白的序列可操作連接的啟動(dòng)子或其他調(diào)控序列的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”和“表達(dá)控制序列”在本文中用于是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列陣列。用于本文中時(shí)，啟動(dòng)子包括接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的必需核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情形中，TATA元件。啟動(dòng)子還任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件，其可以位于距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)多至數(shù)千堿基對(duì)處。啟動(dòng)子包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。“組成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下處于活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下處于活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”是指核酸表達(dá)控制序列(諸如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。“異源序列”或“異源核酸”，用于本文中時(shí)，是來(lái)源于與特定宿主細(xì)胞異源的來(lái)源的序列或核酸，或如果來(lái)自相同來(lái)源，則由其初始形式進(jìn)行修飾。因此，細(xì)胞中的異源表達(dá)盒不是特定宿主細(xì)胞內(nèi)源的表達(dá)盒，例如通過(guò)與來(lái)自表達(dá)載體的核酸序列而非染色體DNA相連，與異源啟動(dòng)子相連，或與報(bào)道基因相連等。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換地用于指采用單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括包含已知的核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有與參考核酸類似的結(jié)合特性，且其以與參考核苷酸類似的方式代謝。所述類似物的實(shí)例包括，但不僅限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-甲基 核糖核酸、肽-核酸(PNAs)。除非另外指出，特定核酸序列還包括其保守修飾變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子置換可以通過(guò)產(chǎn)生這樣的序列來(lái)獲得，在所述序列中，一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)19 :5081 (1991) ；0htsuka等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell.Probes (分子細(xì)胞探針)8 :91-98 (1994))。表達(dá)或活性的“抑制劑”、“激活劑”和“調(diào)節(jié)劑”分別用來(lái)指利用用于所述靶蛋白的表達(dá)或活性的體外和體內(nèi)測(cè)定所鑒定的抑制分子、活化分子或調(diào)節(jié)分子，例如，配體、激動(dòng)齊 、拮抗劑、及其同系物和模擬物。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”包括抑制劑和激活劑。抑制劑是，例如，抑制表達(dá)或結(jié)合，部分或全部阻斷刺激或蛋白酶抑制劑活性，降低、防止、延遲活化，失活，去穩(wěn)定化，或下調(diào)所述靶蛋白活性的試劑，例如拮抗劑。激活劑是例如，誘導(dǎo)或活化所述靶蛋白表達(dá)或結(jié)合，刺激、增加、開放、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化或蛋白酶抑制劑活性，致敏或上調(diào)所述靶蛋白(或編碼多核苷酸)的活性的試劑，例如，激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑包括天然存在的和合成的配體，拮抗劑和激動(dòng)劑(例如，起激動(dòng)劑或拮抗劑功能的小化學(xué)分子、抗體等)。所述關(guān)于抑制劑和激活劑的測(cè)定包括，例如，將推定的調(diào)節(jié)劑化合物應(yīng)用到表達(dá)所述靶蛋白的細(xì)胞，然后確定對(duì)所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。將用潛在的激活劑、抑制劑、或調(diào)節(jié)劑處理的包含所述靶蛋白的樣品或測(cè)定與無(wú)抑制劑、激活劑、或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢驗(yàn)作用程度。對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)被賦予100%的相對(duì)活性值。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照為約80 %，任選50 %或25、10 %、5 %或I %時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的抑制。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照為約110%，任選150%，任選200,300%,400%，500%或1000-3000%或更高時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的活化。術(shù)語(yǔ)"變構(gòu)"用來(lái)指通過(guò)分子在酶的不同位置的不同位點(diǎn)(調(diào)節(jié)位點(diǎn))處的結(jié)合來(lái)影響酶的一部分(如活性位點(diǎn))的活性的作用。非底物分子在變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合影響底物結(jié)合(活性)位點(diǎn)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。"變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)"包含在許多酶和受體中。作為與變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)果，與正常配體的相互作用可能被增強(qiáng)或減弱。例如，3’-磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)中的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)是位于螺旋C、螺旋B以及-4和-5片之間的TOKl相互作用片段(PIF)結(jié)合口袋(Pearl 等，Curr. Opin. Struct. Biol. 12,761-767(2002) ；Biondi等，Biochem. J. 372，1-13(2003) ；Newton 等，Chem. Rev. 101，2353-2364 (2001))。當(dāng)用于本文中時(shí)，"促進(jìn)(promote)"或"增加(increase)"或者"促進(jìn)(promoting)"或"增加(increasing)"在本文中可互換地使用。這些術(shù)語(yǔ)是指與未處理的細(xì)胞(組織或?qū)ο?相比在處理的細(xì)胞(組織或?qū)ο?中所測(cè)參數(shù)(例如，活性、表達(dá)、糖酵解、糖酵解代謝、葡萄糖攝取、糖酵解的生物合成下游)的增加。也可以進(jìn)行相同細(xì)胞或組織或?qū)ο笤谔幚砬昂秃笾g的比較。增加足以被檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞相比，處理的細(xì)胞中的增加至少是約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,1倍、2倍、3倍、4倍或更多。當(dāng)用于本文中時(shí)，"抑制(inhibit)"、"防止(prevent)"或"降低(reduce)"或"抑制(inhibiting)"、"防止(preventing)"或"降低(reducing)"在本文中可互換地使用。這些術(shù)語(yǔ)是指與未處理的細(xì)胞(組織或?qū)ο?相比在處理的細(xì)胞(組織或?qū)ο?中所測(cè)參數(shù)(例如,活性、表達(dá)、線粒體呼吸、線粒體氧化、氧化磷酸化)的降低。也可以進(jìn)行相同細(xì)胞或組織或?qū)ο笤谔幚砬昂秃笾g的比較。降低足以被檢測(cè)。在一些實(shí)施 方案中，與未處理的細(xì)胞相比，處理的細(xì)胞中的減小至少是約10%、20%、30%、40%、50%、60%,70%,80%,90%或完全被抑制。在一些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞相比，在處理的細(xì)胞中被測(cè)量的參數(shù)是不可被檢測(cè)的(即，完全被抑制)。附圖簡(jiǎn)述圖I.通過(guò)單個(gè)基因、0CT4和小分子由初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。(a)用O. 5μΜ PD0325901(PD)和O. 5μΜ Α-83-01 (Α83)處理顯著改善由轉(zhuǎn)導(dǎo)有4TFs (4F, 0KSM)或3TFs(3F，OKS)的初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生iPSC。以100，000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞/IOcm皿的密度接種NHEK。(b)進(jìn)一步的化學(xué)篩選鑒定出可以基本上增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)有2TFs (OK)的初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞的重編程的PS48、NaB和它們的組合。以100，000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞/IOcm皿的密度接種NHEK。(c)由被單個(gè)重編程基因(0CT4)轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生人iPSC的實(shí)驗(yàn)方案。KCM，角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基；hESCM，人ESC培養(yǎng)基。(d)在挑取集落前用TRA-1-81對(duì)由轉(zhuǎn)導(dǎo)有2TFs/0K或1TF/0CT4的初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC集落進(jìn)行活體免疫染色。(e)建立的人iPSC-ΟΚ和iPSC-Ο細(xì)胞表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括ALP (堿性磷酸酶)，0CT4, S0X2, NANOG, SSEA-4和TRA-1-81。細(xì)胞核用DAPI染色。圖2.人iPSC-ΟΚ和iPSC-Ο細(xì)胞的深入特征。(a)通過(guò)RT-PCR對(duì)內(nèi)源多能性基因和外源0CT4和KLF4進(jìn)行表達(dá)分析。GAPDH用作輸入對(duì)照。(b)通過(guò)硫酸氫鹽基因組測(cè)序?qū)?CT4和NANOG啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化分析。開圓和閉圓分別指示啟動(dòng)子區(qū)域中未甲基化和甲基化的CpG。(c)比較iPSC-Ο細(xì)胞和NHEKs與hESCs之間的全局基因表達(dá)模式的散布圖。通過(guò)箭頭顯示多能性基因0CT4、NAN0G和S0X2的位置。黑線指示樣品之間基因表達(dá)水平的線性當(dāng)量和雙重改變。(d)使用EB方法，人iPSC-ΟΚ和iPSC-Ο在體外可以有效分化為三個(gè)胚層中的細(xì)胞，包括神經(jīng)外胚層細(xì)胞(β III微管蛋白+)，中胚層細(xì)胞(SMA+)和內(nèi)胚層細(xì)胞(AFP+)。(e)對(duì)通過(guò)使用EB方法來(lái)自分化的人iPSC的三個(gè)胚層標(biāo)記物外胚層(PAX6，β III微管蛋白)，中胚層(F0XF1，HAND1)和內(nèi)胚層(AFP，GATA6)進(jìn)行的定量PCR測(cè)試。數(shù)據(jù)顯示GAPDH歸一化的倍數(shù)相對(duì)于未分化的親本人iPSCs變化。(f)人iPSC-ΟΚ和iPSC_0可以在SCID小鼠中有效產(chǎn)生全畸胎瘤(fullteratoma)，其包含分化的三個(gè)胚層中的細(xì)胞。圖3.由人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)單個(gè)基因、0CT4和小分子產(chǎn)生和表征人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。(a)由被0CT4轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVECs產(chǎn)生人iPSCs的實(shí)驗(yàn)方案。HCM，HUVEC培養(yǎng)基；hESCM，人ESC培養(yǎng)基。(b)建立的來(lái)自HUVECs的hiPSC_0細(xì)胞表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括NANOG和SSEA-4。細(xì)胞核用DAPI染色。(c)通過(guò)RT-PCR對(duì)內(nèi)源多能性基因進(jìn)行表達(dá)分析。GAPDH用作輸入對(duì)照。(d)通過(guò)硫酸氫鹽基因組測(cè)序?qū)?CT4和NANOG啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化分析。開圓和閉圓分別指示啟動(dòng)子區(qū)域中未甲基化的和甲基化的CpGs。(e)使用EB方法，來(lái)自HUVECs的hiPSC-Ο細(xì)胞在體外可以有效分化為三個(gè)胚層中的細(xì)胞，包括神經(jīng)外胚層細(xì)胞(β III微管蛋白+)，中胚層細(xì)胞(SMA+)和內(nèi)胚層細(xì)胞(AFP+)。(f)hiPSC-O細(xì)胞可以在SCID小鼠中有效產(chǎn)生全畸胎瘤，其包含分化的三個(gè)胚層中的細(xì)胞。圖4.來(lái)自AHEKs的人iPSC-Ο細(xì)胞的表征。(a)建立的來(lái)自成人角質(zhì)形成細(xì)胞的hiPSC-Ο細(xì)胞表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括NANOG，S0X2和SSEA-4。細(xì)胞核用DAPI染色。(b)使用EB方法，這些hiPSC-Ο細(xì)胞可以在體外有效分化為三個(gè)胚層中的細(xì)胞，包括神經(jīng)外胚層細(xì)胞(β III微管蛋白+)，中胚層細(xì)胞(SMA+)和內(nèi)胚層細(xì)胞(AFP+)。圖5.來(lái)自AFDCs的人iPSC-Ο細(xì)胞的表征。(a)建立的來(lái)自源自羊水的細(xì)胞的hiPSC-Ο細(xì)胞表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括NANOG，S0X2和SSEA-4。細(xì)胞核用DAPI染色。
(b)使用EB方法，這些hiPSC-Ο細(xì)胞可以在體外有效分化為三個(gè)胚層中的細(xì)胞，包括神經(jīng)外胚層細(xì)胞(β III微管蛋白+)，中胚層細(xì)胞(SMA+)，和內(nèi)胚層細(xì)胞(AFP+)。圖6.另外的hiPSC細(xì)胞系表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物。其他所建立的hiPSC-Ο細(xì)胞系表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括NANOG和SSEA-4。細(xì)胞核用DAPI染色。圖7. hiPSC細(xì)胞系的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)物。hiPSC被分到涂布有Matrigel/ECM的平板上化學(xué)成分確定的hESC培養(yǎng)基中，如之前所報(bào)導(dǎo)的。這些hiPSC可以在無(wú)培養(yǎng)層環(huán)境中保持和擴(kuò)增。ICC顯示多能性標(biāo)記物0CT4和SSEA4的表達(dá)。細(xì)胞核用DAPI染色。圖8. hiPSCs的基因型分析。使用基因組DNA的RT-PCR分析顯示僅0CT4轉(zhuǎn)基因整合到 hiPSC-Ο 系(hiPSC-0#l，hiPSC-0#3，hiPSC-0#21, hiPSC-0#26 和 hiPSC_0#31)的基因組中。NHEKs (a)和HUVECs (b)用作陰性對(duì)照，而載體用作陽(yáng)性對(duì)照。圖9. 0CT4轉(zhuǎn)基因在hiPSCs中的整合。用EcoRI消化基因組DNA(10 μ g)并與0CT4cDNA探針(pSin-EF2-0CT4-Pur的EcoRI/Spel片段)雜交。檢測(cè)到多個(gè)轉(zhuǎn)基因整合。

圖10. hiPSC細(xì)胞系的核型分析。在第15次傳代后hiPSC_0#l (a)和hiPSC-0#21(b)的中期展開顯示正常的核型。圖11. PS48通過(guò)促進(jìn)朝向糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換增強(qiáng)重編程過(guò)程。(a)PS48處理活化I3DKl活性。在PS48(5yM)或UCN-Ol (20nM)處理后的Akt (Thr_308)的磷酸化的蛋白印跡分析。(b) PS48增強(qiáng)NHEKs的重編程，而UCN-Ol (PDKI抑制劑)或2-脫氧-D-葡萄糖(IOmM) (2-DG，糖酵解抑制劑)抑制重編程過(guò)程。三種因子(Klf，Sox和Oct)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NHEKs以100，000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞/孔的密度接種，用化合物處理四周，然后計(jì)數(shù)TRA-1-81陽(yáng)性集落。
(c)PS48處理促進(jìn)/激活向糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換，而UCN-Ol或2-DG的處理抑制糖酵解。NHEKs用PS48、PS48和UCN-Ol或者PS48和2-DG處理8天，然后通過(guò)使用Lactate Assay試劑盒(BioVision，Mountain View, CA，USA)測(cè)量培養(yǎng)基中的乳酸鹽生產(chǎn)量作為糖酵解的典型指標(biāo)。((1) 548處理上調(diào)若干重要糖酵解基因(包括61^11，皿2，？ 1(1和0)撤)的表達(dá)。(e)已知的已經(jīng)廣泛用于調(diào)節(jié)線粒體呼吸，糖酵解代謝或HIF活化的小分子也顯示對(duì)重編程的對(duì)應(yīng)的一致效果。轉(zhuǎn)導(dǎo)有四種因子(Klf，Sox，Myc和Oct)的HUVECs以20，000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞/孔的密度接種，用代謝調(diào)節(jié)化合物處理三周，并且計(jì)數(shù)TRA-1-81陽(yáng)性集落。F2，6P，IOmM果糖2，6- 二磷酸；F6P，IOmM果糖6-磷酸；6_AN，10 μ Μ6-氨基煙酰胺；0A，10 μ M草酸鹽；DNP，I μ M2，4- 二硝基苯酚；NOG, I μ M N-草酰甘氨酸；QC, I μ M槲皮素；2-ΗΑ, 10 μ M2-羥基戊二酸；ΝΑ，10 μ M煙酸；DMSO用作對(duì)照。發(fā)明詳述I.介紹本發(fā)明基于以下意外的發(fā)現(xiàn)，即3’-磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)激活劑極大地改善在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的效率。因此，本發(fā)明提供在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的方法，其中所述方法包括將非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑接觸。本發(fā)明還基于以下意外的發(fā)現(xiàn)，即本文所述的促進(jìn)糖酵解代謝的化合物極大地改善在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的效率。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物有助于從線粒體氧化(主要由成人體細(xì)胞使用)到糖酵解(主要由胚胎干細(xì)胞(ESCs)使用)的代謝重編程，由此在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。促進(jìn)糖酵解的化合物或抑·制或妨礙線粒體呼吸/氧化的化合物因此可用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。此夕卜，發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)糖酵解的上游(例如，PDKl通路，低氧誘導(dǎo)因子通路，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路)或下游(例如，脂肪酸合成，脂質(zhì)合成，核苷酸合成，和氨基酸合成)的化合物可以用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。因此，本發(fā)明提供在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的方法，其中所述方法包括將非多能細(xì)胞與如本文所述的促進(jìn)糖酵解代謝的一種或多種化合物接觸。至今，已經(jīng)建立大量不同方法和方案用于將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSCs)。據(jù)信，本文所述的試劑可以與基本上任何方案結(jié)合使用以用于產(chǎn)生iPSCs并由此改善該方案的效率。因此，本發(fā)明提供利用至少roKi激活劑(包括但不限于變構(gòu)的roKi激活劑)，與任何方案結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)非多能細(xì)胞從而產(chǎn)生iPSCs。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用至少促進(jìn)糖酵解代謝的化合物與任何方案結(jié)合來(lái)孵育非多能細(xì)胞從而產(chǎn)生iPSCs。當(dāng)用于本文中時(shí)，關(guān)于非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的"誘導(dǎo)效率"，是指在足以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的條件下，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為iPSCs的非多能細(xì)胞的數(shù)目，或?qū)⒁?guī)定數(shù)目的非多能細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs所需的時(shí)間。iPSC產(chǎn)生方案的效率的改善將取決于方案和本發(fā)明所用的試劑。在一些實(shí)施方案中，與在不包括本發(fā)明的試劑(例如，PDKl激活劑，例如，變構(gòu)的roKi激活劑，或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，例如，PDKl激活劑，糖酵解激活劑，糖酵解底物，糖酵解中間體及其它們的代謝前體，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活齊U，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑，如氧化磷酸化抑制劑，以及低氧誘導(dǎo)因子激活劑)的條件下的相同方案相比，效率改善了至少10%，20%，50%，75%，100%，150%，200%，300%或更多。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于在特定的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的iPSCs的數(shù)目的改善來(lái)測(cè)量效率(例如，通過(guò)比較在包括引入本發(fā)明的一種或多種試劑的條件下在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)由非多能細(xì)胞產(chǎn)生的iPSCs的數(shù)目和在不包括引入本發(fā)明的一種或多種試劑的條件下在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)由非多能細(xì)胞產(chǎn)生的iPSCs的數(shù)目)。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于產(chǎn)生iPSCs的速度的改善來(lái)測(cè)量效率(例如，通過(guò)比較在包括引入本發(fā)明的一種或多種試劑的條件下由非多能細(xì)胞產(chǎn)生規(guī)定數(shù)目的iPSCs所需的時(shí)間長(zhǎng)度和在不包括引入本發(fā)明的一種或多種試劑的條件下由非多能細(xì)胞產(chǎn)生規(guī)定數(shù)目的iPSCs所需的時(shí)間長(zhǎng)度)。在一些實(shí)施方案中，在包括用0ct4和Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)非多能細(xì)胞(例如，正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞)然后在存在或不存在本發(fā)明的一種或多種試劑(例如，roKi激活劑)的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的條件下測(cè)量誘導(dǎo)效率，如在以下實(shí)施例部分所述。由非多能細(xì)胞誘導(dǎo)iPSCs可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何方法測(cè)量，所述方法包括但不限于標(biāo)記物分析(例如，使用多能性標(biāo)記物Tra-l-81和/或0CT4)。根據(jù)本發(fā)明的方法，特殊的、依賴于環(huán)境的處理方式可以改善重編程效率。在一些實(shí)施方案中，特定處理方式的有效性可以取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞傳代數(shù)和使用的外源轉(zhuǎn)錄因子。例如，在一些實(shí)施方案中，與轉(zhuǎn)導(dǎo)有四種外源轉(zhuǎn)錄因子或與四種外源轉(zhuǎn)錄因子接觸的重編程細(xì)胞相比，當(dāng)重編程細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有或接觸少于四種外源轉(zhuǎn)錄因子(即，一種、兩種或三種外源轉(zhuǎn)錄因子)時(shí)，可以觀察到通過(guò)特定處理方式的重編程效率的更顯著的改善。通常，重編程人細(xì)胞所需的時(shí)間(例如，6_8周)比重編程小鼠細(xì)胞所需的時(shí)間(例如，約2周)顯著更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，如與小鼠細(xì)胞相比，當(dāng)重編程人細(xì)胞時(shí)，特定處理方式的效果可能更加顯著。因此，當(dāng)在重編程中使用相對(duì)較長(zhǎng)的周期(例如，至少3，4,5,6或更多周)時(shí)，可以使用處理方式，例如使用表觀遺傳修飾劑的處理方式，以改善重 編程效率。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾劑可以改善重編程效率。如本文中所定義的，術(shù)語(yǔ)"表觀遺傳修飾劑"是指甲基化修飾劑(即，將甲基化改變引入DNA或組蛋白的試齊IJ)和/或乙?；揎梽?即，將乙酰化改變引入DNA或組蛋白的試劑)。在一些實(shí)施方案中，甲基化修飾劑是DNA甲基化抑制劑(例如，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑如RG108))，組蛋白甲基化抑制劑和/或組蛋白去甲基化抑制劑。在一些實(shí)施方案中，乙酰化修飾劑是組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如，丙戊酸(VPA)，丁酸鈉(NaB)，曲古他汀A (TSA)，或辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA))，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)抑制劑，組蛋白脫乙酰酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶。在一些實(shí)施方案中，表觀遺傳修飾劑是抑制甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基酶的試劑或活化甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基酶的試劑。在一些實(shí)施方案中，表觀遺傳修飾劑是抑制組蛋白H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，例如，G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶如BIX01294。然而，一些表觀遺傳修飾劑也可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，表觀遺傳修飾劑僅在處理的早期階段使用，例如，在頭I、2、3或4周，在處理周期的前一半、前1/3、前四分之一或前1/5。通過(guò)在處理的后期階段省去表觀遺傳修飾劑，例如，在后1、2、3或4周，在處理周期的后一半、后1/3、后四分之一或后1/5，通過(guò)這些表觀遺傳修飾劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的副作用可以至少部分避免。備選地，可以使用不誘導(dǎo)分化或者僅最小化地誘導(dǎo)分化的表觀遺傳修飾劑。例如，當(dāng)在處理方式中使用HDAC抑制劑時(shí)，使用不誘導(dǎo)分化或僅最小化地誘導(dǎo)分化的HDAC抑制劑，例如，丁酸鈉。在本發(fā)明中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用MEK抑制劑的處理方式可以改善重編程效率。MEK抑制劑還支持誘導(dǎo)的多能細(xì)胞的細(xì)胞自更新。然而，一些MEK抑制劑可以抑制細(xì)胞增殖。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，MEK抑制劑僅在處理的后期階段使用，例如，在后1、2、3或4周，在處理周期的后一半、后1/3、后四分之一或后1/5。通過(guò)在處理的早期階段(例如，在頭1、2、3或4周，在處理周期的前一半、前1/3、前四分之一或前1/5)省去MEK抑制劑，細(xì)胞增殖在早期階段中不被抑制。例如，多能性可以通過(guò)以下方式誘導(dǎo)在較早階段將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞與I3DKl激活劑或與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物(例如，PDKl激活劑)在不存在MEK抑制劑的情況下接觸，之后在后期階段將非多能細(xì)胞與TOKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物(例如，I3DKl激活劑)以及MEK抑制劑接觸。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)多能性的方法包括在早期階段將非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物(例如，PDKl激活劑)、TGFi3受體/ALK5抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑接觸，之后在后期階段將非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物(例如，PDKl激活劑)、TGFii受體/ALK5抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和MEK抑制劑接觸。II. PDKl 激活劑3’ -磷酸肌醇依賴性激酶-I或"I3DKl "是與AKT/PKB和包括PKC、S6K、SGK在內(nèi)的許多其他AGC激酶的活化相關(guān)的主要激酶。PDKl的重要作用存在于由若干生長(zhǎng)因子和激素活化的信號(hào)傳導(dǎo)通路如胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中。TOKl的結(jié)構(gòu)可以劃分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域；激酶結(jié)構(gòu)域或者催化結(jié)構(gòu)域以及PH結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域主要在I3DKl與磷脂酰肌醇(3，4) - 二磷酸和磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸的相互作用中起作用，這在包括AKT在內(nèi)的一些膜相關(guān)I3DKl底物的定位和活化中是重要的。激酶結(jié)構(gòu)域具有三個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)；底物結(jié)合位點(diǎn)，ATP結(jié)合位點(diǎn)，和PIF結(jié)合口袋。包括S6K和蛋白激酶C在內(nèi)的若干TOKl底物需要在該P(yáng)IF結(jié)合 口袋處結(jié)合。PDKl的小分子變構(gòu)激活劑顯示選擇性地抑制需要對(duì)接位點(diǎn)相互作用的底物的活化。這些化合物不結(jié)合到活性位點(diǎn)并且允許TOKl活化不需要對(duì)接位點(diǎn)相互作用的其他底物。I3DKl具有組成型活性，并且目前沒(méi)有已知的TOKl的抑制蛋白。據(jù)信TOKl的主要效應(yīng)器AKT的活化需要激酶和TOKl的PH結(jié)構(gòu)域的合適定向以及AKT在膜處。依賴磷酸肌醇的激酶-I已經(jīng)顯示與以下各項(xiàng)相互作用361(，？1 1^04，鈉-氫交換調(diào)節(jié)輔助因子2，？1 此0，蛋白激酶 M ζ (PKMzeta)，ΡΚΝ2, PRKCI，蛋白激酶 NI, YffHAH 和 AKTI。不例性的F1DKl 激活劑包括鞘氨醇(King 等，Journal of BioIogicalChemistry,275 :18108-18113,2000)。示例性的PDKl的變構(gòu)激活劑包括PS48 ((Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸)，PS08 ((Z) -5- (4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸)(Hindie等，Nature Chemical Biology,5 :758-764,2009 ；Huse&Kuriyan, Celll09 :275-282,2002 ；Johnson&Lewis, Chem. Rev. 101 :2209-2242, 2001)，和化合物 I (2-(3-(4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸)(Engel 等，EMBO J. 25 =5469-5480, 2006) ;3，5- 二苯基戊-2-烯酸如化合物12Z和化合物13Z(12Z :2_ (3-(4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z)-5-(萘-2-基)-3-苯基戊-2-烯酸；13Z : (Z)-5-(1H-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸(Stroba 等，J. Med. Chem. 52，4683-4693 (2009))。PS48 具有下式
OH
PS48如在實(shí)施方案中所示，將roKi激活劑包括在細(xì)胞重編程中可以在單獨(dú)使用時(shí)極大地增加效率并且當(dāng)與HDAC抑制劑結(jié)合使用時(shí)導(dǎo)致甚至進(jìn)一步的效率提高。另外的抑制齊U，包括但不限于ALK5抑制劑和/或Mek抑制劑，如在實(shí)施例中所示，也可以包括在重編程中，尤其當(dāng)在重編程期間少于四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(0ct4，Klf4，Sox2和c-Myc)引入細(xì)胞中時(shí)。III.促進(jìn)糖酵解代謝的化合物如在本文中所定義，代謝調(diào)節(jié)化合物是指調(diào)節(jié)(例如，促進(jìn)或抑制)碳水化合物或其他分子代謝的化合物。代謝調(diào)節(jié)化合物包括促進(jìn)糖酵解代謝的化合物。如在本文中所定義，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是 指有助于從線粒體氧化(主要由成人體細(xì)胞細(xì)胞)到糖酵解(主要由ESCs使用)的細(xì)胞代謝重編程的化合物。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是促進(jìn)糖酵解的化合物或促進(jìn)糖酵解的過(guò)程上游(例如，TOKl通路，低氧誘導(dǎo)因子通路，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路)的化合物。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是抑制或妨礙線粒體呼吸的化合物。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是促進(jìn)糖酵解的過(guò)程下游(例如，脂肪酸合成，脂質(zhì)合成，核苷酸合成和氨基酸合成)的化合物。促進(jìn)糖酵解代謝的化合物的實(shí)例包括I3DKl激活劑，糖酵解激活劑，糖酵解底物，糖酵解中間體及其代謝前體，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑如氧化磷酸化抑制劑，和低氧誘導(dǎo)因子激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物不是單糖(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基中通常使用的單糖)。單糖的實(shí)例包括醛糖如D-葡萄糖，D-甘露糖和D-半乳糖，以及酮糖如D-果糖。I.糖酵解激活劑糖酵解激活劑(例如，糖酵解通路的激活劑)在本領(lǐng)域中是已知的。與糖酵解通路相關(guān)的酶在本領(lǐng)域中是已知的并且包括己糖激酶，葡糖激酶，磷酸葡糖異構(gòu)酶，磷酸果糖激酶，醛縮酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，甘油醛3-磷酸脫氫酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油變位酶，烯醇化酶，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶。在一些實(shí)施方案中，糖酵解激活劑(例如，糖酵解通路的激活劑)是與糖酵解通路相關(guān)的酶的激活劑。在一些實(shí)施方案中，糖酵解激活劑是與糖酵解通路唯一相關(guān)的三種特定酶(己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶)中的一種的激活劑。己糖激酶激活劑的實(shí)例包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、D-蘋果酸鹽、3-磷酸甘油酸鹽、兒茶酚胺和兒茶酚胺衍生物。在一些實(shí)施方案中，己糖激酶激活劑是變構(gòu)激活劑。在一些實(shí)施方案中，己糖激酶激活劑不包括磷酸鹽或檸檬酸鹽。葡糖激酶激活劑的實(shí)例包括GKAl (6-[(3-異丁氧基_5_異丙氧基苯甲酰)氨基]煙酸；Brocklehurst 等，Diabetes53 :535-541，2004)，GKA2 (5- ({3-異丙氧基 ~5~ [2- (3-噻吩基)乙氧基]苯甲酰}氨基)-1，3,4-噻二唑-2-羧酸；Brocklehurst等，Diabetes53 535-541,2004)，R0-28-1675(Grimsby 等，Science301 :370-373,2003)，和化合物A(N-噻唑-2-基-2-氨基-4-氟-5-(1-甲基咪唑-2-基)硫代苯甲酰胺；Kamata等，Structured, 429-438, 2004)，LY2121260 (2- (S)-環(huán)己基-I-(R) - (4-甲烷磺酰苯基)-環(huán)丙燒羧酸噻唑 _2_ 基酸胺；Efanov 等，Endocrinology, 146 :3696-3701, 2005)。在一些實(shí)施方案中，葡糖激酶激活劑是變構(gòu)激活劑。另外的葡糖激酶激活劑描述于W000/058293、W001/44216、W001/83465、W001/83478、W001/85706、W001/85707 和 W002/08209、W007/075847、W007/061923, W007/053345, W007/104034, W007/089512, W008/079787,W008/111473、W009/106203, W009/140624, W009/140624, W008/079787, W002/046173,W007/006814, W007/006760, W006/058923, W002/048106, W007/125103, W007/125105,W008/012227、W008/074694, W008/078674, W008/084043, W008/084044, W009/127544、W009/127546、W007/125103, W007/125105, W002/014312, W004/063179, W007/00676UW007/031739、W008/091770、W008/116107、W008/118718、W009/083553、W004/052869、W005/123132、W004/072066, W007/11738U W007/115967、W008/005964, W008/154563、W009/022179、W009/046784、W008/005964、TO/10/080333、TO/03/095438、W0/06/016194、W0/05/066145、W0/07/115968、W0/07/143434、W0/08/005914、W0/08/149382、W0/09/018065、 W0/09/047798、 W0/09/046802、 W0/10/029461、 W0/08/005914、W0/08/149382、W0/07/143434、W0/10/103438, W0/03/047626、W0/05/095418,TO/08/104994、TO/09/082152、TO/09/082152、TO/05/049019、TO/07/048717、W0/09/042435和 TO/09/042435 中。磷酸果糖激酶(或果糖-6-P激酶)激活劑的實(shí)例包括果糖2，6- 二磷酸。
丙酮酸激酶激活劑的實(shí)例包括木酮糖5-P，神經(jīng)酰胺，Al腺苷受體的激動(dòng)劑如N-6-環(huán)戊基腺苷。另外的丙酮酸激酶激活劑在W010/042867，W010/042867, W099/048490和TO09/025781中公開。磷酸葡糖異構(gòu)酶激活劑，醛縮酶激活劑，甘油醛3P脫氫酶激活劑，磷酸丙糖異構(gòu)酶激活劑，磷酸甘油酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶和乳酸脫氫酶的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的。2.糖酵解底物糖酵解底物的實(shí)例包括葡萄糖6-磷酸，果糖6-磷酸，果糖1，6- 二磷酸，甘油醛
3-磷酸，1,3- 二磷酸甘油酸，3-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物不是單糖(例如，葡萄糖)。3.糖酵解中間體及其代謝前體糖酵解中間體都不同地被用于其他重要分子如脂肪酸，脂質(zhì)，核苷酸和氨基酸的生物合成。因此，如在本文中所定義，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物包括促進(jìn)糖酵解的下游過(guò)程(例如，脂肪酸合成，脂質(zhì)合成，核苷酸合成和氨基酸合成)的化合物。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物包括糖酵解中間體，例如，在這些下游生物合成通路中使用的糖酵解中間體。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物包括糖酵解中間體的代謝前體。如在本文中所定義，術(shù)語(yǔ)"代謝前體"是指例如在細(xì)胞、組織或人體中代謝轉(zhuǎn)化為糖酵解中間體的化合物。糖酵解中間體的實(shí)例包括葡萄糖6-磷酸，果糖6-磷酸，果糖I，6- 二磷酸，二羥丙酮磷酸，甘油醛3-磷酸，I，3-雙磷酸甘油酸，3-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸，磷酸烯醇丙酮酸，草酰乙酸鹽，丙酮酸鹽及其代謝前體。在一些實(shí)施方案中，糖酵解中間體是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是NADH的代謝前體。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是煙酸或煙酰胺。4.葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑如在本文中所定義，術(shù)語(yǔ)"葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑"是指刺激或以其他方式促進(jìn)葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或活性的化合物。如在本文中所定義，術(shù)語(yǔ)"葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白"是指將化合物(葡萄糖，葡萄糖類似物，其他糖如果糖或肌醇，或非糖類如抗壞血酸)運(yùn)輸通過(guò)細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，并且基于結(jié)構(gòu)相似性(例如，與其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源性)其是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白"家族"成員。如在本文中所定義，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還包括具有不同于葡萄糖的初級(jí)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUTS主要是果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且據(jù)報(bào)道以低的親和性轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖本身。相似地，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMIT的初級(jí)底物是肌醇(糖醇)。當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白"包括果糖和肌醇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的實(shí)例包括選自GLUT1-12、HMIT和SGLT1-6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑的實(shí)例包括胰島素，松醇(參見(jiàn)，例如，W0/2000/071111), 8-溴-環(huán) AMP (參見(jiàn)，例如，Ogura 等,Journal ofEndocrinology, 164 171-178,2000)，花生四烯酸(Fong 等，CellularSignalling,8 :179-183，1996)，佛波酯如12-0-四-癸?；?佛波醇13-乙酸酯(參見(jiàn)，例如，Molecular Brain Research, 15 221-226，1992)。5.線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑(氧化磷酸化抑制劑)·如在本文中所定義，術(shù)語(yǔ)"線粒體呼吸"或"線粒體氧化"是指線粒體內(nèi)部底物分子(例如，糖、有機(jī)酸、丙酮酸鹽等)的氧化。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。能夠影響線粒體呼吸/氧化程度的化合物本文中通常稱為"線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑"或其他類似的術(shù)語(yǔ)。在一些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的方法的線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是抑制或妨礙線粒體呼吸或線粒體氧化的化合物。在一些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的方法的線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑。本發(fā)明的氧化磷酸化抑制劑可以是一種或多種氧化磷酸化酶的任何抑制劑或氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。氧化磷酸化酶在本領(lǐng)域中是已知的并且包括酶復(fù)合物I (NADH輔酶Q還原酶)，II (琥珀酸-輔酶Q還原酶)，III (輔酶Q細(xì)胞色素C還原酶)，IV(細(xì)胞色素氧化酶)和V (R)-Fl，ATP合成酶)。酶復(fù)合物I的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種并且可以包括，但不限于以下任一種三苯甲基硫代丙氨酸(tritylthioalanine),洋紅霉素,和哌嗪二酮,魚藤酮,戍巴比妥，I-甲基4-苯基吡啶鐐丨(MPP+)，百草枯(paraquat)，亞甲基藍(lán)，和鐵氰化物(后2種是電子受體)。酶復(fù)合物II的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種。輔酶Q的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種。酶復(fù)合物III的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種并且可以包括，但不限于黏硫菌素，抗霉素A,泛半醌,細(xì)胞色素C, 4,6-二氨基三嗪衍生物，甲氨蝶呤(metothrexate)或電子受體如吩嗪甲基硫酸酯和2，6- 二氯苯酚-靛酚。酶復(fù)合物IV的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種并且可以包括，但不限于氰化物，硫化氫，疊氮化物，甲酸酯，膦，一氧化碳和電子受體鐵氰化物。酶復(fù)合物V的抑制劑是本領(lǐng)域中已知的任一種并且可以包括，但不限于2-羥基戊二酸，VM-26(4/ -去甲-表鬼臼毒噻吩亞甲基糖苷)，三苯甲基硫代丙氨酸，洋紅霉素，哌嗪二酮，二硝基苯酚，二硝甲酚，2-羥基-3-烷基-I，4-萘醌，誘凋亡菌素糖苷配基(aglycone),寡霉素,奧薩霉素,胞變霉素(cytovaricin),萘醌衍生物(例如,二氯烯丙基-散沫花醌和拉帕醇)，羅丹明，羅丹明123，羅丹明6G，羰基氰化對(duì)三氟甲氧基苯腙，rothenone,番紅0，環(huán)己錫，DDT，十氯酮，砷酸鹽，五氯苯酚，芐腈，噻二唑除草劑，水楊酸鹽，陽(yáng)離子兩親藥物(胺碘酮(amiodarone),哌克昔林(perhexiline)),短桿菌肽,卡西霉素，五氯丁二烯基-半胱氨酸(PCBD-cys)，和三氟羰基氰化苯腙(FCCP)。氧化磷酸化的其他抑制劑可以包括蒼術(shù)苷，DDT,游離脂肪酸,溶血磷脂(Iysophospholipids), η-乙基馬來(lái)酰亞胺，mersanyl和對(duì)苯醌。氧化磷酸化解偶聯(lián)劑是指充當(dāng)從電子傳遞的氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑的化合物。氧化磷酸化解偶聯(lián)劑的實(shí)例包括，但不限于，DNP，5-氯-3-叔丁基-2'-氯-4'-硝基水楊酰苯胺(3-13)，2，3，4，5，6-五氯酚鈉(PCP)，4，5，6，7-四氯-2-(三氟甲基)-IH-苯并咪唑(TTFB)，氟滅酸(2-[3-(三氟甲基)苯胺基]苯甲酸)，3，5-二叔丁基-4-羥基-苯亞甲基丙二腈(SF6847)，羰基氰化間氯苯腙(CCCP)，羰基氰化對(duì)[三氟甲氧基]-苯腙(FCCP)JPα-(苯腙基)苯基乙腈衍生物.苯基乙腈衍生物；和弱酸，包括弱酸性酚類，苯并咪唑，N-苯基鄰氨基苯甲酸鹽，水楊酰苯胺，苯腙，水楊酸，?；?-硫代肼基甲酸鹽，香豆素，和芳香胺。6.低氧誘導(dǎo)因子激活劑 低氧誘導(dǎo)因子通路的激活劑是本領(lǐng)域中已知的并且包括生物堿和其他氨基酸衍生物，HIF天冬酰胺酰羥化酶(抑制因子的HIF或FIH)和HIF脯氨酰羥化酶(HPH或PHD)的抑制劑，糖原合成酶激酶3 β (GSK3 β )的抑制劑，氧化氮(NO)供體，微管解聚劑(MDA)，酚類化合物，萜烯/類固醇，和前列腺素E2(PGE2)。生物堿和其他氨基酸衍生物的實(shí)例包括去鐵胺和去鐵-鐵外螯合素DFE722SM，環(huán)吡酮胺[Loprox ，6-環(huán)己基-I-羥基-4-甲基-2 (IH)-吡啶酮2-氨基乙醇]，和8-甲基-pyridoxatin。糖原合成酶激酶3 β (GSK3 β )的抑制劑的實(shí)例包括靛玉紅，靛玉紅的衍生物如5-碘靛玉紅-3' 虧和5-甲基靛玉紅-3 '-肟。氧化氮(NO)供體的實(shí)例包括S-亞硝基-N-乙?；?D，L-青霉胺(SNAP)，3-(羥基-1-(1-甲基乙基)-2-亞硝基肼基)-1_丙胺(N0C5)，二氮烯-I-鐐_1，2_ 二醇(N0C-18)，S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)，精胺NONOate (NO與天然產(chǎn)物精胺的復(fù)合物)，二乙胺NONOate，和二乙基酪胺NONOate。微管解聚劑(MDA)的實(shí)例包括植物生物堿長(zhǎng)春堿，秋水仙素，和合成的MDA如諾考達(dá)唑。酚類化合物的實(shí)例包括二苯甲酰甲烷(DBM)，黃酮類槲皮素(3，3'，4'，5，7-五羥黃酮)，(-)-表兒茶素-3-五倍子酸鹽(ECG)，和(-)-表掊兒茶素-3-五倍子酸鹽(EGCG)。職烯和類固醇的實(shí)例包括倍半職-托酹酮(例如,pycnidione,epolone A和印olone B)，4-羥基雌二醇(4-0HE2)，二氫睪酮，甲基三烯甘油酯(R1881)，和半萜酯佛波醇12-0-十四酸酯13-乙酸酯(PMA，也被稱為12-0-十四烷酰佛波醇13-乙酸酯或TPA)。HIF天冬酰胺酰羥化酶(抑制因子的HIF或FIH)和HIF脯氨酰羥化酶(HPH或PHD)的抑制劑的實(shí)例包括2-酮戊二酸(20G)的類似物如N-草酰甘氨酸(5，NOG)，NOG的酯衍生物(例如，DMOG (二甲基-草酰甘氨酸))，N- ((3-羥基-6-氯喹啉-2-基)羰基)-甘氨酸，3-羥基吡啶-2-羰基-甘氨酸，3,4- 二羥苯甲酸酯，吡啶_2，5-草酸酯，吡啶-2，4-草酸酯，N-草酰-2S-丙氨酸,20G的其他類似物,如在Mole等，Bioorg Med Chem Lett. 13 2677-80, 2003中描述的，丙氨何普菌素和去丙氨酰丙氨何普菌素(dealanylalahopcin),去丙氨酰丙氨何普菌素類似物3-羰基亞甲基N-羥基琥珀酰亞胺，3-羰基-N-羥基吡咯烷酮，I-含羞草素(L-Mim)，3，4-二羥基苯甲酸乙酯(3，4_DHB)，和6-氯-3-羥基喹啉-2-碳酸-N-羰基甲基胺(S956711)。另外的HIF天冬酰胺酰羥化酶和HIF脯氨酰羥化酶抑制劑描述于，例如，Ivan 等，Proc Natl Acad Sci USA99 :13459-13464，2002，W003/049686,W003/080566，和 W006/084210，W010/056767。
HIF通路的其他激活劑包括離子螯合劑(例如，去鐵胺，2，2'-吡啶基，1，10-鄰二氮雜菲，Ca2+螯合劑BAPTA(I，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸)，過(guò)度金屬(例如，鈷，鎳，鉻(VI)，和銅)，有機(jī)汞化合物汞撒利(mersalyl)，和FG-0041 (在結(jié)構(gòu)上與1，10-鄰二氮雜菲相關(guān)的化合物)。HIF通路的其他激活劑包括上調(diào)HIF-I翻譯的蛋白質(zhì)。蛋白激酶C(PKC)提高HIF-I α轉(zhuǎn)錄的速率并且在磷脂酰肌醇3-激酶(ΡΙ3Κ)通路中起作用，這同樣增強(qiáng)HIF-I α翻譯。PKC通路激活S6核糖體蛋白的表達(dá)，該蛋白特異性地識(shí)別mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如HIF-I α。經(jīng)由S6蛋白在正常氧含量條件中的磷酸化，HIF-I a mRNA翻譯的速率可以被極大提高，從而有效地對(duì)抗該亞基的蛋白酶體降解的效果并且增加HIF-I復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的水平。PI3K通路已經(jīng)被鑒定為多種調(diào)節(jié)物(如脂多糖)的初級(jí)手段，影響HIF-Ια在脈管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的活化(Dery 等，Int J Biochem Cell Bio. 37 :535_540，2004 ;Page 等，JBiol Chem. 277 :48403-48409,2002)。
·
來(lái)源于巨噬細(xì)胞的肽PR39已經(jīng)顯示為通過(guò)降低其降解來(lái)穩(wěn)定HIF-I α，導(dǎo)致脈管結(jié)構(gòu)在體外的加速形成和小鼠中增加的心肌脈管系統(tǒng)(Li等，NatMed6 :49-55. 2000)。HIF-I的直接誘導(dǎo)已經(jīng)通過(guò)使用阻斷VHL介導(dǎo)的降解的ODDD多肽的N端或C端來(lái)實(shí)現(xiàn)(Maranchie 等，Cancer Celll:247-255,2002) HIF通路激活劑還包括其他非缺氧生理刺激如生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，和激素。激活HIF通路的生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括胰島素類生長(zhǎng)因子(IGF)-I和IGF-2，IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)-2和IGFBP-3，EGF，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，和調(diào)蛋白。激活HIF通路的細(xì)胞因子的實(shí)例包括腫瘤壞死因子a (TNFa)，白介素-1β (IL_1 β )，和IL_1。激活HIF通路的激素的實(shí)例包括脈管激素血管緊張素II和凝血酶，甲狀腺激素和卵泡刺激激素。其他生理因子如氧化還原蛋白硫氧還蛋白-I (Trx-I)和氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)也可以誘導(dǎo)HIF-I α蛋白并激活HIF-I。7. PDKl 激活劑在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。示例性的TOKl激活劑描述于本文之前的部分II中。IV. HDAC 抑制劑示例性的HDAC抑制劑可以包括結(jié)合其顯性陰性變體的抗體，以及靶向HDAC的siRNA和反義核酸。HDAC抑制劑包括，但不限于，TSA (曲古他汀A)(參見(jiàn)，例如，Adcock, British Journal of Pharmaco logy 150 :829-831(2007)), VPA(丙戍酸)(參見(jiàn)，例如，Munster 等，Journal of Clinical 0ncology25 :18S (2007) :1065), 丁酸鈉(NaBu)(參見(jiàn)，例如，Han 等，ImmunoIogyLetters 108 143-150 (2007))，SAHA (辛二酸苯胺異輕月虧酸或伏林司他(vorinostat))(參見(jiàn)，例如，Kelly 等，Nature Clinical Practice0ncology2 150-157 (2005))，苯基丁酸納鹽(參見(jiàn)，例如，Gore 等，Cancer Research66 6361-6369(2006))，縮肽(FR901228, FK228)(參見(jiàn)，例如，Zhu 等，CurrentMedicinalChemistry3 (3) :187-199 (2003)),特拉抱星(trapoxin) (TPX)(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)urumai 等，PNAS98(1) :87-92 (2001))，含環(huán)氧肟酸的肽 I(CHAPl)(參見(jiàn)，F(xiàn)urumai，同上)，MS-275 (參見(jiàn)，例如，Carninci等，W02008/126932，其通過(guò)引用結(jié)合于此))，LBH589 (參見(jiàn)，例如，Goh等，W02008/108741，其通過(guò)引用結(jié)合于此)和PXD101 (參見(jiàn)，Goh，同上)。通常在整體水平，多能細(xì)胞具有更多的組蛋白乙?；?，而分化的細(xì)胞具有較少的組蛋白乙?；＝M蛋白乙?；采婕敖M蛋白和DNA甲基化調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，HDAC抑制劑促進(jìn)沉默的多能性基因的活化。V.ALK5 抑制劑TGF^受體(例如，ALK5)抑制劑可以包括與其顯性陰性變體結(jié)合的抗體，以及抑制TGFii受體(例如，ALK5)表達(dá)的反義核酸。示例性的TGFii受體/ALK5抑制劑包括，但不限于，SB431542 (參見(jiàn)，例如，Inman 等，Molecular Pharmacology62 (I)65-74 (2002))，A-83-01，也被稱為3- (6-甲基_2_吡啶基)-N-苯基-4- (4-喹啉基)-IH-吡唑-I-碳硫酰胺(參見(jiàn)，例如，Tojo 等，Cancer Science96 (11) :791-800 (2005)，并且可以商購(gòu)自例如，ToicrisBioscience) ；2~ (3~ (6~ 甲基批 P定 ~2~ 基)-IH-批唑 ~4~ 基)-I,5-萘啶，Wnt3a/BI0 (參見(jiàn)，例如，Dalton等，W02008/094597，其通過(guò)引用結(jié)合于此)，BMP4(參見(jiàn)，Dalton,同上)，GW788388 (-{4_[3_(吡啶-2-基)_1H_ 吡唑-4-基]吡 啶-2-基}-N-(四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(參見(jiàn)，例如，Gellibert等，JournalofMedicinal Chemistry49 (7) :2210-2221(2006)), SM16(參見(jiàn)，例如，Suzuki 等,Cancer Research67 (5) :2351-2359 (2007))，IN-1130 (3- ((5- (6-甲基吡啶 _2_ 基)-4-(喹噁啉-6-基)-IH-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(參見(jiàn)，例如，Kim等，Xenobiotica38(3)325-339 (2008))，GW6604 (2-苯基 ~4~ (3-吡啶-2-基-IH-吡唑 ~4~ 基)吡啶)(參見(jiàn)，例如，de Gouville 等，Drug News Perspectivel9 (2) :85-90 (2006)), SB-505124 (2-(5-苯并[1，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽)(參見(jiàn)，例如，DaCosta 等，MolecularPharmacology65 (3) :744-752 (2004))和卩密 P定衍生物(參見(jiàn)，例如，列于Stiefl等，W02008/006583(通過(guò)引用結(jié)合于此)中的那些)，SU5416 ；2-(5-苯并[1，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽(SB-505124);樂(lè)地單抗(Ierdelimumb) (CAT-152);美替木單抗(metelimumab) (CAT-192)；GC-1008 ；ID11 ；AP-12009 ;AP_11014 ；LY550410 ；LY580276 ；LY364947 ；LY2109761 ；SB-505124 ； SB-431542 ;SD_208 ；SM16 ;NPC_30345 ；Ki26894 ； SB-203580 ;SD_093 ；Gleevec ；3，5，7，2'，4'-五羥黃酮(Morin);活化素-M108A ;P144 ;和可溶性TBR2_Fc (參見(jiàn)，例如，Wrzesinski 等,Clinical Cancer Researchl3 (18) :5262-5270(2007) ;Kaminska 等,ActaBiochimica Polonica52 (2) :329-337(2005)；和 Chang 等，F(xiàn)rontiersin Biosciencel2 4393-4401(2007))。此外，雖然"ALK5抑制劑"不意在涵蓋非特異性的激酶抑制劑，但是"ALK5抑制劑"應(yīng)當(dāng)被理解為涵蓋除了 ALK5外還抑制ALK4和/或ALK7的抑制劑，如，例如，SB-431542 (參見(jiàn)，例如，Inman 等，J，Mol. Phamacol. 62 (I) :65-74 (2002)。不意在限制本發(fā)明的范圍，據(jù)信，ALK5抑制劑影響間充質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)變(MET)過(guò)程。TGFii/活化素通路是上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)驅(qū)動(dòng)物。因此，抑制TGFB/活化素通路可以促進(jìn)MET (即，重編程)過(guò)程。考慮到本文中顯示抑制ALK5的效果的數(shù)據(jù)，據(jù)信，TGF0/活化素通路的抑制將具有相似效果。因此，TGFii/活化素通路的任何抑制劑(例如，上游或下游)可以用于結(jié)合，或代替，本文中每一段所述的ALK5抑制劑。示例性的TGFii /活化素通路抑制劑包括但不限于TGF0受體抑制劑，SMAD2/3磷酸化抑制劑，SMAD2/3與SMAD4相互作用抑制劑，以及SMAD6和SMAD7的激活劑/激動(dòng)劑。此外，以下所述的分類僅出于組織目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道化合物可以影響通路中的一點(diǎn)或多點(diǎn)，并且因此化合物可以作用于超過(guò)一種的所限定的分類。SMAD2/3磷酸化的抑制劑可以包括與其顯性陰性變體結(jié)合的抗體，以及靶向SMAD2或SMAD3的反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括HH69316 ；SB203580 ；SB-431542 ；1^364947 ^77-014^3,5,7,2'，4'-五羥黃酮(Morin)。參見(jiàn)，例如，Wrzesinski，同上;Kaminska,同上；Shimanuki,等，0ncogene26 :3311-3320(2007);和 Kataoka 等，EP1992360,上述文獻(xiàn)中的每個(gè)的內(nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合于此。SMAD2/3和SMAD4相互作用的抑制劑可以包括與其顯性陰性變體結(jié)合的抗體，以及靶向SMAD2，SMAD3和/或SMAD4的反義核酸。SMAD2/3和SMAD4的相互作用的抑制劑的具體實(shí)例包括，但不限于，Trx-SARA, Trx-xFoxHlb和Trx-Lefl.(參見(jiàn),例如，Cui等，0ncogene24 :3864-3874(2005)以及 Zhao 等，Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831(2006).) SMAD6和SMAD7的激活劑/激動(dòng)劑包括，但不限于，與其顯性陰性變體結(jié)合的抗體，以及靶向SMAD6或SMAD7的反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括，但不限于，smad7-as PTO-寡核苷酸。參見(jiàn)，例如，Miyazono 等，US6534476，和 Steinbrecher 等，US2005119203，這兩篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合于此。VI. MEK 抑制劑MEK的抑制劑可以包括針對(duì)其顯性陰性變體的抗體，以及抑制MEK表達(dá)的siRNA和反義核酸。MEK抑制劑的具體實(shí)例包括，但不限于，PD0325901,(參見(jiàn)，例如，Rinehart,等，Journal of Clinical 0ncology22 :4456-4462 (2004)), PD98059 (可獲得自，例如，Cell Signaling Technology), U0126 (可獲得自，例如，Cell Signaling Technology),SL327 (可獲得自，例如，Sigma-Aldrich), ARRY-162 (可獲得自，例如，Array Biopharma),PD184161(參見(jiàn)，例如，Klein 等，Neoplasia8 :1-8 (2006))，PD184352 (CI-1040)(參見(jiàn)，例如，Mattingly 等，The Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics316 456-465 (2006))，舒尼替尼(sunitinib)(參見(jiàn)，例如，Voss 等，US2008004287，其通過(guò)引用結(jié)合于此)，索拉非尼(sorafenib)(參見(jiàn)，Voss supra),凡德他尼(Vandetanib)(參見(jiàn)，Voss,同上)，帕唑帕尼(pazopanib)(參見(jiàn),例如，Voss,同上),阿昔替尼(Axitinib)(參見(jiàn)，Voss，同上)和PTK787(參見(jiàn)，Voss，同上)。目前，若干MEK抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)估。CI-1040已經(jīng)在對(duì)癌癥的I期和II期臨床試驗(yàn)中得到評(píng)估(參見(jiàn)，例如，Rinehart等,Journal ofClinical 0ncology22 (22)4456-4462 (2004))。臨床試驗(yàn)中評(píng)估的其他MEK抑制劑包括HH84352 (參見(jiàn)，例如，Engl ish等，Trends in PharmaceuticalSciences23(I) :40-45(2002)), BAY43-9006(參見(jiàn)，例如，Chow 等，Cytometry(Communications in Clinical Cytometry) 46 :72-78 (2001)),PD-325901 (也被稱為 PD0325901)，GSKl 120212，ARRY-438162，RDEAl 19，AZD6244(也被稱為ARRY-142886 或 ARRY-886)，R05126766, XL518 和 AZD8330 (也被稱為 ARRY-704)。參見(jiàn)，例如，來(lái)自國(guó)立衛(wèi)生研究院(Naional Institutesof Health)在萬(wàn)維網(wǎng)(World Wide Web)于clinicaltrials. gov的信息以及來(lái)自國(guó)立癌癥研究院(Naional Cancer Institute)在萬(wàn)維網(wǎng)于 cancer, gov/clinicaltrials 的信息。VII.重編程
至今，已經(jīng)建立大量不同方法和方案用于誘導(dǎo)非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞成為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSCs)。通過(guò)畸胎瘤形成和嵌合體分布判斷，iPSC在形態(tài)學(xué)、增殖和多能性方面類似于ESCs。據(jù)信，PDKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物(例如，PDKl激活劑)，任選結(jié)合HDAC抑制劑，并且任選ALK5抑制劑和任選MEK抑制劑，將基本上改進(jìn)用于產(chǎn)生iPSCs的任何重編程方案。據(jù)信可以改進(jìn)的重編程方案包括那些，其涉及誘導(dǎo)選自O(shè)ct多肽(包括但不限于0ct3/4)，SoX多肽(包括但不限于Sox2)，Klf多肽(包括但不限于Klf4)和/或Myc多肽(包括但不限于c-Myc)的一種或多種重編程轉(zhuǎn)錄因子。因此，在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括這樣的條件，其中選自O(shè)ct多肽(包括但不限于0ct3/4)，SoX多肽(包括但不限于Sox2)，Klf多肽(包括但不限于Klf4)和/或Myc多肽(包括但不限于c-Myc)的一種或多種重編程轉(zhuǎn)錄因子被引入到細(xì)胞中。如在實(shí)施例中所述，PDKl激活劑已經(jīng)顯示利用少至一種重編程轉(zhuǎn)錄因子(例如，僅0ct4)改善重編程。因此，在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括這樣的條件，其中一種重編程轉(zhuǎn)錄因子(例如，僅0ct4)被引入到細(xì)胞中。
在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括將重編程因子引入到細(xì)胞，例如，通過(guò)從已經(jīng)被引入到目標(biāo)細(xì)胞中的重組表達(dá)盒表達(dá)，或者通過(guò)在外源重編程轉(zhuǎn)錄因子多肽存在的情況下孵育細(xì)胞以使多肽進(jìn)入細(xì)胞。研究表明利用在ESCs中高表達(dá)的四種轉(zhuǎn)錄因子(0ct-3/4，Sox2, KLF4和c_Myc)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞。參見(jiàn)，Takahashi,K.和 Yamanaka，S. Cell (細(xì)胞)126，663-676 (2006) ；0kita, K·，Ichisaka, T.和Yamanaka, S. Nature448,313-317 (2007) ；ffernig, Μ.等 Nature448，318-324 (2007)；Maherali, N.等 Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)I, 55-70 (2007) ；Meissner, A. , ffernig,M. &Jaenisch, R. NatureBiotechnol. 25,1177-1181 (2007) ；Takahashi, K.等 Cell (細(xì)胞)131,861-872(2007) ；Yu, J.等 Science318,1917-1920(2007) ；Nakagawa, M.等 NatureBiotechnol. 26,101-106 (2007) ；ffernig, M. , Meissner, A. , Cassady, J. P. &Jaenisch,R-Cell Stem Cell.(細(xì)胞干細(xì)胞)2，10-12 (2008)。研究還證明了利用在ESCs中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的人體細(xì)胞的重編程Hockemeyer等Cell Stem Cell.(細(xì)胞干細(xì)胞)11 ;3(3) :346-53(2008) ；Lowry 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 105(8) :2883-8(2008)；Park 等 Nature. 10 ;451 (7175) 141-6 (2008) ；Nakagawa 等 Nat Biotechnol.Jan ；26(1) :101-6(2008) ;Takahashi 等 Cell.(細(xì)胞) 131 (5) :861-72(2007)；和 Yu 等Science. 318(5858) =1917-20(2007)。據(jù)信這些方法可以通過(guò)包括I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的更多的化合物中的一種(例如，PDKl激活劑)以及任選如本文所述的其他試劑而得到改善。為了解決靶細(xì)胞基因組承載整合的外源序列而帶來(lái)的安全問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)一步開發(fā)了多種改進(jìn)的遺傳方法并且可以根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用。這些方法以潛在減小的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，并且包括用以遞送重編程基因的非整合的腺病毒(Stadtfeld，Μ.等
(2008)Science322，945-949)，重編程質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Okita,K.等(2008) Science322,949-953)，piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(Woltjen，K.等(2009) · Nature458，766-770，Yusa 等
(2009)Nat. Methods6 :363-369, Kaji, K.等(2009) Nature458, 771-775), Cre-可切除病毒(Soldner，F(xiàn).等(2009)Celll36，964-977)，和基于 oriP/EBNAl 的游離型表達(dá)系統(tǒng)(Yu,J.等(2009)Science DOI :10. 1126);以上每篇文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用完整地結(jié)合于此。因此，在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括這樣的條件，其中根據(jù)上述任一種方法通過(guò)非整合腺病毒，重編程質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，re-可切除病毒(Soldner,F.等(2009) Cell (細(xì)胞)136，964-977)，和 / 或基于 oriP/EBNAl 的游離型表達(dá)系統(tǒng)來(lái)遞送重編程因子。在一些實(shí)施方案中，如上所述的TOKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的更多的化合物中的一種(例如，PDKl激活劑)和任選其他試劑在任何上述方法中與細(xì)胞一起孵育。如上所述，重編程可以包括在一種或多種蛋白質(zhì)的存在下在允許蛋白質(zhì)引入到細(xì)胞中的條件下培養(yǎng)靶細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，Zhou H等，Cell StemCell. 2009May8 ；4(5) :381-4;W0/2009/117439?？梢酝ㄟ^(guò)不涉及引入編碼多肽的多核苷酸的多種不同方法來(lái)將外源多肽(即，自細(xì)胞外部提供和/或不由細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì))引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括將一種或多種外源蛋白引入到細(xì)胞中，每種外源蛋白包括目的轉(zhuǎn)錄因子多肽，所述目的轉(zhuǎn)錄因子多肽與使轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞(并且在一 些實(shí)施方案中是細(xì)胞核)的能力增強(qiáng)的多肽連接(例如，作為融合蛋白連接或者不同地共價(jià)或非共價(jià)連接)。增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽序列的實(shí)例包括，但不限于，果蠅同源異型蛋白觸角足轉(zhuǎn)錄蛋白(Drosophila homeoprotein antennapedia transcriptionprotein)(AntHD)(Joliot 等，New Biol. 3 :1121-34,1991 Joliot 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :1864-8,1991 ；Le Roux 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :9120-4,1993)，單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP22 (Elliott 和 O' Hare, Cell (細(xì)胞)88 :223-33,1997) ；HIV-1 轉(zhuǎn)錄激活劑 TAT 蛋白(Green 和 Loewenstein, Cell (細(xì)胞)55 :1179-1188,1988 ；Frankel 和 Pabo, Cell (細(xì)胞)55 :1289-1193，1988) ；Kaposi FGF 信號(hào)序列(kFGF);蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 _4 (PTD4)；Penetratin, M918, Transportan-IO ;核定位序列序列，PEP-I肽；兩性分子肽(例如，MPG肽)；遞送增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如在美國(guó)專利號(hào)6，730，293中所述的(包括但不限于包含至少5-25個(gè)以上連續(xù)的精氨酸或者在30、40或50個(gè)氨基酸的連續(xù)組中包含5_25個(gè)以上的精氨酸的肽序列；包括但不限于具有足夠的(例如，至少5個(gè))胍基或脒基部分的肽)；以及可商購(gòu)的Penetratin l肽，以及可以從法國(guó)巴黎的Daitos S. A.獲得的VectocelKRflzS的 Diatos Peptide Vectors (" DPVs")。同樣參見(jiàn)，W0/2005/084158 和 W0/2007/123667以及其中描述的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。不僅這些蛋白可以通過(guò)質(zhì)膜，而且其他蛋白(如本文所述的轉(zhuǎn)錄因子)的附著，也足以刺激這些復(fù)合物的細(xì)胞攝取。之前已經(jīng)描述了能夠介導(dǎo)相關(guān)分子向細(xì)胞中的引入的多種多肽并且其可以適用于本發(fā)明。參見(jiàn)，例如，Langel (2002)Cell Penetrating Peptides (細(xì)胞穿透妝)CRC Press, Pharmacology and ToxicologySeries (藥理學(xué)和毒理學(xué)系列)。增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的示例性多肽序列包括VP22 GSPPTAPTRSKTPAQGLARKLHFSTAPPNPDAPWTPRVAGFNKRVFRFSPQTARRATTTRI ；kFGF AGSGGAAVALLPAVLLALLAPGGEFA ；PTD4 AGSGGYARAAARQARAGGEFA PENETRATIN RQIKIffFQGRRMKffKK ；TAT YGRKKRRQRRR M918 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV TRANSP0RTAN-10 AGYLLGKIGLKALAALAKKILo在一些實(shí)施方案中,增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽是包含至少5個(gè)以上連續(xù)或非連續(xù)精氨酸的肽序列(例如，8-精氨酸肽)。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽是包含至少7個(gè)以上連續(xù)或非連續(xù)精氨酸的肽序列。例如，增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽是包含11個(gè)連續(xù)精氨酸的肽序列，例如，ESGGGGSPGRRRRRRRRRRR。如上所述，轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)序列中的精氨酸不需要都是連續(xù)的。在一些實(shí)施方案中，多精氨酸(例如，連續(xù)或非連續(xù)的)區(qū)域至少為5，8，10，12，15，20以上個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且具有至少例如，40%, 50%,60%, 70%,80%,90%以上的精氨酸。在一些實(shí)施方案中，足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件包括這樣的條件，其中一種或多種外源多肽，例如，Oct多肽(包括但不限于0ct3/4)，Sox多肽(包括但不限于Sox2), Klf多肽(包括但不限于Klf4)和/或Myc多肽(包括但不限于c_Myc),通過(guò)常規(guī)方法如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，電穿孔，磷酸鈣沉淀，粒子轟擊和/或微注射引入到細(xì)胞中，或者可以通過(guò)蛋白質(zhì)遞送試劑引入到細(xì)胞中。例如，外源多肽可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接的脂質(zhì)(例如通過(guò)共價(jià)連接的十四酰基團(tuán))引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)任選被排斥在細(xì)胞遞送模塊外。在一些實(shí)施方案中，本文所述的轉(zhuǎn)錄因子多肽作為 脂質(zhì)體的部分或脂質(zhì)混合物(lipid cocktail)(如可商購(gòu)的Fugene6和Lipofectamine)外源引入。在另外的備選方案中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白可以被微注射或通過(guò)其他方式直接引入到祀細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，使用Profect蛋白遞送試劑，例如，Profect-Pl和Profect-P2 (TargetingSystems, El Cajon, CA),或者使用 Pro-Ject 轉(zhuǎn)染試劑(Pierce,Rockford IL，USA)將轉(zhuǎn)錄因子多肽遞送到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，使用單層納米管(SffNT)將轉(zhuǎn)錄因子多肽遞送到細(xì)胞中。如在W0/2009/117439的實(shí)施例中所述，利用該發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子多肽孵育細(xì)胞的周期延長(zhǎng)可能對(duì)細(xì)胞是有毒性的。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，足以誘導(dǎo)非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞成為多能干細(xì)胞的條件包括孵育I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的更多的化合物中的一種(例如，PDKl激活劑)和任選HDAC抑制劑，ALK5抑制劑和/或Mek抑制劑，以及間歇地用Oct多肽(包括但不限于0ct3/4)，Sox多肽(包括但不限于Sox2)，Klf多肽(包括但不限于Klf4)和/或Myc多肽(包括但不限于c-Myc)中的一種或多種孵育非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且具有插入周期，其中在不存在一種或多種多肽的情況下孵育細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用和不使用多肽進(jìn)行孵育的循環(huán)可以重復(fù)2，3，4，5，6或更多次并且進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間(即，使用以及不使用蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育)從而實(shí)現(xiàn)多能細(xì)胞的開發(fā)。在編程轉(zhuǎn)錄因子(例如，經(jīng)由表達(dá)盒或作為蛋白質(zhì)遞送的)的遞送前、同時(shí)或之后，多種試劑(例如，I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，HDAC抑制劑，TGF^受體/ALK5抑制劑，MEK/ERK通路抑制劑，和/或Rho GTPase/ROCK抑制劑等)可以與非多能細(xì)胞接觸。為方便起見(jiàn)，遞送重編程因子的日期被指定為"第I天"。在一些實(shí)施方案中，抑制劑在約第3-7天集合地(即，作為"混合物(cocktail)")與細(xì)胞接觸并且持續(xù)7-14天。備選地，在一些實(shí)施方案中，該混合物在第O天(即，預(yù)編程因子前一天)與細(xì)胞接觸并孵育達(dá)約14-30天。目的蛋白所引入到的細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是人或非人(例如，靈長(zhǎng)類，大鼠，小鼠，兔，牛，狗，貓，豬等)的。所述細(xì)胞可以是，例如，在培養(yǎng)物中或在組織、液體等中和/或來(lái)自有機(jī)體或在有機(jī)體中?？梢韵蚨嗄苄哉T導(dǎo)的細(xì)胞包括，但不限于，角質(zhì)形成細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，臍帶血細(xì)胞，神經(jīng)祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，小分子可以改善產(chǎn)生多能細(xì)胞(例如，iPS細(xì)胞)的方法的效率。例如，改善的效率可以顯示為加快產(chǎn)生這樣多能細(xì)胞的時(shí)間(例如，與不使用小分子的相似或相同方法相比，將開發(fā)多能細(xì)胞的時(shí)間縮短至少一天)。備選地，或相結(jié)合地，小分子可以增加通過(guò)特定方法所產(chǎn)生的多能細(xì)胞的數(shù)目(例如，與不使用小分子的相似或相同方法相比，在給定的時(shí)間內(nèi)，將數(shù)目增加至少10%，30%，50%，100%，200%，500%等)。任選地，或此外，小分子可以"補(bǔ)充"或替代通常不同地被認(rèn)為是產(chǎn)生多能細(xì)胞所必須的這些蛋白質(zhì)中的一種的表達(dá)。通過(guò)將細(xì)胞與在功能上替代轉(zhuǎn)錄因子中的一種的試劑接觸，可能的是產(chǎn)生這樣的多能細(xì)胞，所述多能細(xì)胞具有除了被所述試劑替代或補(bǔ)充的轉(zhuǎn)錄因子外的所有以上列出的轉(zhuǎn)錄因子。VIII.轉(zhuǎn)化 本發(fā)明采用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開了本發(fā)明中所用一般方法的基礎(chǔ)文本包括Sambrook等,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(第 3 版· 2001) ；Kriegler, Gene Transfer andExpression A Laboratory Manual (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(1990) JPCurrent Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)方案)(Ausubel等編輯，1994))。在一些實(shí)施方案中，用于表達(dá)一種或多種重編程轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)盒被引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞和要被表達(dá)的蛋白質(zhì)的物種是相同的。例如，如果使用小鼠細(xì)胞，則將小鼠直向同源物引入到細(xì)胞中。如果使用人細(xì)胞，則將人直向同源物引入到細(xì)胞中。要理解，當(dāng)要將兩個(gè)以上的蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可以使用一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒。例如，當(dāng)一個(gè)表達(dá)盒表達(dá)多個(gè)多肽時(shí)，可以使用多順?lè)醋颖磉_(dá)盒。任何類型的載體都可以用于將本發(fā)明的表達(dá)盒引入到細(xì)胞中。示例性的載體包括但不限于質(zhì)粒和病毒載體。示例性的病毒載體包括，例如，腺病毒載體，AAV載體，和逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(Ientiviral))載體。據(jù)信用于供本發(fā)明使用的細(xì)胞、組織或有機(jī)體的轉(zhuǎn)化的核酸遞送的合適方法實(shí)際上包括任何這樣的方法，通過(guò)所述方法核酸(例如，DNA)可以引入到細(xì)胞、組織或有機(jī)體中，如本文所述或如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，Stadtfeld和Hochedlinger,Nature Methods6(5) :329-330(2009) ;Yusa 等，Nat. Methods6 :363-369(2009) ；ffoltjen,等，Nature458，766-770 (9April2009))。這些方法包括，但不限于，DNA的直接遞送如通過(guò)體外轉(zhuǎn)染(Wilson 等，Science, 244 1344-1346,1989, Nabel 和 Baltimore, Nature326 711-713,1987),任選使用 Fugene6(Roche)或 Lipofectamine(Invitrogen),通過(guò)注射(美國(guó)專利號(hào) 5，994，624，5，981，274，5，945，100，5，780，448，5，736，524，5，702，932，5，656，610，5，589，466和5，580，859，每個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合于此)，包括微注射(Harland和ffeintraub, J. Cell Biol.，101 :1094-1099，1985 ;U. S. Pat. No. 5，789，215，其通過(guò)引用結(jié)合于此)；通過(guò)電穿孔(U. S. Pat. No. 5，384，253,其通過(guò)引用結(jié)合于此；Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6 :716-718,1986 ;Potter 等，Proc. Nat ' I Acad. Sci. USA,81 :7161-7165,1984);通過(guò)憐酸I丐沉淀(Graham 和 Van Der Eb, Virology, 52 :456-467,1973 ;Chen 和Okayama,Mol. Cell Biol.，7 (8) :2745-2752,1987 ；Rippe 等，Mol. CellBiol.，10 :689-695,1990);通過(guò)使用 DEAE-葡聚糖，繼之以聚乙二醇(Gopal，Mol. Cell Biol. , 5 :1188-1190,1985);通過(guò)直接聲波加載(sonicloading) (Fechheimer 等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA,84 :8463-8467,1987);通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Nicolau 和 Sene, Biochim. Biophys. Acta,721 :185-190,1982 ;Fraley等，Proc. Nat' I Acad. S ci. USA, 76 :3348-3352,1979 ；Nicolau等，Methods Enzymo I. , 149 157-176,1987 ；ffong 等，Gene, 10 :87-94,1980 ； Kane da 等，Science, 243 :375-378,1989 ;Kato 等，J Biol. Chem.，266 :3361-3364,1991)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu 和 Wu，Biochemistry，27 :887-892,1988 ;Wu 和 Wu，J. Biol. Chem.，262 :4429-4432,1987);以及這些方法的任何組合，所述文獻(xiàn)中的每個(gè)都通過(guò)引用結(jié)合于此。IX.混合物如本文所述，本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在與I3DKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，以及以下各項(xiàng)中的一種或多種的混合物中(a)TGF0受體/ALK5抑制劑；(b)MEK抑制劑；(c)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或(d)選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源多肽。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑，例如，PS48。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活劑，例如，果糖2，6- 二磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解的底物，例如，果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解中間體或其代謝前體，例如，煙酸，NADH，或果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑，例如，2，4-二硝基苯酚，或2-羥基戊二酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是低氧誘導(dǎo)因子激活劑，例如，N-草酰甘氨酸，或槲皮素。在一些實(shí)施方案中，所述混合物還包含TGFP受體/ALK5抑制劑。TGF0受體/ALK5抑制劑包括但不限于A-83-01。在一些實(shí)施方案中，所述混合物還包含MEK抑制劑。MEK抑制劑包括但不限于Η)0325901。在一些實(shí)施方案中，所述混合物還包含組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。HDAC抑制劑包括但不限于丁酸鈉(NaB)和丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，所述混合物還包含外源轉(zhuǎn)錄因子，例如，選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。在一些?shí)施方案中，化合物(例如，PDKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物)以足以誘導(dǎo)或改善向多能性誘導(dǎo)的效率的濃度存在于混合物中。例如，在一些實(shí)施方案中，化合物的濃度為至少O. InM，例如，至少1，10，100，1000，10000或ΙΟΟΟΟΟηΜ，例如，在O. InM至IOOOOOnM之間，例如，在InM至IOOOOnM之間，例如，在IOnM至IOOOOnM之間。在一些實(shí)施方案中，混合物在合成的容器中(例如，試管、培養(yǎng)皿等)。因此，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是分離的細(xì)胞(不是動(dòng)物的部分)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞分離自動(dòng)物(人或非人)，放置在容器中，與本文所述的一種或多種化合物接觸。隨后可以培養(yǎng)細(xì)胞并且任選地，將其回插入相同或不同的動(dòng)物中，任選在細(xì)胞已經(jīng)被刺激從而變?yōu)樘囟?xì)胞類型或品系后。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)混合物在足以誘導(dǎo)細(xì)胞到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的條件下時(shí)，抑制劑的濃度足以使混合物中的非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率改善至少10%，20%，50%，75%，100%，150%，200%，300%以上。
如本文所述,在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含用于異源表達(dá)Oct多肽、Myc多肽、Sox多肽和Klf多肽中的至少一種或多種的表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞不包含用于表達(dá)Oct、Myc、Sox或Klf多肽中的一種或多種(在一些實(shí)施方案中，包括任何)的表達(dá)盒。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以是人或非人(例如，靈長(zhǎng)類，大鼠，小鼠，兔，牛，狗，貓，豬等)的。非多能細(xì)胞的實(shí)例包括本文所述的那些，包括但不限于，來(lái)自選自骨髓、皮膚、骨骼肌、脂肪組織和外周血的組織的細(xì)胞。示例性細(xì)胞類型包括，但不限于，成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞，成肌細(xì)胞，神經(jīng)元，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，T細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，臍帶血細(xì)胞，和神經(jīng)祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，混合物中至少99%的細(xì)胞最初是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，混合物中基本上所有細(xì)胞最初都是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，混合物中至少O. 001 %，至少O. 002 %，至少O. 005 %，至少O. 01%，至少O. 05%，至少O. 1%，至少O. 5%，至少1%，至少2%，至少3%，至少4%，至少5%，至少6%，至少7%，至少8%，至少9%，至少10%，至少15%，至少20%，至少30%，至·少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或至少90 %的細(xì)胞被誘導(dǎo)為多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，混合物中至少99%的細(xì)胞被誘導(dǎo)為多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，基本上所有細(xì)胞都被誘導(dǎo)為非多能細(xì)胞。X.試劑盒本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性，所述試劑盒包括TOKl激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物，以及以下各項(xiàng)中的一種或多種(a)TGF^受體/ALK5抑制劑；(b)MEK抑制劑；(c)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑;或⑷選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源多肽。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是I3DKl激活劑。在一些實(shí)施方案中，PDKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑，例如，PS48。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活劑，例如，果糖2，6_ 二磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解的底物，例如，果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解中間體或其代謝前體，例如，煙酸，NADH,或果糖6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑是氧化磷酸化抑制劑，例如，2，4- 二硝基苯酚，或2-羥基戊二酸。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是低氧誘導(dǎo)因子激活劑，例如，N-草酰甘氨酸，或槲皮素.在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括TGFβ受體/ALK5抑制劑，例如，Α_83_01。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括MEK抑制劑，例如，PD0325901。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，例如，丁酸鈉(NaB)，或丙戊酸(VPA)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括外源轉(zhuǎn)錄因子，例如，選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄小Ｔ谝恍?shí)施方案中，所述試劑盒還包括非多能細(xì)胞。非多能細(xì)胞的實(shí)例包括本文所述的那些，包括但不限于，來(lái)自選自骨髓、皮膚、骨骼肌、脂肪組織和外周血的組織的細(xì)胞。示例性的細(xì)胞類型包括，但不限于，成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞，成肌細(xì)胞，神經(jīng)元，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，T細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，臍帶血細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞。實(shí)施例以下實(shí)施例用于說(shuō)明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例I :通過(guò)0CT4和化學(xué)化合物重編程人初級(jí)體細(xì)胞我們?cè)诖藞?bào)道新型小分子混合物(cocktail)，其能利用僅0CT4的外源表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)人初級(jí)體細(xì)胞向iPSC的重編程。 結(jié)果在若干容易獲得的初級(jí)人體細(xì)胞類型中，能夠容易地從人皮膚或毛囊分離的角質(zhì)形成細(xì)胞代表有吸引力的用于重編程的細(xì)胞源，因?yàn)樗鼈儍?nèi)源表達(dá)KLF4和cMYC，并且據(jù)報(bào)道可以使用常規(guī)的四種TFs或三種TFs (沒(méi)有MYC)更有效地重編程(Aasen，T.等，NatBiotechnol26 :1276-1284(2008) ；Maherali,N.等，Cell Stem Cell3，340-345(2008))。最近，我們報(bào)道了使用小分子(即，分別使用SB431542和Η)0325901)對(duì)TGFP和MAPK/ERK通路進(jìn)行雙重抑制為利用四種外源TFs (即，0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc TFs，或"0SKM")的人成纖維細(xì)胞的重編程提供顯著增強(qiáng)的條件(Lin，T.等，Nat Methods6 :805-808 (2009))。此外，我們已經(jīng)證明這樣的雙通路抑制也可以增強(qiáng)通過(guò)兩種外源TFs ( S卩，0ct4和Klf4，或"0K")以及兩種小分子，Parnate(賴氨酸特異性去甲基化酶I的抑制劑)和CHIR99021(GSK3抑制劑)的人角質(zhì)形成細(xì)胞的重編程(Li，W.等，Stem Cells27 2992-3000 (2009)) ο然而，這樣的2_TFs重編程過(guò)程效率很低并且復(fù)雜(例如，涉及兩種外源TFs和四種化學(xué)品)，并且利用甚至還要少一種TF的重編程都顯得令人畏懼。為了實(shí)現(xiàn)僅使用0CT4的重編程，我們?cè)诟纳浦鼐幊虠l件和鑒別新的重編程化學(xué)實(shí)體方面開發(fā)出逐步策略。我們首先嘗試在四種或三種TFs(即，OSKM或0SK)條件下進(jìn)一步優(yōu)化重編程過(guò)程在新生人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NHEKs)中，通過(guò)在不同濃度測(cè)試TGFii和MAPK通路的多種抑制劑，使用之前報(bào)道的人iPSC表征方法(Lin，T.等,Nat Methods6 :805-808 (2009))。我們發(fā)現(xiàn)，0·5μΜ PD0325901和0·5μΜ A-83-01 (更加有效和選擇性的TGFβ受體抑制劑)的組合在增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)有OSKM或OSK的人角質(zhì)形成細(xì)胞的重編程方面更加有效(圖Ia)。顯著地，當(dāng)我們進(jìn)一步減少病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至僅兩種因子/OK時(shí)，當(dāng)NHEKs用O. 5 μ M PD0325901和O. 5 μ MA-83-01處理時(shí)，我們?nèi)匀豢梢詮钠洚a(chǎn)生iPSC，雖然效率很低。然后我們開始以不同濃度篩選來(lái)自已知具有生物活性的化合物的集合的其他小分子，如之前所報(bào)道的。在目前多測(cè)試的多種化合物中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在重編程方面從未得到報(bào)道的TOKl (3’ -磷酸肌醇依賴性激酶-I)的小分子激活劑，PS48(5yM)可以顯著地使重編程效率增加約十五倍。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)對(duì)于在OK條件下產(chǎn)生iPSC，0. 25mM 丁酸鈉(NaB，組蛋白脫乙酰酶抑制劑)結(jié)果比之前報(bào)道的O. 5mM VPA更可靠和有效(圖Ib)。之后的后續(xù)研究證明5 μ M PS48和O. 25mM NaB的組合可以進(jìn)一步增強(qiáng)重編程效率超過(guò)二十五倍(圖Ib和表3)。在僅兩種TFs的重編程N(yùn)HEKs的這樣空前的效率的情況下，我們進(jìn)一步研究了通過(guò)在不同的處理窗口期間細(xì)化那些小分子的組合來(lái)僅利用0CT4產(chǎn)生iPSC的可能性。用0CT4轉(zhuǎn)導(dǎo)初級(jí)NHEKs并用化學(xué)品處理(圖Ic)。在不同的條件下，類似于hESCs的少量iPSC集落(1，000，000個(gè)接種的細(xì)胞中的四至六個(gè)集落)出現(xiàn)在前四周期間用O. 25mM NaB,5yMPS48 和 O. 5 μ M A-83-01 處理，之后用 O. 25mM NaB, 5 μ M PS48，O. 5 μ M Α-83-01 和 O. 5 μ MPD0325901再處理四周的0CT4感染的NHEKs中(圖lc)。這樣的TRA-1-81陽(yáng)性iPSC集落(圖Id)在常規(guī)hESC培養(yǎng)基下生長(zhǎng)得更大并且可以連續(xù)傳代從而產(chǎn)生被進(jìn)一步表征的穩(wěn)定的iPSC克隆(圖Ie和2)。此外，通過(guò)向該化學(xué)品混合物中加入2 μ M Parnate和3 μ MCHIR99021 (其已經(jīng)顯示出在OK條件下改善NHEKs的重編程)，僅使用0CT4的iPSC也可以產(chǎn)生自人成人角質(zhì)形成細(xì)胞。在初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)0CT4和小分子可靠的重編程為iPSC后，我們進(jìn)一步將該條件應(yīng)用于其他人初級(jí)細(xì)胞類型，包括HUVECs (分化的中胚層細(xì)胞)和AFDCs (源自羊水的細(xì)胞)。類似地，TRA-1-81陽(yáng)性iPSC集落出現(xiàn)在用化學(xué)品處理的0CT4感染的HUVECs和AFDCs中。顯著地，表現(xiàn)為在0CT4和小分子條件下HUVECs和AFDCs的重編程比NHEKs的重編程更有效和快速(表3)。來(lái)自每個(gè)細(xì)胞類型的iPSC的兩個(gè)克隆在常規(guī)hESC培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期擴(kuò)增達(dá)超過(guò)20代并被進(jìn)一步表征(表4)。這些穩(wěn)定擴(kuò)增的hiPSC-OK和hiPSC-Ο細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上不能區(qū)別于hESCs，并且可以在無(wú)飼料(feeder-free)和化學(xué)成分確定的條件下在ECM涂布的表面上培養(yǎng)(圖Ie和 圖6)。它們對(duì)于堿性磷酸酶(ALP)染色呈陽(yáng)性，并且通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)/ICC檢測(cè)，表達(dá)典型的多能性標(biāo)記物，包括0CT4, S0X2, NANOG, TRA-1-81和SSEA4 (圖le, 3b,圖4-5)。此外，RT-PCR分析確認(rèn)了內(nèi)源人0CT4，S0X2, NANOG, REX1，UTF1，TDGF2，F(xiàn)GF4基因的表達(dá)，以及外源0CT4和KLF4的沉默(圖2a和3c)。此外，亞硫酸氫鹽測(cè)序分析顯示hiPSC-OK和hiPSC-0細(xì)胞的0CT4和NANOG啟動(dòng)子在很大程度上被去甲基化(圖2b和3d)。該結(jié)果為hiPSC-OK和hiPSC-Ο細(xì)胞中的多能性轉(zhuǎn)錄程序的再活化提供了進(jìn)一步的證據(jù)。hiPSC-Ο細(xì)胞，NHEKs和hESCs的全局基因表達(dá)分析顯示hiPSC-Ο細(xì)胞不同于NHEKs (Pearson相關(guān)性值0. 87)并且與hESCs最相似(Pearson相關(guān)性值0. 98)(圖2c)?；蛐头治鲲@示hiPSC-Ο細(xì)胞僅包含0CT4轉(zhuǎn)基因而未受轉(zhuǎn)基因KLF4或S0X2的污染(圖8)。DNA印跡分析顯示在不同的克隆之間存在0CT4轉(zhuǎn)基因的多個(gè)不同的整合位點(diǎn)(圖9)。此外，核型分析結(jié)果顯示hiPSC-0在整個(gè)重編程和擴(kuò)增過(guò)程期間保持正常的核型(圖10)。此外，DNA指紋測(cè)試排除了這樣的可能性，即這些hiPSC由實(shí)驗(yàn)室中的hESC污染產(chǎn)生(表5)。為檢驗(yàn)這些hiPSC-Ο細(xì)胞的發(fā)育潛能，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)胚狀體(EB)分化方法使它們?cè)隗w外分化。ICC分析表明它們可以有效地分化為以β III-微管蛋白+為特征的神經(jīng)元細(xì)胞(外胚層)，SMA+中胚層細(xì)胞，和AFP+內(nèi)胚層細(xì)胞(圖2d和3e)。定量PCR分析進(jìn)一步確認(rèn)了這些和另外的品系特異的標(biāo)記基因的表達(dá)，所述標(biāo)記基因包括外胚層細(xì)胞(β III-微管蛋白和NESTIN)，中胚層細(xì)胞(MSX1和MLC2a)，以及內(nèi)胚層細(xì)胞(F0XA2和AFP)(圖2e)。在EB方案后，這些hiPSC-OK和hiPSC-Ο細(xì)胞還可以產(chǎn)生有節(jié)奏搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。為測(cè)試它們?cè)隗w內(nèi)的多能性，將它們移植到SCID小鼠中。四至六周后，這些hiPSC-Ο細(xì)胞有效地產(chǎn)生包含所有三個(gè)胚層的衍生物的典型的畸胎瘤(圖2f和3f)?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些體外和體內(nèi)特征表明單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，0CT4，與限定的小分子混合物結(jié)合，足以將若干種人初級(jí)體細(xì)胞重編程為在形態(tài)學(xué)上、分子上和功能上類似于多能hESCs的iPSC。討論上述研究具有大量重要的啟示首先,盡管胎兒NSCs顯示為通過(guò)僅0CT4的異位表達(dá)被重編程為iPSC，關(guān)于下述問(wèn)題存在顯著的懷疑僅外源0CT4基因是否足以重編程不內(nèi)源表達(dá)S0X2(重編程中兩種主要多能性基因之一)、處于較后的發(fā)育階段(例如，早期胚胎/胎兒對(duì)比出生/成人)的其他更實(shí)用的人體細(xì)胞，并且是否可以在不顯著傷害個(gè)體的情況下獲得。就我們所知，我們的研究第一次證明iPSC可以實(shí)際來(lái)源于轉(zhuǎn)導(dǎo)有單個(gè)外源重編程基因0CT4的容易獲得的初級(jí)人體細(xì)胞(例如，角質(zhì)形成細(xì)胞)。與來(lái)自腦部的神經(jīng)干細(xì)胞相比，角質(zhì)形成細(xì)胞更易獲得并且可以利用較少的侵入式方法容易地獲得自出生的個(gè)體。這進(jìn)一步加強(qiáng)了開發(fā)用于以更安全的方法和/或更好的質(zhì)量產(chǎn)生iPSC的多種實(shí)際上易獲得的人體細(xì)胞的策略。因此，該新方法及其進(jìn)一步的開發(fā)將顯著促進(jìn)用于多種用途的患者特異的多能干細(xì)胞的制備。第二，雖然小分子及它們的組合已經(jīng)被鑒別為僅替代一種或兩種重編程TFs，當(dāng)更多的外源重編程TFs被一起省略時(shí)，產(chǎn)生iPSC的挑戰(zhàn)呈指數(shù)地增大。在使得能夠僅利用0CT4產(chǎn)生iPSC方面在功能上同時(shí)替代三種主要轉(zhuǎn)錄因子(即，S0X2、KLF4和MYC)的此新的小分子混合物的鑒定代表了向著僅利用小分子的最終重編程的又一主要步驟，并進(jìn)一步證實(shí)和鞏固了獲得iPSCs的化學(xué)方法。
第三，這表明單個(gè)基因條件對(duì)于蛋白質(zhì)-誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(piPSC)技術(shù)也具有重要啟示。PiPSC技術(shù)的實(shí)際挑戰(zhàn)是大規(guī)模且可靠地制備四種可轉(zhuǎn)導(dǎo)的重編程蛋白，所述四種蛋白中的每個(gè)在制備中具有不同的性質(zhì)(例如，它們的表達(dá)，折疊，穩(wěn)定性等)。顯然地，將該小分子混合物與單個(gè)可轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白組合將顯著簡(jiǎn)化PiPSC技術(shù)并促進(jìn)其應(yīng)用。第四，我們鑒定了新的小分子，PS48，其在增強(qiáng)重編程方面具有新的靶標(biāo)/機(jī)制。PS48 是 PDKl 的變構(gòu)的小分子激活劑(Hindie, V.等，Nat ChemBiol4 :758-764(2009))。PS48增強(qiáng)重編程的一種機(jī)制表現(xiàn)為促進(jìn)從主要由成人體細(xì)胞使用的線粒體氧化到主要由ESCs使用的糖酵解的代謝重編程(其也被稱為Warburg作用)(Manning, B. D.和Cantley,Celll29 :1261-1274(2007) ；Kondoh, H.等，Antioxid Redox Signal9 :293-299(2007);Heiden, M. G. V.等，Science324 :1029-1033 (2009))。相比線粒體呼吸，多能干細(xì)胞對(duì)糖酵解代謝的這種差異性使用將通過(guò)在較少的氧化脅迫下促進(jìn)增殖/細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化來(lái)有助于多能性。對(duì)于高度增殖的細(xì)胞，氧化磷酸化將不能夠滿足為細(xì)胞復(fù)制提供大分子前體的需要，并且還在線粒體中產(chǎn)生大量的活性氧種類，所述活性氧種類可能誘發(fā)過(guò)度的氧化損傷。另一方面，糖酵解代謝可以更有效地產(chǎn)生大分子前體，如針對(duì)非必需氨基酸的糖酵解中間體和針對(duì)脂肪酸的乙?；?CoA，同時(shí)提供足夠的能量從而滿足增殖細(xì)胞的需要(Kondoh，
H.等，Antioxid Redox Signal9 :293-299(2007) ；Heiden, M. G. V.等，Science324 1029-1033(2009))。有趣地，缺氧條件及其效應(yīng)物HIF-I α活化不僅與促進(jìn)糖酵解代謝緊密聯(lián)系，并且還顯示為增強(qiáng)小鼠和人兩者的重編程(Yoshida，Y.等，Cell Stem Cell5 237-241(2009))。機(jī)械地，生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路，缺氧條件/HIF-I α和重編程因子Myc顯示為調(diào)控細(xì)胞代謝的互補(bǔ)方面，包括上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解的代謝酶，如GLUT1，HK2和 PFKl (Gordan，J. D.等，Cancer Celll2 :108-113(2007) ；DeBerardinis, R. J.等，Cellmetabolism7 :11-20 (2008))。這些研究表明在增強(qiáng)重編程方面，Myc、缺氧條件/HIF-1 α和生長(zhǎng)因子/Akt通路活化的一種可能的保守機(jī)制集中在它們?cè)谡{(diào)節(jié)糖酵解代謝中的基本作用。支持該主張的是，我們發(fā)現(xiàn)用PS48處理激活下游Akt/PKB (圖I la)，并且上調(diào)若干主要糖酵解基因的表達(dá)(圖Ild)，促進(jìn)到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換(圖lie)。相反地，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)UCN-Ol (PDKI抑制劑)使TOKl活性失活或通過(guò)2-脫氧-D-葡萄糖(糖酵解抑制劑)抑制糖酵解不僅減弱糖酵解(圖lie)而且還阻斷重編程過(guò)程(圖Ilb)。此外，已經(jīng)廣泛用于介導(dǎo)線粒體呼吸(2，4-二硝基苯酚)，糖酵解代謝(果糖2，6-二磷酸和草酸鹽)，或更具體地HIF通路活化(N-草酰甘氨酸和槲皮素)的若干已知的小分子也顯示相應(yīng)的對(duì)重編程的一致作用即，促進(jìn)糖酵解代謝的化合物增強(qiáng)重編程(如2，4-二硝基苯酚和N-草酰甘氨酸)，而阻斷糖酵解代謝的化合物抑制重編程(如草酸鹽)(圖lie) (Hewitson, K. S.和Schofield, C. J. , Drug Discov Today9 :704-711(2004) ；Pelicano, H.等，0ncogene25 4633-4646(2006))?？傊@些結(jié)果表明向厭氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換對(duì)于體細(xì)胞到多能干細(xì)胞的重編程是關(guān)鍵的并且對(duì)其有促進(jìn)作用。最后，此新且強(qiáng)大的用于重編程的小分子混合物證實(shí)了本文提出的逐步的化學(xué)優(yōu)化和篩選策略作為獲得最終純粹化學(xué)品誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的生產(chǎn)性方法。此外，我們發(fā)現(xiàn)在不同的情境中，不同的小分子介導(dǎo)相同的靶標(biāo)/機(jī)制可能對(duì)重編程具有顯著不同的效果，例如A-83-01和NaB的更好的重編程增強(qiáng)人角質(zhì)形成細(xì)胞中的活性，表明對(duì)于具體的重編程情境來(lái)說(shuō)“個(gè)性化”優(yōu)化和用不同方式處理的重要性。方法細(xì)胞培養(yǎng)將正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(Lonza)保持在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(KCM，Lonza)中。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，Millipore)保持在EndoGRO-VEGF完全培養(yǎng)基(HCM，CHEMIC0N)中。將人ESCs和hiPSC在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上在常規(guī)人ESC培養(yǎng)基(hESCM =DMEM/F12,15 % Knockout血清替代物，I % Glutamax, I %非必需氨基酸，I %青霉素/鏈霉素，O. ΙπιΜβ巰基乙醇和10ng/ml bFGF)中培養(yǎng)。除非有所提及，所有細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品均來(lái)自Invitrogen/Gibco BRL0 慢病毒制備制備慢病毒上清并如前所述那樣收集(Yu，J.等，Science318 1917-1920(2007))。用于制備慢病毒的質(zhì)粒包括 pSin-EF2-Puro_h0CT4，pSin2-EF2-Puro-hS0X2, pLove_mKlf4, pLove-mMyc,包裝質(zhì)粒 psPAX2 和編碼被膜的質(zhì)粒 pMD2. G(Yu，J.等，Science318 :1917-1920(2007)和 Li，W.等，Stem Cells27 2992-3000(2009)) ·NHEKs的重編程將NHEKs培養(yǎng)在IOOmm組織培養(yǎng)皿中并用新鮮制備的慢病毒上清對(duì)其進(jìn)行3次轉(zhuǎn)導(dǎo)(每次轉(zhuǎn)導(dǎo)3-4小時(shí))。將1，000，000個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NHEKs接種到放射x射線滅活的CFlMEF飼養(yǎng)細(xì)胞上在100-mm皿中并在KCM中培養(yǎng)并用5μΜ PS48,0. 25mM NaB(Stemgent)和0. 5 μ M A-83-01 (Stemgent)處理2周，之后將一半體積的培養(yǎng)基變?yōu)閔ESCM并補(bǔ)充以5yMPS48,0. 25mM NaB和0. 5 μ M Α-83-01再培養(yǎng)2周。然后細(xì)胞培養(yǎng)基變?yōu)閔ESCM并補(bǔ)充以 5μΜ PS48,0. 25mM NaB,0. 5μ M A-83-01 和 0· 5 μ MPD0325901 (Stemgent)再培養(yǎng) 4周。將在不含有化學(xué)品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的相同的0CT4感染的角質(zhì)形成細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)Accutase(Millipore)分解培養(yǎng)物并在分解后的第一天中用ΙμΜ Thiazovivin(Stemgent)處理。挑取Alexa Fluor555小鼠抗人TRA-1-81抗體(BD Pharmingen)陽(yáng)性染色的iPSC集落用于在飼養(yǎng)細(xì)胞上在hESCM中擴(kuò)增并常規(guī)培養(yǎng)。HUVECs的重編程將HUVECs培養(yǎng)在IOOmm組織培養(yǎng)皿中并用新鮮制備的慢病毒上清對(duì)其進(jìn)行2次轉(zhuǎn)導(dǎo)(每次轉(zhuǎn)導(dǎo)4-6小時(shí))。將200，000個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVECs接種到明膠涂布的100-mm皿上，在HCM中培養(yǎng)，并用5μ M PS48，0. 25mM NaB和O. 5μ M Α-83-01處理2周，之后將一半體積的培養(yǎng)基變?yōu)閔ESCM并補(bǔ)充以5 μ M PS48，0. 25mM NaB和O. 5 μ M A-83-01再培養(yǎng)2周。然后將細(xì)胞培養(yǎng)基變?yōu)閔ESCM并補(bǔ)充以5μ M PS48，0. 25mM NaB,0. 5μΜ A-83-01和0· 5 μ MPD0325901再培養(yǎng)1_2周。挑取Alexa Fluor555小鼠抗人TRA-1-81抗體陽(yáng)性染色的iPSC集落用于在飼養(yǎng)細(xì)胞上在hESCM中擴(kuò)增并常規(guī)培養(yǎng)。通過(guò)Accutase分解培養(yǎng)物并在分解后的第一天中用IuM Thiazovivin處理。使用多種代謝調(diào)節(jié)化合物的HUVECs的重編程將HUVECs培養(yǎng)在100-mm組織培養(yǎng)皿中并用新鮮制備的含四種重編程因子(Klf，Sox, Myc和Oct)的慢病毒上清對(duì)其進(jìn)行2次轉(zhuǎn)導(dǎo)(每次轉(zhuǎn)導(dǎo)4_6小時(shí))。將約20，000個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVECs接種到明膠涂布的6-孔板上，在HCM中培養(yǎng)，并用代謝調(diào)節(jié)化合物處理2周。然后將細(xì)胞培養(yǎng)基變?yōu)閔ESCM并補(bǔ)充以代謝調(diào)節(jié)化合物再培養(yǎng)1-2周。計(jì)數(shù)Alexa Fluor555小鼠抗人TRA-1-81抗體陽(yáng)性染色的iPSC集落的數(shù)目。測(cè)試多種代謝調(diào)節(jié)化合物，包括IOmM果糖2，6-二磷酸(F2，6P)，10mM果糖6-磷酸(F6P)，10 μ M6-氨基煙酰胺(6-ΑΝ)，10 μ M草酸鹽(OA)，I μ M2，4- 二硝基苯酚(DNP)，I μ M N-草酰甘氨酸(NOG)，I μ M槲皮素(QC)，10 μ M2-羥基戊二酸(2-ΗΑ)，或 10 μ M 煙酸(NA)。體外分化hiPSC的體外分化通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)胚狀體(EB)方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，通過(guò)Accutase(Millipore)解離hiPSC,在超低附著6孔板中培養(yǎng)八天然后轉(zhuǎn)移到Matrigel涂布的6孔板在分化培養(yǎng)基中。在八天后，將細(xì)胞固定用于免疫細(xì)胞化學(xué)分析或者收集用于RT-PCR測(cè)試。分化培養(yǎng)基DMEM/F12，10% FBS，I % Glutamax，I %非必需氨基酸，I %青霉素/鏈霉素，O. ImM β巰基乙醇。堿性磷酸酶染色和免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Stemgent)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行堿性磷酸酶染色。標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定如前所報(bào)道的那樣進(jìn)行(Li，W.等，StemCells27 2992-3000 (2009)) ο所用的初級(jí)抗體可以見(jiàn)于表2中。次級(jí)抗體是Alexa Fluor488驢抗小鼠或抗兔IgG(l :1000) (Invitrogen)。細(xì)胞核通過(guò)DAPI (Sigma-Aldrich)染色顯示。使用Nikon Eclipse TE2000-U顯微鏡捕獲圖像。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR的基因表達(dá)分析對(duì)于RT-PCR和qRT-PCR分析，使用RNeasy Plus Mini試劑盒結(jié)合QIAshredder (Qiagen)從人iPSC提取總RNA。第一鏈反轉(zhuǎn)錄利用2 μ gRNA使用iScript cDNA合成試劑盒(BioRad)進(jìn)行。多能性標(biāo)記物的表達(dá)通過(guò)RT-PCR使用Platinum PCRSuperMix (Invitrogen)來(lái)分析。分化后的品系特異標(biāo)記物的表達(dá)通過(guò)qRT-PCR使用iQSYBR Green Supermix(Bio-Rad)來(lái)分析。引物可見(jiàn)于表I中。微陣列分析將Human Ref-8_v3expression Beadchip (IIlumina, CA, USA)用于微陣列雜交以檢查NHEKs、hiPSC和hES細(xì)胞的全局基因表達(dá)。利用Illumina TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒(Ambion AMIL1791, Foster City, CA, USA)從 500ng 總 RNA 合成生物素-16-UTP-標(biāo)記的 cRNAο 根據(jù) Illumina BeadStation500X 系統(tǒng)手冊(cè)(Illumina, San Diego, CA, USA)使用提供的試劑和GE Healthcare鏈霉抗生物素_Cy3染色溶液制備含750ng標(biāo)記的擴(kuò)增的cRNA 的雜交混合物。到 Illumina Human Ref_8v3expressionBeadchip 的雜交在 BeadChipHyb Wheel上在55°C進(jìn)行18小時(shí)。使用Illumina BeadArray Reader掃描陣列。所有樣品都制成兩份生物學(xué)復(fù)制品。微陣列數(shù)據(jù)的處理和分析利用Illumina BeadStudio軟件進(jìn)行。所述數(shù)據(jù)被減去背景并使用秩不變量選項(xiàng)歸一化。硫酸氫鹽基因組測(cè)序使用Non Organic DNA分離試劑盒(Millipore)分離基因組DNA然后用EZ DNAMethylation-Gold 試劑盒(Zymo Research Corp. , Orange, CA)處理。然后將經(jīng)處理的 DNA用作擴(kuò)增目的序列的模板。用于0CT4和NANOG啟動(dòng)子片段擴(kuò)增的引物顯示在表I中。使用用于測(cè)序的TOPO TA克隆試劑盒(InvitiOgen)克隆所得的片段并測(cè)序。hiPSCs的基因型分析使用基因組DNA的RT-PCR，利用特異性引物(表I ;Yu，J.等，Science318 1917-1920(2007)和 Li，W.等，Stem Cells27 :2992-3000(2009))來(lái)進(jìn)行 hiPSC 系的基因型分析?；チ鲂纬赏ㄟ^(guò)使用O. 05%胰蛋白酶-EDTA來(lái)收獲hiPSC系。在SCID小鼠(η = 3)的腎包膜下注射五百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在4-6周后，收獲發(fā)育良好的畸胎瘤，固定然后在TSRI組織學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(TSRI histology core facility)進(jìn)行組織學(xué)分析。表I.所用引物
權(quán)利要求
1.將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括在足以將細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下將非多能細(xì)胞與3’ -磷酸肌醇依賴性激酶-I (PDKl)激活劑接觸，由此將所述非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述I3DKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑。
3.根據(jù)權(quán)利要 求2所述的方法，其中所述I3DKl激活劑是(Z)-5-(4-氯苯基)-3_苯基戊-2-烯酸("PS48" )，(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS08 ")，2-(3- (4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z) -5-(萘-2-基)-3-苯基戍-2-烯酸("121")，或(Ζ)-5-(1Η-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述TOKl激活劑是PS48。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將所述非多能細(xì)胞與TGF β受體/ALK5抑制劑接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述TGFii受體/ALK5抑制劑是Α-83-01。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將所述非多能細(xì)胞與MEK抑制劑接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將所述非多能細(xì)胞與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是丁酸鈉(NaB)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是丙戊酸(VPA)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述條件包括將至少一種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到所述非多能細(xì)胞中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包括多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包括Oct多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽和Klf多肽組成的組的多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，所述方法包括將至少兩種、三種或四種外源轉(zhuǎn)錄因子引入到所述非多能細(xì)胞中，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子各自包括選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的不同多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)將多核苷酸引入到所述非多能細(xì)胞中來(lái)引入，其中所述多核苷酸編碼所述外源轉(zhuǎn)錄因子，由此在所述非多能細(xì)胞中表達(dá)一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)將所述外源轉(zhuǎn)錄因子與所述非多能細(xì)胞接觸來(lái)引入。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄小?br> 21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非多能細(xì)胞是人細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述I3DKl激活劑以這樣的濃度存在所述濃度足以在足以誘導(dǎo)所述非多能細(xì)胞向所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的條件下將所述非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中接觸包括將所述非多能細(xì)胞與TOKl激活劑在不存在MEK抑制劑的情況下接觸，之后將所述非多能細(xì)胞與TOKl激活劑和MEK抑制劑接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中接觸包括將所述非多能細(xì)胞與TOKl激活劑、TGF^受體/ALK5抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑在不存在MEK抑制劑的情況下接觸，之后將所述非多能細(xì)胞與I3DKl激活劑、TGF^受體/ALK5抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和MEK抑制劑接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中誘導(dǎo)多個(gè)多能干細(xì)胞，所述方法還包括純化所述多能干細(xì)胞從而產(chǎn)生同質(zhì)的多能干細(xì)胞群。
26.混合物，其包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、PDKl激活劑和以下各項(xiàng)中的一種或多種 TGF β受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑； 組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或 選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種外源轉(zhuǎn)錄因子。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的混合物，其中至少99%的所述細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求26-27中任一項(xiàng)所述的混合物，其中基本上所有所述細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的混合物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)所述的混合物，其中所述TOKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的混合物，其中所述TOKl激活劑是(Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS48" )，(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS08")，2-(3- (4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z) -5-(萘-2-基)-3-苯基戍-2-烯酸("121")，或(Ζ)-5-(1Η-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的混合物，其中所述I3DKl激活劑是PS48。
33.根據(jù)權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)所述的混合物，所述混合物還包括TGFβ受體/ALK5抑制劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的混合物，其中所述TGFβ受體/ALK5抑制劑是Α-83-01。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)所述的混合物，所述混合物還包括MEK抑制劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的混合物，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
37.根據(jù)權(quán)利要求26-36中任一項(xiàng)所述的混合物，所述混合物還包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的混合物，其中所述HDAC抑制劑是丁酸鈉(NaB)。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的混合物，其中所述HDAC抑制劑是丙戊酸(VPA)。
40.根據(jù)權(quán)利要求26-39中任一項(xiàng)所述的混合物，所述混合物還包括選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的外源轉(zhuǎn)錄因子。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的混合物，其中所述外源轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄小?br> 42.根據(jù)權(quán)利要求26-41中任一項(xiàng)所述的混合物，其中所述TOKl激活劑以這樣的濃度存在所述濃度足以在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞向誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的條件下將所述混合物中非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。
43.用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的試劑盒，所述試劑盒包括Η)Κ1激活劑和以下各項(xiàng)中的一種或多種 TGF β受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑； 組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或 選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，所述TOKl激活劑是變構(gòu)的TOKl激活劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述TOKl激活劑是(Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS48" )，(Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸("PS08")，2-(3- (4-氯苯基)-3-氧代-I-苯基丙基硫代)乙酸，(Z) -5-(萘-2-基)-3-苯基戍-2-烯酸("121")，或(Ζ)-5-(1Η-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸("13Z")。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的試劑盒，其中所述I3DKl激活劑是PS48。
47.根據(jù)權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括TGFP受體/ALK5抑制劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的試劑盒，其中所述TGFii受體/ALK5抑制劑是A-83-01。
49.根據(jù)權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括MEK抑制劑。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的試劑盒，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
51.根據(jù)權(quán)利要求43-50中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的試劑盒，其中所述HDAC抑制劑是丁酸鈉(NaB)。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的試劑盒，其中所述HDAC抑制劑是丙戊酸(VPA)。
54.根據(jù)權(quán)利要求43-53中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括選自O(shè)ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽的轉(zhuǎn)錄因子。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的試劑盒，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄小?br> 56.將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述非多能細(xì)胞與促進(jìn)糖酵解代謝的化合物在足以將所述細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞的條件下接觸，由此將所述非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活齊U，糖酵解的底物，糖酵解中間體或其代謝前體，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑，氧化磷酸化抑制劑，或者低氧誘導(dǎo)因子激活劑。
58.混合物，其包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、促進(jìn)糖酵解代謝的化合物和以下各項(xiàng)中的一種或多種 TGF β受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑； 組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種外源轉(zhuǎn)錄因子。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的混合物，其中所述促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活齊U，糖酵解的底物，糖酵解中間體或其代謝前體，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑，氧化磷酸化抑制劑，或者低氧誘導(dǎo)因子激活劑。
60.用于在非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的試劑盒，所述試劑盒包括促進(jìn)糖酵解代謝的化合物和以下各項(xiàng)中的一種或多種 TGF β受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑； 組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；或 選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽組成的組的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述促進(jìn)糖酵解代謝的化合物是糖酵解激活齊U，糖酵解的底物，糖酵解中間體或其代謝前體，葡萄糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活劑，線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑，氧化磷酸化抑制劑，或者低氧誘導(dǎo)因子激活劑。
全文摘要
本發(fā)明提供使用3’-磷酸肌醇依賴性激酶-1(PDK1)激活劑或促進(jìn)糖酵解代謝的化合物以及其他小分子從非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102959076SQ201180026219
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者朱賽勇, 丁生 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究所