專利名稱：產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇在本領(lǐng)域是公知的。工業(yè)上，目前主要使用兩種不同種類的方法。最常用的方法，通常稱作“常規(guī)方法”，包括在高溫使用細(xì)菌α-淀粉酶液化經(jīng)糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和發(fā)酵生物的存在下進(jìn)行同時(shí)糖化和發(fā)酵。另一種通常稱作“生淀粉水解”方法(“RSH”方法)的公知的方法類型包括在起始糊化溫度之下在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下同時(shí)糖化和發(fā)酵粒狀淀粉。盡管在過(guò)去十年間對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生方法的顯著改進(jìn)，仍有顯著量的殘余淀粉材料未轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。至少一些未轉(zhuǎn)化的殘余淀粉材料，例如糖和糊精，以無(wú)法發(fā)酵的Maillard產(chǎn)物的形式存在。因此，仍有下述期望和需求即提供從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法，其可與常規(guī)方法相比提供更高的發(fā)酵產(chǎn)物收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用發(fā)酵生物從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法，其包括下述步驟i)使用α -淀粉酶液化含淀粉材料；ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶在70°C，pH 5. 3具有至少70%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性(如實(shí)施例4中所述確定的)；iii)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。在一個(gè)實(shí)施方案中，添加至步驟ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，如本文中的SEQ ID N0:9 或 PCT/CN10/071753 中作為 SEQ ID NO:2 公開(kāi)的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)葡糖淀粉酶。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及使用發(fā)酵生物從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法相對(duì)于常規(guī)方法具有多種優(yōu)點(diǎn)。如例如實(shí)施例5中所示，在方法中將在70°C，pH 5. 3具有至少70%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性(如實(shí)施例4中所述確定)的葡糖淀粉酶如草酸青霉葡糖淀粉酶在預(yù)糖化(pH 5.0，70°C )過(guò)程中添加，與在液化(pH 4.5，85°C )過(guò)程中添加相同葡糖淀粉酶相比，導(dǎo)致更高的葡萄糖水平。當(dāng)將相同的葡糖淀粉酶在液化過(guò)程中添加時(shí)，當(dāng)不在發(fā)酵過(guò)程額外添加葡糖淀粉酶時(shí)，其性能不佳，導(dǎo)致顯著較低的發(fā)酵速率和較低的乙醇效價(jià)。然而，當(dāng)在預(yù)糖化過(guò)程中添加葡糖淀粉酶時(shí)，則當(dāng)不在發(fā)酵過(guò)程額外添加葡糖淀粉酶時(shí)，其仍性能良好，具有降低所需的酶蛋白的潛力。此外，由于所用的酶的較高熱穩(wěn)定性，可減少酶劑量。本發(fā)明的方法僅需要對(duì)現(xiàn)存方法和方法設(shè)備進(jìn)行有限的改變，因此僅需有限的資本投資。
在第一個(gè)方面本發(fā)明涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法，其包括下述步驟i)使用α -淀粉酶液化含淀粉材料；ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶在70°C，pH 5. 3具有至少70%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性(如實(shí)施例4中所述確定)；iii)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。液化步驟i)液化步驟i)可在本領(lǐng)域公知的條件下在α -淀粉酶的存在下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在液化步驟i)之前，進(jìn)一步包括下述步驟a)減少含淀粉材料的粒度；b)形成包含所述含淀粉材料和水的漿料。含淀粉起始材料,如全谷粒,可通過(guò)磨制減少粒徑，以打開(kāi)其結(jié)構(gòu)，并允許進(jìn)一步加工。通常有兩種類型的磨制方法濕磨和干磨。在干磨中，將整粒磨碎并使用。濕磨給出胚和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))的良好分離，并通常用于使用淀粉水解物產(chǎn)生例如糖漿的場(chǎng)合。干磨和濕磨在本領(lǐng)域是公知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選干磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，將粒徑減少至O. 05至3. Omm,優(yōu)選O. I至O. 5mm,或使得至少30%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選90%的含淀粉材料可穿過(guò)具有O. 05至3. Omm篩網(wǎng)，優(yōu)選O. I至O. 5mm篩網(wǎng)的篩。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，特別是至少90%的含淀粉材料通過(guò)具有#6-8篩網(wǎng)的篩。水性漿料可含有10至55w/w%干固形物(DS)，優(yōu)選25至45w/w%干固形物(DS)，更優(yōu)選30至40 /\￥%干固形物(DS)的含淀粉材料。將漿料加熱至糊化溫度以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，將漿料加熱至糊化溫度以上，優(yōu)選至80至90°C，pH 4. 5-4. 8進(jìn)行15至60分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟i)之前將漿料在95至140°C，優(yōu)選105至125°C的溫度噴射蒸煮1-15分鐘，優(yōu)選3-10分鐘，特別是約5分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，液化過(guò)程中的pH是約4. O至7. 0，如4. 5至6. 0，如約5. 8，或
4.5 至 4. 8。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Ct -淀粉酶是細(xì)菌α -淀粉酶或真菌α-淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶。合適的α-淀粉酶可見(jiàn)于下文“在液化過(guò)程中存在和/或添加的α -淀粉酶”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是熱穩(wěn)定性α-淀粉酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述細(xì)菌α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶(有時(shí)稱作嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophiIus))或其變體，其包含雙缺失如 R179* 和 G180* 或I181*+G182*，特別是I181*+G182*+N193F。若其為嗜熱淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，細(xì)菌α -淀粉酶通常以O(shè). 0005-5KNU每g DS，優(yōu)選O. 001-1KNU每gDS，如大約O. 06KNU每g DS,或 O. 0005-5KNU(S)每 g DS，優(yōu)選 O. OOl-IKNU(S)每 g DS，如約 O. 060KNU (S)每 g DS 的量添加。蛋白酶可任選地在液化步驟i)，糖化步驟ii)，和/或發(fā)酵步驟iii)，如SSF過(guò)程
5中存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶是在液化步驟i)過(guò)程中添加的熱穩(wěn)定性蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶，如熱穩(wěn)定性蛋白酶在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)，如SSF過(guò)程中添加。蛋白酶包括熱穩(wěn)定性蛋白酶的實(shí)例，可見(jiàn)于下文“在本發(fā)明的方法步驟過(guò)程中添加的蛋白酶”部分。普魯蘭酶(pullulanase)(包括淀粉普魯蘭酶)可任選地在液化步驟i)，糖化步驟ii)，和/或發(fā)酵步驟iii)，如SSF過(guò)程中存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述普魯蘭酶是在液化步驟i)過(guò)程中添加的熱穩(wěn)定性普魯蘭酶。普魯蘭酶包括熱穩(wěn)定性普魯蘭酶的實(shí)例，可見(jiàn)于下文“在本發(fā)明的方法步驟過(guò)程中存在和/或添加的普魯蘭酶”部分。糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)可分別(順序)或同時(shí)進(jìn)行在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖化作為預(yù)糖化進(jìn)行，接著進(jìn)行單獨(dú)的發(fā)酵步驟iii)，或在發(fā)酵過(guò)程中完成糖化的步驟(SSF)，S卩，預(yù)糖化然后同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)糖化步驟在發(fā)酵之前完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，在發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中，即在糖化或預(yù)糖化之后，不添加其它糖源生成酶，如葡糖淀粉酶。預(yù)糖化在與發(fā)酵條件(即適應(yīng)于發(fā)酵生物)相比更適于添加的酶(即適于糖源生成酶如葡糖淀粉酶的條件)的條件下進(jìn)行。發(fā)酵通常在顯著較低溫度，例如25至40°C，如約32°C進(jìn)行，而糖化或預(yù)糖化通常如下所示進(jìn)行。當(dāng)糖化步驟ii)作為預(yù)糖化步驟或單獨(dú)的糖化步驟進(jìn)行時(shí)，pH可為4至7，優(yōu)選pH 4. 5至5的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖化步驟ii)在50至80°C，優(yōu)選60至75°C，如約70°C的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖化步驟ii)進(jìn)行10分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選30分鐘至3小時(shí)，如90分鐘至150分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)可同時(shí)進(jìn)行，這廣泛用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生方法，如乙醇產(chǎn)生方法。當(dāng)進(jìn)行SSF時(shí)，糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)同時(shí)進(jìn)行。對(duì)于糖化并無(wú)保持階段，意指發(fā)酵生物如酵母，和酶可同時(shí)添加。SSF或單獨(dú)的發(fā)酵步驟iii)根據(jù)本發(fā)明通常在25°C至40°C，如28°C至35°C，如30°C至34°C，優(yōu)選約32°C的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵步驟iii)或SSF持續(xù)6至120個(gè)小時(shí)，特別是24至96個(gè)小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH是3. 5至5，特別是3. 8至4. 3。用于糖化步驟ii)的糖源生成酶可優(yōu)選為葡糖淀粉酶。然而，所述糖源生成酶亦可為選自下組的酶β -淀粉酶，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶，和α -葡糖苷酶，或其組合。糖源生成酶，包括特別是葡糖淀粉酶的實(shí)例，可見(jiàn)于下文“在糖化或SSF過(guò)程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。合適的葡糖淀粉酶的實(shí)例可見(jiàn)于下文“在糖化或SSF過(guò)程中存在和/或添加的糖源生成酶”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述糖源生成酶是作為PCT/CN10/071753 中 SEQ ID Ν0:2 或本文中 SEQ ID NO:9 公開(kāi)的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)葡糖淀粉酶,或其如下定義的同源物。根據(jù)本發(fā)明，所述糖源生成酶，如特別是葡糖淀粉酶，以O(shè). 0001_20AGU/gDS，優(yōu)選O. 001-10AGU/g DS，特別是 O. 01_5AGU/g DS, O. l_2AGU/g DS 的量添加。發(fā)酵培養(yǎng)基“發(fā)酵培養(yǎng)基”，指發(fā)酵進(jìn)行的環(huán)境，包含發(fā)酵底物，S卩，由發(fā)酵生物代謝的糖源。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含對(duì)于發(fā)酵生物的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)刺激物。營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)刺激物廣泛用于發(fā)酵
6領(lǐng)域，并包含氮源如氨、尿素，維生素和礦物質(zhì)，或其組合。發(fā)酵牛物術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”可指任何生物，包括細(xì)菌和真菌生物，其適用于發(fā)酵方法，并能夠產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物。特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻侨缙咸烟腔螓溠刻牵苯踊蜷g接發(fā)酵即轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。發(fā)酵生物的實(shí)例包括真菌生物如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomyces spp),具體而言,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，將發(fā)酵生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基使得活的發(fā)酵生物如酵母,在每mL發(fā)酵培養(yǎng)基中的計(jì)數(shù)為IO5至1012，優(yōu)選IO7至101。，特別是5xl07的范圍。商業(yè)上可獲得的酵母包括例如RED STAR 和ETHANOL RED 酵母(可從Fermentis/Lesaffre, USA獲得),FALI (可從Fleischmann，s Yeast, USA獲得),SUPERSTART和 THERM0SACC 新鮮酵母(可從 EthanolTechnology，WI，USA 獲得)，BIOFERM AFT 和 XR (可從 NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation, GA, USA 獲得)，GERT STRAND (可從Gert Strand AB, Sweden 獲得),和 FERMI0L (可從 DSM Specialties 獲得)。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明可使用任何合適的含淀粉材料。起始材料通?；谒璧陌l(fā)酵產(chǎn)物選擇。適用于本發(fā)明的方法的含淀粉材料的實(shí)例，包括全谷粒，玉米，小麥，大麥，黑麥，買羅高粱，西米，木薯，樹(shù)薯，高粱，稻，豌豆，豆或甘薯，或其混合物，或從其得到的淀粉，或谷類。亦涵蓋了蠟質(zhì)或非蠟質(zhì)類型的玉米和大麥。發(fā)酵產(chǎn)物術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵產(chǎn)物”意指由包括使用發(fā)酵生物的發(fā)酵步驟的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明所涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2);抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；以及激素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙醇(即，可飲用的中性酒)；或工業(yè)乙醇；或用于可消費(fèi)醇類工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如，發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的產(chǎn)物。優(yōu)選的啤酒類型包括愛(ài)兒啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porters)、陳忙啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麥芽酒(malt liquors)、發(fā)泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(lightbeer)。使用的優(yōu)選發(fā)酵方法包括醇發(fā)酵方法，如本領(lǐng)域公知。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物是燃料乙醇，其通常與汽油混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物是可飲用的乙醇?；厥赵诎l(fā)酵之后，可將發(fā)酵產(chǎn)物從發(fā)酵培養(yǎng)基分離。可蒸餾漿料以提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘?，可從發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)微過(guò)濾或膜過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵產(chǎn)物亦可通過(guò)汽提或本領(lǐng)域公知的其它方法回收。在液化過(guò)稈中存在和/或添加的α -淀粉酶根據(jù)本發(fā)明的方法，可使用任何α -淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α -淀粉酶是細(xì)菌或真菌來(lái)源的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，如特別是酸性真菌α -淀粉酶。術(shù)語(yǔ)“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E. C. 3. 2. I. I)，其以有效量添加時(shí)在3至7，優(yōu)選3. 5至6，或更優(yōu)選4-5的范圍的pH具有最佳活性。細(xì)菌α -淀粉酶根據(jù)本發(fā)明的α -淀粉酶優(yōu)選來(lái)源于芽孢桿菌屬(Bacillus)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述芽孢桿菌屬(或地芽孢桿菌屬(Geobacillus))α _淀粉酶來(lái)源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophi lus)(嗜熱脂肪地芽抱桿菌(Geobacillusstearothermophilus))的菌株，但亦可來(lái)源于其他芽孢桿菌菌種。涵蓋的α-淀粉酶的具體實(shí)例包括示于WO 99/19467中SEQ ID Ν0:4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，示于WO 99/19467中SEQ ID Ν0:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，和示于WO 99/19467中SEQ ID NO: 3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶(所有序列通過(guò)提述并入本文)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述α -淀粉酶為分別與WO 99/19467中SEQ ID NO: 1、2或3中所示的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的同一性程度的酶。所述芽孢桿菌屬α -淀粉酶亦可為變體和/或雜合體，特別是任何WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059 和 TO 02/10355 (所有文獻(xiàn)通過(guò)提述并入本文)中所描述的。具體而言，涵蓋的α-淀粉酶變體公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)6，093，562、6，297，038或美國(guó)專利號(hào)6，187，576 (通過(guò)提述并入本文)，并包括在位置R179至G182中具有一個(gè)或兩個(gè)氨基酸缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶(即，BSG α-淀粉酶)變體，所述缺失優(yōu)選為WO 1996/023873中公開(kāi)的雙缺失(參見(jiàn)，例如第20頁(yè)第1_10行，通過(guò)提述并入本文)，優(yōu)選與WO 99/19467中公開(kāi)的SEQ ID NO: 3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比對(duì)應(yīng)于Λ (181-182)，或使用WO 99/19467(通過(guò)提述并入本文)中SEQ IDN0:3的編號(hào)方式的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更優(yōu)選的是與WO 99/19467中公開(kāi)的SEQ ID NO:3中所列的野生型BSG α -淀粉酶氨基酸序列相比具有對(duì)應(yīng)于Λ (181-182)的雙缺失，并進(jìn)一步包含N193F取代(亦表示為I181*+G182*+N193F)的芽孢桿菌屬α -淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其在位置S242包含取代，優(yōu)選S242A，E或Q，特別是S242Q，或任何美國(guó)專利號(hào)
7,713, 723 (Novozymes) ,WO 2010/036515 (Danisco)或美國(guó)專利號(hào) 7，541，026 (Danisco)中要求保護(hù)的任何取代。細(xì)菌雜合α -淀粉酶具體涵蓋的雜合α -淀粉酶包含地衣芽孢桿菌α -淀粉酶(示為WO 99/19467中的SEQ ID Ν0:4)的445個(gè)C端氨基酸殘基和來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)(示為 WO 99/19467 中的 SEQ ID NO: 5)的 37 個(gè) N 端氨基酸殘基，并具有一個(gè)或多個(gè)，特別是所有的下述取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用 TO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢桿菌編號(hào)方式)。亦優(yōu)選具有一個(gè)或多個(gè)下述突變(或其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶骨架中對(duì)應(yīng)的突變)的變體H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S，和/或位置176和179之間兩個(gè)殘基的缺失，優(yōu)選缺失E178和G179 (使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5的編號(hào)方式)。在一個(gè)實(shí)施方案中，若細(xì)菌α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其以O(shè). 0005-5KNU 每 g DS，優(yōu)選 O. 001-1KNU 每 g DS，如約 O. 050KNU 每 g DS，或 O. 0005-5KNU (S)每g DS，優(yōu)選O. OOl-IKNU(S)每g DS，如約O. 060KNU(S)每g DS的量劑量添加。商業(yè)上可獲得的α-淀粉酶產(chǎn)品優(yōu)選的包含α -淀粉酶的商業(yè)性組合物包括MYC0LASE (來(lái)自DSM (Gi stBrocades)), BAN ,TERMAMYL SC,FUNGAMYL ,LIQUOZYME X,LIQUOZYME SC,LIQUOZYME SCDS 和 SAN SUPER，SAN EXTRA L(Novozymes A/S)和 CLARASE L-40, 000, DEX-LO ,SPEZYME FRED-L, SPEZYME _ HPA，SPEZYME ALPHA, SPEZYME XTRA, SPEZYME AA,SPEZYME DELTA AA，和 GC358，SPEZYME RSL (Danisco) ；FUELZYME -LF (Verenium Inc)，和以商品名SP288出售的酸性真菌α -淀粉酶(可從Novozymes A/S, Denmark)獲得)。在低pH熱穩(wěn)定的α -淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，用于步驟i)的α-淀粉酶可為在低pH (即pH 4. 5至5. 0)熱穩(wěn)定性α -淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，α -淀粉酶對(duì)于在pH 4. 5至5. O的液化中的淀粉溶解具有高活性，并在pH 4. 5-5. O和80至90。。，優(yōu)選4. 5-4. 8，85 °C具有高熱穩(wěn)定性。更具體而言，用于液化步驟i)的α -淀粉酶可優(yōu)選在pH 4. 5，85°C，0. 12mMCaCl2具有至少10的τ1/2 (分鐘)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在pH 4. 5,85°C,0. 12mM CaCl2的T1/2(分鐘)為至少15，如至少20，至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10至70，如15至70，如20至70，如25至70，如30至70，如40至70，如50至70，如60至70。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述α -淀粉酶是細(xì)菌α -淀粉酶，優(yōu)選來(lái)源于芽孢桿菌屬，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，特別是在WO 99/019467中作為SEQ ID Ν0:3(本文中的SEQ ID NO: I)公開(kāi)的、具有雙缺失I181+G182和取代N193F的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶，其進(jìn)一步包含下述突變-V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S ；-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S ；-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N ；-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L ；-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K ；-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F ；-V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K ；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S ；-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T ；-A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-E129V+K177L+R179E ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377* ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S ；-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T ；-E129V+K177L+R179E+S242Q ；-E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S ；-K220P+N224L+S242Q+Q254S ;或-M284V。在本發(fā)明的方法步驟中添加的蛋白酶根據(jù)本發(fā)明，可任選地在本發(fā)明的方法步驟中存在或添加蛋白酶。由于在液化過(guò)程中通常使用的相對(duì)高的溫度，優(yōu)選在液化步驟i)過(guò)程中與如上所述的α-淀粉酶一同添加熱穩(wěn)定性蛋白酶。在其他實(shí)施方案中，在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)，如SSF過(guò)程中添加蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明，所述含淀粉材料可用任何來(lái)源的蛋白酶如熱穩(wěn)定性蛋白酶處理。合適的蛋白酶可為真菌，細(xì)菌，包括絲狀真菌和酵母，以及植物來(lái)源。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”涵蓋肽酶和其它蛋白質(zhì)降解酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶是內(nèi)蛋白酶和/或外蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶如熱穩(wěn)定性蛋白酶，是酸性蛋白酶，即表征為在低于pH 7，例如在2至7的pH的酸性條件下水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酸性蛋白酶具有2. 5至3. 5范圍的最適pH (在37°C以O(shè). 7%w/v對(duì)高氮酪蛋白底物確定)和5至50°C的最適溫度(在10mg/mL的酶濃度，在30°C在O. IM哌嗪/乙酸(鹽)/甘氨酸緩沖液中進(jìn)行I小時(shí))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶，或熱穩(wěn)定性蛋白酶，是堿性蛋白酶，即表征為在高于pH 7，例如在7至11的pH的堿性條件下水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中所述堿性蛋白酶來(lái)源于芽孢桿菌屬優(yōu)選地衣芽孢桿菌的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿性蛋白酶具有7至11的范圍的最適溫度和在pH 9確定時(shí)，約70°C的最適溫度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶，或熱穩(wěn)定性蛋白酶，是中性蛋白酶，即表征為在pH 5至8的中性條件下水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿性蛋白酶來(lái)源于芽孢桿菌屬優(yōu)選解淀粉芽孢桿菌的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿性蛋白酶具
10有7至11的范圍的最適pH(在25°C，用O. 01-0. 2AU/L的酶濃度進(jìn)行10分鐘反應(yīng)時(shí)間確定)，和50至70°C的最適溫度(在pH 8. 5，在10分鐘反應(yīng)時(shí)間和O. 03-0. 3AU/L酶濃度確定)O合適的植物蛋白酶可來(lái)源于大麥。合適的細(xì)菌蛋白酶包括來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的芽孢桿菌屬蛋白酶。合適的絲狀細(xì)菌蛋白酶可來(lái)源于擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的菌株,優(yōu)選是Nocardiopsis prasina NRRL 18262 蛋白酶或(Nocardiopsis sp. IOR)和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonavi I la) NRRL 18133 (Nocardiopsisdassonavilla M58-1),兩者均描述于 WO 1988/003947 (Novozymes)。合適的酸性真菌蛋白酶包括來(lái)源于曲霉屬(Aspergillus),毛霉屬(Mucor)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、假絲酵母屬(Candida)、革蓋菌屬(Coriolus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、蟲(chóng)霉屬(Enthomophtra)、fE齒菌屬(Irpex)、青霉屬(Penicillium)、絲核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特別涵蓋的是來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger)(參見(jiàn)，例如，Koaze 等，1964，Agr. Biol. Chem.Japan, 28, 216)，齋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(參見(jiàn)，例如，Yoshida, 1954, J. Agr. Chem.Soc. Japan, 28, 66)，泡盛曲霉(AspergiIlusawamori) (Hayashida 等,1977 Agric. Biol.Chem.，42 (5)，927-933)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) (WO 95/02044)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶；公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)4，357，357和美國(guó)專利號(hào)3，988，207的來(lái)自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的蛋白酶；或公開(kāi)于例如WO94/24880 的曼赫根毛霉(Rhizomucor mehei)或細(xì)小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbookof Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N. D. Rawlings 和 J. F. Woessner 編，Academic Press, San Diego, 1998, 270章)。天冬氨酸蛋白酶的合適的實(shí)例包括，例如，R. M. Berka等，Gene, 96，313 (1990)；(R. Μ· Berka 等 Gene, 125，195-198) (1993);以及 Gomi 等，Biosci. Biotech.Biochem. 57，1095-1100(1993)公開(kāi)的那些，其通過(guò)提述并入本文。商業(yè)上可得到的產(chǎn)品包括ALCALASE 、ESPERASE 、NEUTRASE RENNILASE 、NOVOZYM FM 2· 0L、以及 NOVOZYM 50006 (可由 Novozymes A/S、Denmark 得到)以及來(lái)自Genencor Int.，Inc. USA.的 SPEZYME FAN。所述蛋白酶或熱穩(wěn)定蛋白酶可以以0. 0001至1.0wt%TS，優(yōu)選O. 001至O. lwt%TS的范圍的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶是金屬蛋白酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白酶來(lái)源于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)的菌株,優(yōu)選是橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的菌株，特別是具有WO 03/048353 (其通過(guò)提述并入本文)中SEQ ID NO:2的成熟部分中所示的序列的橙橘嗜熱子囊菌CGMCC No. 0670。所述橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶在20至90°C具有活性，最適溫度約70°C。此外，所述酶在pH 5至10具有活性，最佳為約pH 6。用于本發(fā)明的方法，優(yōu)選在液化步驟i)過(guò)程中添加的蛋白酶可為熱穩(wěn)定性蛋白酶，其具有以下之一
i)作為在80°C /70°C的相對(duì)活性確定的超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值；和/或ii)作為在85°C /70°C的相對(duì)活性確定的超過(guò)10%的熱穩(wěn)定性值在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶具有如下的熱穩(wěn)定性值-作為在80°C/70°C的相對(duì)活性確定的超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90%，和/或-作為在85°C/70°C的相對(duì)活性確定的超過(guò)12%，超過(guò)14%，超過(guò)16%，超過(guò)18%，超過(guò)20% ;和/或-作為在80°C的殘余活性確定的超過(guò)20%，超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90% ;和/或-作為在84°C的殘余活性確定的超過(guò)20%，超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90%和/或。純化的變體在85°C可具有如使用實(shí)施例3中公開(kāi)的Zein-BCA測(cè)定法確定的90以上，100以上的熱穩(wěn)定性?！跋鄬?duì)活性”和“殘余活性”的確定如實(shí)施例2中所述確定。蛋白酶基于其催化機(jī)理歸類于下述組絲氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金屬蛋白酶(M)和未知的或尚未分類的蛋白酶(U)。參見(jiàn)Handbook of ProteoIyticEnzymes, A. J. Barrett, N.D. Rawlings, J. F. Woessner (編)，Academic Press (1998)，特別是一般簡(jiǎn)介部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法的熱穩(wěn)定性蛋白酶是金屬蛋白酶，其定義為屬于EC 3.4. 24的蛋白酶(金屬內(nèi)肽酶)；優(yōu)選為EC 3. 4. 24. 39 (酸性金屬蛋白酶)。為了確定給定蛋白酶是否金屬蛋白酶，可參照上述“Handbook ofProteolyticEnzymes”，以及其中指示的原則。此種確定可對(duì)于所有類型的蛋白酶進(jìn)行，無(wú)論其為天然存在或野生型的蛋白酶，或?yàn)榛蚬こ袒蚝铣傻牡鞍酌?。蛋白酶活性可使用任何合適的測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量，其中使用底物，所述底物含有與所述蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。測(cè)定pH和測(cè)定溫度同樣應(yīng)適應(yīng)所述蛋白酶。測(cè)定pH值的實(shí)例為pH 6、7、8、9、10或11。測(cè)定溫度的實(shí)例為30、35、37、40、45、
50、55、60、65、70 或 80。。。蛋白酶底物的實(shí)例為酪蛋白，如天青精交聯(lián)的酪蛋白(Azurine-CrosslinkedCasein) (AZCLcasein)。下文在“材料和方法”部分描述了兩種蛋白酶測(cè)定法，其中所謂“AZCL-酪蛋白測(cè)定法”是優(yōu)選的測(cè)定法。所述熱穩(wěn)定性蛋白酶可為例如野生型蛋白酶的變體，只要所述蛋白酶具有如上所定義的熱穩(wěn)定性性質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白酶是如上所定義的金屬蛋白酶的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法的蛋白酶是真菌來(lái)源的，如真菌金屬蛋白酶，如來(lái)源于如下的真菌金屬蛋白酶嗜熱子囊菌屬，優(yōu)選為橙橘嗜熱子囊菌的菌株，特別是橙橘嗜熱子囊菌CGMCCNo. 0670的菌株(歸類為EC 3. 4. 24. 39)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白酶是WO 2010/008841中SEQ ID NO: I的成熟部分或WO 2003/048353中公開(kāi)的SEQ ID NO:2中所示的金屬蛋白酶的成熟部分，和在本文中示為SEQ ID NO:3的具有下述突變的變體
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L-D79L+Y82F+S87P+AII2P+TI24V+DI42L-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L-D79L+S87P+A112P+D142L-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L。在糖化或SSF過(guò)程中存在和/或添加的糖源生成酶根據(jù)本發(fā)明，在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)如SSF過(guò)程中存在和/或添加糖源生成酶。亦存在或添加蛋白酶如熱穩(wěn)定性蛋白酶。如上所述，亦可在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中存在和/或添加普魯蘭酶。
術(shù)語(yǔ)“糖源生成酶”包括任何生成可發(fā)酵的糖的酶。糖源生成酶能夠產(chǎn)生糖，其可被所述發(fā)酵生物用作能源，例如，當(dāng)用于本發(fā)明的方法以供產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇時(shí)。生成的糖可直接或間接轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。根據(jù)本發(fā)明，可使用糖源生成酶的混合物。具體的實(shí)例包括葡糖淀粉酶(其為葡萄糖生產(chǎn)者)，淀粉酶，和產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(其為麥芽糖生產(chǎn)者)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，如熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，可與α -淀粉酶和任選地蛋白酶和/或普魯蘭酶一同添加或分別添加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖源生成酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，在85°C具有至少20%，至少30%，優(yōu)選至少35%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在PH 4. 5具有至少80 %，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%，優(yōu)選至少95%的相對(duì)活性。在一個(gè)具體而優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述糖源生成酶是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，優(yōu)選為真菌來(lái)源的，優(yōu)選絲狀真菌如來(lái)源于青霉屬的菌株，特別是草酸青霉的菌株，其在PCT/CN10/071753(其通過(guò)提述并入本文)中作為SEQ IDN0:2公開(kāi)并在本文中示于SEQ IDN0:9。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶與PCT/CN10/071753中的SEQ IDNO: 2或本文中的SEQ ID NO: 9所示的成熟多肽具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%同一性。在本發(fā)明的方法步驟過(guò)程中存在和/或添加的普魯蘭酶任選地，在液化步驟i)，糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)如SSF過(guò)程中可存在或添加普魯蘭酶(包括淀粉普魯蘭酶)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述普魯蘭酶是在液化步驟i)過(guò)程中添加的熱穩(wěn)定性普魯蘭酶。熱穩(wěn)定性普魯蘭酶可在液化步驟i)過(guò)程中與α-淀粉酶和任選地?zé)岱€(wěn)定性蛋白酶一同存在和/或添加。所述普魯蘭酶可在本發(fā)明的方法步驟如液化步驟i)，糖化步驟ii)，發(fā)酵步驟
iii)和/或同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)過(guò)程中存在和/或添加。普魯蘭酶(E. C. 3. 2. I. 41，普魯蘭6_葡聚糖水解酶)是由其水解例如支鏈淀粉和普魯蘭中的α-1，6-糖苷鍵的能力表征的脫支酶。根據(jù)本發(fā)明涵蓋的普魯蘭酶包括美國(guó)專利號(hào)4，560，651 (通過(guò)提述并入本文)中公開(kāi)的來(lái)自Bacillus amyloderamif icans的普魯蘭酶，在WO 01/151620 (通過(guò)提述并入本文)作為SEQ ID N0:2公開(kāi)的普魯蘭酶，在WO 01/151620 (通過(guò)提述并入本文)中作為 SEQ ID NO: 4 公開(kāi)的 Bacillus deramif icans，和在 W001/151620 (通過(guò)提述并入本文)中作為 SEQ ID NO:6 公開(kāi)并亦描述于 FEMSMic. Let. (1994) 115，97-106 的來(lái)自 Bacillusamyloderamif icans 的普魯蘭酶。根據(jù)本發(fā)明涵蓋的其它普魯蘭酶包括來(lái)自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的普魯蘭酶，特別是WO 92/02614中公開(kāi)的來(lái)自沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)DSM No. 3773
的普魯蘭酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述普魯蘭酶是GH57普魯蘭酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述普
14魯蘭酶含有如公開(kāi)于PCT/US10/061761(其通過(guò)提述并入本文)的X47域。更具體而言， 所述普魯蘭酶可來(lái)源于熱球菌屬(Thermococcus)的菌株,包括Thermococcus Iitoralis 和 Thermococcus hydrothermal is 的菌株，如 SEQ IDNO:11 中所不的 Thermococcus hydrothermal is普魯蘭酶，其在X47域(即SEQID NO: 11和12中的氨基酸1-782)之后在位點(diǎn)X4被截短。所述普魯蘭酶亦可為Thermococcus Iitoralis和Thermococcus hydrothermal is的普魯蘭酶的雜合體或PCT/US10/061761 (其通過(guò)提述并入本文)中公開(kāi)的并在SEQ ID NO: 12公開(kāi)的具有截短位點(diǎn)X4的T. hydrothermalis/T. Iitoralis雜合體酶。
普魯蘭酶可根據(jù)本發(fā)明以有效量添加，其包括約O. 0001-IOmg酶蛋白每克DS的優(yōu)選量，優(yōu)選O. 0001-0. IOmg酶蛋白每克DS，更優(yōu)選O. 0001-0. OlOmg酶蛋白每克DS。普魯蘭酶活性可作為NPUN確定。用于確定NPUN的測(cè)定法描述于下文“材料和方法”部分。
合適的商業(yè)上可獲得的普魯蘭酶產(chǎn)品包括PROMOZYME D, PR0M0ZYME D2(Novozymes A/S,Denmark), OPTIMAX L-300 (GenencorInt.,USA),和 AMANO 8 (Amano, Japan)。
在糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中存在和/或添加的其它糖源生成酶
根據(jù)本發(fā)明，在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中可存在和/或添加其它糖源生成酶，優(yōu)選其它葡糖淀粉酶。其它糖源生成酶亦可為選自下組的酶β -淀粉酶，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶，和α-葡糖苷酶。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述其它糖源生成酶是真菌來(lái)源的葡糖淀粉酶，優(yōu)選來(lái)自曲霉屬的菌株，優(yōu)選黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉的菌株；或木霉屬(Trichoderma)的菌株，優(yōu)選里氏木霉(T. reesei)的菌株；或踝節(jié)菌屬(Talaromyces)的菌株,優(yōu)選埃默森踝節(jié)菌(T. emersonii)的菌株。
在糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中存在和/或添加的其它葡糖淀粉酶
根據(jù)本發(fā)明，在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)如SSF過(guò)程中可存在和/或添加其它葡糖淀粉酶。所述其它葡糖淀粉酶可來(lái)源于任何合適的來(lái)源，例如來(lái)源于微生物或植物。優(yōu)選的其它葡糖淀粉酶是真菌或細(xì)菌來(lái)源的，選自下組曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J. 3 (5) : 1097-1102)，或其變體，如 WO 92/00381, WO 00/04136 和 WO 01/04273 (來(lái)自 Novozymes, Denmark)中公開(kāi)的那些；WO 84/02921中公開(kāi)的泡盛曲霉(A. awamori)葡糖淀粉酶,米曲霉葡糖淀粉酶(Agric. Biol. Chem.，(1991) 55 (4)，p. 941-949)，或它們的變體或片段。其他曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chen等，1996, Prot. Eng. 9:499-505)； D257E 和 D293 E/Q(Chen 等，1995，Prot. Eng. 8，575-582) ；N182(Chen 等，1994，Biochem. J. 301:275-281) ;二硫鍵、A246C (Fierobe 等，1996, Biochemistry, 35:8698-8704);以及在 A435 和 S436 位置導(dǎo)入 Pro 殘基(Li 等，1997，Protein Eng. 10:1199-1204)。
其它的其它葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(之前表示為羅耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 4，727，026 和(Nagasaka 等，1998，“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol. 50:323-330)),踩節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是源自埃莫森踩節(jié)菌(Talaromyces emersonii) (W0 99/28448)、TalaromycesIeycettanus (美國(guó)專利號(hào)Re. 32, 153)、杜邦踩節(jié)菌(Talaromyces duponti)、嗜熱踩節(jié)菌 (Talaromyces thermophilus)(美國(guó)專利號(hào)4，587，215)的葡糖淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中公開(kāi)的埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶。
涵蓋的其它細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來(lái)自梭菌屬(Clostridum),特別是熱解淀粉梭菌(C. thermoamylolyticum) (EP 135, 138)和熱硫化氫梭菌(C. thermohydrosulfuricum) (W0 86/01831)以及瓣環(huán)栓菌(Trametes cingulata),紙質(zhì)大紋飾抱(Pachykytospora papyracea),以及大白樁燕(Leucopaxillus giganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于TO 2006/069289 ；或WO 2007/124285中公開(kāi)的紅邊隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata);或其混合物。根據(jù)本發(fā)明亦涵蓋了雜合體葡糖淀粉酶。所述雜合體葡糖淀粉酶的實(shí)例公開(kāi)于W02005/045018。特定的實(shí)例包括實(shí)施例I表I和4中公開(kāi)的雜合體葡糖淀粉酶(該雜合體通過(guò)提述并入本文)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它葡糖淀粉酶來(lái)源于密孔菌屬(Pycnoporus),特別是如US 61/264,977中所述的密孔菌屬的菌株，或來(lái)自Glo印hyllum屬的菌株，特別是如US 61/406, 741中所述的Gloephyllum的菌株,或擬層孔菌屬(Nigrofomes)的菌株,特別是US 61/411，044中公開(kāi)的擬層孔菌屬菌種的菌株。
涵蓋的還有如下的其它葡糖淀粉酶，即與任何上面提及的葡糖淀粉酶顯示高同一性，即，與上面提及的成熟酶序列顯示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
所述其它葡糖淀粉酶可以以O(shè). 0001-20AGU/g DS，優(yōu)選O. 001_10AGU/gDS，特別是在 O. 01-5AGU/g DS，如 O. l_2AGU/g DS 的量添加。
商業(yè)上可獲得的包含其它葡糖淀粉酶的組合物包括AMG 200L, AMG300 L、SAN SUPER,SAN EXTRA L、SPIRIZYME PLUS、SPIRIZYME FUEL、SPIRIZYME B4U,SPIRIZYME ULTRA和 AMGtmE (來(lái)自 Novozymes A/S) ；0PTIDEX 300，GC480，GC417 (來(lái)自 Genencorlnt.)； AMIGASE 和AMIGASE PLUS (來(lái)自 DSM) ；G-ZYME G900、G-ZYME 和G990ZR (來(lái)自 Genencor Int.) o
產(chǎn)麥芽糖淀粉酶
在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中存在和/或添加的其它糖源生成酶可為產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶?！爱a(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶， Ε. C. 3. 2. I. 133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬搔翗?gòu)象的麥芽糖。來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株NCIB 11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶商業(yè)上可由Novozymes A/S得到。產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶描述于美國(guó)專利號(hào)4，598，048，4，604, 355和6，162，628，其通過(guò)提述并入本文。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述產(chǎn)麥芽糖淀粉酶可以以O(shè). 05-5mg總蛋白/克DS或 O. 05-5MANU/g DS 的量添加。
在下述編號(hào)的段落中進(jìn)一步描述本發(fā)明
[I] 一種用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括下述步驟
i)使用α -淀粉酶液化含淀粉材料；
ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶具有在70°C，pH 5. 3，如實(shí)施例4 中所述確定的至少70%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性；
iii)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。
[2]段I的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，優(yōu)選為真菌葡糖淀粉酶。
[3]段I或2的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在70°C ,pH 5.3,至少80%，優(yōu)選至少85%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性。
[4]段1-3任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在PH 4. 5至少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%的相對(duì)活性。
[5]段1-4任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在pH 4. 5至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%相對(duì)活性的pH穩(wěn)定性。
[6]段1-5任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，來(lái)源于青霉屬的菌株，特別是來(lái)自草酸青霉的菌株作為PCT/CN10/071753中的SEQ ID N0:2或本文中的SEQ ID N0:9公開(kāi)。
[7]段1-6任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶與PCT/ CN10/071753中的SEQ ID N0:2或本文中SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100% 同一I"生。
[8]段1-7任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步其中在發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中未添加任何其它糖源生成酶。
[9]段1-8任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)在pH 4_7，優(yōu)選pH 4. 5-5進(jìn)行。
[10]段1-9任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)在50°C至80°C，優(yōu)選約70°C的溫度進(jìn)行。
[11]段1-9任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)進(jìn)行10分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選30分鐘至3小時(shí)。
[12]段1-11任一項(xiàng)的方法，其中液化步驟i)使用細(xì)菌α -淀粉酶或真菌α -淀粉酶進(jìn)行。
[13]段12的方法，其中所述細(xì)菌α-淀粉酶是芽孢桿菌屬淀粉酶，優(yōu)選來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶或其變體，它們包含雙缺失如R179*和G180*或 I181*+G182*，特別是I181*+G182*+N193F ;或者嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶，其在位置 S242包含取代，優(yōu)選為S242A，E或Q，特別是S242Q。
[14]段1-13任一項(xiàng)的方法，其中若其為嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，所述細(xì)菌 α -淀粉酶以 O. 0005-5KNU 每 g DS，優(yōu)選 O. 001-1KNU 每 g DS，如約 O. 060KNU 每 g DS 或 O. 0005-5KNU(S)每 g DS，優(yōu)選 O. OOl-IKNU(S)每 g DS，如約 O. 060KNU (S)每 g DS 的量使用。
[15]段1-14任一項(xiàng)的方法，其中在液化過(guò)程中的pH為約4. O至7.0，如4. 5至 6.0，優(yōu)選約5.8。
[16]段1-15的方法，在液化步驟i)之前，進(jìn)一步包括下述步驟
i)磨制含淀粉材料；
ii)形成漿料，其包含經(jīng)磨制的含淀粉材料和水。
[17]段16的方法，其中將所述漿料加熱至起始糊化溫度以上。
[18]段16或17的方法，其中將所述漿料在步驟i)之前在95至140°C，優(yōu)選105 至125°C的溫度噴射蒸煮1-15分鐘，優(yōu)選3-10分鐘，特別是約5分鐘。
[19]段1-18的組合物，其中用于液化步驟i)的α _淀粉酶是細(xì)菌α _淀粉酶，特別是芽孢桿菌屬，如嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株的，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，如W099/019467中的SEQ ID Ν0:3或本文中的SEQ IDN0:1中所示的。
[20]段1-19任一項(xiàng)的方法，其中用于液化步驟i)的α -淀粉酶在pH 4. 5，85°C， O. 12mM CaCl2具有至少10的T1/2 (分鐘)。
[21]段1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述α -淀粉酶在pH 4. 5，85。。，O. 12mMCaCl2具有至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如 10至70，如15至70，如20至70，如25至70，如30至70，如40至70，如50至70，如60至 70的T1/2 (分鐘)。
[22]段1-21任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)分別或同時(shí)進(jìn)行。
[23]段1-22任一項(xiàng)的方法，其中至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，特別是至少90%的含淀粉材料穿過(guò)具有#6-8篩網(wǎng)的篩。
[24]段1-23任一項(xiàng)的方法，其中在步驟i)的液化之前進(jìn)行噴射蒸煮步驟。
[25]段1-24任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵在25°C至40°C，如28°C至35°C，如30°C至 34°C，優(yōu)選約32°C的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行6至120個(gè)小時(shí)，特別是 24至96個(gè)小時(shí)。
[26]段1-25任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵之后回收，如通過(guò)蒸餾。
[27]段1-26任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇，優(yōu)選乙醇，優(yōu)選燃料乙醇、可飲用的乙醇或工業(yè)乙醇。
[28]段1-27任一項(xiàng)的方法，其中所述含淀粉起始材料是全谷粒。
[29]段1-28任一項(xiàng)的方法，其中所述含淀粉材料來(lái)源于玉米、小麥、大麥、黑麥、 買羅高粱、西米、木薯、樹(shù)薯、木薯淀粉、高粱、稻或馬鈴薯。
[30]段1-29任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母，優(yōu)選酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母的菌株。
[31]段1-30的方法，其中蛋白酶，優(yōu)選真菌蛋白酶在液化步驟i)或糖化步驟ii) 和/或發(fā)酵如SSF過(guò)程中存在。
[32]段1-31任一項(xiàng)的方法，其中蛋白酶是熱穩(wěn)定性蛋白酶，其具有在80°C /70V 作為相對(duì)活性確定的超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值。
[33]段1-32任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶具有在80°C /70°C作為相對(duì)活性確定的超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90%的熱穩(wěn)定性。
[34]段1-33的方法，其中所述蛋白酶具有在85°C /70°C作為相對(duì)活性確定的超過(guò) 12%，超過(guò)14%，超過(guò)16%，超過(guò)18%，超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性。
[35]段31-34任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶是來(lái)源于嗜熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌的菌株，特別是橙橘嗜熱子囊菌CGMCC No. 0670的金屬蛋白酶的變體。
[36]段31-35任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶是作為WO 2003/048353中公開(kāi)的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:3或W02010/008841中SEQ ID NO: I的成熟部分公開(kāi)的金屬蛋白酶的變體。
[37]段31-36任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶變體與WO 2003/048353中公開(kāi)的 SEQ ID N0:2的多肽的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:3或W02010/008841中的SEQ ID NO: I的成熟部分具有至少75%同一性，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少 95%,如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%同一性。
[38]段1-37任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步其中普魯蘭酶在液化步驟i)和/或糖化步驟 ii)過(guò)程中存在。
[39]段38的方法，其中在在液化步驟i)和/或糖化步驟ii)過(guò)程中存在的普魯蘭酶是家族GH57普魯蘭酶，其中所述普魯蘭酶優(yōu)選含有如PCT/US10/061761中公開(kāi)的X47 域。
[40]段38或39的方法，其中所述普魯蘭酶來(lái)源于來(lái)自熱球菌屬的菌株，包括 Thermococcus Iitoralis 和 Thermococcus hydrothermalis 的菌株，或其雜合體。
[41]段38-40任一項(xiàng)的方法,其中所述普魯蘭酶是在位點(diǎn)X4截短的Thermococcus hydrothermal is普魯蘭酶，或具有在PCT/US10/061761中公開(kāi)的截短位點(diǎn)X4，或示于本文中的 SEQ ID NO: 12 的 T. hydrothermal is/T. Iitoralis 雜合體酶。
材料和方法
材料:
α -淀粉酶A :具有突變I181*+G182*+N193F，截短至491個(gè)氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶(本文中的SEQ ID NO: I)
葡糖淀粉酶T :約9:1比例的WO 99/28448中作為SEQ ID Ν0:7公開(kāi)的埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶和WO 06/069289中公開(kāi)的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶。
酵母可從Red Star/Lesaffre, USA 獲得的 RED STAR ETHANOL RED 。
方法:
同一性兩個(gè)氨基酸序列間或兩個(gè)核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)”同一性”所描述。
就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度，以及兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度，可通過(guò)程序“Align”確定,其為Needleman-Wunsch比對(duì)(即全局比對(duì))。使用該程序以供多肽以及核苷酸序列的比對(duì)。使用缺省的評(píng)分矩陣BL0SUM50以供多肽比對(duì)，并使用缺省的同一性矩陣以供核苷酸比對(duì)。對(duì)于第一個(gè)缺口的殘基的罰分對(duì)于多肽是-12，而對(duì)于核苷酸是-16。對(duì)于缺口的進(jìn)一步的殘基的罰分對(duì)于多肽是_2，而對(duì)于核苷酸是-4。
“Align” 是 FASTA 程序包版本 v20u6 的一部分(參見(jiàn) W. R. Pearson 和 D. J. Lipman(1988)， " Improved Tools for Biological Sequence Analysis"，PNAS85:2444-2448，和W. R. Pearson(1990)" Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA, " Methods in Enzymology 183:63-98)。 FASTA 蛋白比對(duì)使用Smith-Waterman算法而對(duì)缺口大小無(wú)限制(參見(jiàn)“Smith-Waterman算法”, T. F. Smith 和 M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197)。
蛋白酶測(cè)定法
AZCL-酪蛋白測(cè)定法
將O. 2%藍(lán)色底物AZCL-酪蛋白溶液攪拌懸于硼砂(Borax) /NaH2PO4緩沖液pH 9 中。一邊攪拌一邊將所述溶液分配到微滴定板上(每孔100 μ L)，添加30 μ L酶試樣，然后將板在Eppendorf熱混合器中在45°C和600rpm溫育30分鐘。使用變性的酶試樣(100°C 煮沸20分鐘)作為空白。在溫育后，通過(guò)將微滴定板轉(zhuǎn)移至冰上而終止反應(yīng)，且通過(guò)在4°C 以3000rpm離心5分鐘來(lái)將有色溶液與固體分開(kāi)。將60 μ L上清轉(zhuǎn)移至微滴定板，并使用 BioRad微板讀數(shù)器測(cè)量在595nm的吸光度。
DNA測(cè)丨定法
將50 μ L含蛋白酶樣品添加至微滴定板，并通過(guò)添加100 μ L ImM ρΝΑ底物(5mg 溶于100 μ L DMSO,并進(jìn)一步用硼砂/NaH2PO4緩沖液ρΗ9. O稀釋至IOmL)來(lái)起始所述測(cè)定法。監(jiān)測(cè)OD4tl5在室溫的增加作為蛋白酶活性的量度。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以用葡糖淀粉酶單位(AGU)來(lái)測(cè)量。
Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在37°C，pH4. 3，底物麥芽糖23. 2mM，緩沖液 乙酸鹽O. 1M，反應(yīng)時(shí)間5分鐘的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解I微摩爾麥芽糖的酶量。
可使用自動(dòng)分析儀系統(tǒng)。將變旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脫氫酶試劑中，使得存在的任何a -D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為β -D-葡萄糖。葡萄糖脫氫酶特異性地與β -D-葡萄糖在上述提及的反應(yīng)中反應(yīng)，形成NADH，其使用光度計(jì)在340nm處確定作為起始葡萄糖濃度的量度。
權(quán)利要求
1.一種用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括下述步驟i)使用α -淀粉酶液化含淀粉材料； )使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶具有在70°C，pH 5. 3，至少70%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性；iii)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。
2.權(quán)利要求I的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，優(yōu)選真菌葡糖淀粉酶。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在70°C ,pH 5.3,至少80%，優(yōu)選至少85%相對(duì)活性的熱穩(wěn)定性。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在PH 4. 5至少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%的相對(duì)活性。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，具有在pH 4. 5至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%相對(duì)活性的pH穩(wěn)定性。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，來(lái)源于青霉屬的菌株，特別是來(lái)自草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的菌株作為PCT/CN10/071753 中的 SEQ ID NO:2 或本文中的 SEQID NO:9 公開(kāi)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中添加至糖化步驟ii)的葡糖淀粉酶與PCT/CN10/071753中的SEQ ID N0:2或本文中SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%同一I"生。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)在50°C至80°C，優(yōu)選約70°C的溫度進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中糖化步驟ii)進(jìn)行10分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選30分鐘至3小時(shí)。
10.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中液化步驟i)使用細(xì)菌α-淀粉酶或真菌α -淀粉酶進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，在液化步驟i)之前，進(jìn)一步包括下述步驟i)磨制含淀粉材料；ii)形成衆(zhòng)料，其包含經(jīng)磨制的含淀粉材料和水。
12.權(quán)利要求11的方法，其中將所述漿料加熱至起始糊化溫度以上。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中將所述漿料在步驟i)之前在95至140°C，優(yōu)選105至125°C的溫度噴射蒸煮1-15分鐘，優(yōu)選3-10分鐘，特別是約5分鐘。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中用于液化步驟i)的0-淀粉酶在!^4.5，851，O. 12mM CaCl2具有至少10的T1/2 (分鐘)。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中蛋白酶，優(yōu)選真菌蛋白酶在液化步驟i)或糖化步驟ii)和/或發(fā)酵如SSF過(guò)程中存在。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中蛋白酶是熱穩(wěn)定性蛋白酶，其具有在80°C/70°C作為相對(duì)活性確定的超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶具有在80°C/70°C作為相對(duì)活性確定的超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90%的熱穩(wěn)定性。
18.權(quán)利要求1-17的方法，其中所述蛋白酶具有在85°C/70°C作為相對(duì)活性確定的超過(guò)12%，超過(guò)14%，超過(guò)16%，超過(guò)18%，超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性。
19.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶是來(lái)源于嗜熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株,特別是橙橘嗜熱子囊菌CGMCCNo. 0670的金屬蛋白酶的變體。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步其中普魯蘭酶在液化步驟i)和/或糖化步驟ii)過(guò)程中存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中使用熱穩(wěn)定性糖源生成酶在發(fā)酵或SSF之前將液化醪糖化或預(yù)糖化。
文檔編號(hào)C12P7/14GK102939386SQ201180029362
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者R·戴恩哈默, G·科沃德-凱利, 李明, 段俊欣, 劉錚, 福山志朗, 綾部圭 申請(qǐng)人:諾維信公司, 諾維信北美公司