專利名稱：自刪除質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法。具體而言，本發(fā)明涉及在一定條件下培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，所述條件允許根據(jù)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行選擇和選擇標(biāo)記基因的隨后去除。本發(fā)明還涉及通過(guò)本方法制備的質(zhì)粒在制備用于治療和疫苗目的的重組蛋白、制備治療性DNA和DNA疫苗、以及使用活細(xì)菌載體向患者遞送重組蛋白和DNA中的用途。通過(guò)引用將本文涉及的所有文件并入本文。
背景技術(shù)：
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質(zhì)粒是自我復(fù)制的DNA分子，其天然存在于細(xì)菌、古生菌和一些單細(xì)胞真核生物，例如酵母。近年來(lái)，質(zhì)粒在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中必不可少，可用于表達(dá)重組蛋白基因以及作為DNA治療劑和疫苗。對(duì)于這些應(yīng)用，通常修飾編碼感興趣基因的質(zhì)粒，并使其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如大腸桿菌(Escherichia coli)。質(zhì)粒通常編碼抗生素抗性基因,從而能夠?qū)崿F(xiàn)抗生素選擇，抗生素選擇是用于鑒定轉(zhuǎn)化后含有質(zhì)粒的細(xì)胞，其中向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入的選擇性抗生素能夠殺死丟失質(zhì)粒的細(xì)胞。然而，使用抗生素進(jìn)行質(zhì)粒選擇和維持有多種弊端。第一，抗生素抗性基因在宿主細(xì)胞中的組成型表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生代謝負(fù)擔(dān)，這會(huì)降低細(xì)胞活力并增加質(zhì)粒丟失的頻率。第二，抗生素是生產(chǎn)過(guò)程中的額外的污染，發(fā)酵過(guò)程中的抗生素降解會(huì)降低選擇壓力。第三，對(duì)于DNA治療劑和疫苗，使用抗生素抗性基因會(huì)具有在環(huán)境中轉(zhuǎn)入病原體的危險(xiǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)生抗生素抗性病原株。當(dāng)使用活細(xì)菌株作為向患者遞送基因的載體時(shí)，存在急性危險(xiǎn)。因此，需要開發(fā)出不使用抗生素抗性基因的質(zhì)粒選擇機(jī)制。已經(jīng)發(fā)展出的備選技術(shù)需要表達(dá)的選擇標(biāo)記基因，例如能補(bǔ)充宿主染色體中缺失的拷貝的必需基因的功能拷貝。胸苷酸合酶基因thyA (McNeil et al.2000, Appl.Environ.Microbiol., 66:1216-1219)或參與二氛基庚二酸合成的 asd 基因(Degryse 1991, Mol.Gen.Genet.227:49-51)已經(jīng)被用作細(xì)胞中質(zhì)粒的選擇基因，該細(xì)胞中的染色體基因是無(wú)功能的。該方法和抗生素選擇均有相同的重要缺點(diǎn):選擇標(biāo)記基因的存在和表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的代謝負(fù)擔(dān)，并易于使質(zhì)粒選擇性丟失(Bentley et al.1990, Biotechnol.Bioeng.35:668-681)。已經(jīng)開發(fā)出了兩種更新的技術(shù)，其不需要選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，因此降低細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)。ORT(操縱基因-阻遏蛋白滴定)利用修飾的細(xì)菌細(xì)胞，其中必需的染色體基因被置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。阻遏蛋白與鄰近啟動(dòng)子的操縱基因序列結(jié)合，阻止必需基因的表達(dá)，從而在不存在誘導(dǎo)劑的情況下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)用含有操縱基因序列的多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ORT細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，通過(guò)質(zhì)粒滴定阻遏蛋白，并使必需基因表達(dá)，從而允許細(xì)胞生長(zhǎng)并因此允許質(zhì)粒選擇和維持(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。另一個(gè)無(wú)選擇標(biāo)記基因的系統(tǒng)(oriSELECT)利用了 pMBl復(fù)制起點(diǎn)，在分子遺傳學(xué)研究和開發(fā)中使用的大多數(shù)質(zhì)粒中均存在pMBl復(fù)制起點(diǎn)。pMBl ori天然產(chǎn)生用來(lái)調(diào)節(jié)其拷貝數(shù)的反義RNA，修飾oriSELECT細(xì)胞，使得該RNA與對(duì)應(yīng)的有義序列的mRNA相互作用，有義序列被設(shè)計(jì)在與調(diào)節(jié)必需基因的的阻遏基因或毒素基因的基因融合體中，使得細(xì)胞存活需要質(zhì)粒的存在(Cranenburgh 2005，W006/003412)。這些無(wú)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于，需要對(duì)微生物細(xì)胞的染色體進(jìn)行遺傳修飾。這些修飾在許多物種中存在技術(shù)難度，甚至在易于接受遺傳操作的物種中，這些修飾耗時(shí)并且需要的工作量大。因此，仍需要開發(fā)出不含有選擇標(biāo)記基因且不需要對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的質(zhì)粒選擇系統(tǒng)。發(fā)明描述本申請(qǐng)的發(fā)明人開發(fā)出了制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的系統(tǒng)。在開發(fā)本系統(tǒng)時(shí)，本申請(qǐng)的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在無(wú)質(zhì)粒維持系統(tǒng)的情況下，無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞中維持。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是意想不到的，因?yàn)樵谌鄙儋|(zhì)粒維持系統(tǒng)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)預(yù)測(cè)質(zhì)粒從宿主細(xì)胞中丟失。這個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)可能是由于在去除選擇標(biāo)記基因之后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的代謝負(fù)擔(dān)大幅降低。因此，第一方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括如下步驟:a)在第一宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，第一宿主細(xì)胞環(huán)境不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后在第二宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)質(zhì)粒，第二宿主細(xì)胞環(huán)境能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。宿主細(xì)胞環(huán)境 術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞環(huán)境”包括宿主細(xì)胞本身和宿主細(xì)胞環(huán)境的條件。因此，如果質(zhì)粒被從第一宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第二宿主細(xì)胞或者如果宿主細(xì)胞的條件改變，則宿主細(xì)胞環(huán)境改變。在后一情況中，第一宿主細(xì)胞環(huán)境和第二宿主細(xì)胞環(huán)境是暫時(shí)分開的。通常，通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)的條件來(lái)改變宿主細(xì)胞中的條件?？梢愿淖兊臈l件包括但不限于滲透濃度、溫度、是否存在誘導(dǎo)劑、細(xì)胞生長(zhǎng)期和能夠改變DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)或超螺旋的化合物的存在。因此，第二方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在第一宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，第一宿主細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后在第二宿主細(xì)胞中培養(yǎng)質(zhì)粒，第二宿主細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。第三方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在一定滲透濃度下，在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，在所述滲透濃度下不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后改變宿主細(xì)胞的滲透濃度，從而能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。第四方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在一定溫度下，在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，在所述溫度下不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后改變宿主細(xì)胞的溫度，從而能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。第五方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在缺少誘導(dǎo)劑的條件下，在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，在缺少誘導(dǎo)劑的條件下不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后向宿主細(xì)胞添加誘導(dǎo)劑，從而能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。第六方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在能改變質(zhì)粒的DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)或超螺旋的化合物的存在下，在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，所述化合物的存在使細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及
b)隨后改變細(xì)胞內(nèi)化合物的水平，從而能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除選擇標(biāo)記基因。第七方面，本發(fā)明涉及制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟:a)在缺少能夠作用于位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶的條件下，在第一宿主細(xì)胞中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，從而細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及b)隨后在能夠作用于位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶的存在下，在第二宿主細(xì)胞中培養(yǎng)質(zhì)粒，從而去除選擇標(biāo)記基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)上述改變中的一種或多種可以改變宿主細(xì)胞環(huán)境。位點(diǎn)特異性重組酶在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法利用內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶，從而在第二宿主細(xì)胞環(huán)境中實(shí)現(xiàn)選擇標(biāo)記基因的去除。這樣是有利的，因?yàn)椴恍枰獙?duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，從而使方法更簡(jiǎn)單并且更高效。所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性”表示位點(diǎn)特異性重組酶來(lái)源于與第二宿主細(xì)胞環(huán)境相同的細(xì)胞類型。通常，位點(diǎn)特異性重組酶來(lái)源于第二宿主細(xì)胞環(huán)境，即，第二宿主細(xì)胞環(huán)境不必接受遺傳操作，即含有能夠表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶的基因。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，作用于本發(fā)明方法中的質(zhì)粒的內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶的性質(zhì)取決于質(zhì)粒內(nèi)存在的位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)的性質(zhì)。利用內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶能提供優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴恍枰敕词酵庠粗亟M酶。這簡(jiǎn)化了方法，使方法更快捷、更便宜并且更高效，因?yàn)椴恍枰揎椝拗骷?xì)胞環(huán)境來(lái)表達(dá)重組酶。在其它實(shí)施方案中，內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶可以包括XerC、XerD,CodV、RipX、Cre、Int、Xis、P22、Flp 和 Rl 中的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶可選自Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX和 CodV。在另一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶可以是轉(zhuǎn)座酶。優(yōu)選地，位點(diǎn)特異性重組酶是XerC和XerD。更優(yōu)選地，XerC和XerD位點(diǎn)特異性重組酶是內(nèi)源性的。在原核細(xì)胞中，Xer重組系統(tǒng)對(duì)于確保復(fù)制后正確的染色體分離以及將由RecA產(chǎn)生的染色體二聚體恢復(fù)為單體從而允許復(fù)制的染色體分離是必需的。Xer重組酶是酪氨酸重組酶家族的成員，在革蘭氏陰性細(xì)菌(例如大腸桿菌)中，以XerC和XerD為代表(Blakely et al.Cell 1993，75:351-361),在枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，以CodV和RipX為代表(Sciochetti et al.1999，J.Bacteriol.181:6053-6062)。Xer重組酶作用于染色體上被稱為dif的28個(gè)堿基對(duì)的革巴序列(Leslie andSherratt 1995, EMBO J.14:1561-1570; Sciochetti et al.2001, J.Bacteriol.183:1058-1068)。在大腸桿菌中，蛋白FtsK對(duì)于Xer重組是必需的(Recchiaetal.1999, EMBO J.18:5724-5734)，并且FtsK同源物在細(xì)菌中是廣泛保守的，但在古生菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(Recchia and Sherratt 1999，Mol.Microbiol.34:1146-1148)。內(nèi)源性Xer重組系統(tǒng)已被用于Xer-cise技術(shù)，用于在線性DNA分子整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體之后，從染色體中去除抗生素抗性基因(Bloor andCranenburgh 10 2006, Appl.Environ.Microbiol.72:2520-2525)。內(nèi)源性Xer重組系統(tǒng)還具有解離質(zhì)粒二聚體的功能。為了促進(jìn)重組，質(zhì)粒二聚體包含位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)與dif功能相同。這些位點(diǎn)是cer和psi。在大腸桿菌質(zhì)粒 ColEl 中發(fā)現(xiàn)了 cer (Summers andSherratt 1984, Cell 36:1097-1103),在沙門氏菌(Salmonella)質(zhì)粒 pSClOl 中發(fā)現(xiàn)了 psi (Cornet et al.1994, J.Bacteriol.176:3188-3195)。當(dāng)形成質(zhì)粒二聚體時(shí),Xer重組系統(tǒng)發(fā)揮作用，通過(guò)在cer和psi位點(diǎn)進(jìn)行DNA重組，使二聚體轉(zhuǎn)化為兩個(gè)單體。然而，與染色體dif位點(diǎn)不同，如果還存在約ISObp的附屬序列,XerC和XerD只作用于質(zhì)粒祀位點(diǎn)(Hayes and Sherratt, 1997)。cer的附屬序列是蛋白PepA(氨基肽酶A)和ArgR(精氨酸生物合成途徑阻遏蛋白)的結(jié)合位點(diǎn),psi的附屬序列是蛋白 PepA和 ArcA 的結(jié)合位點(diǎn)(Collo`ms et al.1998, Mol Microbiol.28:521-530)。需要這樣設(shè)置來(lái)確保質(zhì)粒上的Xer重組是定向的，即，只對(duì)二聚化作用天然形成的同向重復(fù)二聚體解離位點(diǎn)起作用。由于解離質(zhì)粒二聚體需要附屬序列，所以以前描述的Xer-cise系統(tǒng)不能直接用于質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶可以是誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)的。在一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶優(yōu)選是誘導(dǎo)型的。具體而言，當(dāng)本發(fā)明的方法利用在相同的宿主細(xì)胞內(nèi)存在的第一宿主細(xì)胞環(huán)境和第二宿主細(xì)胞環(huán)境時(shí)，位點(diǎn)特異性重組酶優(yōu)選是誘導(dǎo)型的。在這個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)改變滲透濃度、溫度、是否存在誘導(dǎo)劑、細(xì)胞生長(zhǎng)期和能夠改變DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)或超螺旋的化合物的存在中的一個(gè)或多個(gè)條件，可以誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)。重組酶介紹如上所述，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案不需要對(duì)維持質(zhì)粒的第二宿主細(xì)胞環(huán)境進(jìn)行遺傳修飾。然而，當(dāng)位點(diǎn)特異性重組酶(例如Xer重組酶系統(tǒng))在第二宿主細(xì)胞環(huán)境中不是天然存在時(shí)，可以通過(guò)向宿主細(xì)胞環(huán)境中引入編碼合適的位點(diǎn)特異性重組酶或轉(zhuǎn)座酶的基因來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。當(dāng)?shù)诙拗骷?xì)胞環(huán)境中存在位點(diǎn)特異性重組酶，但需要在第二宿主細(xì)胞環(huán)境中非天然存在的其它位點(diǎn)特異性重組酶時(shí)，也可以運(yùn)用該方法。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以向第二宿主細(xì)胞環(huán)境中引入編碼所述其它位點(diǎn)特異性重組酶的基因?？梢詫⒕幋a位點(diǎn)特異性重組酶的基因引入染色體外元件或整合入宿主細(xì)胞染色體。適于引入宿主細(xì)胞環(huán)境的重組酶實(shí)例包括但不限于來(lái)自噬菌體Pl的Cre(Dale andOw 1991, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:10558-10562)、來(lái)自 λ 噬菌體的 Int 和 Xis (Zubkoet al.2000, NatureBiotechnol.18:442-445)和來(lái)自酵母的 P22 (Wulff et al.1993, Mol.Microbiol.9:261-271) > Flp (Datsenko and Wanner 2000,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:6640-6645)和R(Sugita et al.2000, Plant J.22:461-469)。還可以使用反式表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶來(lái)去除側(cè)翼具有內(nèi)部解離位點(diǎn)的選擇標(biāo)記基因(Sanchis et al.1997, Appl.Environ.Microbiol.63:779-784)，因此可以以與重組酶相同的方式將轉(zhuǎn)座酶弓I入宿主細(xì)胞環(huán)境。質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為被引入宿主細(xì)胞環(huán)境的重組酶系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)。如上文所述，當(dāng)使用內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)時(shí)，本發(fā)明的方法也能發(fā)揮作用。位點(diǎn)特異性重組酶祀位點(diǎn)本發(fā)明方法中使用的存在于質(zhì)粒內(nèi)的選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶革巴位點(diǎn)。位點(diǎn)特異性重組酶祀位點(diǎn)是位點(diǎn)特異性重組酶所針對(duì)的染色體或質(zhì)粒DNA序列的一部分。當(dāng)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)按前后順序存在時(shí)，一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶能夠作用于所述位點(diǎn)，從而去除位于所述位點(diǎn)之間的DNA部分。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)位點(diǎn)特異性重組酶祀位點(diǎn)還包括轉(zhuǎn)座酶祀位點(diǎn)。如上述討論，Xer重組酶系統(tǒng)對(duì)于原核細(xì)胞是內(nèi)源性的，并利用酪氨酸重組酶XerC和XerD來(lái)解離染色體和質(zhì)粒二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)可以能夠結(jié)合XerC和/或XerD。在一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)可以是任何XerC和/或XerD結(jié)合位點(diǎn)?？梢詮乃拗骷?xì)胞染色體和質(zhì)粒中鑒定出示例性的位點(diǎn)。通過(guò)組合來(lái)自質(zhì)粒和染色體的天然存在的質(zhì)粒二聚體解離位點(diǎn)，可以形成位點(diǎn)特異性重組酶祀位點(diǎn)。這樣的雜合位點(diǎn)的實(shí)例是dif-psi雜合位點(diǎn)，也被稱為pif位點(diǎn)(Cornet et al.1994，J.Bacteriol.176:3188-3195),在下面的表 I 中給出了 pif 位點(diǎn)的序列。Pif位點(diǎn)與psi只有一個(gè)核苷酸不同，但其能夠促進(jìn)質(zhì)粒和染色體上的Xer重組。通過(guò)制備雜合序列和使用諸如Barre et al.2000描述的簡(jiǎn)單的重組測(cè)試(GenesDev.14:2976-2988)來(lái)測(cè)定這些雜合序列作為質(zhì)粒二聚體解離位點(diǎn)的能力，可以開發(fā)出能用于本發(fā)明方法中的其它雜合位點(diǎn)。染色體或質(zhì)粒的局部超螺旋被認(rèn)為是Xer重組中重要的因素，因此可能存在以下情況，滲透濃度條件或周圍的DNA序列能夠通過(guò)通常僅在染色體上發(fā)揮功能的位點(diǎn)(如dif)而促進(jìn)質(zhì)粒上的Xer重組。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)可以是dif位點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性 重組位點(diǎn)可以類似于下面表I中列出的任何位點(diǎn)或SEQ ID N0:17、20或23中的任意一個(gè)。如果位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)包含SEQ IDN0:l-9、17、20或23中的任意一個(gè)或由SEQ ID NO: 1-9、17、20或23中的任意一個(gè)組成，則認(rèn)為該位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)與SEQ ID NO: 1-9,17,20或23中的一個(gè)類似。如果位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)與SEQ ID NO: 1-9、17、20或23中任意一個(gè)具有50%或更高的序列一致性，則認(rèn)為該位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)與SEQ IDN0:1-9、17、20或23中的一個(gè)類似?；蛘撸稽c(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)可以與SEQ ID N0:l-9、17、20或23中的一個(gè)具有60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列一致性。這可以相當(dāng)于與SEQ ID NO: 1_9、17、20或23中的任意一個(gè)相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)核苷酸取代。包含SEQID N0:l-9、17、20 或 23 中任意一個(gè)的 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33或34個(gè)核苷酸的片段的序列也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以上描述的片段或變體序列可能夠結(jié)合XerC和/或XerD。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，質(zhì)粒中包括的位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)的性質(zhì)取決于本發(fā)明方法涉及的第一和第二宿主細(xì)胞環(huán)境中內(nèi)源性的位點(diǎn)特異性重組酶。本發(fā)明的方法提供的優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)方法的優(yōu)勢(shì)在于，不需要反式引入外源重組酶。因此，第二細(xì)胞環(huán)環(huán)境中的內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶必須能作用于位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)。然而，這并不表示位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)必須對(duì)于過(guò)程發(fā)生的細(xì)胞也是內(nèi)源性的。例如，有證據(jù)表明，來(lái)自一個(gè)物種的位點(diǎn)特異性重組酶能夠作用于來(lái)自另一個(gè)物種的位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)(Neilson et al.1999，Mol.Microbiol.31:915-926)。此夕卜，位點(diǎn)特異性重組酶已被證實(shí)能解離不同的位點(diǎn)(Cornet et al.1994，J.Bacteriol.176:3188-3195),例如大腸桿菌dif位點(diǎn)和ps1-dif雜合體(pif位點(diǎn))。真核細(xì)胞也包含用于去除兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的DNA的天然的位點(diǎn)特異性重組酶。例如，通過(guò)FRT位點(diǎn)之間的DNA重組，酵母2 μ m質(zhì)粒的Flp重組酶能夠反轉(zhuǎn)質(zhì)粒的區(qū)域。 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)可以是FRT位點(diǎn)。表1:本發(fā)明中使用的位點(diǎn)特異性重組酶的示例性結(jié)合位點(diǎn)和它們的結(jié)合位點(diǎn)
權(quán)利要求
1.備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，所述方法包括以下步驟: a)在第一宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，所述選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境不能實(shí)現(xiàn)所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及 b)隨后在第二宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)所述質(zhì)粒，所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境能夠?qū)崿F(xiàn)所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除所述選擇標(biāo)記基因。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟: c)在細(xì)胞培養(yǎng)中維持所述無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒。
3.按權(quán)利要求1或2所述的方法，還包括以下步驟: d)從所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境分離所述無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒。
4.按權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)與實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組所必需的附屬序列在功能上相關(guān)聯(lián)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境在不同的細(xì)胞內(nèi)。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境在編碼P印A、ArgR和ArcA的基因中的一個(gè)或多個(gè)中包含失活突變。
7.按權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境包含ArgR或ArcA基因和PepA基因的活性形式。
8.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境包含位點(diǎn)特異性重組酶。
9.按權(quán)利要求7所述的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶是內(nèi)源性位點(diǎn)特異性重組酶。
10.按權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境在相同的宿主細(xì)胞中形成。
11.按權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是暫時(shí)分開的。
12.按權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境包含誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組酶。
13.按權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)改變所述細(xì)胞的溫度，改變所述細(xì)胞的滲透濃度，改變所述細(xì)胞中誘導(dǎo)劑的水平或改變所述細(xì)胞中能改變所述質(zhì)粒的二級(jí)結(jié)構(gòu)或超螺旋的化合物的水平來(lái)形成所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境。
14.按權(quán)利要求8、9、12或13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶選自Cre, Flp, R、XerC, XerD, RipX 和 CodV。
15.按權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)是轉(zhuǎn)座酶靶位點(diǎn)。
16.按權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)選自Ecdif、cer、ps1、pif > mwr、Bsdif、loxP、FRT 和 RS0
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。
18.按權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因能允許產(chǎn)生在所述第一和/或第二宿主細(xì)胞環(huán)境中缺少，但又是所述第一和/或第二宿主細(xì)胞環(huán)境必需的代謝物。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和/或所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
20.按權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境獨(dú)立地選自埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和弧菌屬(Vibrio)。
21.按權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和/或所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞。
22.按權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是獨(dú)立地選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、利斯特氏菌屬(Listeria)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和分枝桿菌屬(Mycobacterium)。
23.按權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和/或所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是古生菌。
24.按權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和/或所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是酵母細(xì)胞。
25.按權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境獨(dú)立地選自漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
26.按權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和/或所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境是能夠復(fù)制質(zhì)粒的非真菌真核生物。
27.按權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境和所述第二宿主細(xì)胞環(huán)境獨(dú)立地選自衣藻屬(Chlamydomomas)、網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)和內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述質(zhì)粒編碼一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法制備的質(zhì)粒。
30.修飾的宿主細(xì)胞，其含有無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒。
31.主細(xì)胞，其含有無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒具有殘留的位點(diǎn)特異性重組酶革巴位點(diǎn)。
32.按權(quán)利要求31所述的宿主細(xì)胞，其含有編碼誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組酶的基因。
33.按權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組酶存在于所述宿主細(xì)胞的染色體上。
34.合物，其包含權(quán)利要求30所述的未修飾的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、以及藥學(xué)上可接受的載體。
35.一種患者或治療患者的方法，包括將權(quán)利要求30所述的未修飾的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求34所述的組合物給予所述患者。
36.關(guān)于接種患者或治療患者疾病的權(quán)利要求30所述的未修飾的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求34所述的組合物。
37.關(guān)于制備用于接種患者或治療患者疾病的藥物的權(quán)利要求30所述的未修飾的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求34所述的組合物。
38.主細(xì)胞，其包含含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，所述選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶祀位點(diǎn)，其中所述宿主細(xì)胞還在編碼附屬蛋白PepA、ArgR或ArcA中一個(gè)或多個(gè)的染色體基因的一個(gè)或多個(gè)中包含失活突變。
39.劑盒，其包括以下或由以下組成: i)第一宿 主細(xì)胞環(huán)境，其包含含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，所述選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，其中所述第一宿主細(xì)胞環(huán)境不能實(shí)現(xiàn)所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組；以及 ii)第二宿主細(xì)胞環(huán)境，其能實(shí)現(xiàn)所述位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組，從而去除所述選擇標(biāo)記基因。
全文摘要
提供了制備無(wú)選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒的方法，包括在不能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組的宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，選擇標(biāo)記基因的側(cè)翼為位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)，隨后在能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組酶靶位點(diǎn)之間的重組的另一宿主細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)所述質(zhì)粒，從而去除所述選擇標(biāo)記基因。還提供了通過(guò)所述方法制備的質(zhì)粒在制備用于治療和疫苗目的的重組蛋白、制備治療性DNA和DNA疫苗以及使用活細(xì)菌載體向患者遞送重組蛋白和DNA中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/64GK103097537SQ201180032633
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者羅基·馬爾科·科瑞安恩波格, 馬修·威廉·萊肯拜 申請(qǐng)人:科步爾生物制劑有限公司