專利名稱：腎移植耐受的確定方法
腎移植耐受的確定方法本發(fā)明涉及一種根據(jù)多個生物標志的水平確定個體移植耐受性的方法。本發(fā)明還涉及一個含有用于測定生物標志水平所需試劑的試劑盒。本發(fā)明還涉及了一種傳感器，用于測定多個決定個體移植耐受性基因的表達水平。移植耐受性是指在持續(xù)無免疫抑制治療的情況下穩(wěn)定維持良好的異源移植功能。在臨床領域，僅當患者盡管在長期停止接受所有的免疫抑制治療時，仍具備穩(wěn)定的同種異體移植功能時可見。這一狀態(tài)被稱之為可操作的耐受，在腎移植中很少有報道(1-5)，在肝臟移植中更為常見出、7)。腎移植患者的長期生存依賴于藥物持續(xù)誘導的免疫抑制。然而，這通常伴隨著發(fā)病率和死亡率的提高，主要是心血管疾病，偶然機會引起的感染和惡性腫瘤(8)。目前，我們不能提前確定哪些患者會對他們接受的移植體耐受，哪些患者可以從部分或完全中止免疫抑制獲益。因此，日益需要研發(fā)檢測和鑒定生物標志，從而能夠使臨床醫(yī)生在患者自身特異的免疫特性的基礎上，安全地使免疫抑制作用最小化。先前的研究已經(jīng)在肝移植受體中鑒定出耐受相關的生物標志。特別研究了兒童受體的患者群中的細胞因子基因的多態(tài)性。與持續(xù)接受免疫抑制的對照組患者相比，所有未進行免疫抑制的患兒和絕大多數(shù)接受最小量免疫抑制的患兒顯示出較低的腫瘤壞死因子(TNF)-Q和高度/中度白介素(IL)-1O (36)。此外，在兩組患者之間，還存在樹突細胞亞群比率的差異。與持續(xù)接受免疫抑制的患者相比，類漿細胞樹突細胞(PDC2)，即報道的選擇誘導的T-輔助細胞(Th) 2型應答的循環(huán)水平相對于單核樹突細胞(pDCl)來說更為普遍，后者在未接受免疫抑制或最小量免疫抑制的患者體內(nèi)誘導Thl型應答(37)。研究者進一步嘗試使用外周血液基因表達特征和大量血細胞免疫表型來確定成人肝臟移植受體耐受的生物標志。研究證明，可操作的耐受患者可通過編碼Y S T細胞的基因和自然殺傷(NK)細胞受體，以及涉及細胞增殖阻滯的基因得以確定(38)。他們還在耐受患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的潛在的周期調(diào)節(jié)T-細胞亞群、⑶4+⑶25+T細胞和Y S T細胞，特別是在上皮組織的免疫調(diào)控過程涉及的S Vl+亞型。有趣的是，之前觀察到的樹突細胞亞群比率的差異在該患者群 體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)。研究了相同群體內(nèi)肝移植受體的外周血中的基因表達特征，與中斷免疫抑制的患者及健康對照相比，前者成功嘗試了中斷過程，但導致需要重新采用免疫抑制的急性細胞排斥(39)。他們確定了三個不同的基因，涉及適量的基因(2至7個之間)，以區(qū)別耐受和非耐受同種異體肝移植受體與健康者對照。對附加的肝移植受體的獨立人群中驗證了可操作的耐受的基因組印記，其主要特征是由NK細胞、CD8+細胞和Y ST細胞表達的多種細胞表面受體編碼基因的上調(diào)。外周血內(nèi)假定的調(diào)節(jié)性T細胞(⑶4+CD25+Foxp3+，y S TCR+和S ITCR+T細胞)的擴增也在這一組新的耐受受體中觀察到?？傮w而言，結合外周血中的轉錄特征和流式細胞儀研究可以確定那些能夠在不接受藥物免疫抑制的情況下接受移植體的肝移植受體。索里婁(Soulillou)等分析了五個可操作的耐受性腎移植受體中的TCR (T細胞抗原受體)，并在這些偏離的TCR 鏈使用的患者中進行論證，主要觀察了⑶8+亞型。這些細胞具有細胞因子(IL10，IL2，IL13，IFN-Y )轉錄下降的特征，代表一種反應低下狀態(tài)(40)。與慢性同種異體移植排斥的患者相比，耐受患者體內(nèi)還有明顯較少的循環(huán)⑶8+CD28_W巴球功能細胞，這意味著在這些患者體內(nèi)存在對細胞毒性的抑制(Baeten等，2005(45))。隨后，該研究組使用基因表達芯片來鑒定一套33個基因，能夠區(qū)分高度特異的可操作的耐受性腎移植受體和急性/慢性同種異體移植排斥及相應年齡的健康志愿者(41)。與對照組相比，耐受患者體內(nèi)共刺激基因和早期及后期T細胞活性標志的表達量有所減少，盡管耐受患者體內(nèi)的抗炎癥的細胞因子一轉化生長因子P (TGFP)并未像很多TGFP調(diào)節(jié)基因那樣上調(diào)。該研究組還分析了一組含有8個可操作的耐受腎移植受體的血細胞的表型和轉錄模式，研究表明與慢性排斥患者對照組相比，該組顯示了較高的循環(huán)B細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(⑶25hira4+)，而在慢性排斥受體體內(nèi)則表現(xiàn)有F0XP3轉錄水平的顯著下降(42)。有趣的是，在本研究中，臨床耐受患者的血細胞表型與健康個體之間沒有差別，這意味著可操作的耐受并非歸因于調(diào)節(jié)性T細胞的增長，而是由于慢性排斥患者體內(nèi)缺乏對自然狀態(tài)的維持。相反，另一個研究組報道了與慢性排斥患者、透析患者和健康對照組相比，在長期穩(wěn)定性腎移植受體內(nèi)表現(xiàn)有更為多變的TCR-V ^組成和較高的CD4+CD25high百分比，該兩個是沒有接受免疫抑制的(43)。在波羅爾德(Brouard)等2007發(fā)表的文章中(41)，使用了 49個基因，在訓練組內(nèi)獲得90%的最大靈敏性。絕大多數(shù)不同的33個基因被用來區(qū)分耐受和慢性排斥的個體。MS4A1是一種又被稱為⑶20的分子，它在B淋巴細胞的表面表達。該分子出現(xiàn)在Brouard等2007的文章(41)中的兩個基因組中，例如33個基因和49個基因組。此外，婁伊特(Louyet)等2005 (44)確定MS4A1為一種大鼠動物模型中的移植耐受相關標志。這提出需要一種改進的方法來有效地確定個體對器官移植的耐受。本發(fā)明提出了一種確定個體對腎移植免疫耐受的方法，包括確定從個體體內(nèi)獲得的樣品中的 TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1 和 FCRL2 基因內(nèi)選擇至少兩個基因的表達水平。通過上述確定的結果，可能會高度特異性和靈敏性地確定個體是否對器官移植具有免疫耐受。特異性是指本方法確定為非耐受的真陰性(非耐受個體)比例。靈敏性是指本方法確定為耐受的真陽性(耐受個體)比例。本方法提供了一個高度精確的測試，能夠僅通過檢測少量的生物標志(例如，基因表達水平)而相對容易地進行。從而提供了一種針對個體對器官移植耐受性的簡單且有效的測試。“免疫耐受”一詞對本領域的技術人員來說是非常熟悉的，該術語是指在持續(xù)無免疫抑制治療的情況下，能夠穩(wěn)定的維持良好的異體移植功能。在臨床領域，僅當患者在很長一段時間內(nèi)即使停止了所有的免疫抑制治療，例如一年，仍具有穩(wěn)定的異體移植功能時才可視為免疫耐受。本發(fā)明的方法可用于確定個體對腎移植的耐受性。有研究表明，在能夠耐受移植器官的個體中，SH2D1B、PN0C、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl和FCRL2基因的表達水平升高，而TLR5和SLC8A1基因的表達水平則降低。這些基因的任意組合都可用于確定個體對器官移植的耐受性。盡管這10個基因都可用于耐受性的確定，也可優(yōu)選為僅用2、3、4或5個基因來確定，進一步優(yōu)選為僅用3個基因來確定。

更優(yōu)選地，本發(fā)明公開的方法包含確定從個體獲得的樣本中的TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表達水平。個體對器官移植耐受性的陽性預測是由SH2D1B和PNOC的高表達水平和TLR5的低表達水平?jīng)Q定的。如本領域的技術人員所熟知的那樣，本發(fā)明公開的方法還包括確定CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一個或多個基因的表達水平。本發(fā)明公開的方法還可以進一步包含確定一個或多個適當?shù)膶φ栈虻谋磉_水平。適當?shù)膶φ瞻℉PRT (次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶)、￠-肌動蛋白和￠2微管蛋白。對照基因的水平在耐受和不耐受個體之間不存在明顯的差異。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施例中，耐受個體的概率(P-Tol)可由下列公式計算得出:P-Tol=ez/(ez+l)，其中
Z=-4.4347+2.7191X[SH2DBl]-4.198733X[TLR5]+3.300620X[PNOC]
P-Tol值大于0.11時說明該個體是耐受性的。這個公式用于使用微芯片分析確定基因的表達水平。如果基因表達水平是通過其他方法來確定的，例如RT_PCR(實時聚合酶鏈式反應)，那么則需要對這個公式進行修訂。更具體地說，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，當使用RT-PCR時，個體耐受概率(P-Tol)的計算公式為:P-Tol=ez/(ez+l)，其中
Z=-14.457+94156X[PNOC]+6.289X[SH2DBl]+5.054X[TLR5]-1.523X[PNOC]X[SH2DB1]-51.584X[PNOC]X[ TLR5]-2.339X[SH2DB1]X[TLR5]
每個基因的表達水平表示為2_dCT，其中dCT為每個基因與對照基因之間的CT值(每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))差。另一個公式可用于提供一個對概率在大幅度上的確定測量。這個可選用的方程對于本領域的技術員來說是可以理解的且方便計算的。本發(fā)明的方法還包括確定B細胞和NK細胞的水平。通過確定B細胞和NK細胞的水平，可進一步提高本方法的特異性和靈敏性。更具體地說，在對移植器官耐受的個體體內(nèi)，B細胞和NK細胞的水平都有所增加。本發(fā)明還包括確定⑶4+⑶25int T細胞的水平。通過確定⑶4+⑶25int T細胞的水平，可進一步提高本方法的特異性和靈敏性。更具體地說，在對移植器官耐受的個體體內(nèi)，⑶4+⑶25int T細胞的水平相對于⑶4+T細胞的水平有所降低。本發(fā)明的方法還包括確定供體特異性CD4+T細胞的水平。供體特異性CD4+T細胞的水平可使用以下所述的IFN-Y ( Y干擾素)ELISPot (酶聯(lián)免疫斑點法)分析確定。通過確定供體特異性CD4+T細胞的水平，可進一步提高本方法的特異性和靈敏性。通過確定供體特異的CD4+T細胞的水平，可確定個體對供體器官的應答。更具體地說，在對移植器官耐受的個體體內(nèi)，這種應答(供體特異性CD4+T細胞的水平)有所降低。本發(fā)明所述方法還包括確定⑶4+T細胞FoxP3與a-1，2_甘露糖苷酶基因的表達t匕。通過確定⑶4+T細胞FoxP3與a-1,2-甘露糖苷酶基因的表達比，可進一步提高本方法的特異性和靈敏性。更具體地說，在對移植器官耐受的個體體內(nèi)，該比值有所增加。本發(fā)明所述方法還包括確定⑶19+與⑶3+細胞的比率。通過確定⑶19+與⑶3+細胞的比率，可進一步提高本方法的特異性和靈敏性。更具體地說，在對移植器官耐受的個體體內(nèi)，該比值有所增加。本方法用于取自個體的樣本。該樣本可以是任何一種能夠檢測上述標志的合適樣本。這些樣本可以是血液、血清和其他血液組分、尿液或移植的活組織樣本。最優(yōu)選的樣本是外周血。SH2D1B (含有蛋白IB的SH2結構域)對該領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體SH2D1B的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為 G1:42744572，版本號 AAH66595.1 ;登錄號 Gl: 54792745，版本號 NP444512.2 ;登錄號 G1: 18490409，版本號 AAH22407.1 和登錄號 G1:55960297，版本號 CAI15780.1。TLR5 (Toll樣受體5蛋白)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體TLR5的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為GI =80478954,版本號 AA109119.1 ;登錄號 GI =80475052,版本號 AA109120.1 ;登錄號 GI:13810568，版本號 BAB43955.1 ;登錄號 G1:222875780，版本號 ACM69034.1。PNOC (痛敏肽)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體PNOC的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為GI =49456885,版本號 CAG46763.1 和登錄號 G1:49456835，版本號 CAG46738.1。CD79B (B細胞抗原受體復合物相關蛋白P鏈)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體CD79B的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1: 1087009，版本號AAC60654.1和登錄號G1:20987620，版本號AAH30210.1。 TCLlA (T細胞白血病/淋巴瘤1A)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體TCLlA的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為 G1:48145709，版本號 CAG33077.1 ;登錄號 G1: 148922879，版本號 NP_001092195.1 ；登錄號 G1: 11415028，版本號 NP_068801.1 ;登錄號 G1: 13097750，版本號 AAH03574.1 ;登錄號 G1:46255821，版本號 AAH14024.1 和登錄號 G1: 13543334，版本號 AAH05831.1。HS3ST1 (硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶I)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體HS3ST1的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:116283706，版本號AAH;25735.1和登錄號G1:34785943，版本號 AAH57803.1。MS4A1 (跨膜4-結構域，A亞家族，成員I ;B_淋巴細胞抗原⑶20)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體MS4A1的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:23110989，版本號NP_690605.1 ;登錄號GI:23110987，版本號 NP_068769.2 和登錄號 G1: 12803921，版本號 AAH02807.1。FCRLl (這里又稱作THC2438936) (Fe受體樣蛋白I靠近3’段(FCRLl)基因)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體FCRLl的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:55662454，版本號CAH73053.1 ;登錄號 G1:55661513，版本號 CAH70234.1 ;登錄號 G1:55661511，版本號 CAH70232.1 ;登錄號G1:21707303，版本號 AAH33690.1 和登錄號 G1:117606520，版本號 ABK41917.1。SLC8A1 (溶解物載體家族8 (鈉/鈣交換蛋白)，成員I)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體SLC8A1的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:68087008，版本號AAH98285.1和登錄號G1:67514242，版本號 AAH98308.1。
FCRL2 (Fe受體樣蛋白2)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體FCRL2的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:55662464，版本號 CAH73063.1 ;登錄號 G1:55662461，版本號 CAH73060.1 ;登錄號 GI:46623042，版本號 AAH69185.1 和登錄號 G1:117606518，版本號 ABK41916.1。FoxP3 (叉頭框P3)對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，人體FoxP3的多形性形式的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為GI:146262391，版本號 ABQ15210.1 ;登錄號 GI =219518921,版本號 AAI43787.1 ;登錄號 GI:219517996，版本號 AAI43786.1 ;登錄號 G1:109731678,版本號 AAI13404.1 ;登錄號 GI:109730459，版本號 AAI13402.1 和登錄號 G1:63028441，版本號 AAY27088.1。a -1, 2-甘露糖苷酶對于本領域的技術人員來說是一個熟知的標準術語。更具體地說，該術語是指a-1，2-甘露糖苷酶Al形式。人體a-1，2-甘露糖苷酶Al的序列可從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，其登錄號為G1:24497519，版本號NP_005898.2。為了避免出現(xiàn)不確定性，上述標志的特異序列是根據(jù)本應用提出優(yōu)先權日期時數(shù)據(jù)庫中的版本號決定。標志的特異序列是可以仿效的。本領域的技術人員將會意識到人群中存在多形性變體。確定基因表達水平有很多種方法，包括Northern印跡(RNA印跡雜交)、mRNA微芯片分析、RT-PCR、差異顯示、RNA干擾、報告基因分析和諸如基因表達序列分析(SAGE)之類的以堿基為基礎技術。這些方法對于本領域的技術人員來說是熟知的(見Matthew Avison列舉的基因表達測定，2007，由Taylor&Francis組出版；ISBN:978-0-415-37472-9 (簡裝本)978-0-203-88987-9 (電子版))。也可測定編碼蛋白質(zhì)的表達水平，從而確定基因表達水平。本領域的技術人員知道很多種確定蛋白表達的方法。

本發(fā)明所述方法中測定作為附加生物標志的不同細胞類型的水平可使用任何適當?shù)姆椒z測。例如，使用適合抗體的流式細胞儀來測定。該方法對于本領域的技術人員來說是熟知的?？梢允褂萌魏芜m當?shù)姆椒▉頊y定CD4+T細胞供體特異的低反應性水平。適當?shù)姆椒òɡ肊LISA、流式熒光檢測技術測定IFNy產(chǎn)量，或使用流式細胞術測定細胞內(nèi)的細胞因子產(chǎn)量。在進行上述測定時，本優(yōu)選地包含以下步驟:
a.取得一定數(shù)量的來自受體的CD4+T細胞；
b.用來自供體的細胞或作為供體具有相同HLA(人類白細胞抗原)_類型II個體的細胞刺激CD4+T細胞(于血清精度)，其中細胞受到輻照(細胞優(yōu)選為耗盡T細胞和NK細胞的PBMC (外周血單核細胞)(使用⑶2和TCRgd抗體))；
c.用來自與供體和受體之間的情況類似的HLA-1I類錯配的“第三方”的細胞刺激⑶4+T細胞(通常這些細胞是耗盡T細胞和NK細胞的PBMC (使用⑶2和TCRgd抗體))；
d.用來自與供體和受體之間的情況完全相同的HLA-1I類錯配的“第四方”細胞刺激⑶4+T細胞(通常這些細胞是耗盡T細胞和NK細胞的PBMC (使用⑶2和TCRgd抗體))；
e.測定由⑶4+T細胞生產(chǎn)IFNy的相對水平。確定供體特異性的⑶4+T細胞水平的適宜方法如下所示。為了根據(jù)上述方法確定標志的水平是否大于(高于)或小于(低于)正常值，通常需要確定非耐受個體相關人群的正常水平。可在免疫抑制藥物治療水平和類型、種族背景或其他能夠影響標志正常水平的其他特征的基礎上進行確定相關人群，例如器官移植人群。一旦已知正常水平，則使用標準的統(tǒng)計方法來比較檢測到的水平和差異的顯著性。如果測定的水平和正常水平之間存在明顯差異(例如，一個統(tǒng)計學上的顯著差異)，那么該個體可被認為是免疫耐受的。所述的技術允許監(jiān)測個體對移植體(例如，移植器官)的耐受性，從而確定能夠停止免疫抑制藥物治療或減少免疫抑制藥物治療的個體。該技術也有助于移植器官受體的免疫抑制方案管理和移植后控制。本發(fā)明還提供了一個用于檢測包括 TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2在內(nèi)的一組基因中的至少兩個基因表達水平的傳感器。優(yōu)選地，這個傳感器用于監(jiān)測TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表達水平。適用于監(jiān)測微芯片中基因表達水平的傳感器是本領域中的技術人員所熟知的，包括mRNA芯片、蛋白表達傳感器等。這些傳感器通常包括一個或多個待測基因特異性的核酸探針粘附在傳感器表面上。因此，核酸探針能夠從目標基因檢測基因轉錄。優(yōu)選地，該傳感器還進一步用于檢測CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一個或多個甚至所有基因的表達。本發(fā)明還提供了一個包含有檢測包括TLR5、PN0C、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLU SLC8A1和FCRL2在內(nèi)的一組基因中的至少兩個基因表達水平所用試劑的試劑盒。該試劑盒包括用于檢測TLR5、PN0C和SH2D1B基因的表達水平的試劑。優(yōu)選地，該試劑盒還包含用于檢測CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一個或多個基因表達所用試劑的試劑盒。檢測這些基因表達水平的試劑優(yōu)選為通過RT-PCR檢測的試劑。該試劑盒還具有一個含一種算法的計算機程序，用于計算個體耐受的概率，以及上述方法操作所需的說明和其他事項。本技術特別的方面將參考以下附圖通過舉例的方式進行描述。

圖1是對訓練集( A-D)和測試集(E-H)外周血淋巴細胞子集的流式細胞儀分析。淋巴細胞子集被定義為=B細胞為⑶19+淋巴細胞(A，E)、NK細胞為⑶56+⑶3淋巴細胞(B，F(xiàn)) ;T細胞為CD3+淋巴細胞(C，G)。CD19+:CD3+的比值如圖所示(D，H)。圖中還顯示了中值和四分位差，以及用于比較Tol-DF (免疫耐受-無藥物治療)患者和其他組之間的曼-惠特尼 U 檢驗(Mann-Whitney U 檢驗)的雙側檢驗 P 值(***p〈0.001, **p〈0.01 或 *p〈0.05)。表5為其他組間的P值。圖2是對訓練集(A&B)和測試集(C&D)外周血T細胞表達的流式細胞儀分析。圖中顯示了具有中級(⑶4+⑶25int)和高級(⑶4+⑶25hi)⑶25表達的⑶4+T細胞百分比的中值和四分位差，以及用于比較Tol-DF患者和其他組之間的Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗P值(**) p〈0.01或(*) p〈0.05)。表5為其他組間的P值。圖3中(A)在訓練集中供體特異的(DSA)和非特異的(NDSA)抗HLA類型I (Cl)和類型II (CU)抗體的血清陽性檢測的每組中患者的百分率。(B)補體結合(IgGI，IgG3)或非補體結合(IgG2，IgG4)DSA存在(+ve)或缺失(_ve)患者的腎功能。圖中顯示了值和四分位差，以及各組之間的Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗P值(*p〈0.05)。值得注意的是，在耐受受體體內(nèi)缺失DSA水平。圖4顯示了用于檢測訓練集(A)和測試集(B)患者體內(nèi)直接的同種異體反應途徑的IFNYELISpots (干擾素-Y酶聯(lián)免疫斑點法)。當用供體細胞和第三方細胞(3rdP)刺激時，計算受體CD4+T細胞內(nèi)產(chǎn)生IFNy的細胞數(shù)量(扣除背景)，以獲得一定頻度的應答細胞。圖中顯示有供體:3rdP刺激的應答頻率比值的中值和四分位差。該比值大于1.5時表示對供體的低反應性。圖中還有各組之間的Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗P值(**p〈0.01，*p〈0.05)。各個患者對供體和3rdP的IFNyELISpot應答頻率如圖10所示。供體與3rdP頻率之間的魏克森(Wilcoxon)檢測的p〈0.05。圖5顯示了 FoxP3和a -1, 2_甘露糖苷酶外周血表達的qRT_PCR基因表達分析。計算了訓練集(A)和測試集(B)患者中FoxP和a-1，2-甘露糖苷酶的表達水平比值。圖中顯示了中值和四分位差，以及用于比較Tol-DF患者和其他組之間的Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗P值(#*p〈0.001，**p〈0.01)。其他研究組之間比較的統(tǒng)計值如表6所示。FoxP和a-1,2-甘露糖苷酶在個體內(nèi)的表達水平分別如圖1lA和IlB所示。圖6顯示了訓練集(A)和測試集(B)患者中使用10多個最高等級基因繪制的ROC(受體運轉特征)曲線(黑線)。使用外周血的微芯片分析檢測明顯差異的基因表達。對微芯片數(shù)據(jù)使用四類克-瓦氏(Kruskal-Wallis)分析確定的前10個重要基因構建回歸模型，從而對ROC曲線進行分類(Tol-·DF vs非耐受組，不包括HC)。根據(jù)具有1%FDR (錯誤發(fā)現(xiàn)率)的P值的基礎上排列訓練集內(nèi)的基因。相同的2-類模型被用于評估使用相同基因檢測測試集內(nèi)Tol-DF受體的診斷能力。圖7顯示了使用微芯片分析鑒定的跨平臺生物標志和基因產(chǎn)生的訓練集(A)和測試集(B)的ROC曲線。使用4個生物標志:B/T淋巴細胞比例，％CD4+⑶25int、抗供體:抗3rdP ELISpot頻率的比率以及FoxP3/ a -1, 2_甘露糖苷酶的表達，并結合10個重要基因產(chǎn)生兩類ROC曲線(Tol-DF vs非耐受組，不包括健康對照HC)。根據(jù)使用二進制回歸步驟計算耐受的跨平臺生物標志信號(4個生物標志+10個基因)的基礎上被分類為耐受的訓練集(C)和測試集(D)。圖8顯示了訓練集和測試集患者體內(nèi)外周血B細胞分析。(A)通過開啟⑶19+淋巴細胞分析的B細胞亞組，定義如下:后記憶B細胞⑶19+⑶27+IgD-⑶24+⑶38-/int ;初始/ 成熟 B 細胞 CD19+CD27-CD24intCD38int ；T1/T2 過渡 B 細胞 CD19+CD27_CD24+CD38hi。初始B細胞(B)，T1/T2過渡B細胞(C)和記憶B細胞(D)占B細胞總數(shù)的百分比。T1/T2過渡B細胞:記憶B細胞的百分數(shù)比例(E)。圖中顯示了中值和四分位差。當差異顯著時，顯示了各組之間Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗p值(*p〈0.05, **p〈0.01)。圖9顯示了 B細胞細胞因子產(chǎn)生分析。當用佛波醇12-豆蘧酸鹽13-醋酸鹽和離子霉素在體外對PBMC刺激后，利用細胞內(nèi)細胞因子染色方法估計B細胞TGFP (A)、IL-1O (B)和IFNy (C)的產(chǎn)生。結果由產(chǎn)生細胞因子的B細胞數(shù)量表示(通向⑶19+淋巴細胞)，對刺激(+ )和非刺激(_)的培養(yǎng)物進行流式細胞儀分析，每個樣本分析IX 104個細胞，同時在圖中表示了每組的中值和四分位差。圖(D-F)以每個細胞因子反應的比率顯示了每IX IO4個刺激的B細胞中細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)量。圖G顯示了 TGFP和IFNy細胞因子應答，其中每個患者由一個實心圓表示，黑色填充的圓形代表Tol-DF患者，圖中顯示Tol-DF患者的B細胞產(chǎn)生TGFP的能力高于IFN Y。各組間Wilcoxon配對檢驗的P值(A-C)和Mann-Whitney U檢驗(D-F)的雙側檢驗值圖中也有顯示(*p〈0.05，#p〈0.01，_p〈0.001)。樣本數(shù):HC=8, Tol-DF=IO, s_LP=8，s_CNI=16，CR=4。
圖10顯示了細胞功能分析測定訓練集(A)和測試集(B)中由IFNyELISpot引起的直接同種異體反應性途徑。計算了受體CD4+T細胞內(nèi)產(chǎn)IFNy細胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)顯示了扣除背景后的T細胞對供體抗原呈遞細胞APCs Co抗供體應答)或等同于錯配的第三方APCs (倒三角表示抗3rdP應答)的T細胞應答頻率(I應答/n細胞)和中間組頻率(黑條)。供體與3rdP頻率之間的Mann-Whitney U檢驗的雙側檢驗P值(**p〈0.01)如圖所示。圖11顯示了在訓練集和測試集的外周血樣本中(A) FoxP3和(B) a -1, 2_甘露糖苷酶表達的qRT_PCR(熒光實時定量PCR)分析。相對于HPRT的表達水平單位計算FoxP3和a -1, 2-甘露糖苷酶的表達水平。表達水平明顯較高時,標示出各組之間的Mann-WhitneyU檢驗的雙側檢驗 p 值(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001)。圖12顯示了利用微芯片和qRT-PCR分析訓練集中所選擇的展示顯著差異表達的基因(A-E)表達的相互關系。計算每個患者在微芯片上的每個探針的信號強度數(shù)據(jù)，計算每個基因相對于HPRT的表達量，即log2 [感興趣的基因]_log2[HPRT]。qRT-PCR的數(shù)據(jù)被描述為單位/HPRT。其中顯示了皮爾森(Pearson)和斯皮爾曼(Spearman)等級相關系數(shù)和P-值。同組基因的RT-PCR基因表達數(shù)據(jù)顯示在F-J。圖中還顯示出每組的中值和四分位差。利用Mann-Whitney U檢驗各組之間的統(tǒng)計比較,并標識出顯著性p值(*p〈0.05,**p〈0.01, ***p〈0.001)。圖13顯示了利用微芯片和qRT-PCR檢測測試集中所選擇的展示顯著差異表達的基因(A-E)表達的相互關系。計算每個患者在微芯片上的每個探針的信號強度數(shù)據(jù)，計算每個基因相對于HPRT的表達量，即log2 [感興趣的基因]_log2[HPRT]。qRT-PCR的數(shù)據(jù)被描述為單位/HPRT。其中顯示了 Pearson和Spearman等級相關系數(shù)和p-值。同組基因的RT-PCR基因表達數(shù)據(jù)顯示在F-J。圖中還顯示出每組的中值和四分位差。利用Mann-Whitney U檢驗各組之間的統(tǒng)計比較,并標識出顯著性p值(*p〈0.05, **p〈0.01,***p〈0.001)。圖14顯示了二元回歸模型的結果，用于交叉驗證選擇的生物標志組合。MSE=均方誤差，SD=標準差。圖15是顯示每組中3個基因(SH2DB1，PNOC和TLR5)表達水平的箱線圖。圖16是使用Logistic (邏輯)回歸獲得的ROC曲線，對TLR5、PNOC和SH2DB1三個基因之間的主要和相互作用進行分類。計算該樣本中的AUC (曲線下面積)、靈敏性和特異性以得到最佳取點(例如0.0602)。圖17顯示了通過使用三個基因(SH2DB1，PNOC和TLR5)進行l(wèi)ogistic回歸分類估計耐受性概率的箱線圖。圖18顯示了用三個基因(TLR5，SH2DB1和PN0C)估計的分類樹。圖中在每個終點指定了各個結果的每個節(jié)點(0-以上-非耐受，1-以下-耐受)和概率。圖19顯示了一系列說明分類樹節(jié)點應用的箱線圖。圖20顯示的是一個使用3個基因估計的分類樹來預測耐受性的ROC曲線。圖21顯示的是通過患者群體構建的分類樹指定的耐受概率頻率的柱狀圖。
實施例

材料與方法研究患者:
對訓練集的描述:
由耐受網(wǎng)絡(IOT)表征的患者群體由71個腎移植受體和19個年齡與性別匹配的健康對照(HC)組成。5個患者組包括:11個功能穩(wěn)定的腎移植受體(血清肌氨酸酐(CRT)<160umol/l,并且在過去12個月的增長〈10%)，盡管停止一年以上的免疫抑制治療(Tol-DF)，11個具有穩(wěn)定的腎臟功能的患者(相同的標準)，每天使用少于IOmg強的松作為唯一的免疫抑制劑(s-LP)，10個保持免疫抑制的患者(硝基咪唑硫嘌呤和強的松)，自移植以來都不用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(s-nCNI)，30個維持標準鈣調(diào)磷酸酶治療(s-CNI)的患者，9個經(jīng)活組織檢查證明的患者(本研究均進行了重新估計)，并且免疫驅動了慢性排斥(CR)?；颊叩呐R床特征如表I所述。所有的樣本均以盲測的方式進行處理和分析。對測試集的描述:
在美國招募了一組腎移植受體(ITN人群)。該ITN人群包括(I) “Tol-DF”(n=24)功能穩(wěn)定的腎移植受體(血清肌氨酸酐(CRT)在基線的25%內(nèi))，盡管停止所有的免疫抑制治療達一年以上；(2) “Mono”(n=ll)患者，具有穩(wěn)定的腎功能，僅用類固醇單一治療維持；
(3)“84[”對象(11=34)，使用與1'01-0 相同的標準具有臨床穩(wěn)定的腎功能，并且用三種藥物免疫抑制方式(包括I丐調(diào)憐Ife酶或雷帕霉素革巴蛋白mTOR抑制劑、抗增殖劑和皮質(zhì)留類)和“CAN”參與者(n=20)，被定義為慢性同種異體移植腎病和損傷的腎功能(相對于最初的移植后基線，其基線CRT有50%的增加)，這歸因于假定的免疫介導的同種異體移植排斥。另一組由31名健康對照志愿者(HC)沒 有腎病/腎功能障礙病史，或沒有明確醫(yī)學疾病患病證據(jù)。各組特征如表3所述。完整的血液mRNA和冰凍的PBMC由實驗室進行上述選擇的驗證分析。血樣:
在靜脈放血24內(nèi)，對所有訓練集樣本進行處理。使用淋巴細胞分選儀(PAA實驗室，英國薩莫塞特郡)的密度梯度離心獲取PBMCs。細胞清洗后重懸于10%的DMSO (Sigma公司，英國多塞特郡)和人血清(Biowest公司，法國)中，并立即冷凍于_80°C。24小時后轉移至液氮存放備用。PBMC的流式細胞儀分析
融化后的PBMC清洗后重懸為lX106/mL。用滴定量的熒光結合的單克隆抗體來鑒定白血球，⑶45+⑶14-用于鑒定淋巴細胞，⑶3+用于鑒定T細胞，⑶19+用于鑒定B細胞，⑶56+⑶3-用于鑒定NK細胞，⑶4+⑶3+用于鑒定⑶4T細胞，⑶8+⑶3+用于鑒定⑶8T細胞。B細胞集群如上所述，⑶19+⑶27+IgD-⑶24+⑶38int用于后期記憶B細胞，CD19+CD27-CD24intCD38int 用于初始 / 成熟 B 細胞，CD19+CD27_CD24+CD38hi 用于 T1/T2過渡B細胞(以上均來自Caltag公司，美國伯林翰)。用多聚甲醛/PBS固定細胞，在48小時內(nèi)從FAC Scalibur流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)。如參考文獻(31)所述研究⑶4+T細胞的⑶25表達。利用500ng/mL佛波醇12-豆蘧酸鹽13-醋酸鹽和I y M離子霉素，在2 u M莫能菌素和10 u g/mL布雷菲爾得菌素-A存在下，于37°C處理5小時，體外刺激PBMC的細胞內(nèi)細胞因子染色估計TGFP (來自R&D系統(tǒng))、IL-10和IFNy (均來自eBioscience英國)的B細胞產(chǎn)生?？构w抗體檢測:將外周血收集在凝血激活因子采血器中(Becton Dickinson,美國圣何塞),使之在最少2小時，最多24小時內(nèi)凝血。離心后收集血清并保存在_80°C備用。利用xMAP Luminex,液態(tài)懸浮芯片)技術篩選任何特異性的IgG抗HLA抗體
(32)。清洗后，被覆HLA的Luminex篩選小球和12.5 μl患者血清或對照血清被添加到平板上，在暗處溫和混合30分鐘。清洗平板3次，將結合PE (藻紅蛋白)的目標抗人IgG (1:10)添加至每個測試孔中。孵育1小時，添加清洗緩沖液，然后參照操作手冊使用LuminexlOO收集數(shù)據(jù)。IgG亞類和抗HLA廣譜特異性的篩選:
檢測陽性血清中的IgG亞類、類型I和類型II廣譜特異性的差別。使用類型I和類型II的Luminex識別試劑盒(Quest生物醫(yī)學公司)進行篩選。用于檢測結合患者抗體的二級抗體為:與生物素結合的抗人IgGl (8c/6-39克隆，Sigma公司)，與生物素結合的抗人IgG2 (HP-6014克隆，Sigma公司)，與生物素結合的抗人IgG3 (HP-6050克隆，Sigma公司)，與生物素結合的抗人IgG4 (clone HP-6050，Sigma公司)和鏈霉素親和素-藻紅蛋白(Calbiochem 公司)。用于功能分析的細胞組分:
分析當天融化PBMCs。使用上述陰性免疫分離方法分離T細胞集CD4+和CD4+CD25-(扣除CD4+的CD25+細胞)(33)。利用流式細胞儀確定純度。具體地說，本發(fā)明使用了兩組特異的結合熒光染料的單克隆抗體來對分離的外周血單核細胞進行染色。對淋巴細胞(正向和CD45+CD14-表達選擇)進行以下分析。第一組包括:TCRy / S -FITC，CD25-PE，CD4-APC。(FITC:異硫氰酸熒光素)。選擇CD4+T細胞獲得CD4+CD25int的水平，在這一組內(nèi)研究CD25中間體的表達(限定為從CD25陰性到CD25，與CD4NEG細胞顯示水平一樣高的，高CD25細胞被排除在外)。第二組包括:CD3-FITC，CD56-PE和CD19-APC。選擇CD19+細胞獲得可變的“B.T”，通過CD3+淋巴細胞的百分比加以區(qū)分。供體、替代供體和第三方細胞:
來自31名肝腎供體的細胞被用于對訓練集進行71供體特異性細胞分析，以及28個供體用于對測試集64個細胞樣本的分析。在無法獲得供體血的情況下，取具有與原始供體相同的HLA II類表達的替代供體細胞。這些細胞和類似地錯配第三方細胞來自:安東尼 諾蘭骨髓庫登記處的健康志愿者、HLA類型的健康志愿者和來自倫敦漢默史密斯與蓋伊醫(yī)院的尸體捐贈者的脾細胞。當與相應供體和受體比較時，根據(jù)類型II (HLA-DR和HLA-DQMAHLC錯配數(shù)選擇類似錯配的第三方細胞。用于ELISpot的MLR (混合淋巴細胞)培養(yǎng)物:
根據(jù)操作手冊使用人IFN Y-ELISpotPRO試劑盒(Mabtech公司，瑞典)。使用ELISpot平板的自動成像分析儀(AID公司，德國)列舉扣除背景的陽性點。使用從供體PBMCs或HLA-類型的第三方細胞分離到的無T細胞和NK細胞的PBMCs (APCs)的受體CD4+T細胞進行直接途徑的供體抗體特異性應答T細胞頻率的定量分析。異體移植物MLR培養(yǎng)24小時以上。通常從每孔2X 105個應答細胞開始進行三次兩倍稀釋設置重復。通過與在最高稀釋中使用應答細胞數(shù)量相比一半的APCs來保持刺激物與應答細胞的比例一致，通常每孔2X105個應答細胞。利用對供體頻率和對第三方頻率的比表示供體的反應性。在數(shù)據(jù)庫中記錄頻率倒數(shù)(例如，54000個細胞中的1個記錄為54000)，從而當該比值大于1.5時表示對供體刺激的應答不足。用于基因表達分析的血樣:
對于訓練集來說，外周靜脈血直接流入PAXgene全血RNA采血管(QIAgen公司，英國克勞里)中。使用包括DNAse I (脫氧核糖核酸酶I)處理的PAXgene全血RNA試劑盒(QIAgen公司)抽提全血RNA。對于測試集來說，外周靜脈血直接流入Tempus 全血RA采血管(美國應用生物系統(tǒng)公司)中。根據(jù)操作手冊抽提全血RNA?？俁NA樣本進行RT-PCR和微芯片分析確定基因表達。用于mRA研究的樣本:
來自訓練集的95個樣本包括:13個來自IOTol-DF患者的樣本，16個來自Ils-LP患者的樣本，8個來自8s-nCNI患者的樣本，40個來自28s_CNI患者的樣本，10個來自9CR患者的樣本和8個來自8HC的樣本。來自測試集的142個樣本包括:31個來自23Tol-DF患者的樣本，14個來自IlMono患者的樣本，52個來自34s_CNI患者的樣本，25個來自18CAN患者的樣本和20個來自20HC的樣本。

RNA質(zhì)量控制:
使用安捷倫(Agilent) RNA6000Nano試劑盒在Agilent2100生物分析儀(Agilent科技公司)上測定MXgene (訓練集)和Tempus (測試集)純化的RNA的質(zhì)量和完整度。在ND-1000分光光度計(NanoDrop科技公司)上通過測定A260nm處的吸收值對RNA進行定量。RNA擴增和標記:
根據(jù)“基于單色微芯片的基因表達分析”方法(第5.5版，G4140-90040)對樣本進行標記。簡單地說，使用安捷倫低RNA輸入線性擴增試劑盒(來自Agilent科技公司)，在青色素3-CTP存在的情況下，對0.5 ii g總RNA進行擴增和標記。使用ND-1000分光光度計測定cRNA的產(chǎn)量和染料結合率。RISET2.0Agilent 定制微芯片:
所有的全血樣本在RISET2.0微芯片平臺上進行雜交。這是一個定制的Agilent8X15K60mer寡核苷酸微芯片，包括5069個重復三次出現(xiàn)的探針。選擇的探針對應于4607個具有有效的Entrez (因特茲)基因ID的基因，還有407個未指定有效Entrez基因ID的探針。在探針優(yōu)化的雜交特性基礎上，優(yōu)化探針設計以檢測一個基因的多種轉錄變體，并避免交叉雜交。在對RNA質(zhì)量和完整性的控制后，使用Agilent基因表達雜交試劑盒(Agilent科技公司)中“基于單色微芯片的基因表達分析”方法進行雜交過程。簡單地說，0.6ug溶于雜交緩沖液的用Cy3標記的cRNA碎片過夜雜交(17小時，65°C )至RISET2.0微芯片。雜交后，用Agilent基因表達漂洗緩沖液I在室溫清洗一次，清洗時間為I分鐘，之后用預熱的(37°C )含有0.005%N-月桂酰肌氨酸的Agilent基因表達漂洗緩沖液2清洗第二次，清洗時間為I分鐘。最后用乙腈清洗30秒。掃描和數(shù)據(jù)分析:
使用Agilent微芯片掃描系統(tǒng)(Agilent科技公司)檢測Agilent微芯片上的突光信號。Agilent特征提取軟件(FES v.9.5.1.1)用于讀取和處理微芯片圖像文件。為了確定差異的基因表達，使用羅塞特(Rosetta)解析基因表達分析系統(tǒng)(v.7.1.0.2，Rosetta制藥公司)對FES來源的輸出數(shù)據(jù)進行進一步的分析。首先，從IOT數(shù)據(jù)庫中包含的所有樣本中計算模擬共用基準。使用該基線，計算每個基因和樣本的log2比率。同時，使用羅塞特分解(Rosetta Resolver)軟件中的通用誤差模型計算代表每個基因中樣本與通用參照之間所觀察到的差異可靠性的P-值(34)。注釋富集分析:
不同樣本組之間差異和兩個研究組相同的基因列表對照完整的RISET2.0微芯片配置分析了生物途徑注釋的統(tǒng)計學重要富集。富集一詞是指使用Fisher精密實驗為預期的背景分布進行打分。注釋源于不同的資源，例如基因本體(GO, www.geneontology.0rg)、信號通路、序列主題、染色體附近、文獻關鍵詞和細胞特異性標志基因。定量RT-PCR 分析:
使用qPCRlstStrand合成試劑盒(Stratagene公司)對200ng全血總RNA進行反轉錄，合成的cDNA用于RT-PCR分析。微芯片數(shù)據(jù)驗證
利用定量RT-PCR對所選擇的一套由微芯片基因表達分析鑒定的基因進行驗證。使用來自美國應用生物系統(tǒng)公司的預制TaqMan (水解探針)平板對下列基因進行定量RT-PCR:Hs01017452_mlB 淋巴酪氨酸激酶(BLK)、Hs00236881_mlCD79b 分子(CD79b)、Hs01099196_ml硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-029磺基轉移酶I (HS3ST1)、含有IB的Hs01592483_mlSH2結構域(SH2D1B)、Hs00172040_mlT 細胞白血病(TCL1A)。訓練集中的其他分析篩查:
發(fā)明人還進行了間接途徑IFN y ELISpot和直接與間接途徑的trans-vivo DTH (體內(nèi)轉移性遲發(fā)型超敏反應)分析。對直接和間接途徑培養(yǎng)的供體和受體細胞進行細胞因子基因的RT-PCR擴增，利用TC R-景觀分析進行TCR-全側面剖析(數(shù)據(jù)未顯示)。統(tǒng)計學:
當n〈20，數(shù)據(jù)不遵循正態(tài)分布時，在很多組比較中非參數(shù)測試被用于評估統(tǒng)計學意義。魏克森(Wilcoxon)標志的等級檢驗被用于比較相同患者組內(nèi)的應答。曼-惠特尼U檢驗(Mann-ffhitney U檢驗)被用于比較患者組之間的中值。為了比較臨床變量之間的相互關系，通常作為絕對的數(shù)據(jù)和存在或不存在抗HLA抗體進行記錄，使用費歇爾(Fisher)精度檢驗。當小于0.05時，雙側p值被用于表示差異顯著。微芯片和生物標志的統(tǒng)計分析:
使用4類分析和克-瓦氏(Kruskal-Wallis)檢驗，結合本杰明-霍伯格檢驗(Benjamin1-Hochberg)調(diào)節(jié)1%的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR) (12),統(tǒng)計地確定了微芯片檢測到顯著改變的表達。當數(shù)據(jù)似乎背離正常情況時，發(fā)明人選擇一種非參數(shù)檢驗進行分析。使用類似的處理來排列生物標志(大規(guī)模檢測，其遺漏值等于樣本平均值)。為了評估變體數(shù)檢測耐受患者的預測能力，發(fā)明人使用受體運轉特征(ROC)曲線。為此，首先在訓練集中進行四類分析，鑒定Tol-DF的差異表達探針，使用Kruskal-Wallis測試排序。然后在二元回歸模型中添加顯著差異表達的探針，并用于在樣本中進行分類。二元回歸處理用于計算每個主體是Tol-DF患者的概率p[l]，…，p[n]。通過在0至I之間改變概率閾值產(chǎn)生ROS曲線；對于每個閾值t來說，如果p [i] >t，那么主體i的實際等級與預期等級比的2 X 2分類表等同于“Tol-DF”。個體的自引重取樣表示樣本分類內(nèi)的結果是堅定的。對于測試集來說，使用來自訓練集分析的相同探針。耐受腎移植患者的人口統(tǒng)計學:訓練集包括71個歐洲腎移植受體和19歲性別匹配健康對照(表I)。Tol-DF組具有高比例尸體供體(11個供體中有7個是尸體供體)、高度的HLA錯配(中間錯配4.0)，主要是男性(11個供體中有9個是男性)，該組有不同的原因導致晚期腎衰竭，以及一些敏感事件證據(jù)，例如輸血和先前的移植(表2)。這些患者經(jīng)歷相對平安無事的移植后過程，其中僅有I名患者具有發(fā)生急性細胞排斥(ACR)的記錄。無需免疫抑制的時間為期I年到21年。測試集的Tol-DF組(表3)包括24名患者，他們絕大多數(shù)接受了來自HLA高度匹配的活體供體的移植(中間錯配0.0)，停止免疫抑制治療長達I年至32年。Tol-DF受體出現(xiàn)B淋巴細胞和NK淋巴細胞數(shù)量的增長。如圖1所示,訓練集中的Tol-DF患者外周血B細胞和NK細胞的百分比有所增長，而T細胞的百分比則相應降低。當將B細胞與T細胞的百分比表示為一個比率時，Tol-DF患者于所有其他研究組相比具有較高的比率，包括HC。對于6位Tol-DF患者和10位s-CNI患者來說，也有可能計算每個淋巴細胞亞集中細胞的絕對數(shù)量。這表示可變的比例是由于B細胞和NK細胞數(shù)目的擴增，并不是T細胞數(shù)目的減少，因為Tol-DF組中沒有一個是免疫缺陷的(表2)。與訓練集中的結果一致，測試組中的Tol-DF患者體內(nèi)外周血B細胞百分比有所增加，與其他所有組相比，除了 HC外，具有更高比率的B:T細胞百分比。假設Tol-DF患者體內(nèi)檢測到外周血B細胞有明顯的增加，進一步評估來自兩個研究集中所選患者的B細胞亞集分析(圖8)和細胞因子產(chǎn)量(圖9) Tol-DF組中的B細胞亞集展現(xiàn)重新分布的趨勢，后期記憶庫降低，并伴隨過渡性和天然B細胞亞集的增加。當檢測B細胞亞集百分率時，Tol-DF患者與CR患者相比具有明顯較低的記憶B細胞比率和較高的過渡態(tài)B細胞。源自Tol-DF患者B細胞的絕大部分可在體外刺激下產(chǎn)生TGF β，而不是IL-1O或IFN Y。但是，任何研究組中都沒有觀察到IL-1O產(chǎn)量的顯著差異。通過計算產(chǎn)每種細胞因子的B細胞數(shù)量比值分析來自每個患者分組的B細胞在刺激下產(chǎn)細胞因子的能力。這表明Tol-DF患者的B細胞具有偏離的細胞因子應答，其產(chǎn)TGF β的能力比來自其他研究組的B細胞高。

耐受受體的外周血內(nèi)具有較少的活性⑶4+Τ細胞。按照上述方法分析⑶4+Τ細胞中CD25的表達。與HC、s-LP, s-nCNI和CR組相比，訓練集中Tol-DF患者具有明顯較低的循環(huán)⑶4+⑶25int T細胞百分比，大體上被認為是活性T細胞(9，10)(圖2A)。有趣的是，僅在用s-CNI完全免疫抑制的患者和其他組患者之間僅檢測到⑶4+⑶25hi調(diào)節(jié)T細胞百分比的明顯差異(圖2B)。相似的結果也見于測試集，其中Tol-DF患者的⑶4+⑶25int T細胞的百分比較s-CNI和CAN組明顯更低，但To1-DF和其他研究組之間沒有檢測到⑶4+⑶hiTregs百分比的差異(圖2C和2D)。其他組之間的統(tǒng)計比較如表5所示。當我們檢測富集的CD4+CD25hi T細胞抑制因多克隆刺激誘導的自身T細胞增殖的能力是，我們發(fā)現(xiàn)任何患者組或健康對照之間沒有明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，Tol-DF患者沒有更高比率的其他調(diào)節(jié)T細胞亞集，例如⑶3+⑶8+⑶28-或⑶3+⑶4-⑶8-T細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。絕大多數(shù)耐受受體沒有檢測到抗供體HLA特異性抗體。利用Luminex xMAP分析，在來自所有訓練集研究組的一些患者中檢測到了血清非供體特異性抗體(NDSA)(圖3A)。在這群人中，沒有Tol-DF患者具有可檢測的供體特異性抗體(DSA)，其中所有其他組中的一些患者具有可檢測的DSA，幾乎有一半的CR患者具有可檢測的供體和非供體特異性抗HLA類型I和類型II抗體。與訓練集類似，測試集中的22名Tol-DF患者中只有一名患者具有可檢測的DSA (數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，通常DSA-陽性患者較DSA-陰性患者具有更差的移植功能，與DSA-陰性患者中估計的腎小球滲透率為60(幅度13-94)相比，DSA-陽性患者僅為31 (幅度17-87)。在訓練集中檢測到可能的檢測抗供體抗體的致病性(圖3B)。在20名具有抗類型I抗體的患者中的7位和13名具有抗類型II抗體的患者中的4位體內(nèi)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)補體固定的同型抗原(IgGl和IgG3);其余陽性病例僅是非補體固定的同型抗原。NDSA抗類型I和抗類型II抗體的檢測與之前接受移植有關，在移植前具有可檢測的專門活性抗體(Fisher精確檢驗p〈0.05),但與之前的懷孕、輸血、移植功能障礙或ACR發(fā)作無關。相反，DSA抗類型II抗體與之前的ACR發(fā)作和供體與受體之間HLA錯配數(shù)量有關(Fisher精確檢驗P〈0.05)。耐受患者具有較低頻率的直接途徑抗供體IFNy⑶4+T細胞應答。與由IFNyELISport評估的直接途徑的⑶4+T細胞抗供體和抗第三方(等同于與供體錯配)應答相比，Tol-DF患者較訓練集內(nèi)其他所有穩(wěn)定患者組具有明顯更高應答抗供體:抗第三方頻率比值，代表供體特異性的低反應性(圖4A ;供體和第三方的個體應答頻率如圖10所示)。供體特異性的低反應性并不是由調(diào)·節(jié)性T細胞介導的，因為CD25+細胞從應答T細胞的耗盡并沒有導致應答頻率的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。由于測試集Tol-DF組通常與其供體完全HLA匹配，抗供體和抗第三方IFNy應答通常非常低(應答頻率>1/200000)。盡管如此，Tol-DF組中抗供體應答的趨勢通常會再生，盡管沒有檢測到與其他組有明顯的不同(圖4B)。耐受受體的外周血中有較高的FoxP3和α -1, 2_甘露糖苷酶基因的表達比率，由qRT-PCR分析得到的全血FoxP3和α· -1, 2_甘露糖苷酶基因的表達水平都與移植后抗供體免疫活性相關(圖11)。當計算FoxP3和α-1，2_甘露糖苷酶基因表達比率時，訓練集Tol-DF和CR與HC組之間檢測到明顯的差異(圖5Α)。顯示最高比率的患者組是HC，s_LP和Tol-DF，其中CR中的比率非常低(用于各組間比較的Mann-Whitney U檢驗P值如表6所不)。該比率明顯與eGFR (表皮生長因子受體)相關,與血清肌氨酸酐相反(Pearson皮爾森系數(shù):0.372p=0.002和-0.299p=0.014，數(shù)據(jù)未顯示)。當對測試集進行同樣的分析時，Tol-DF患者比率明顯高于其他患者組，除了 HC (圖5B)。結合訓練集和測試集的觀察結果顯示耐受與外周血中FoxP3和α -1, 2-甘露糖苷酶基因的高表達比有關。耐受患者具有不同的基因表達特征。以移植研究為目的設計的RISET2.0定制微芯片包含5069個探針，用于分析外周血樣本中4607個基因的表達(有效的Entrez基因ID)。對訓練集進行微芯片數(shù)據(jù)的四類分析(圖6)。使用Kruska-Wallis非參數(shù)測試，結合將錯誤發(fā)生率(FDR)調(diào)整為1%，統(tǒng)計確定Tol-DF患者于其他比較組、穩(wěn)定受體(s-CN1、s-nCNI和s-LP )、CR和HR之間檢測到顯著改變的基因表達。HC組被弓I入這一分析中，從而解決與其他研究組相比Tol-DF患者中免疫抑制的缺乏。對應于255個基因的260個探針在研究組之間有明顯的差異表達。當對測試集進行同樣的分析時，對應于1352個基因的1378個探針有明顯改變的表達，而訓練集與測試集之間有174個探針(170個基因)是共同的(表7)。對列表中高度排列的若干探針進行qRT-PCR分析驗證微芯片表達，包括下調(diào)或上調(diào)探針。使用兩種分析所有基因的表達都是高度共相關的(圖12A-E)，根據(jù)基因研究，所選擇基因的qRT-PCR定量表達與至少一個其他患者組有明顯差異(圖12F-J)。有趣的是，訓練集和測試集之間，Tol-DF患者樣本中所有選擇基因的中間表達水平非常相似，盡管測試集中具有更高的樣本數(shù)，其相關系數(shù)通常更高(圖13A-E)。此外，Tol-DF患者中檢測的5個基因中的4個基因的基因表達與其他組中的絕大多數(shù)差異顯著(圖12&13F-J)。表8中顯示了頂端排布探針的中間探針表達值。一種更為精確的基因表達分析的定量方法進行基因表達診斷能夠確定非耐受個體的耐受性，這種能力是由微芯片分析鑒定的頂端排布基因進行研究，不包括用于任何單個基因(例如，排名第2和4的TCL1A，不包括排名第4的探針)的任何重疊探針，在附加的二元回歸模式中繪制ROC曲線。這些探針被用于構建基因表達標記，通過首次產(chǎn)生預測類型(樣本內(nèi))來特異性鑒定Tol-DF患者，從而對每個個體進行分類。為了進行這種分析，通過從非耐受比較組中包含和排除HC組建立兩類ROC曲線(耐受與非耐受)。因為盡管健康對照與耐受個體相比是鑒定耐受特異性基因表達，在腎移植患者中研發(fā)進行臨床耐受診斷測試時，這種比較是無用的。在排前10位的基因表達的基礎上(表4)，排除HC建立相應的ROC曲線具有一個特異性和靈敏性為I的峰，其閾值是0.01，訓練集(R0C包括HC ;閾值0.2、特異性0.853、靈敏性0.923)內(nèi)100%相應陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)。盡管3個基因和6個基因足以在訓練集內(nèi)很好地分辨耐受患者，選擇使用排前10位的基因，它們提高測試集ROC分析的特異性和靈敏性，其特異性為0.890，靈敏性為0.806，閾值為0.35，PPV和NPV分別為71%和93% (R0C包括HC ；閾值0.23，特異性0.801，靈敏性0.806)。發(fā)明人對訓練集和測試集之確定的174個重疊探針進行注釋富集分析。絕大多數(shù)與注釋途徑有關的基因在相關途徑的B細胞內(nèi)富集(表9)。與這些數(shù)據(jù)一致，排名前11的探針與10個基因、6個基因相關，由B細胞或相應于B細胞功能表達(表4)。除了本探針列表內(nèi)富集的B細胞相關途徑，其他途徑也是非常重要的，包括蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶、次級信號分子的產(chǎn)生和其他T細胞激活相關途徑(表9)?？缙脚_生物標志診斷能力
材料與方法部分描述的所有測試與其從所有其他研究組中區(qū)分Tol-DF患者的診斷能力并行測定對測試集的分析是對訓練集內(nèi)耐受的高度預測，這已在上文進行討論。通過結合表示耐受的多種生物標志，發(fā)明人預期它可以明顯提高任何個體測試的診斷能力。這確實在測試集中觀察到了。事實上，當結合分析生物標志和微芯片數(shù)據(jù)，使用B/T淋巴細胞亞集比，2)CD4+CD25int T細胞百分比，3)抗供體比抗第三方ELISpot頻率比，4)FoxP3/α-1，2-甘露糖苷酶表達比，5)排名前10基因特征，訓練集的特異性和靈敏性為1，閾值為
0.01，這表示100%的PPV和NPV(圖7Α)。當分析測試集時，獲得一個特異性為0.923、靈敏性為0.903的峰，其閾值為0.27，PPV為80%，NPV為96% (圖7Β)，這比僅獲得基因表達的方法提高了診斷能力。因此，跨平臺生物標志的應用提高了鑒定真實耐受性的能力，除了基因表達和表型分析，還考慮了個體的免疫功能狀態(tài)，后者可能與描述耐受機制的基礎的關系更為密切。在這一方面，研究患者T細胞和B細胞應答是有用的方法，也可能用作本發(fā)明的生物標志?？缙脚_生物標志的利用在于它能夠確定未察覺的可操作耐受的腎移植患者。如圖7C和D所示，測試集中5個穩(wěn)定的受體具有耐受特征，可從免疫抑制的中斷管理中受益。有趣的是，測試集中2個CAN患者也被鑒定為具有高概率的耐受性。該結果可用慢性排斥的臨床評估中的不同來解釋，與訓練集中的CR組不同，CAN患者的活組織檢查結果并不被證明具有免疫介導的排斥，但可在低移植功能的基礎上確定。用于檢測這些患者的跨平臺生物標志具有足夠的靈敏性來檢測 這兩組患者之間的微小差異，其性能可由對患者連續(xù)的免疫監(jiān)測揭示。統(tǒng)計數(shù)據(jù)
權利要求
1.種確定個體對腎移植免疫耐受的方法，其特征在于，該方法包含確定從個體所獲取樣本的一組基因中選擇的至少2個基因的表達水平，這組基因由TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1 和 FCRL2 組成。
2.權利要求1所述方法,其特征在于，SH2D1B、PN0C、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl和FCRL2的表達水平比具有免疫耐受性個體的正常水平更高，而TLR5和SLC8A1的表達水平則比具有免疫耐受性個體的正常水平低。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法確定了來自個體樣本中的TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表達水平。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法通過SH2D1B和PNOC的高表達水平，以及TLR5的低表達水平能夠確定個體對器官移植耐受的陽性預測結果。
5.權利要求3所述方法，其特征在于，所述方法還確定了⑶79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一個或多個的表達水平。
6.上述權利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含確定B細胞和NK細胞的水平，該兩種細胞的水平升高代表免疫耐受。
7.上述權利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含確定⑶4+⑶25int T細胞的水平，該細胞水平相對于⑶4+ T細胞總數(shù)而降低代表免疫耐受。
8.上述權利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含確定供體特異性CD4+ T細胞的水平，該細胞水平的降低代表免疫耐受。
9.上述權利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含確定CD4+T細胞的FoxP3與a -1, 2-甘露糖苷酶基因表達水平的比率，該比率高則代表免疫耐受。
10.上述權利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含確定CD19+與CD3+細胞的比率，該比率高則代表免疫耐受。
11.上述權利要求任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法將P-actin和/或HRPT的表達水平作為對照。
12.個傳感器，其特征在于，所述傳感器用于檢測從包括TLR5、PN0C、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1和FCRL2在內(nèi)的基因中選擇的至少2個基因的表達水平。
13.個傳感器，其特征在于，所述傳感器用于檢測TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表達水平。
14.權利要求13所述的傳感器，其特征在于，所述傳感器用于檢測⑶79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2中的一個或多個基因表達水平。
15.個試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用于檢測從包括TLR5、PNOC、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2在內(nèi)的基因中選擇的至少2個基因的表達水平的試劑。
16.個試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用于檢測TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表達水平的試劑。
17.權利要求16所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還進一步包含用于檢測CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2中的一個或多個基因表達水平的試劑。
18.權利要求15至17所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含利用RT-PCR檢測基因表達水 平的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種根據(jù)多個生物標志的水平確定個體移植耐受性的方法。本發(fā)明還包括一個含有用于測定生物標志水平所需試劑的試劑盒。此外，本發(fā)明還公開了一種傳感器，用于測定多個決定個體移植耐受性基因的表達水平。
文檔編號C12Q1/68GK103097549SQ201180032809
公開日2013年5月8日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權日2010年5月4日
發(fā)明者瑪利亞·赫爾南德茲-富恩特斯, 艾琳·梅薩, 烏維·楊森, 斯蒂凡·湯米尤, 波吉特·薩維斯基, 漢斯-迪特·沃爾克, 羅伯特·萊克勒 申請人:倫敦國王學院, 柏林夏洛蒂醫(yī)科大學, 美天旎生物技術有限公司