專利名稱：用于治療基質(zhì)礦化障礙的方法、組合物、和試劑盒的制作方法
用于治療基質(zhì)礦化障礙的方法、組合物、和試劑盒
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及基質(zhì)礦化障礙如低磷酸酯酶癥(HPP)的治療。HPP是由在ALPL基因中的一個(gè)或多個(gè)功能缺去突變所引起的罕見的遺傳性疾病，上述基因編碼組織非特異性堿性磷酸酶(TNALP ；a.k.a骨/肝/腎型ALP)。在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的堿性磷酸酶缺乏會損害骨骼礦化，從而導(dǎo)致佝僂病或骨軟化。HPP的嚴(yán)重性取決于它的發(fā)作年齡。圍產(chǎn)期HPP，HPP的最嚴(yán)重形式，導(dǎo)致在子宮內(nèi)幾乎完全沒有骨礦化并且可以引起死產(chǎn)(死胎)。嬰兒HPP，在6個(gè)月的年齡以前診斷的，導(dǎo)致骨骼礦化的受損，其可以導(dǎo)致骨折和畸形。童年期HPP可以引起乳牙的過早缺失和佝僂病。最后，成年HPP可以引起應(yīng)力骨折以及關(guān)節(jié)炎和焦磷酸鹽關(guān)節(jié)病的發(fā)作。鑒于基質(zhì)礦化障礙如HPP對受影響患者，尤其是嬰兒和兒童的可怕的近期和長期影響，所以需要開發(fā)用于治療基質(zhì)礦化障礙的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在HPP小鼠模型中，缺乏聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)的堿性磷酸酶-Fe融合蛋白可以有效地治療HPP。因此，本發(fā)明提供了包含sALP-Fc或Fc-sALP多肽的組合物和包含編碼sALP-Fc或Fc_sALP多肽的核酸的組合物。本發(fā)明還提供了方法和試劑盒，用于利用上述多肽和核酸來治療基質(zhì)礦化障礙如HPP和它的相關(guān)的表型。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療主體的基質(zhì)礦化障礙的方法，該方法包括給予主體治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含:(a)多肽，其包含結(jié)構(gòu)Z-sALP-Y-Fc-X或結(jié)構(gòu)Z-Fc-Y-sALP-X ;以及(b)藥用賦形劑，其中sALP是堿性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列；以及多肽并不包含長于三個(gè)連續(xù)天冬氨酸或谷氨酸殘基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含:(a)多肽，該多肽包含結(jié)構(gòu)Z-sALP-Y-Fc-X或結(jié)構(gòu)Z-Fc-Y-sALP-X ;和(b)藥用賦形劑，其中sALP是堿性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列；以及多肽并不包含長于三個(gè)連續(xù)天冬氨酸或谷氨酸殘基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療主體的基質(zhì)礦化障礙的方法，該方法包括給予主體治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含:(a)編碼多肽的分離的核酸，上述多肽包含結(jié)構(gòu)Z-sALP-Y-Fc-X或結(jié)構(gòu)Z-Fc-Y-sALP-X ;和(b)藥用賦形劑，其中sALP是堿性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列；以及分離的核酸并不編碼包含長于三個(gè)連續(xù)天冬氨酸或谷氨酸殘基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其配制用于治療主體的基質(zhì)礦化障礙，上述藥物組合物包含:(a)編碼多肽的分離的核酸，上述多肽包含結(jié)構(gòu)Z-sALP-Y-Fc-X或結(jié)構(gòu)Z-Fc-Y-sALP-X ;和(b)藥用賦形劑，其中sALP是堿性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列；以及分離的核酸并不編碼包含長于三個(gè)連續(xù)天冬氨酸或谷氨酸殘基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)的氨基酸序列。在本發(fā)明的任何實(shí)施方式中，多肽可以可選地包含結(jié)構(gòu)Z-sALP-Y-Fc-X。在任何實(shí)施方式中，多肽可選地并不包含長于兩個(gè)連續(xù)天冬氨酸或谷氨酸殘基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸區(qū)。在任何實(shí)施方式中，多肽可選地并不包含骨靶向部分。在任何實(shí)施方式中，sALP的氨基酸序列可選地包括或由SEQ ID NO:15的氨基酸殘基23-508組成。例如，sALP的氨基酸序列可選地包括或由SEQ ID NO:15的氨基酸殘基23-512 組成。在任何實(shí)施方式中，sALP的氨基酸序列可選地包括或由SEQ ID NO:16的氨基酸殘基18-498組成。例如，sALP的氨基酸序列可以可選地包括或由SEQ ID NO:16的氨基酸殘基18-502組成。在任何實(shí)施方式中，sALP的氨基酸序列可選地包括與SEQ ID NO:5具有至少85%(例如，至少95%或99% )序列同一性的氨基酸序列。例如，sALP的氨基酸序列可選地包括 SEQ ID NO:5 或由 SEQ ID NO:5 組成。在任何實(shí)施方式中，F(xiàn)e可以可選地包括Ch2域、Ch3域和鉸鏈區(qū)。例如，F(xiàn)e可選地是免疫球蛋白的恒定域，和述免疫球蛋白選自由IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3和IgG_4組成的組。在特定的實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG-1。在其它特定的實(shí)施方式中，F(xiàn)e包括與SEQID NO:3具有至少85% ( 例如，至少95%或99% )序列同一性的氨基酸序列。例如，F(xiàn)e的氨基酸序列可選地包括SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3組成。在任何實(shí)施方式中，Z可選地不存在。在任何實(shí)施方式中，Y可選地為兩個(gè)氨基酸殘基(例如，亮氨酸-賴氨酸)。在任何實(shí)施方式中，X可選地不存在。在任何實(shí)施方式中，Z和X可以均不存在，以及Y可以不存在或可以是至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。例如，多肽可以由結(jié)構(gòu)sALP-Y-Fc或結(jié)構(gòu)Fc-Y-sALP組成。在多肽由結(jié)構(gòu)sALP-Y-Fc或Fc-Y-sALP組成的一些實(shí)施方式中，Y可以由兩個(gè)氨基酸殘基(例如，亮氨酸-賴氨酸)組成。例如，多肽可以由結(jié)構(gòu)sALP-Y-Fc組成?？蛇x地，sALP的氨基酸序列是SEQ ID NO:5的氨基酸序列，Y的氨基酸序列是亮氨酸-賴氨酸，和/或Fe的氨基酸序列是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。例如，多肽的氨基酸序列可以由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成。在任何實(shí)施方式中，多肽的氨基酸序列可選地包括與SEQ ID NO:4具有至少85%(例如，至少95%或99% )序列同一性的氨基酸序列。例如，多肽的氨基酸序列可以可選地包括 SEQ ID NO:4 或由 SEQ ID NO:4 組成。在任何實(shí)施方式中，多肽可選地被聚乙二醇化或糖基化。 在任何實(shí)施方式中，藥物組合物可選地包括多肽的二聚物。在任何實(shí)施方式中，藥用賦形劑可選地包括鹽水。在任何實(shí)施方式中，可選地冷凍干燥藥物組合物。在本發(fā)明的任何方法中，可選地通過皮下、靜脈內(nèi)、口服、鼻、肌內(nèi)、舌下、鞘內(nèi)、或皮內(nèi)途徑來給予藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，皮下給予藥物組合物。例如，本發(fā)明的方法可以可選地包括以約0.5mg/kg/天至約10mg/kg/天(例如，約2mg/kg/天至約3mg/kg/天)的劑量將包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物給予主體。在其它實(shí)施例中，上述方法包括將藥物組合物給予主體，一周一次至七次(例如，一周三次)。在本發(fā)明的任何方法中，基質(zhì)礦化障礙可選地為低磷酸酯酶癥(例如，嬰兒HPP、童年期HPP、圍產(chǎn)期HPP、成年HPP、或牙齒型低堿性磷酸酯酶癥)。在本發(fā)明的任何方法中，可選地以治療有效量給予藥物組合物以治療HPP表型，其選自由HPP相關(guān)的癲癇發(fā)作、乳牙的過早缺失、不完全骨礦化、無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)的升高的血和/或尿水平、磷酸乙醇胺(PEA)的升高的血和/或尿水平、吡哆醛5'-磷酸(PLP)的升高的血和/或尿水平、不適當(dāng)?shù)捏w重增加、佝僂病、骨痛、焦磷酸鈣二水合物晶體沉積、不發(fā)育、發(fā)育不全、和牙骨 質(zhì)的發(fā)育不良組成的組。在一些實(shí)施方式中，不完全骨礦化是不完全股骨礦化、不完全脛骨礦化、不完全跖骨礦化、或不完全肋骨礦化。在任何實(shí)施方式中，主體可以是人?？梢钥蛇x地配制本發(fā)明的任何藥物組合物，用于治療主體的基質(zhì)礦化障礙。在本發(fā)明的特點(diǎn)為給予分離的核酸的任何方法中，可選地用慢病毒載體將分離的核酸給予主體。在一些實(shí)施方式中，可選地以約0.1mg至約IOmg的劑量將分離的核酸給予主體。本發(fā)明的特點(diǎn)在于分離的核酸的任何藥物組合物可以可選地包括包含分離的核酸的重組表達(dá)載體(例如，慢病毒載體)。本發(fā)明還提供了用上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的分離的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的任何多肽的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中在適合于進(jìn)行多肽的表示的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)基回收多肽。例如，宿主細(xì)胞可選地為L細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、或C0S-7細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞(例如，CH0-DG44細(xì)胞)。本發(fā)明還提供了試劑盒。例如，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括:(a)本發(fā)明的任何藥物組合物和(b)將所述藥物組合物給予主體以治療基質(zhì)礦化障礙的說明書。“約”是指列舉值的±10%?！肮前邢虿糠帧笔侵搁L度為6至20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其對于骨基質(zhì)具有足夠的親和力以致骨靶向部分與骨基質(zhì)具有至少10_6M或更好(例如，10_7M、10_8M、10_9M、或更好)的體內(nèi)結(jié)合親和力?！癋e”是指免疫球蛋白(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3, IgG-3或IgG_4)的片段可結(jié)晶區(qū)，包括免疫球蛋白重鏈的Ch2和Ch3域。Fe還可以包括連接Fab和Fe區(qū)的鉸鏈區(qū)的任何部分。Fe可以來自任何哺乳動物(包括人)，并且可以是翻譯后修飾的(例如，通過糖基化)。在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，F(xiàn)e可以是人IgG-1的片段可結(jié)晶區(qū)，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列?！盎|(zhì)礦化障礙”是指影響骨基質(zhì)的礦化的病癥或與病癥相關(guān)的任何表型?；|(zhì)礦化障礙和它們的相關(guān)的表型包括，例如，佝僂病(生長板軟骨的缺損)、骨軟化、成骨不全、嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥、和低磷酸酯酶癥(HPP)(例如，嬰兒HPP、童年期HPP、圍產(chǎn)期HPP、成年HPP、或牙齒型低堿性磷酸酯酶癥)、HPP相關(guān)的癲癇發(fā)作、乳牙的過早缺失、不完全骨礦化、無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)的升高的血和/或尿水平、磷酸乙醇胺(PEA)的升高的血和/或尿水平、吡哆醛5'-磷酸(PLP)的升高的血和/或尿水平、不適當(dāng)?shù)捏w重增加、骨痛、焦磷酸鈣二水合物(CPro)晶體沉積、和牙骨質(zhì)的不發(fā)育、發(fā)育不全或發(fā)育不良。例如，通過生長遲緩，如長骨長度(如股骨、脛骨、肱骨、橈骨、尺骨)的減小、總骨的平均密度的減小和在骨如股骨、脛骨、肋骨和跖骨、以及指骨中骨礦化的減少、牙礦化的減少、和乳牙的過早缺失(例如，牙骨質(zhì)的不發(fā)育、發(fā)育不全或發(fā)育不良)，可以診斷基質(zhì)礦化障礙。沒有被如此限制，可以通過以下一種或多種來觀測基質(zhì)礦化障礙的治療:長骨長度的增加、在骨和/或牙中礦化的增加、弓形腿的矯正、骨痛的降低和在關(guān)節(jié)中CPro晶體沉積的減少?！八幬锝M合物”是指這樣的組合物，其包含本文描述的多肽或核酸，用藥用賦形劑加以配制，并在得到政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)的情況下加以制造或出售，作為用于治療哺乳動物的疾病的治療方案的一部分。可以配制藥物組合物，例如，用于單位劑型的口服給予(例如，片劑、膠囊劑、膠囊形片劑、軟膠囊、或糖漿劑)；用于外用(例如，作為乳膏劑、凝膠劑、洗劑、或軟膏劑)；用于靜脈內(nèi)給予(例如，作為沒有顆粒栓塞并在適用于靜脈內(nèi)使用的溶劑系統(tǒng)中的無菌溶液)；用于皮下給予；或配方描述的任何其它劑型?！八幱觅x形劑”是指這樣的載體，其對于接受治療的主體來說是生理上可接受的，同時(shí)保留和它一起給予的化合物的治療性能。一種示例性的藥用賦形劑是生理鹽水。其它生理上可接受的賦形劑和其它劑型是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且描述于，例如，“Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20 th ed., ed.A.R.Gennaro, 2000,Lippincott Williams &ffilkins)?！岸嚯摹笔侵搁L度為至少兩個(gè)氨基酸的氨基酸的任何天然或合成鏈，并且包括那些具有翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)的氨基酸的任何天然或合成鏈。如在本文中所使用的，當(dāng)多肽或核酸序列被稱作相對于參比序列具有“至少X%序列同一性”時(shí)，它是指，當(dāng)最佳對齊序列時(shí)，在多肽或核酸中的至少x%的氨基酸或核苷酸相同于參比序列的那些氨基酸或核苷酸?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的各種方式來確定最佳序列對比，例如，Smit hWaterman 序列對比算法(Smith et al.，].Mol.Biol.147: 195-7,1981)和 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ；Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-10，1990)。利用公開可用的計(jì)算機(jī)軟件可以訪問這些和其它序列對比算法，如“BestFit”(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489,1981),如合并至丨JGeneMatcher Plus (Schwarz and Dayhof,Atlas ofProtein Sequence and Structure,Dayhoff，M.0.，Ed pp 353-358，1979)、BLAST、BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N、BLAST-X,WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、或 Megal ign (DNASTAR)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量序列對比的適當(dāng)參數(shù)，包括為在待比較的序列長度上實(shí)現(xiàn)最佳序列對比所需要的任何算法。通常，對于多肽，比較序列的長度可以為至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選10、20、30、
40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、或更多個(gè)氨基酸，高達(dá)多肽的整個(gè)長度。對于核酸，比較序列的長度可以通常為至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、或更多個(gè)核苷酸，高達(dá)核酸分子的整個(gè)長度。應(yīng)當(dāng)明了，當(dāng)比較DNA序列與RNA序列時(shí)，為了確定序列同一性，胸腺嘧啶核苷酸相當(dāng)于尿嘧啶核苷酸。術(shù)語“sALP”、“可溶性堿性磷酸酶”、和“堿性磷酸酶的胞外域”可互換使用并且是指可溶性的、非膜結(jié)合的堿性磷酸酶，或其域、生物活性片段、或生物活性變體。sALP包括，例如，缺乏C端GPI信號序列的堿性磷酸酶，例如，包括或由人TNALP(SEQ ID NO:6)的氨基酸18-502組成的多肽。sALP進(jìn)一步包括，例如，人TNALP的哺乳動物直系同源物的可溶性的、非膜結(jié)合形式(例如，這樣的多肽，其包括或組成自SEQ ID NO:7的氨基酸16-502或18-502、SEQ ID NO:8 的氨基酸 18-502、SEQ ID NO:9 的氨基酸 18-502、SEQ ID NO:10 的氨基酸18-502、或SEQ ID NO:11的氨基酸)、人IALP、GCALP、和PLALP的可溶性的、非膜結(jié)合形式(例如，這樣的多肽，其包括或組成自SEQ ID NO:12的氨基酸20-503、SEQ ID NO:13的氨基酸20-503、或SEQ ID NO:14的氨基酸23-506)、以及其另外的變體和類似物，其保留堿性磷酸酶活性，例如，水解PPi的能力?！爸黧w”是指任何哺乳動物，例如，人。“治療有效量”是指本發(fā)明的核酸或多肽的量，其足以顯著治療、預(yù)防、延緩、抑制、或阻止基質(zhì)礦化障礙的任何癥狀。本發(fā)明的化合物的治療有效量可以取決于基質(zhì)礦化障礙的嚴(yán)重性以及主體的條件、體重和一般狀態(tài)，并且可以由普通技術(shù)人員考慮到上述因素來確定?？梢砸詥蝿┝炕蛞栽谝欢螘r(shí)間內(nèi)給予的多劑量，將本發(fā)明的化合物的治療有效量給予哺乳動物?！爸委煛笔侵笧榱祟A(yù)防和/或治療的目的給予藥物組合物。“預(yù)防疾病”是指主體的預(yù)防性治療，其中主體尚未生病，但易患、或具有特定疾病的風(fēng)險(xiǎn)。“治療疾病”或用于“治療性治療”是指對已患有疾病的主體進(jìn)行治療以改善或穩(wěn)定主體的病癥。因此，在權(quán)利要求和實(shí)施方式中，用于治療或預(yù)防的目的，對主體進(jìn)行治療。


圖1示出本發(fā)明的多肽的示意圖。(a)人組織非特異性堿性磷酸酶基因(hTNALP)的完全初級翻譯產(chǎn)物，包括N端信號肽和用于GPI加成的瞬時(shí)膜錨定信號。(b) hsTNALP-Fc融合蛋白的初級翻譯產(chǎn)物。(c)分泌的hsTNALP-Fc，其缺乏N端信號肽。圖2示出hsTNALP-Fc (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，包括N端信號肽(開始的17個(gè)氨基酸殘基，下劃線和 斜體的；位置2，纈氨酸，不同于在上述位置處的野生型殘基，異亮氨酸)。多肽(SEQ ID NO:2)的118了嫩1^部分的氨基酸，其對應(yīng)于於嫩1^(5￡0 ID NO:6)的氨基酸1-502，除了如上所述的位置2以外，是斜體。此多肽(SEQ ID NO:3)的Fe部分帶下劃線。以粗體示出在hsTNALP和Fe部分之間的兩個(gè)氨基酸亮氨酸-賴氨酸接頭。圖3示出分泌的hsTNALP-Fc (SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其缺乏N端信號肽。多肽(SEQ ID NO:5)的hsTNALP部分的氨基酸，其對應(yīng)于hTNALP的氨基酸18-502，為斜體。此多肽(SEQ ID NO:3)的Fe部分帶下劃線。以粗體示出在hsTNALP和Fe部分之間的兩個(gè)氨基酸亮氨酸-賴氨酸接頭。圖4 (a) - (d)示出哺乳動物TNALP直系同源物和人ALP同工酶的CLUSTAL W(1.82)多序列對比。哺乳動物TNALP直系同源物包括人TNALP( “sp | P05186 | TNALP_HUMAN”；登錄號 P05186 ;SEQ ID NO:6)、牛 TNALP( “sp|P09487|TNALP_B0VINE” ；登錄號 P09487 ；SEQ ID NO:7)；貓 TNALP ( “sp | Q29486 | TNALP_FELCA” ；登錄號 Q29486 ；SEQ ID NO:8)、小鼠 TNALP ( “sp | P09242 | TNALP_M0USE” ；登錄號 P09242 ；SEQ ID NO:9)、大鼠 TNALP( “sp|P08289|TNALP_RAT” ；登錄號 P08289 ;SEQ ID NO:10)、和狗TNALP( “tr|Q9N0V0|TNALP_CANFA” ；登錄號 Q9N0V0 ；SEQ IDNO:11)的部分序列。人ALP 同工酶包括人 IALP( “sp|P09923|IALP_HUMAN” ；登錄號 P09923 ；SEQ ID NO:12)、人 GCALP( “sp|P10696|GCALP_HUMAN” ；登錄號 P10696 ;SEQ ID NO:13)、和人PLALP( “sp|P05187|PLALP_HUMAN” ；登錄號 05187 ;SEQ ID NO:14)。" *"表示在該列中的殘基在對比的所有序列中是相同的，":"表示觀測到保守替代，以及"."則表示觀測到半保守替代。共有序列源自此對比(“Consensus” ；SEQ ID NO:15)，其中X表示簡并位置。圖5 (a)-(c)示出哺乳動物TNALP直系同源物的CLUSTAL ff(l.82)多序列對 t匕包括人 TNALP( “sp|P05186|TNALP_HUMAN” ；登錄號 P05186 ;SEQ IDNO:6),牛 TNALP( “sp|P09487|TNALP_B0VINE” ；登錄號 P09487 ;SEQ ID NO:7)；貓 TNALP( “sp|Q29486|TNALP_FELCA” ；登錄號 Q29486 ;SEQ ID NO:8)、小鼠 TNALP( “sp|P09242|TNALP_M0USE” ；登錄號 P09242 ;SEQ ID NO:9)、大鼠 TNALP( “sp|P08289|TNALP_RAT” ；登錄號 P08289 ;SEQ ID NO:10)、和狗
ID NO:11)的部分序列。"*"表示在該列中的殘基在對比的所有序列中是相同的，表示觀測到保守替代，以及"則表示觀測到半保守替代。共有序列源自此對比(“Consensus” ；SEQ ID NO:16)，其中X表示簡并位置。圖6示出編碼圖2所示的hsTNALP-Fc多肽的核酸序列(SEQ ID NO:17)。圖7示出在單劑量IV和SC給予(a)sALP和(b) sALP_Fc以后在血清中的平均(土 SD)濃度分布。圖8示出接受載體或不斷提高劑量的sALP-Fc (即，Tx-1、Tx_3、和Tx_6)的Akp2+小鼠的(a)百分比生存和(b)中位生存。圖9示出體重隨年齡的變化，作為治療劑量的函數(shù)。從研究的第一天至結(jié)束，用載體、Tx-1、Tx-3、Tx-6治療的Akp2+小鼠或未經(jīng)處理的WT小鼠的平均每天體重。圖10示出作為治療劑量的函數(shù)的脛骨/股骨長度。和WT相比，在研究結(jié)束時(shí)，使用兩種治療劑量的左脛骨和股骨的個(gè)體長度。圖11示出在Akp2+和正常小鼠中代表性的左腳(放射造影放大3X)、肋廓(放射造影放大(2X)、和右下肢樣品(放射造影放大2X)的放射照片。圖12示出相對于腳的礦化改善，作為sALP-Fc劑量的函數(shù)的正常個(gè)體的百分比。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及融合于Fe的可溶性堿性磷酸酶(sALP)，編碼上述酶的核酸，以及它們應(yīng)用于治療基質(zhì)礦化障礙如低磷酸酯酶癥。下文提供了本發(fā)明的另外的細(xì)節(jié)。堿性磷酸酶堿性磷酸酶包括一組酶，其共享在多種情況下能夠切割磷酸鹽的能力(例如，焦磷酸鹽，PPi,的水解)。存在四種已知的哺乳動物堿性磷酸酶(ALP)同工酶:組織非特異性堿性磷酸酶(TNALP ;下文進(jìn) 一步描述)、胎盤堿性磷酸酶(PLALP)(例如，登錄號P05187、NP_112603、和NP_001623)、生殖細(xì)胞堿性磷酸酶(GCALP)(例如，登錄號P10696)、和腸堿性磷酸酶(IALP)(例如，登錄號P09923和NP_001622)。這些同工酶具有非常類似的三維結(jié)構(gòu)。它們的催化部位各自包含四個(gè)金屬結(jié)合域，其結(jié)合于酶活性所必要的金屬離子，包括兩個(gè)鋅離子和一個(gè)鎂離子。在有高濃度磷酸鹽受體存在的條件下，這些酶催化磷酸的單酯的水解并且還催化磷酸根轉(zhuǎn)移反應(yīng)。已表明，相對于磷酸乙醇胺(PEA)、無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)、和吡哆醛5'-磷酸(PLP)，PALP是生理活性的，所有上述三種是TNALP的天然底物(Whyte，1995)。這些同工酶之間的序列對比示于圖4(a)-4(d)。另外的堿性磷酸酶描述于，例如，WO 2008/138131和美國
發(fā)明者菲利普·克里內(nèi), 皮埃爾·萊昂納多 申請人:阿萊克森國際制藥有限公司