專利名稱：具有β-葡糖苷酶活性的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含下述基因的序列，所述基因編碼具有降解碳水化合物材料活性的多肽的序列或輔助降解碳水化合物材料活性的多肽的序列。本發(fā)明涉及該新穎基因的全長(zhǎng)編碼序列以及該全長(zhǎng)功能性蛋白的氨基酸序列，以及所述基因或氨基酸序列的變體和片段。本發(fā)明還涉及在工業(yè)方法中使用這些蛋白的方法。本發(fā)明還包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的適用于生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及編碼下述多肽的基因在宿主中的成功表達(dá)，所述多肽具有降解碳水化合物材料的活性。宿主可以是任何合適的宿主，例如Aspergillus (例如 Aspergillus niger)或 Talaromyces (例如 Talaromyces emersonii)。
背景技術(shù)：
碳水化合物組成地球上最豐量的有機(jī)化合物。然而，許多這類碳水化合物隱蔽在復(fù)雜聚合物中，包括淀粉(種子和谷物中的主要儲(chǔ)存碳水化合物)和被稱為木質(zhì)纖維素的碳水化合物與木質(zhì)素的集合體。木質(zhì)纖維素的主要碳水化合物組分是纖維素、半纖維素和果膠。這些復(fù)雜的聚合物通常被統(tǒng)稱為木質(zhì)纖維素。從由于OPEC減少石油輸出而導(dǎo)致石油危機(jī)爆發(fā)的70年代開始，可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖的生物轉(zhuǎn)化吸引了研究人員強(qiáng)烈的注意力，所述可發(fā)酵的糖隨后被發(fā)酵產(chǎn)生醇(例如乙醇)，作為液體燃料的替代品。在過(guò)去二十年間，乙醇已被廣泛使用，在美國(guó)作為與汽油的10%的摻合物，或在巴西作為車輛的純?nèi)剂稀Ｗ罱鼘?shí)現(xiàn)了E85(85%乙醇摻合物)的使用，特別是用于清潔城市應(yīng)用。燃料生物乙醇的重要性將會(huì)隨著油價(jià)的提高及其來(lái)源的逐漸耗盡而提高。另外，可發(fā)酵的糖被用于生產(chǎn)塑料、聚合物和其他基于生物的制品，并且預(yù)期這一工業(yè)將大幅增長(zhǎng)，從而提高了對(duì)大量的低成本可發(fā)酵糖的需求，所述可發(fā)酵糖可以被用作原料來(lái)代替基于石油的原料。大量碳水化合物在植物生物質(zhì)中的隱蔽以糖(五碳糖以及六碳糖)的形式提供了大量潛在的能量來(lái)源，所述糖能夠被用于大量工業(yè)和農(nóng)業(yè)過(guò)程。然而，這些碳水化合物的巨大能源潛力目前利用不足，因?yàn)樘欠忾]在復(fù)雜聚合物中并因此不容易進(jìn)行發(fā)酵。由植物生物質(zhì)生產(chǎn)糖的方法會(huì)提供大量的、經(jīng)濟(jì)上有競(jìng)爭(zhēng)性的原料，用于發(fā)酵成化學(xué)品、塑料，例如琥珀酸和(生物)燃料，包括乙醇、甲醇、丁醇合成液體燃料和沼氣。與纖維素原料的種類無(wú)關(guān)，酶的成本和水解效率是限制生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化方法商業(yè)化的主要因素。由微生物生產(chǎn)的酶的生產(chǎn)成本與產(chǎn)酶菌株的生產(chǎn)力和發(fā)酵液中最終的活性產(chǎn)率密切相關(guān)。盡管過(guò)去幾十年為了理解酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解和纖維素酶生產(chǎn)而進(jìn)行了持續(xù)的研究，但是仍然期望發(fā)現(xiàn)或者改造新的有高度活性的纖維素酶和半纖維素酶。還高度期望構(gòu)建能夠進(jìn)行迅速和高效的木質(zhì)纖維素材料生物降解的高效酶組合物，尤其是具有提高的熱穩(wěn)定性的此類纖維素酶和半纖維素酶。此類酶可被用于生產(chǎn)糖，用于發(fā)酵成化學(xué)品，塑料，例如琥珀酸和(生物)燃料，包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液體燃料和沼氣，用于青貯，還在其他工業(yè)方法中(例如在食品或飼料、紡織品、制漿或造紙或洗滌劑工業(yè)和其他工業(yè)中)用作酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了編碼能夠降解(即幫助降解)碳水化合物(例如多糖)、特別是木質(zhì)纖維素的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸典型地編碼具有￠-葡糖苷酶活性的多肽。本發(fā)明還提供了具有此類活性的天然和重組生產(chǎn)的多肽，以及生產(chǎn)此類酶的重組細(xì)胞系。還提供了制造和使用本發(fā)明多核苷酸和多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了包含SEQ ID NO :2中示出的氨基酸序列或SEQID NO :1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或其變體多肽或變體多核苷酸，其中所述變體多肽與SEQ IDNO :2中示出的序列具有至少70%的序列同一性，或所述變體多核苷酸編碼與SEQ ID NO 2中示出的序列具有至少70%序列同一性的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽具有良好的特性，尤其是降解纖維素的活性。在一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有P -葡糖苷酶(縮寫為BG)活性。本文中，3 -葡糖苷酶(beta-glucosidase) (EC 3. 2. I. 21)是能夠催化末端、非還原性P-D-葡萄糖殘基水解并釋放P-D-葡萄糖的任何多肽。這樣的多肽可具有針對(duì)^ -D-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種P -D-半乳糖苷、a -L-阿拉伯糖苷、3-D-木糖苷或3-D-巖藻糖苷。這種酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、3-D-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。在一種實(shí)施方式中，變體多肽具有催化殘基Asp276-Glu508(如在SEQ ID N0:2中的位置)。在一種實(shí)施方式中，變體多肽與SEQ ID NO 2中列出的序列具有至少70%序列同一性、具有催化殘基Asp276-Glu508和BG活性。另外，多肽可具有高的熱穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的多肽以孵育時(shí)間(h)的函數(shù)保持高的相對(duì)活性(初始活性的％)，例如2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)或更多、20小時(shí)或更多、30小時(shí)或更多，尤其是在高溫下，例如在60°C或更高溫度下、在65°C或更高溫度下、在70°C或更高溫度下，例如在65°C下8小時(shí)或在60°C下72小時(shí)。本發(fā)明還提供了包含以下的多核苷酸(a) SEQ ID NO 1中示出的核苷酸序列；或(b)與是SEQ ID NO 1的反向互補(bǔ)體對(duì)多核苷酸選擇性雜交的核苷酸序列；或(c)與SEQ ID NO : I的核苷酸序列具有至少約75%序列同一性的核苷酸序列；或(d)如(a)、(b)或(C)中定義的核苷酸序列的片段，其長(zhǎng)度至少約100個(gè)核苷酸；或(e)序列，其是作為遺傳編碼的結(jié)果的(a)、(b)、(c)或(d)任一中定義的序列簡(jiǎn)并體；或(f)核苷酸序列，其為(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定義的核苷酸序列的反向互補(bǔ)體。
根據(jù)本發(fā)明還提供了并入了本發(fā)明多核苷酸序列的載體(例如表達(dá)載體)和包含本發(fā)明多肽、多核苷酸或載體的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了 用于制備具有P -葡糖苷酶活性的多肽的方法，所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，并任選地回收所表達(dá)的多肽；可通過(guò)此類方法獲得的多肽；和組合物，其包含(i)本發(fā)明的多肽；和(ii)纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶。具有￠-葡糖苷酶活性的本發(fā)明多肽可被用于工業(yè)方法中。因此，本發(fā)明提供了用于處理包含碳水化合物材料的底物的方法，所述方法包括使底物與本發(fā)明的多肽或組合物接觸?！け景l(fā)明尤其提供了用于從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)一種或多種糖的方法，所述方法包括使木質(zhì)纖維素材料與本發(fā)明的多肽或組合物接觸。通過(guò)這種方式生產(chǎn)的糖可在發(fā)酵方法中使用。因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括使用上述方法生產(chǎn)可發(fā)酵的糖；對(duì)得到的可發(fā)酵的糖進(jìn)行發(fā)酵，從而生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的多肽或組合物也可以在例如食物制品的制備、洗滌劑的制備、動(dòng)物飼料的制備、漿體的處理或造紙或織物或紡織品的制備或其清潔中使用。本發(fā)明還提供了 可通過(guò)使植物材料或木質(zhì)纖維素材料與本發(fā)明的多肽或組合物接觸獲得的經(jīng)加工的材料；包含本發(fā)明的多肽或組合物的食物或飼料；和包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、多肽、載體或細(xì)胞的植物或其部分。附圖
簡(jiǎn)述圖I :用于在A.niger中表達(dá)基因的pGBTOP的圖譜。描繪了從葡糖淀粉酶啟動(dòng)子(PglaA)開始表達(dá)的感興趣的基因(GOI)。另外，描繪了表達(dá)盒的葡糖淀粉酶?jìng)?cè)翼(3’ glaA)。在該申請(qǐng)中，感興趣的基因是TEMER06387的編碼序列，如下文所定義。序列表簡(jiǎn)述SEQ ID NO 1 展示了 TEMER06387 的編碼序列；SEQ ID NO 2 展示了 TEMER06387 的氨基酸序列；SEQ ID NO 3 展示了 TEMER06387 的信號(hào)序列；發(fā)明詳述在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書的通篇中，詞語(yǔ)“包含”("comprise")和“包括，，(" include")及其不同詞性的變體(如"comprises" , " comprising" ," includes"和"including")應(yīng)被解釋為開放性的。也就是說(shuō)，在上下文允許時(shí)，這些詞語(yǔ)旨在表達(dá)可能包括未明確指出的其他要素或成分。冠詞“一”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一個(gè)或多于一個(gè)(即一個(gè)或至少一個(gè))所述冠詞的語(yǔ)法客體。例如，“一要素”可表示一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽例如是能夠改性(例如降解)碳水化合物材料的酶。碳水化合物材料是包含一種或多種碳水化合物或由其組成或基本由其組成的材料。酶在本文中是多肽的亞類。在本文中，底物(也稱作原料)被用于表示包含碳水化合物材料的物質(zhì)，其可用根據(jù)本發(fā)明的酶處理，使得其中的碳水化合物材料被改性。除了碳水化合物材料以外，底物還可含有任何其他組分，包括但不限于非碳水化合物材料和淀粉。本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽例如是能夠改性(例如降解)碳水化合物材料的酶。碳水化合物材料是包含一種或多種碳水化合物或由其組成或基本由其組成的材料。酶在本文中是多肽的亞類。典型地，本發(fā)明的多核苷酸編碼具有至少￠-葡糖苷酶活性，暫時(shí)稱作TEMER06387、具有根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽，或編碼其變體的序列，或編碼所述多肽或其變體的片段的序列，所述變體典型地為具有SEQ ID NO :2的序列的多肽的功能 性等同物。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可具有一種或多種除上述提到的￠-葡糖苷酶活性之外的替代性和/或額外的活性，例如本文中提到的其他降解碳水化合物和/或水解碳水化合物活性之一。碳水化合物在本文上下文中包括所有糖類，例如多糖、寡糖、二糖或單糖。根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過(guò)化學(xué)降解或物理降解此類材料或水解碳水化合物來(lái)改性和/或降解碳水化合物材料。物理降解包括例如打斷纖維素微纖維之間的相互作用和/或打開纖維素纖維結(jié)構(gòu)。碳水化合物材料的化學(xué)改性可例如通過(guò)水解、氧化或其他化學(xué)改性，例如通過(guò)裂合酶的作用導(dǎo)致此類材料的降解。物理改性可伴隨或不伴隨化學(xué)改性。合適的碳水化合物材料適合被本發(fā)明的多肽改性的非淀粉碳水化合物是木質(zhì)纖維素?？梢员徽J(rèn)為是潛在的可再生原料的、包含不同木質(zhì)纖維素殘基的主要的多糖是纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖、雜木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外,一些半纖維素可以作為葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。這些多糖變成為可溶糖(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、D-半乳糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解發(fā)生于共同作用的不同酶的作用下。另外，果膠和其他果膠物質(zhì)如阿拉伯聚糖(arabinans)可占來(lái)自非木本植物組織典型的細(xì)胞壁干物質(zhì)的可觀的比例(約四分之一到一半的干物質(zhì)可以是果膠)。纖維素是由通過(guò)￠-1,4鍵連接的葡萄糖殘基組成的線性多糖。纖維素纖維的線性本質(zhì)以及化學(xué)計(jì)量的￠-連接的葡萄糖(相對(duì)于a)比淀粉的高度枝化的a-連接的結(jié)構(gòu)更傾向于產(chǎn)生鏈間(interstrand)氫鍵合的結(jié)構(gòu)。因此，纖維素聚合物與淀粉中存在的纖維相比通常溶解度更小，并且形成更緊密結(jié)合的纖維。半纖維素是復(fù)合聚合物，并且其組成常常在生物之間、組織類型之間大幅變化。通常，半纖維素的主要成分是￠-1,4-連接的木糖(一種五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2處被枝化，并且可以被與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的鍵取代，或者被對(duì)乙酸的酯化(和阿魏酸對(duì)阿拉伯糖的酯化)取代。半纖維素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是￠-連接的六碳糖(如先前提到的￠-(1,3)(1,4)葡聚糖和雜葡聚糖)和額外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于線性主鏈中，彼此通過(guò)鍵連接)的總稱。與單子葉植物(monocots,即具有單個(gè)子葉或種子葉的植物,如玉米、小麥、水稻、草、大麥)相比，雙子葉植物(dicot，即其種子具有兩片子葉或種子葉的植物，如利馬豆(lima beans)、花生、杏仁、豌豆、四季豆)中半纖維素的組成、取代性質(zhì)和枝化程度差異很大。在雙子葉植物中，半纖維素主要由下述木葡聚糖組成，所述木葡聚糖是具有I，6- P -連接的木糖基側(cè)鏈的1，4-0_連接的葡萄糖鏈。在單子葉植物(包括大部分谷類作物)中，半纖維素的主要組分是雜木聚糖。這些主要由下述1，4-0_連接的木糖主鏈聚合物組成，所述木糖主鏈聚合物與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸或4-0-甲基-葡糖醛酸具有l(wèi)，3_a連接以及與由酯連接的乙酸改性的木糖具有I，3-a連接。還存在由1，3_和1，4-3-連接的葡糖基鏈組成的P葡聚糖。在單子葉植物中，纖維素、雜木聚糖和￠-葡聚糖可以大致等量地存在，各自包含約15-25%的細(xì)胞壁干物質(zhì)。另外，不同的植物可包含不同量和不同組成的果膠物質(zhì)。例如，甜菜含有以干重為基礎(chǔ)約19%的果膠和約21%的阿拉伯聚糖。因此，本發(fā)明的組合物可根據(jù)要使用的具體原料(也稱作底物)來(lái)定制。也就是·說(shuō)，本發(fā)明組合物中的活性譜可根據(jù)考慮的原料來(lái)變化。酶組合或物理處理可以并發(fā)或先后地施用。酶可以在微生物、酵母、真菌、細(xì)菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入木質(zhì)纖維素原料中?；蛘?，酶可以被生產(chǎn)但不分離，并且將粗制細(xì)胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米桿)等等加入原料中?；蛘?，可以處理粗制細(xì)胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預(yù)防進(jìn)一步的微生物生長(zhǎng)(例如通過(guò)加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至原料。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物?；蛘?，酶可以在下述發(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵施用原料(例如玉米桿)對(duì)生產(chǎn)酶的生物提供營(yíng)養(yǎng)。通過(guò)這種方式，生產(chǎn)酶的植物可以發(fā)揮木質(zhì)纖維素原料的作用，并且被添加進(jìn)木質(zhì)纖維素原料中。酶活性內(nèi)切-1，4- P -葡聚糖酶(EG)和外切-纖維二糖水解酶(CBH)催化不溶性纖維素水解成為纖維寡糖(纖維二糖作為主要產(chǎn)物)，而￠-葡糖苷酶(BGL)將寡糖(主要是纖維二糖和纖維三糖)轉(zhuǎn)化為葡萄糖。木聚糖酶與其他附屬酶例如a-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和3 -木糖苷酶一起，催化半纖維素的部分水解。果膠物質(zhì)包括果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果膠是植物細(xì)胞壁中最復(fù)雜的多糖。它們沿著一定程度上散布有L-鼠李糖的a (1，4)_連接的D-半乳糖醛酸單元核心鏈周圍構(gòu)建。在任何細(xì)胞壁中都存在符合該描述的大量結(jié)構(gòu)單元，并且通常認(rèn)為在單個(gè)果膠分子中，不同結(jié)構(gòu)單元的核心鏈彼此連續(xù)。果膠酶包括例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，^ -半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ?，內(nèi)切-果膠裂合酶，果膠酸裂合酶，a -鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ?，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶，a-阿拉伯呋喃糖苷酶。結(jié)構(gòu)單元的主要類型是聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在0-2和0-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I (RGI)，其中半乳糖醛酸單元與帶有(1，4)_連接的半乳聚糖和(1，5)_連接的阿拉伯聚糖側(cè)鏈的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖側(cè)鏈可直接與鼠李糖結(jié)合，或者通過(guò)半乳聚糖鏈間接結(jié)合；木半乳糖醛酸聚糖，在半乳糖醛酸的0-3上具有單個(gè)木糖基單元(與RGI緊密結(jié)合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖
II(RGII)，含有罕見(jiàn)糖例如芹菜糖的特別復(fù)雜的小型單元。RGII單元可含有兩個(gè)芹菜糖殘基，所述芹菜糖殘基在合適的離子條件下能夠與硼酸鹽可逆地形成酯。如上文所述，本發(fā)明的多肽典型地具有￠-葡糖苷酶活性。然而，除了所述活性之外或替代所述活性，本發(fā)明的多肽可具有一種或多種上文公開的活性。除了具有￠-葡糖苷酶活性的本發(fā)明多肽所提供的活性以外，本文所述的本發(fā)明的組合物還可具有一種或多種上文所述的活性。
多核苷酸序列本發(fā)明提供了包含編碼TEMER06387的基因的基因組多核苷酸序列及其編碼序列。因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)SEQ ID NO :1的編碼核苷酸序列的基因組核苷酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸，及其任一的變體，例如功能性等同物。本發(fā)明尤其涉及下述經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠(例如在嚴(yán)格條件下、優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下)選擇性地與包含SEQ ID NO :1中示出的序列的多核苷酸的反向互補(bǔ)體雜交。更特定地，本發(fā)明涉及包含根據(jù)SEQ ID NO 1的核苷酸序列或基本由其組成的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含下述序列或基本由其組成的經(jīng)分離的多核苷酸或其任一的變體(例如功能性等同物)或片段，所述序列編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽或其變體的至少一個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”是指可從染色體DNA中分離的核酸分子，其包含編碼蛋白質(zhì)(例如根據(jù)本發(fā)明的￠-葡糖苷酶蛋白)的開放讀碼框?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和/或調(diào)節(jié)序列。另外，術(shù)語(yǔ)“基因”可表示如本文定義的經(jīng)分離的核酸分子?？墒褂帽疚奶峁┑男蛄行畔⒑蜆?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，分離本發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的核酸分子或其變體(例如功能等同物)。例如，使用SEQ ID NO :1的全部或部分核酸序列作為雜交探針，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子(例如，如Sambrook, J. , Fritsh, E. F. , and Maniatis,T. Molecular Cloning ALaboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 中所述)。另外，可使用以SEQ ID NO :I中含有的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離包含SEQ ID NO :1全部或部分的核酸分子。可以使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铮鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸?？梢詫⒔宕藬U(kuò)增的核酸克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體中，并通過(guò)DNA序列分析來(lái)表征。另外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如使用自動(dòng)化DNA合成儀，制備對(duì)應(yīng)于本發(fā)明核苷酸序列或可與本發(fā)明核苷酸序列雜交的寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含SEQ IDNO :1中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO :1中所示核苷酸序列的反向互補(bǔ)體，或此類核苷酸序列任一的變體，例如功能性等同物。與另一核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與另一核苷酸序列充分互補(bǔ)、使得其能夠與另一核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼本發(fā)明多肽或其變體(例如功能性等同物，例如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)的經(jīng)分離的核酸分子，以及足以用作鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子的雜交探針的核酸分子，和適合用作用于擴(kuò)增或突變核酸分子的PCR引物的、此類核酸分子的片段。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以是“經(jīng)分離的”。在本發(fā)明上下文中，“經(jīng)分離的多核苷酸”或“經(jīng)分離的核酸”是下述DNA或RNA，所述DNA或RNA與其來(lái)源生物天然存在的基因組中與之緊鄰的一條或兩條編碼序列(一條在5’端，一條在3’端)不再緊鄰。因此，在一·個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)分離的核酸包括與編碼序列緊鄰的部分或所有5’非編碼(例如啟動(dòng)子)區(qū)。該術(shù)語(yǔ)因此包括例如被整合進(jìn)載體中、自助復(fù)制的質(zhì)?；虿《局?、或原核生物或真核生物的基因組DNA中的，或者作為獨(dú)立于其他序列的單獨(dú)的分子(例如通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理生產(chǎn)的eDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括基本不含細(xì)胞材料、病毒材料、或培養(yǎng)基(通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其他化學(xué)品(化學(xué)合成時(shí))的重組DNA，所述重組DNA是編碼其他多肽的雜種基因的部分。另外，“經(jīng)分離的核酸片段”是不作為片段天然存在并且在天然狀態(tài)下不會(huì)被找到的核酸片段。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如eDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物生產(chǎn)的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選地是雙鏈DNA。可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸(phosphorothioate nucleotides))合成核酸。此類寡核苷酸可被用于例如制備具有改變的堿基配對(duì)能力或提高的核酸酶抗性的核酸。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了與TEMER06387核酸分子反義的經(jīng)分離的核酸分子，例如TEMER06387核酸分子的編碼鏈。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本文所述核酸分子的互補(bǔ)鏈。除非另有說(shuō)明，本文通過(guò)測(cè)序DNA分子所測(cè)定的所有核苷酸序列均使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀測(cè)定，本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列均通過(guò)上文測(cè)定的DNA序列的翻譯來(lái)預(yù)測(cè)。因此，如本領(lǐng)域針對(duì)通過(guò)所述自動(dòng)化途徑測(cè)定的任何DNA序列所已知的，本文測(cè)定的任何核苷酸序列可含有一些錯(cuò)誤。通過(guò)自動(dòng)化測(cè)定的核苷酸序列典型地與被測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90%相同，更典型地至少約95%到至少約99. 9%相同?？梢酝ㄟ^(guò)其他途徑(包括本領(lǐng)域公知的手動(dòng)DNA測(cè)序法)來(lái)更加精確地測(cè)定實(shí)際序列。也如本領(lǐng)域所已知的，與實(shí)際序列相比被測(cè)定的核苷酸序列中的單個(gè)插入或缺失會(huì)在核苷酸序列的翻譯中引起移碼，使得預(yù)測(cè)的由所測(cè)定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列從此類插入或缺失點(diǎn)處開始，與被測(cè)定的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列完全不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定此類被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并且已知如何校正此類錯(cuò)誤。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含SEQ ID NO :1中所不核酸序列(或其任一的變體)的部分或片段，例如可用作探針或引物的片段，或編碼TEMER06387多肽的一部分的片段。通過(guò)克隆TEMER06387基因和cDNA測(cè)定的核苷酸序列允許生產(chǎn)被設(shè)計(jì)用于鑒定和/或克隆其他TEMER06387家族成員以及來(lái)自其他物種的TEMER06387同源物的探針和引物。探針/引物典型地包含基本純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列區(qū)域，所述區(qū)域優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: I所示核苷酸序列或其任一的變體(例如功能性等同物)的至少?gòu)募s12個(gè)到約15個(gè)、優(yōu)選地從約18個(gè)到約20個(gè)、優(yōu)選地從約22個(gè)到約25個(gè)、更優(yōu)選地約30個(gè)、約35個(gè)、約40個(gè)、約45個(gè)、約50個(gè)、約55個(gè)、約60個(gè)、約65個(gè)、或曰75個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸雜交?；赥EMER06387核苷酸序列的探針可被用于檢測(cè)例如其他生物中編碼相同或同源多肽的轉(zhuǎn)錄本或基因組TEMER06387序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針還包含與之結(jié)合的標(biāo)簽基團(tuán)，例如所述標(biāo)簽基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。此類探針·也可以被用作用于鑒定表達(dá)TEMER06387多肽的細(xì)胞的診斷測(cè)試試劑盒的部分。本文的多核苷酸可以是合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可以按照密碼子使用被優(yōu)化，優(yōu)選地根據(jù)W02006/077258和/或PCT/EP2007/055943中所述的方法被優(yōu)化，所述參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。PCT/EP2007/055943介紹了密碼子對(duì)優(yōu)化。密碼子對(duì)優(yōu)化是這樣一種方法其中編碼多肽的核苷酸序列根據(jù)其密碼子使用、尤其是使用的密碼子對(duì)而被修飾，以獲得編碼多肽的核苷酸序列經(jīng)改進(jìn)的表達(dá)和/或所編碼的多肽的經(jīng)改進(jìn)的生產(chǎn)。密碼子對(duì)被定義為編碼序列中一組兩個(gè)連續(xù)的三聯(lián)體(密碼子)。本發(fā)明還涉及包含前文所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體。“核酸構(gòu)建體”在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其與天然存在的基因分離，或者已被修飾為含有下述核酸區(qū)段，所述核酸區(qū)段以天然不會(huì)存在的方式組合和并置。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的所有控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。本文定義的術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在本文中被定義為下述序列，所述序列被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成本發(fā)明的蛋白酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化子。編碼序列的界限通常由mRNA 5’-端的ATG起始密碼子和mRNA 3'-端終止開放讀碼框的翻譯終止密碼子序列決定。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。優(yōu)選地，核酸具有高GC含量。本文的GC含量是指構(gòu)建體中G和C核苷酸的數(shù)量除以核苷酸的總數(shù)，以％表示。GC含量?jī)?yōu)選地為56%或更多、57%或更多、58%或更多、59%或更多、60 %或更多，或者在56-70 %的范圍內(nèi)或58-65 %的范圍內(nèi)。優(yōu)選地,DNA構(gòu)建體包含啟動(dòng)子DNA序列、與所述啟動(dòng)子DNA序列可操作地連接的編碼序列，和控制序列例如-一個(gè)選自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻譯終止序列TAAG、TAGA和TAAA，優(yōu)選地TAAA，和/或-一個(gè)選自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻譯起始子編碼序列GCTACCCCC ；GCTACCTCC ；GCTACCCTC ；GCTACCTTC ；GCTCCCCCC ；GCTCCCTCC ；GCTCCCCTC ；GCTCCCTTC ；GCTGCCCCC ；GCTGCCTCC ；GCTGCCCTC ；GCTGCCTTC ；GCTTCCCCC ；GCTTCCTCC ；GCTTCCCTC ；和GCTTCCTTC,優(yōu)選地 GCTTCCTTC，和 / 或-選自以下序列列表的翻譯起始子序列5’-mwChkyCAAA_3’;5’-mwChkyCACA_3’或5’-mwChkyCAAG-3’，其中使用核苷酸的模糊編碼m(A/C) ；w(A/T) ；y(C/T) ；k(G/T) ；h(A/C/T)，優(yōu)選地 5’ -CACCGTCAAA-3’ 或 5’ -CGCAGTCAAG-3 ’。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始子編碼序列”被定義為DNA編碼序列開放讀碼框起始子或起始密碼子緊下游的9個(gè)核苷酸。起始子或起始密碼子編碼AA甲硫氨酸。起始密碼子典型地為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子如GTG。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“翻譯終止序列”被定義為從開放讀碼框或核苷酸編碼序列3’端的翻譯終止密碼子開始并按5’到3’方向的四個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始子序列”被定義為編碼多肽的DNA序列開放讀碼框的起始子或起始密碼子緊上游的十個(gè)核苷酸。起始子或起始密碼子編碼AA甲硫氨酸。起始密碼子典型地為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子如GTG。本領(lǐng)域公知在RNA中尿嘧啶U代替脫氧核苷酸胸腺嘧啶T。 同源性和同一性當(dāng)氨基酸序列或核苷酸序列展示某些相似性水平時(shí)，其被稱為是同源的。同源的兩個(gè)序列表示共同的進(jìn)化來(lái)源。不論兩個(gè)同源序列是密切相關(guān)的還是更遠(yuǎn)相關(guān)的，其分別由或高或低的“百分比同一性”或“百分比相似性”表示。雖然是有爭(zhēng)論的，但為了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”通常互換使用。術(shù)語(yǔ)“同源性”、“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在本文中定義為了測(cè)定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的百分比同一性，就最佳比較目的而言比對(duì)全序列。為了優(yōu)化兩個(gè)序列之間的比對(duì)，可在被比較的兩條序列的任一條中引入缺口。這類比對(duì)可以在被比較的序列的仝長(zhǎng)上進(jìn)行?；蛘?，比對(duì)可在更短的比較長(zhǎng)度上進(jìn)行，例如在約20、約50、約100或更多個(gè)核酸/堿基或氨基酸上進(jìn)行。同一性是在報(bào)告的比對(duì)區(qū)域上的兩條序列之間的同一性匹配的百分比?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分比測(cè)定。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實(shí)可獲得比對(duì)兩條序列的若干種不同的計(jì)算機(jī)程序并測(cè)定兩條序列之間的同源性(Kruskal, J. B. (1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoffand J. B. Kruskal, (ed. ), Time warps, stringedits and macromolecules the theoryand practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley)?？墒褂糜糜贗匕對(duì)兩條序列的Needleman和Wunsch算法測(cè)定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性(Needleman,
S.B. andffunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)。算法比對(duì)氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在計(jì)算機(jī)程序NEEDLE中實(shí)施。就本發(fā)明目的而言,使用了來(lái)自 EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2. 8. 0 或更高，EMBOSS :The European Molecular BiologyOpen Software Suite(2000)Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16,
(6)pp276~277,http://emboss, bioinformatics, nl/)。就多妝序列而言，BL0SUM62 用于替換矩陣，就核苷酸序列而言，使用了 EDNAFULL。可指定其他矩陣。用于比對(duì)氨基酸序列的任選的參數(shù)是缺口開放懲罰為10和缺口延伸懲罰為0. 5。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到所有這些不同的參數(shù)會(huì)產(chǎn)生些微不同的結(jié)果，但是當(dāng)使用不同的算法時(shí)兩條序列的總百分比同一性不顯著改變。總體同源性定義同源性或同一性是在包括任何缺口或延伸的總比對(duì)區(qū)域上的兩條全序列之間的同一性匹配的百分比。兩條比對(duì)序列之間的同源性或同一性如下計(jì)算在兩個(gè)序列中都顯示相同氨基酸的比對(duì)中的對(duì)應(yīng)位置的數(shù)目除以包括缺口的比對(duì)的仝長(zhǎng)。本文中定義的同一性可從NEEDLE中獲得并在程序輸出中被標(biāo)記為“同一性”。最長(zhǎng)的同一丨丨生定義在兩個(gè)比對(duì)序列之間的同源性或同一性如下計(jì)算在兩個(gè)序列中都顯示相同氨基酸的比對(duì)中的對(duì)應(yīng)位置的數(shù)目除以減去比對(duì)中的總?cè)笨跀?shù)目后的比對(duì)的仝長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)使用N0BRIEF選擇從NEEDLE中獲得本文中定義的同一性并且所述同一性在程序輸出中被標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”。就本發(fā)明目的而言，根據(jù)“最長(zhǎng)同一性”的定義計(jì)算兩條序列(氨基酸或核苷酸)之間的同一性(同源性)水平，如可通過(guò)使用程序NEEDLE進(jìn)行計(jì)算。 本方面的多肽序列還可用作“查詢序列”以針對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，例如來(lái)鑒定其他家族成員或相關(guān)序列?？墒褂肂LAST程序進(jìn)行此類搜索。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過(guò)National Center for BiotechnologyInformation (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)是公眾可得到的。BLASTP用于氨基酸序列，BLASTN用于核苷酸序列。BLAST程序使用下述缺省-開放缺口的開銷缺省=5用于核苷酸/11用于多肽-延伸缺口的開銷缺省=2用于核苷酸/I用于多肽-核苷酸錯(cuò)配懲罰缺省=-3-核苷酸匹配獎(jiǎng)勵(lì)缺省=I-期望值缺省=10-字長(zhǎng)缺省=11用于核苷酸/28用于megablast/3用于多肽此外，通過(guò)BLAST程序，測(cè)定查詢氨基酸序列或查詢核酸序列與檢索的同源序列之間的局部同一性(同源性)程度。但是，僅僅比較在某一閾值上給出匹配的那些序列段。從而，程序僅針對(duì)這些匹配段計(jì)算同一性。因此，以這種方式計(jì)算的同一性被稱為局部同一性。雜交在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“選擇性雜交”("selectively hybridizing "和“hybridizes selectively”)和類似的術(shù)語(yǔ)旨在描述用于雜交和洗漆的下述條件,在所述條件下彼此至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75%、至少約80%、更優(yōu)選地至少約85%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約90%、最優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少約98%或更優(yōu)選地至少約99%彼此同源的核苷酸序列典型地保持為彼此雜交。也就是說(shuō)，這類雜交序列可共享至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65*%、至少約70*%、至少約75*%、至少約80*%、更優(yōu)選地至少約85*%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約98%或更優(yōu)選地至少約99%的序列同一性。這類雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子是于約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于約50°C、優(yōu)選約55°C、優(yōu)選約60°C和進(jìn)一步更優(yōu)選約65°C下，在I X SSC,0. 1% SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于約68°C下在5XSSC/5XDenhardf s溶液/I. 0% SDS中雜交并于室溫下在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗滌?；蛘?，洗滌可以在42°C進(jìn)行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對(duì)于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrooket al. , 1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, N. Y.；和 Ausubel etal. (eds.), 1995, Current Protocols in MolecularBiology, (John ffiley&Sons,N. Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互補(bǔ)的T (或U)殘基段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括于與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)檫@類多核苷酸會(huì)與含有多聚(A)段或其互補(bǔ)體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。可以以一種典型的途徑，來(lái)篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來(lái)自Trichomaceae 科、例如來(lái)自 Aspergillus 或 Penicillium 屬的微生物例如 Penicilliumdecumbens)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。例如,可以通過(guò)Northern印跡針對(duì)同源的TEMER06387多核苷酸篩選Penicillium菌株。檢測(cè)到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)?；蛘撸梢允褂媚軌蚺c根據(jù)本發(fā)明的TEMER06387多核苷酸雜交的探針來(lái)篩選總基因組DNA文庫(kù)。
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可以例如通過(guò)進(jìn)行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA,所述mRNA從已知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備。可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測(cè)序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了新TEMER06387核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過(guò)多種已知方法，使用PCR片段來(lái)分離仝長(zhǎng)cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫(kù)?；蛘撸粯?biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫(kù)。也可以用PCR技術(shù)來(lái)從其它生物中分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源中分離RNA?？梢允褂锰禺愑诒粩U(kuò)增片段最5’端的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如用鳥嘌呤)，可以用RNase H消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文 Sambrook etal.;和上文的 Ausubel et al.。載體本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼TEMER06387多肽或其功能性等同物的本發(fā)明多核苷酸的載體，包括克隆和表達(dá)載體，還涉及在例如本發(fā)明多肽發(fā)生表達(dá)的條件下，在合適的宿主細(xì)胞中培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染這類載體的方法。本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可以被摻入重組的可復(fù)制載體中，例如克隆或表達(dá)載體中。載體可被用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如下制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中被回收。合適的宿主細(xì)胞在下文討論。其中插入本發(fā)明表達(dá)盒或多核苷酸的載體可以是能夠便利地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，并且所述載體的選擇通常應(yīng)取決于要引入它的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的載體可以是自主復(fù)制載體，即顯示為染色體外實(shí)體的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘咻d體可以是被引入宿主細(xì)胞中后被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，并與整合了它的染色體一起復(fù)制的載體。一種類型的載體是“質(zhì)?！保|(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主細(xì)胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中被稱作“表達(dá)載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類表達(dá)載體的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)和噬菌體載體。 對(duì)大部分絲狀真菌和酵母而言，載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。然而，對(duì)某些酵母而言還可獲得合適的附加體載體，可以向其中并入表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行穩(wěn)定和高水平的表達(dá)，其例子包括分別衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2 U和pKDl質(zhì)粒的載體，或含有AMA序列(例如來(lái)自Aspergillus的AMA1)的載體。將表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中的情況下，所述構(gòu)建體被整合進(jìn)基因組中隨機(jī)基因座處，或者使用同源重組整合進(jìn)預(yù)定的目標(biāo)基因座處，在這種情況下目標(biāo)基因座優(yōu)選地包含高度表達(dá)的基因。因此，可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括來(lái)自染色體、附加體和病毒的載體,例如來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和來(lái)自其組合的病毒，如來(lái)自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。根據(jù)本發(fā)明的載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。可以例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可包含兩種或更多，例如三種、四種或五種本發(fā)明的多核苷酸，例如用于過(guò)表達(dá)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在載體例如表達(dá)載體中，“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)的方式連接，即術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指一種連接，其中所述組分處于允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)以下述方式放置在與所述控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)；或者所述調(diào)節(jié)序列被布置為使得它們與其預(yù)期目的一致地發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子處開始并通過(guò)編碼多肽的DNA序列繼續(xù)。
針對(duì)指定宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體因此可包含以下元件，所述元件以相對(duì)于編碼第一發(fā)明的多肽的序列的編碼鏈從5’ -端到3’ -端的連續(xù)順序彼此可操作地連接(i)能夠在給定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列；(2)任選地，能夠指導(dǎo)多肽從給定的宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的信號(hào)序列；(3)本發(fā)明的DNA序列，其編碼成熟和優(yōu)選地活性形式的、具有3 -葡糖苷酶活性的多肽；和優(yōu)選地還有(4)能夠終止編碼多肽的核苷酸序列下游轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的下游可以是含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)的3’非翻譯區(qū)。終止子的起點(diǎn)較不關(guān)鍵。終止子可以例如對(duì)編碼多肽的DNA序列而言是天然的。然而，優(yōu)選地在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母終止子并在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用絲狀真菌終止子。更優(yōu)選地，終止子對(duì)宿主細(xì)胞(其中要表達(dá)編碼多肽的核苷酸序列)而言是內(nèi)源的。在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中，可存在用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體所表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)當(dāng)包括位于要翻譯的多肽起點(diǎn)處的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诮Y(jié)尾處的終止密碼子。本發(fā)明多核苷酸的增強(qiáng)的表達(dá)也可以通過(guò)對(duì)異源調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)肽和/或終止子區(qū))的選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述異源調(diào)節(jié)區(qū)可發(fā)揮以下作用提高表達(dá)宿主對(duì)感興·趣的多肽的表達(dá)水平和需要時(shí)的分泌水平，和/或提供本發(fā)明多肽表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以以下述因素為基礎(chǔ)，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的多肽表達(dá)水平等。本發(fā)明的載體(例如表達(dá)載體)可以被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如TEMER06387多肽、TEMER06387多肽的突變體形式，其片段、變體或功能等同物)。本發(fā)明的載體(例如重組表達(dá)載體)可以被設(shè)計(jì)用于在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)TEMER06387多肽。例如，TEMER06387多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞如E. coli、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、絲狀真菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel,Gene Expression Technology !Methods inEnzymology 185,Academic Press,SanDiego, CA(1990)中進(jìn)一步討論。適當(dāng)宿主的代表性例子在下文中描述。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語(yǔ)“控制序列”或“調(diào)節(jié)序列”在本文中被定義為至少包括對(duì)多肽表達(dá)而言必需和/或有利地任何組件。任何控制序列對(duì)于編碼多肽的本發(fā)明核酸序列而言可以是天然的或外源的。此類控制序列可包括但不限于啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、最適翻譯起始序列(如Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266 :19867-19870中所述)、分泌信號(hào)序列、原-肽序列、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止子。控制序列至少典型地包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。如上文所述，“可操作地連接”在本文中被定義為一種連接，其中控制序列相對(duì)于DNA序列的編碼序列被適當(dāng)?shù)刂糜谝欢ㄎ恢蒙?，使得控制序列指?dǎo)多肽的生產(chǎn)?？梢詾榱艘胩囟ǖ南拗菩晕稽c(diǎn)而對(duì)控制序列提供連接子，所述特定的限制性位點(diǎn)有助于將控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文中被定義為一種連接，其中控制序列相對(duì)于DNA序列的編碼序列被適當(dāng)?shù)刂糜谝欢ㄎ恢蒙?，使得控制序列指?dǎo)多肽的生產(chǎn)?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列是被宿主細(xì)胞識(shí)別用于表達(dá)核酸序列的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變、截短和雜種的啟動(dòng)子，并且可得自編碼對(duì)細(xì)胞而言同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別為終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'-端可操作地連接。本發(fā)明中可以使用在細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何終止子?？刂菩蛄幸部梢允墙K止子。對(duì)絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的終止子得自編碼以下的基因A. oryzae TAKA淀粉酶、A. niger葡糖淀粉酶(glaA)、A. nidulans鄰氨基苯甲酸合酶、A. niger a -葡糖苷酶、trpC基因和Fusariumoxysporum膜蛋白酶樣蛋白酶?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的前導(dǎo)序列、對(duì)絲狀真菌細(xì)胞翻譯而言重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5'端可操作地連接。在細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明中。對(duì)絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的前導(dǎo)序列得自編碼以下的基因A. oryzae淀粉酶和A. nidulans憐酸丙糖異構(gòu)酶和A. niger glaA。 其他控制序列可分離自Penicillium IPNS基因，或pcbC基因，P微管蛋白基因。WO 01/21779中引用的所有控制序列通過(guò)引用并入本文?？刂菩蛄幸部梢允嵌嗑巯佘账峄蛄?，這是與核酸序列3'-端可操作地連接的序列，其轉(zhuǎn)錄后被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別為對(duì)所轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷殘基的信號(hào)。本發(fā)明中可以使用在細(xì)胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。對(duì)絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列得自編碼以下的基因A. oryzae TAKA淀粉酶、A. niger葡糖淀粉酶、A. nidulans鄰氨基苯甲酸合酶、Fusarium oxysporum膜蛋白酶樣蛋白酶和A. niger a-葡糖苷酶。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的多肽要從宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基時(shí)，可以對(duì)多肽添加適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列，從而將從新合成的多肽導(dǎo)向宿主細(xì)胞的分泌途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知針對(duì)特定的宿主細(xì)胞選擇適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列。信號(hào)序列對(duì)宿主細(xì)胞可以是天然的，或者對(duì)宿主細(xì)胞可以是外源的。例如，可以使用來(lái)自對(duì)宿主細(xì)胞而言天然的多肽的信號(hào)序列。優(yōu)選地，所述天然的多肽是高度分泌的多肽，即以高于被分泌的多肽總量10%的量被分泌的多肽。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地使用的信號(hào)序列是例如pmeA。作為信號(hào)序列的替代方式，本發(fā)明的多肽可與分泌載體多肽(carrierpolypeptide)或其部分融合。此類嵌合構(gòu)建體借助于載體多肽或其部分的信號(hào)序列而被導(dǎo)向分泌途徑。另外，載體多肽會(huì)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽提供穩(wěn)定化效應(yīng)，和/或可以增強(qiáng)溶解度。此類載體多肽可以是任何多肽。優(yōu)選地，使用高度分泌的多肽作為載體多肽。載體多肽對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽而言可以是天然的或外源的。載體多肽對(duì)宿主細(xì)胞而言可以是天然的或可以是外源的。此類載體多肽的例子是葡糖淀粉酶，a-交配因子的前原序列，Clostridium cellulovorans纖維素結(jié)合蛋白A的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶,Bacillus circulans幾丁質(zhì)酶Al的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，E. coliK12的malE基因編碼的麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，P -半乳糖苷酶，和堿性磷酸酶。用于在Aspergillus細(xì)胞中表達(dá)此類嵌合構(gòu)建體的一種優(yōu)選的載體多肽是葡糖淀粉酶。載體蛋白和多肽可含有特定的氨基酸基序，以便于多肽的分離；根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過(guò)專用的釋放劑被釋放。釋放劑可以是蛋白水解酶或化學(xué)試劑。此類氨基酸基序的一個(gè)例子是KEX蛋白酶切割位點(diǎn)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
可以使用信號(hào)序列來(lái)協(xié)助本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的分泌和分離。信號(hào)序列的典型特征是疏水氨基酸核，其通常在分泌期間的一個(gè)或多個(gè)切割事件中從成熟蛋白質(zhì)上被切割。這類信號(hào)肽含有加工位點(diǎn)，所述加工位點(diǎn)允許在經(jīng)過(guò)分泌通路時(shí)從成熟蛋白質(zhì)上切下信號(hào)序列。信號(hào)序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)如從轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體的真核宿主中分泌，并且隨后或同時(shí)切割信號(hào)序列。然后可以通過(guò)已知方法，從細(xì)胞外介質(zhì)中容易地純化蛋白質(zhì)。或者，可以使用簡(jiǎn)化純化的序列(如具有GST結(jié)構(gòu)域)，將信號(hào)序列與感興趣的蛋白質(zhì)連接。因此，例如編碼多肽的序列可以與簡(jiǎn)化融合多肽純化的標(biāo)記序列(如編碼肽的序列)融合。在本發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記序列是六-組氨酸肽，如PQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的標(biāo)簽，以及其它，其中許多可商業(yè)獲得。例如如Gentz et al,Proc. Natl. Acad. Sci.USA86 =821-824(1989)中所述，六-組氨酸提供了融合蛋白的便利純化。HA標(biāo)簽是可用于純化的另一種肽，其對(duì)應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白的表位，由例如Wilson et al. , Cell 37:767(1984)描述。優(yōu)選地，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的TEMER06387融合蛋白。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段以符合讀碼框的方式連接在一起，所述常規(guī)技術(shù)例如通過(guò)使用平末端或交錯(cuò)末端(stagger-ended termini)用于連接、使用限制性酶消化來(lái)提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)時(shí)填平粘末端、使用堿性磷酸酶處理來(lái)避免不想要的接合，和酶促·連接。在另一實(shí)施方式中，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)(包括自動(dòng)化DNA合成儀)合成融合基因?；蛘撸梢允褂缅^定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物在兩條相鄰的基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)性懸突，所述相鄰基因片段可隨后退火并被再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列(參閱例如 CurrentProtocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley &Sons:1992)。另外，可以商業(yè)獲得已經(jīng)編碼融合片段(例如GST多肽)的許多表達(dá)載體。TEMER06387-編碼核酸可以被克隆進(jìn)這樣的表達(dá)載體中，從而使融合片段與TEMER06387蛋白以符合讀碼框的方式連接。優(yōu)選地，通過(guò)宿主細(xì)胞增強(qiáng)的同源重組能力提高了定向整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中(即在預(yù)定的靶基因座中整合)的效率。細(xì)胞的此類表型優(yōu)選地涉及如W02005/095624中所述的缺陷型hdfA或hdfB基因。W02005/095624公開了獲得包含提高的定向整合效率的絲狀真菌細(xì)胞的一種優(yōu)選的方法。任選地，宿主細(xì)胞包含與野生型細(xì)胞相比提高的解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)，以增強(qiáng)感興趣的多肽的生產(chǎn)能力?？梢酝ㄟ^(guò)US2004/0186070A1和/或US2001/0034045A1和/或W001/72783A2和/或W02005/123763中描述的技術(shù)提高UPR。更特定地，為了獲得具有提高的UPR的宿主細(xì)胞，調(diào)控了 HACl和/或IREl和/或PTC2的蛋白質(zhì)水平，和/或改造了SEC61蛋白質(zhì)?；蛘?，或與提高的UPR組合，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以獲得與野生型細(xì)胞相比展示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌的表型，從而增強(qiáng)感興趣的多肽的生產(chǎn)能力。此類表型可以通過(guò)蛋白酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的缺失和/或修飾和/或失活來(lái)獲得。此類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子可以是例如prtT。通過(guò)調(diào)控prtT來(lái)降低蛋白酶的表達(dá)可以通過(guò)US2004/0191864A1中描述的技術(shù)進(jìn)行?；蛘撸蚺c提高的UPR和/或展示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌的表型組合，宿主細(xì)胞展示了草酸鹽缺陷型表型，從而增強(qiáng)感興趣的多肽的生產(chǎn)產(chǎn)量。草酸鹽缺陷型表型可以通過(guò)W02004/070022A2中描述的技術(shù)獲得。或者，或與提高的UPR和/或展示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌和/或草酸鹽缺陷的表型組合，宿主細(xì)胞展示了與野生型相比的表型差異的組合，以增強(qiáng)感興趣的多肽的生產(chǎn)產(chǎn)率。這些差異可包括但不限于，降低的葡糖淀粉酶和/或中性a-淀粉酶A和/或中性a-淀粉酶B蛋白酶和草酸水解酶的表達(dá)。宿主細(xì)胞展示的所述表型差異可以通過(guò)根據(jù)US2004/0191864A1中所述技術(shù)的遺傳修飾獲得?；蛘?，或與提高的UPR和/或展示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌和/或草酸鹽缺陷的表型和雨野生型相比為了增強(qiáng)感興趣的多肽生產(chǎn)產(chǎn)率的表型差異的組合相組合，宿主細(xì)胞展示毒素基因的缺陷，使得絲狀真菌宿主細(xì)胞失去表達(dá)毒素的能力。此類毒素包括但不限于，赭曲毒素，煙曲霉毒素，環(huán)并偶氮酸(cyclapiazonic acid)，3_硝基丙酸，布洛芬，畸形素，黃曲霉毒素和黑麥酸。此類缺陷優(yōu)選地例如描述于W02000/039322中。 (過(guò))表達(dá)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，與其中本文所述的本發(fā)明的多核苷酸未被過(guò)表達(dá)的親本微生物菌株相比，所述基因可以在本發(fā)明的微生物菌株中被過(guò)表達(dá)。多核苷酸序列的過(guò)表達(dá)在本文中被定義為所述序列基因的表達(dá)，所述表達(dá)導(dǎo)致微生物菌株中所述序列編碼的酶活性是親本微生物中酶活性的至少約I. 5倍；優(yōu)選地所述酶活性是親本微生物中酶活性的至少約2倍，更優(yōu)選地至少約3倍，更優(yōu)選地至少約4倍，更優(yōu)選地至少約5倍，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約10倍，最優(yōu)選地至少約20倍。載體可還包括產(chǎn)生RNA的多核苷酸側(cè)翼的序列，所述側(cè)翼的序列包含與真核基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這會(huì)允許將本發(fā)明的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的基因組中。整合型克隆載體可在整合了它的宿主細(xì)胞染色體中隨機(jī)整合或在預(yù)定的靶基因座處整合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，整合型克隆載體可包含與宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于將克隆載體的整合靶向所述預(yù)定的基因座。為了促進(jìn)定向整合，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之前優(yōu)選地將克隆載體線性化。優(yōu)選地以下述方式進(jìn)行線性化，所述方式使得克隆載體的至少一端，優(yōu)選地任一端的側(cè)翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側(cè)翼的同源序列的長(zhǎng)度優(yōu)選地至少約0. lkb，例如至少約0. 2kb，更優(yōu)選地至少約0. 5kb,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約Ikb,最優(yōu)選地至少約2kb。優(yōu)選地,可如W005/095624和/或W02007/115886中所述，為了經(jīng)改進(jìn)的定向DNA整合頻率修飾親本宿主菌株。本發(fā)明中提供的缺失例子使用基因的啟動(dòng)子作為5’-側(cè)翼，使用基因作為3’-側(cè)翼，從而在啟動(dòng)子和基因之間插入選擇標(biāo)記物，進(jìn)而破壞(即功能性失活)基因轉(zhuǎn)錄。上文給出的基因序列可被用于制造類似地功能失活的基因。基因可以被一分為二，得到5’ -側(cè)翼和3’ -側(cè)翼，但是基因也可以被用于克隆含有基因啟動(dòng)子和終止子區(qū)的基因組DNA的大片段，所述啟動(dòng)子和終止子區(qū)隨后可發(fā)揮5’ -側(cè)翼和3’ -側(cè)翼的功能。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體例如單個(gè)質(zhì)粒，或兩個(gè)或更多個(gè)載體，例如兩個(gè)或更多個(gè)質(zhì)粒，它們一起含有要被引入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA。載體可以反義方向含有本發(fā)明的多核苷酸，以提供反義RNA的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在表示用于向宿主細(xì)胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見(jiàn)于Sambrook,et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd,ed. ColdSpring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY,1989),Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology (1986)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，已知取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有非常小的細(xì)胞級(jí)分可以將外源DNA整合進(jìn)它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括但不限于賦予藥物抗性或補(bǔ)足宿主細(xì)胞缺陷的可選擇標(biāo)記。它們包括例如可用于轉(zhuǎn)化大部分絲狀真菌和酵母的通用標(biāo)記基因，如乙酰胺酶基因或cDNA (來(lái)自 A. nidulans、A. oryzae 或 A. niger 的 amdS、niaD、facA基因或 cDNA),或提供抗生素抗性如G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素或苯菌靈抗性(benA)的基因?；蛘?，可以使用特異性選擇標(biāo)記，如需要相應(yīng)突變體宿主菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，例如URA3(來(lái)自S. cerevisiae或來(lái)自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA (來(lái)自A. nidulans·或A. niger)、argB (來(lái)自A. nidulans或A. niger)或trpC。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在引入表達(dá)構(gòu)建體后從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中缺失選擇標(biāo)記，從而獲得能夠生產(chǎn)下述多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述多肽不含選擇標(biāo)記基因。其它標(biāo)記包括ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌G418抗性基因(這也可在酵母中使用，但是不能在真菌中使用)、氨芐西林抗性基因(E. coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)、來(lái)自Streptomyces nursei的諾爾絲菌素抗性基因natl、Aspergillus oryzae的卩比唳硫胺抗性基因ptrA以及編碼P _葡糖醒酸糖苷酶(GUS)的E. coli UidA基因。載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)常在E. coli中用下述載體完成，所述載體含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。融合載體對(duì)其中編碼的蛋白質(zhì)、例如對(duì)重組蛋白的氨基端添加大量氨基酸。這類融合載體典型地具有三個(gè)目的1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解度；3)通過(guò)在親和層析中發(fā)揮配體作用來(lái)幫助純化重組蛋白。通常在融合表達(dá)載體中，在融合片段和重組蛋白的接合處引入蛋白水解切割位點(diǎn)，使得能夠在融合蛋白的純化后將重組蛋白與融合片段分開。如所指出的，表達(dá)載體優(yōu)選地含有可選擇標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在E. coli和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐西林抗性。優(yōu)選用于細(xì)菌的載體例如公開于W0-A1-2004/074468中，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。其它合適的載體應(yīng)是技術(shù)人員容易知道的。為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、進(jìn)入壁膜間隙中或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境中，可以向被表達(dá)的多肽中整合進(jìn)適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)。所述信號(hào)對(duì)多肽可以是同源的或它們可以是異源信號(hào)。TEMER06387多肽可以以經(jīng)修飾的方式(例如作為融合蛋白)被生產(chǎn)，并可不僅含有分泌信號(hào)而且含有額外的異源功能區(qū)。因此，例如額外氨基酸區(qū)(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促進(jìn)純化期間或隨后的操作和儲(chǔ)存期間在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多肽，所述多肽具有根據(jù)SEQ ID NO :2的氨基酸序列，和能夠通過(guò)在合適的宿主中表達(dá)SEQ ID NO :1的多核苷酸獲得的氨基酸序列。包含上述多肽的變體(例如功能等同物)的肽或多肽也包括在本發(fā)明內(nèi)。上述多肽集體包含在術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的多肽”中。術(shù)語(yǔ)“變體肽”或“變體多肽”在本文中被定義為分別在肽或多肽的一個(gè)或多個(gè)特定位置上包含一個(gè)或多個(gè)改變(例如一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基的取代、插入、缺失和/或截短)的肽或多肽。相應(yīng)地，變體信號(hào)肽是在信號(hào)肽的一個(gè)或多個(gè)特定位置上包含一個(gè)或多個(gè)改變(例如一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基的取代、插入、缺失和/或截短)的信號(hào)肽。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”與術(shù)語(yǔ)“核酸分子”相同，并且在本文中可互換理解。該術(shù)語(yǔ)是 指多核苷酸分子，其為單鏈或雙鏈的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)分子。多核苷酸可以分離形式存在，或者可包含在重組核酸分子或載體中，或包含在宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“變體多核苷酸”在本文中被定義為在多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)特定位置上包含一個(gè)或多個(gè)改變(例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、插入、缺失和/或截短)的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義的(如其通常被認(rèn)為的那樣)，且當(dāng)上下文需要表示通過(guò)肽鍵偶合的至少兩個(gè)氨基酸鏈時(shí)，每個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換使用。詞語(yǔ)“多肽”在本文中使用表示含有多于七個(gè)氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中從左到右和從氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域普遍已知的，并可見(jiàn)于 Sambrook, et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd, ed. ColdSpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold SpringHarbor, NY,1989)o“分離的”多肽或蛋白質(zhì)表示被從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，就本發(fā)明的目的而言，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，與通過(guò)任何合適的技術(shù)已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術(shù)例如Smith andJohnson, Gene 67 :31-40 (1988)中公開的單步驟純化方法。根據(jù)本發(fā)明的TEMER06387P -葡糖苷酶多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜(“HPLC”)進(jìn)行純化。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物，和通過(guò)重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。取決于重組生產(chǎn)步驟中使用的宿主，可以將本發(fā)明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可以包含最初被修飾的殘基(在一些情況下由宿主介導(dǎo)的過(guò)程產(chǎn)生)。本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物活性片段。本發(fā)明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與TEMER06387多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO 2的氨基酸序列)足夠相同或來(lái)自后者，所述片段包含比全長(zhǎng)多肽更少的氨基酸但是顯示相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽的至少一種生物活性。典型地，生物活性片段包含具有TEMER06387多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明的多肽的生物活性片段可以是長(zhǎng)度為例如約10、約25、約50、約100或更多個(gè)氨基酸，或長(zhǎng)度至少約100個(gè)氨基酸、至少約150、200、250、300、350、400個(gè)氨基酸，或長(zhǎng)度多達(dá)本發(fā)明多肽氨基酸總數(shù)的多肽。另外，其它生物活性部分(其中多肽的其它區(qū)域被缺失)可以通過(guò)重組技術(shù)被制備，并針對(duì)本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種生物活性做出評(píng)價(jià)。本發(fā)明還包括編碼TEMER06387多肽的上述生物活性片段的核酸片段。多肽在本發(fā)明的另一方面中，提供了經(jīng)改進(jìn)的TEMER06387多肽。經(jīng)改進(jìn)的TEMER06387多肽是其中至少一種生物活性被改進(jìn)的多肽。這類多肽可以如下獲得沿全部或部分TEMER06387編碼序列隨機(jī)地引入突變(例如通過(guò)飽和誘變)，重組表達(dá)得到的突變體并針對(duì)生物活性進(jìn)行篩選。導(dǎo)致經(jīng)改進(jìn)的￠-葡糖苷酶功能的本發(fā)明氨基酸序列經(jīng)改進(jìn)的變體可通過(guò)本發(fā) 明的相應(yīng)基因獲得。此類修飾包括I.易錯(cuò)PCR以引入隨機(jī)突變，之后篩選獲得的變體并分離具有經(jīng)改進(jìn)的動(dòng)力學(xué)特性的變體2.編碼￠-葡糖苷酶的基因相關(guān)變體的家族改組，之后篩選獲得的變體并分離具有經(jīng)改進(jìn)的動(dòng)力學(xué)特性的變體導(dǎo)致提高的mRNA和/或多肽水平、導(dǎo)致更多P -葡糖苷酶活性的本發(fā)明的基因變體可通過(guò)所述基因的多核苷酸序列獲得。此類修飾包括I.以下述方式改進(jìn)密碼子使用，所述方式使得密碼子(最適地)適合親本微生物宿主。2.以下述方式改進(jìn)密碼子對(duì)使用，所述方式使得密碼子(最適地)適合親本微生物宿主3.對(duì)編碼0 -葡糖苷酶多肽的基因組信息添加穩(wěn)定化序列，導(dǎo)致具有提高的半哀期的mRNA分子分離具有經(jīng)改進(jìn)的催化特性或提高的mRNA或蛋白質(zhì)水平的變體的優(yōu)選方法描述于TO03/010183和W003/01311中。優(yōu)化親本微生物菌株中密碼子使用的優(yōu)選方法描述于PCT/EP2007/05594中。對(duì)編碼本發(fā)明的P -葡糖苷酶多肽的基因添加穩(wěn)定化元件的優(yōu)選方法描述于W02005/059149中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，TEMER06387多肽具有根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，TEMER06387多肽與根據(jù)SEQ ID NO :2的氨基酸序列基本同源，并保留根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽的至少一種生物活性，但是由于所述的天然變異或誘變而在
氨基酸序列上有差異。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，TEMER06387多肽具有由下述經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述經(jīng)分離的核酸片段能夠與根據(jù)SEQ IDNO 1的核酸優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下雜交。因此，TEMER06387多肽優(yōu)選地是包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :2所示氨基酸序列至少70%、至少71 %、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多同源，典型地，保留根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽的至少一種功能活性。也可以如下文所述來(lái)鑒定根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等同物例如，針對(duì)￠-葡糖苷酶活性，篩選本發(fā)明多肽的突變體(例如截短突變體)的組合文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生有斑文庫(kù)(variegated library)。可以通過(guò)例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來(lái)產(chǎn)生變體的有斑文庫(kù)，從而可能的多肽序列的簡(jiǎn)并集合(degenerateset)可作為個(gè)體多肽表達(dá),或者作為一組更大的融合蛋白表達(dá)(例如用于噬菌體展示)。存在可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明多肽的可能變體文庫(kù)的多種方法。用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)例如Narang (1983) Tetrahedron 39:3;ltakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53 :323 ;ltakura et al. (1984) Science 198 1056 ；Ike et al. (1983)Nucleic AcidRes. 11 :477)。另外，本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫(kù)可以被用于產(chǎn)生有斑的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫(kù)在每個(gè)分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復(fù)性形成雙鏈DNA (其可包含來(lái)自被不同切割的產(chǎn)物的有義/反義對(duì))，通過(guò)用SI核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫(kù)連接進(jìn)表達(dá)載體中。通過(guò)該方法，可以·得到下述表達(dá)文庫(kù)，所述表達(dá)文庫(kù)編碼感興趣的蛋白質(zhì)的不同大小的N-末端和內(nèi)部片段。本領(lǐng)域已知有若干種技術(shù)可用于篩選組合文庫(kù)(其通過(guò)截短的點(diǎn)突變制造)的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫(kù)以獲得具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫(kù)的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)典型地包括將基因文庫(kù)克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體中，用得到的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，和在下述條件下表達(dá)組合基因，所述條件下想要的活性的檢測(cè)簡(jiǎn)化編碼基因(其產(chǎn)物被檢測(cè))的載體的分離。循環(huán)總體誘變(Recursiveensemble mutagenesis, REM),—種增強(qiáng)文庫(kù)中功能突變體頻率的技術(shù),可以與篩選實(shí)驗(yàn)組合使用以鑒定本發(fā)明多妝的變體(Arkin andYourvan (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815 ；Delgrave et al. (1993)Protein Engineering 6(3) :327-331)。除了 SEQ ID NO :1中所示的TEMER06387基因序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道給定的種群中可存在DNA序列多態(tài)，所述多態(tài)導(dǎo)致TEMER06387多肽氨基酸序列中的改變。這類遺傳多態(tài)性可存在于來(lái)自不同種群的細(xì)胞中或由于天然等位基因變異而存在于一個(gè)種群中。等位基因變體也可包括功能等同物。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為PCR反應(yīng)的探針或引物作用。根據(jù)本發(fā)明的核酸無(wú)論是編碼功能多肽還是無(wú)功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有TEMER06387活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途尤其包括(I)從cDNA文庫(kù)分離編碼TEMER06387多肽的基因或其等位基因變體，所述cDNA文庫(kù)例如來(lái)自合適的微生物；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供 TEMER06387 基因的精確染色體定位，如 Verma et al. ,HumanChromosomes a Manual ofBasic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)所述；(3)Northern 印跡分析,用于檢測(cè)TEMER06387mRNA在特定組織中的表達(dá)；和4)能夠被用作診斷工具來(lái)分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與TEMER06387探針雜交。本發(fā)明還包括獲得TEMER06387基因功能等同物的方法。這類方法需要獲得被標(biāo)記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽序列或其任何變體的全部或部分；在允許探針與文庫(kù)中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫(kù)，和從任何被標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備仝長(zhǎng)的基因序列，以獲得與TEMER06387基因相關(guān)的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的TEMER06387核酸與SEQ ID NO :1中所示的核酸序列或其互補(bǔ)體至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更加同源。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。所述多核苷酸對(duì)宿主細(xì)胞的基因組可以是異源的。通常涉及宿主細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“異源的”表示多核苷酸不天然存在于宿主細(xì)胞的基因組中，或者多肽不由所述細(xì)胞天然地生產(chǎn)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括細(xì)胞，例如含有本發(fā)明所包括的核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是其中(或其祖先中)已經(jīng)借助于重組DNA技術(shù)引入了本發(fā)明核酸的細(xì)胞。原核和真核細(xì)胞均包括在內(nèi)，例如細(xì)菌、真菌、酵母等等，特別優(yōu)選的是來(lái)自絲狀真菌(例如Aspergillus niger或Talaromycesemersonii)的細(xì)胞?？蛇x用調(diào)控插入序列表達(dá)并以特異的、期望的方式加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。多種宿主細(xì)胞具有用于翻譯如加工和修飾蛋白質(zhì)和基因廣物的特性和特異機(jī)制?？蛇x用分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對(duì)所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。如果需要的話，可以在根據(jù)本發(fā)明的多肽的制備中使用上述細(xì)胞。這樣的方法典型地包含在提供編碼多肽的編碼序列(的載體)表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(例如用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的)，并任選地回收被表達(dá)的多肽?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸并入重組可復(fù)制載體例如表達(dá)載體中。可以使用載體在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如下制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞?？梢詮乃鏊拗骷?xì)胞中回收載體。優(yōu)選地，多肽作為分泌型蛋白質(zhì)被生產(chǎn)，在這種情況下，表達(dá)構(gòu)建體中編碼多肽成熟形式的核苷酸序列與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作地連接。優(yōu)選地，信號(hào)序列對(duì)編碼多肽的核苷酸序列而言是天然的(同源的)?；蛘?，信號(hào)序列對(duì)編碼多肽的核苷酸序列而言是外來(lái)的(異源的)，在這種情況下信號(hào)序列優(yōu)選地對(duì)其中表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列的宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源的。對(duì)酵母宿主細(xì)胞而言合適的信號(hào)序列的例子是衍生自酵母a-因子基因的信號(hào)序列。類似地，對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞而言合適的信號(hào)序列是例如衍生自絲狀真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如A.niger glaA基因的信號(hào)序列。這可與淀粉糖苷酶(也稱作(葡糖)淀粉酶)啟動(dòng)子自身組合使用，以及與其它啟動(dòng)子組合使用。在本發(fā)明上下文中也可以使用雜種信號(hào)序列。優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是來(lái)自于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-例如來(lái)自Aspergillus的18和24個(gè)氨基酸版本)、a -因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或a -淀粉酶基因(Bacillus)的分泌前導(dǎo)序列?？扇缟衔乃鰧⑤d體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞中，以提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。該方法可包括在提供編碼本發(fā)明多肽的編碼序列的載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。宿主細(xì)胞本發(fā)明因此提供了用本發(fā)明多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的或包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述多核苷酸被包含在用于復(fù)制和表達(dá)多核苷酸的載體中。 應(yīng)選擇與所述載體相容的細(xì)胞，并且其可以是原核(例如細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞?？梢赃x擇異源宿主，其中本發(fā)明的多肽以基本不含其它纖維素降解酶或半纖維素降解酶的形式被生產(chǎn)。這可以通過(guò)選擇正常情況下不生產(chǎn)此類酶的宿主來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明包括通過(guò)編碼多肽的DNA序列的重組表達(dá)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。就這一目的而言，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴(kuò)增和/或改變表達(dá)信號(hào)如啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列，從而允許合適同源或異源宿主細(xì)胞中多肽的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。同源宿主細(xì)胞是下述宿主細(xì)胞，其與DNA序列衍生自的物種是相同物種或是相同物種內(nèi)的變體。合適的宿主細(xì)胞優(yōu)選地是原核微生物如細(xì)菌，或更優(yōu)選地是真核生物，例如真菌，如酵母或絲狀真菌，或植物細(xì)胞。通常，酵母細(xì)胞是超過(guò)真菌細(xì)胞優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兏子诓僮?。然而，一些蛋白質(zhì)在酵母中分泌較差，或者在一些情況下不被正確加工(例如酵母中的超糖基化)。在這些情況下，應(yīng)當(dāng)選擇真菌宿主生物。宿主細(xì)胞可過(guò)表達(dá)多肽，并且用于進(jìn)行過(guò)表達(dá)的技術(shù)是公知的。宿主細(xì)胞因此可具有兩個(gè)或更多拷貝的編碼多核苷酸(因此載體可相應(yīng)地具有兩個(gè)或更多拷貝)。來(lái)自Bacillus屬的細(xì)菌非常適合作為異源宿主，因?yàn)樗鼈兡軌驅(qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌進(jìn)培養(yǎng)基中。適合作為宿主的其它細(xì)菌是來(lái)自Streptomyces和Pseudomonas屬的細(xì)菌。用于表達(dá)編碼多肽的DNA序列的一種優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia 和 Schizosaccharomyces 的屬。更優(yōu)選地，酵母宿主細(xì)胞選自由Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyceslactis (也已知為 Kluyveromycesmarxianus var. lactis)、Hansenulapolymorpha、Pichiapastoris、Yarrowia Iipolytica 和 Schizosaccharomyces pombe 物種組成的組。然而，最優(yōu)選的是(例如絲狀)真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞選自由 Aspergillus、Trichoderma/Hypocrea、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora、Sporotrichum、Thielavia、Chryosporium、Fusarium、Humicola、Neurospora 和 Talaromyces 屬組成的組。更優(yōu)選地，絲狀真菌宿主細(xì)胞是下屬種。所述種包括但不限于Aspergillusniger、Aspergillu sawamori> Aspergillus tubingensis、AspergiIlusacuIeatus>Aspergillus foetidus、Aspergillus nidulans、Aspergillusjaponicus> Aspergillusoryzae 和 Aspergillus ficuum、 Trichodermareesei/Hypocrea jecorina、 Fusariumgraminearum>Talaromyces emersonii、Penicillium decumbens'Acremonium alabamense、Neurospora crassa、Myceliophtora thernaophilurri、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichumdimorphosporum^ Talaromyces emersonii、Talaromyces stipiatus 和Thielavia terrestris。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞，因此本發(fā)明擴(kuò)展至含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因生物，如植物及其部分。所述細(xì)胞可異源表達(dá)本發(fā)明的多肽，或可異源地含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因(或經(jīng)遺傳修飾的)植物可因此在其基因組中(例如穩(wěn)定地)插入了編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明多肽的序列?？梢允褂靡阎夹g(shù)，例如使用來(lái)自Agrobacterium tumefaciens的Ti或Ri質(zhì)粒,進(jìn)行植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒(或載體)可因此含有感染植物必需的序列，并且可以使用Ti和/或Ri質(zhì)粒的衍生物?；蛘?，可進(jìn)行植物部分例如葉、根或莖的直接感染。在該技術(shù)中，例如如下對(duì)要被感染的植物造成創(chuàng)傷用刀片切割植物、或用針穿刺植物或用磨蝕劑摩擦植物。然后用Agrobacterium接種傷口。然后可在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物或植物部分，并允許其發(fā)育成為成熟的植物?？赏ㄟ^(guò)已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞成為經(jīng)遺傳修飾的植物的再生，例如通 過(guò)使用抗生素選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的枝條，并將枝條接種在含有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)素、植物激素等等的培養(yǎng)基上來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明因此還包括被修飾為表達(dá)本發(fā)明的￠-葡糖苷酶多肽或其變體的細(xì)胞。這類細(xì)胞包括經(jīng)瞬時(shí)修飾的，或優(yōu)選地經(jīng)穩(wěn)定修飾的高級(jí)真核細(xì)胞系，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，低級(jí)真核細(xì)胞，例如酵母和絲狀真菌細(xì)胞，或原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。還可能本發(fā)明的多肽在細(xì)胞系中或膜上(例如在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中)被瞬時(shí)表達(dá)。適合表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽的此類系統(tǒng)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明多肽的生產(chǎn)可以通過(guò)在便利的營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物表達(dá)宿主來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述微生物表達(dá)宿主已用一種或多種本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化。多肽/酶生產(chǎn)可使用本領(lǐng)域已知的步驟培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞。對(duì)啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每種組合而言，可以獲得有助于編碼多肽的DNA序列表達(dá)的培養(yǎng)條件。達(dá)到期望的細(xì)胞密度或多肽滴度后，停止培養(yǎng)并使用已知的步驟回收多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基可含有已知的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素、木聚糖、果膠、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物等等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等等)、有機(jī)氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等等)和無(wú)機(jī)氮源(例如磷酸鎂、磷酸鉀、磷酸鋅、磷酸鐵等等)。任選地可以包括誘導(dǎo)劑(例如纖維素、果膠、木聚糖、麥芽糖、麥芽糖糊精或聚木糖半乳糖醒酸(xylogalacturonan))。對(duì)合適培養(yǎng)基的選擇可基于表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)節(jié)需求來(lái)進(jìn)行。這類培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。需要時(shí)，培養(yǎng)基可含有額外的組分，所述額外的組分對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主的偏好優(yōu)于其它可能的污染微生物?？筛鶕?jù)任何已知的程序進(jìn)行通過(guò)轉(zhuǎn)化的宿主(發(fā)酵)的多肽生產(chǎn)。生產(chǎn)時(shí)間可在從約0. 5到約30天的周期上進(jìn)行。發(fā)酵可以是分批、連續(xù)或補(bǔ)料分批的過(guò)程，在0-100°C或0-80°C范圍內(nèi)，例如從約0°C到約60°C的合適溫度下，和/或例如在從約2到約10或從約3到約9的pH下。優(yōu)選的發(fā)酵條件是從約20°C到約55°C之間范圍內(nèi)的溫度和/或從約3到約5之間的pH。適當(dāng)?shù)臈l件通?；诒磉_(dá)宿主的選擇和要表達(dá)的多肽來(lái)選擇。
發(fā)酵后，如果必須的話，可通過(guò)離心或過(guò)濾從發(fā)酵液中去除細(xì)胞。發(fā)酵停止或去除細(xì)胞后，可隨后回收本發(fā)明的多肽，并且需要時(shí)通過(guò)常規(guī)手段純化和分離。多肽/酶組合物本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽和纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶的組合物。當(dāng)本發(fā)明的多肽是纖維素酶時(shí)，除了本發(fā)明的多肽以外，本發(fā)明的組合物會(huì)典型地包含半纖維素酶和/或果膠酶。當(dāng)本發(fā)明的多肽是半纖維素酶時(shí)，除了本發(fā)明的多肽以外，本發(fā)明的組合物會(huì)典型地包含纖維素酶和/或果膠酶。當(dāng)本發(fā)明的多肽是果膠酶時(shí)，除了本發(fā)明的多肽以外，本發(fā)明的組合物會(huì)典型地包含纖維素酶和/或半纖維素酶。 本發(fā)明的組合物可包含一類、兩類或三類或更多類的纖維素酶，例如內(nèi)切-1，4-3-葡聚糖酶(EG)、外切-纖維二糖水解酶(CBH)和￠-葡糖苷酶(BG)中的一種、兩種或所有。本發(fā)明的組合物可包含具有相同酶活性的多肽，例如與本發(fā)明多肽提供的活性相同類型的纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶活性。本發(fā)明的組合物可包含與本發(fā)明的多肽提供的活性不同類型的纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。例如，本發(fā)明的組合物可包含本發(fā)明多肽提供的一種類型的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性和其他半纖維素酶/果膠酶提供的另一種類型的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。在本文中，纖維素酶是能夠降解纖維素的任何多肽。能夠降解纖維素的多肽是能夠催化下述過(guò)程的多肽將纖維素降解成更小的單元，例如部分地降解成纖維素糊精，或者完全降解成葡萄糖單體。與纖維素酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可得到纖維素糊精與葡萄糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過(guò)水解反應(yīng)而發(fā)生。本文中，半纖維素是能夠降解半纖維素的任何多肽。也就是說(shuō)，半纖維素酶可以能夠降解木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一種或多種。能夠降解半纖維素的多肽是能夠催化下述過(guò)程的多肽將半纖維素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體，例如己糖或戊糖單體。與半纖維素酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的半纖維素酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過(guò)水解反應(yīng)而發(fā)生。本文中，果膠酶是能夠降解果膠的任何多肽。能夠降解果膠的多肽是能夠催化下述過(guò)程的多肽將果膠降解成更小的單元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體。與果膠酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的果膠酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過(guò)水解反應(yīng)而發(fā)生。因此，本發(fā)明的組合物可包含任何纖維素酶，例如纖維二糖水解酶，內(nèi)切-P -1，4-葡聚糖酶，￠-葡糖苷酶或￠-(1,3) (1，4)_葡聚糖酶。本文中，纖維二糖水解酶是能夠催化纖維素或纖維四糖中1,4-0-D-葡糖苷鍵水解、從鏈的末端釋放纖維二糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作纖維素酶1，4-0_纖維二糖苷酶(I，4-0 -cellobiosidase)，1，4_0 -纖維二糖水解酶，1,4-^ -D-葡聚糖纖維二糖水解酶，微晶纖維素酶(avicelase)，外切_1，4_ P-D-葡聚糖酶，外切-葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。其可具有EC編碼EC3. 2. I. 91。纖維二糖水解酶可細(xì)分為纖維二糖水解酶I (CBHI)和纖維二糖水解酶II (CBHII)。CBHI被定義為主要從還原性末端水解纖維素、分裂出纖維二糖的纖維二糖水解酶。CBHI被定義為主要從非還原性末端水解纖維素、分裂出纖維二糖的纖維二糖水解酶。本文中，內(nèi)切-3-1，4-葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4)是能夠催化纖維素、地衣淀粉或谷類P-D-葡聚糖中1，4-0-D-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解還含有1，3_鍵的P-D-葡聚糖中的1，4_鍵。所述酶也可以被稱作纖維素酶、微晶纖維素酶、￠-1,4-內(nèi)切葡聚糖水解酶、￠-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶、纖維糊精酶、內(nèi) 切-I，4- @ -D-葡聚糖酶、內(nèi)切-I，4- @ -D-葡聚糖水解酶、內(nèi)切-I，4- @ -葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶。本文中，CEA是基于其3D結(jié)構(gòu)被歸類在糖基水解酶家族5 (GH5)下的內(nèi)切葡聚糖酶EC3.2.1.4。GH5家族成員的已知活性包括殼聚糖酶(EC 3.2.1.132)、P -甘露糖苷酶(EC 3.2. I. 25)、纖維素酶(EC 3.2. I. 4)、葡聚糖 1，3-0-葡糖苷酶(EC3. 2. I. 58)、地衣淀粉酶(Iicheninase) (EC 3.2. I. 73)、葡聚糖內(nèi)切-1，6-P -葡糖苷酶(EC 3.2. I. 75)、甘露聚糖內(nèi)切-3-1，4-甘露糖苷酶(EC 3.2. I. 78)、內(nèi)切-3-1，4-木聚糖酶(EC 3.2. 1.8)、纖維素￠-1,4-纖維二糖苷酶(EC 3. 2. I. 91)、內(nèi)切-3-1，6-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.-)、￠-1,3-甘露聚糖酶(EC 3.2. I.-)、木糖葡聚糖-特異性內(nèi)切-￠-1,4-葡聚糖酶(EC3. 2. I. 151)、甘露聚糖轉(zhuǎn)糖基酶(EC 2. 4. I.-)活性。本文中CEB是基于其3D結(jié)構(gòu)被歸類在糖基水解酶家族7 (GH7)下的內(nèi)切葡聚糖酶EC 3.2. 1.4。GH7家族成員的已知活性包括內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1.4),[對(duì)還原末端起作用的]纖維二糖水解酶(EC3.2. I.-)、殼聚糖酶(EC 3.2. I. 132)、內(nèi)切-3-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2. I. 73)活性。本文中，￠-葡糖苷酶(縮寫為BG) (EC 3.2.1.21)是能夠催化末端、非還原性
3-D-葡萄糖殘基水解并釋放P-D-葡萄糖的任何多肽。這樣的多肽可具有針對(duì)P-D-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種P -D-半乳糖苷、a -L-阿拉伯糖苷、
3-D-木糖苷或3-D-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、3-D-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。本文中，￠-(1,3) (1，4)_葡聚糖酶(EC 3. 2. 1.73)是能夠催化含有1，3_和1，
4-鍵的P-D-葡聚糖中I，4-P-D-葡糖苷鍵水解的任何多肽。此類多肽可作用于地衣淀粉和谷類P-D-葡聚糖，但不作用于僅含1，3_或1，4_鍵的P-D-葡聚糖。所述酶也可以被稱作地衣淀粉酶(Iicheninase)，I, 3-1,4-^-D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶，P -葡聚糖酶，內(nèi)切-￠-1, 3-1，4葡聚糖酶，地衣多糖酶(Iichenase)或混合鍵P -葡聚糖酶。這類酶的替代方案是被描述為內(nèi)切-1,3(4)-0-葡聚糖酶的EC 3. 2. 1.6。當(dāng)下述葡萄糖殘基在C-3處被自身取代時(shí)，這類酶水解P -D-葡聚糖酶中的I，3-鍵或I，4-鍵，所述葡萄糖殘基的還原基團(tuán)涉及要水解的鍵。替代性的名稱包括內(nèi)切-1，3-P-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1，3-(1，3 ;1，4)-P-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷類P-D-葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含GH61家族酶或具有增強(qiáng)纖維素酶的活性的任何其他酶。本文中增強(qiáng)纖維素酶的活性被定義為增強(qiáng)至少一種纖維素酶的活性。當(dāng)本發(fā)明的@ -葡糖苷酶蛋白在具有一種或多種纖維素酶的混合物中，例如在具有纖維二糖水解酶(CBH)和￠-葡糖苷酶(BG)的混合物中存在時(shí)，其會(huì)增強(qiáng)這些纖維素酶的活性，這會(huì)導(dǎo)致降解纖維素的混合物的活性更高。基于家族成員(內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4))中的非常弱的內(nèi)切_l，4-b-D-葡聚糖酶活性的測(cè)量，GH61家族中的酶最初被歸類為糖苷水解酶家族。當(dāng)然這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式不是典型的并且它們不能被認(rèn)作真正的糖苷酶。但是，當(dāng)與纖維素酶或纖維素酶的混合物連起來(lái)使用時(shí)，基于其增強(qiáng)木質(zhì)纖維素分解的能力，它們被保留在 CAZy 種類中。在 Harris，PV et al,Biochemistry 2010，49，3305-3316 的圖 5 中給出了 GH61家族的已知成員的綜述。本發(fā)明的組合物可以包含任何半纖維素酶，例如內(nèi)切木聚糖酶、￠-木糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、a -半乳糖苷酶、3 -半乳糖苷酶、3 -甘露聚糖酶或3 -甘露糖苷酶。本文中，內(nèi)切木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是能夠催化木聚糖中1，4_0 -D-木糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作內(nèi)切-1，4-0 -木聚糖酶或1，4-P-D-木聚糖木 聚糖水解酶。一種替代是EC 3. 2. I. 136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖內(nèi)切木聚糖酶，一種能夠水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1，4木糖苷鍵的酶。本文中，@ -木糖苷酶(EC 3. 2. I. 37)是能夠催化1，4_@ -D-木聚糖的水解、從非還原性末端去除相繼的D-木糖殘基的任何多肽。這類酶也可以水解木二糖。所述酶也可以被稱作木聚糖1，4-0 -木糖苷酶、1，4-0 -D-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4-0 -木糖苷酶或木二糖酶。本文中，a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. I. 55)是能夠作用于a -L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1，2)和/或(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作a-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。本文中，a -D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3. 2. I. 139)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽a -D-葡糖醛酸苷+H2O =醇+D-葡糖醛酸酯。所述酶也被稱作a -葡糖醛酸糖苷酶或a-葡糖苷酸酶。這些酶也可水解可作為木聚糖中取代基存在的4-0-甲基化的葡糖醛酸。替代方式是EC 3.2. I. 131 :木聚糖a-I，2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化a-l，2-(4-0-甲基)葡糖醛?；B接的水解。本文中，乙?；揪厶酋ッ?EC 3. I. I. 72)是能夠催化木聚糖和木寡糖脫乙酰化的任何多肽。此類多肽可催化來(lái)自多聚木聚糖、乙?；咎恰⒁阴；咸烟?、a -萘基乙酸酯或?qū)ο趸交宜狨サ囊阴；?，但是一般不催化?lái)自于三酰甘油的乙?；狻４祟惗嚯囊话悴蛔饔糜谝阴；母事毒厶腔蚬z。本文中，阿魏酸酯酶(EC 3. I. I. 73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽阿魏酸基-糖+H2O=阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化來(lái)自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，對(duì)硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被稱作肉桂?；ニ饷?，阿魏酸酯酶或羥基肉桂?；ッ浮Ｒ部梢员环Q作半纖維素附屬酶，因?yàn)槠淇蓭椭揪厶敲负凸z酶分解植物細(xì)胞壁半纖維素和果膠。本文中，香豆?；ッ?EC 3. I. I. 73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽香豆酰基-糖+H2O=香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被稱作反式-4-香豆?；ッ?、反式-對(duì)香豆酰基酯酶、對(duì)香豆酰基酯酶或?qū)ο愣顾狨ッ?。所述酶也落入EC 3. I. I. 73中，從而也可以被稱作阿魏酸酯酶。本文中，a -半乳糖苷酶(EC 3. 2. I. 22)是能夠催化a -D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非還原性a-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解a-D-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作蜜二糖酶。本文中，P -半乳糖苷酶(EC 3. 2. I. 23)是能夠催化P -D-半乳糖苷中末端非還原性P-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。這樣的多肽也可以能夠水解a-L-阿拉伯糖苷。所述酶也可以被稱作外切- (I- > 4)-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。本文中，^ -甘露聚糖酶(EC 3. 2. I. 78)是能夠催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中I，4-P-D-甘露糖苷鍵隨機(jī)水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖內(nèi)·切-1,4- P -甘露糖苷酶或內(nèi)切-1,4-甘露聚糖酶。本文中，@ -甘露糖苷酶(EC 3. 2. I. 25)是能夠催化@ -D-甘露糖苷中末端非還原性P-D-甘露糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖酶或甘露糖酶。本發(fā)明的組合物可包含任何果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，P -半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ福瑑?nèi)切-果膠裂合酶，果膠酸裂合酶，a -鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。本文中，內(nèi)切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. I. 15)是能夠催化果膠酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中l(wèi)，4-a-D-半乳糖醛酸鍵的隨機(jī)水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作多聚半乳糖醒酸酶果膠解聚酶，果膠酶，內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶，果膠酶(pectolase),果膠水解酶，果膠多聚半乳糖醛酸酶，多聚-a -1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酶；內(nèi)切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(I，4-a-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。在本文中，果膠甲基酯酶(EC 3. I. I. 11)是能夠催化下述反應(yīng)的任何酶果膠+nH2O = n甲醇+果膠酸酯。所述酶也已知為果膠酯酶(pectinesterase),果膠脫甲氧基酶，果膠甲氧基酶，果膠甲基酯酶，果膠酶，果膠酯酶(pectinoesterase)或果膠果?；饷?pectinpectylhydroIase)。在本文中，內(nèi)切-半乳聚糖酶(EC 3. 2. I. 89)是能夠催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-3-D-半乳糖苷鍵的內(nèi)切水解的任何酶。所述酶也已知為阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-I，
4-3 -半乳糖苷鍵，內(nèi)切-I，4- 0 -半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4- 3 -D-半乳聚糖水解酶。本文中，果膠乙?；ッ冈诒疚闹斜欢x為下述任何酶，所述酶具有催化果膠GaIUA殘基羥基處乙?；拿撘阴；饔玫囊阴；ッ富钚?。本文中，內(nèi)切-果膠裂合酶(EC 4. 2. 2. 10)是能夠催化(I — 4) - a -D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非還原末端具有4_脫氧-6-0-甲基-a -D-半乳-4-糖醒酰基的寡糖。所述酶也可已知為果膠裂合酶，果膠反式消除酶(trans-eliminase),內(nèi)切果膠裂合酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果膠甲基反式消除酶，果膠酶(pectolyase)，PL, PNL或PMGL或(I — 4) -6-0-甲基-a -D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。本文中，果膠酸裂合酶(EC 4. 2. 2. 2)是能夠催化(I — 4) - a -D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非還原性末端具有4-脫氧- a -D-半乳-4-糖醛?；娜魏蚊浮Ｔ撁敢部梢砸阎獮槎嗑郯肴樘侨┧岱词较?，果膠酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，內(nèi)切果膠甲基反式消除酶，果膠酸反式消除酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果膠酸裂合酶，果膠裂合酶，a-l，4_D-內(nèi)切多聚半乳糖醛酸裂合酶，PGA裂合酶，PPase-N,內(nèi)切-a -1，4-多聚半乳糖醛酸裂合酶，多聚半乳糖醛酸裂合酶，果膠反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(I — 4)-a-D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。本文中，a -鼠李糖苷酶(EC 3. 2. I. 40)是能夠催化a -L-鼠李糖苷或鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非還原性a-L-鼠李糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以已知為a -L-鼠李糖苷酶T，a -L-鼠李糖苷酶N或a -L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. I. 82)是能夠從非還原性末 端水解果膠酸、釋放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知為外切-多聚- a-半乳糖醒酸昔酶(exo-poly-a-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醒酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醒酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2. 1.67)是能夠催化以下的任何多肽(1，
4-0-0-半乳糖醛酸苷)11+1120= (1，4-0-0-半乳糖醛酸苷)11_1+0-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知為半乳糖醒1,4_ a -半乳糖醒酸苷酶(galacturanl, 4_ a -galacturonidase),外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(I，4-a-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶(EC 4. 2. 2. 9)是能夠催化從果膠酸(即脫脂化的果膠)的還原末端消除性切割4- (4-脫氧-a -D-半乳-4-糖醛?；?-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知為果膠酸二糖裂合酶，果膠酸外切裂合酶，外切果膠酸反式消除酶，外切果膠酸裂合酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATEjF切-PGL或(I — 4) - a -D-半乳糖醛酸聚糖還原末端二糖裂合酶。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能夠在嚴(yán)格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)中以內(nèi)切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之間鍵的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)由二糖[(l，2-a-L-鼠李糖基-(l，4)-a-半乳糖醛酸]組成。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶是能夠以內(nèi)切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通過(guò)P -消除切割a -L-Rhap-(I — 4) - a -D-GalpA鍵的任何多肽。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能夠催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替出現(xiàn)的鼠李糖和半乳糖醛酸殘基主鏈的脫乙?；娜魏味嚯摹１疚闹校罄畎肴樘侨┧峋厶前肴樘侨┧崴饷甘悄軌蛞酝馇蟹绞?、從嚴(yán)格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)的非還原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。本文中，木半乳糖醛酸酶是通過(guò)以內(nèi)切方式切割￠-木糖取代的半乳糖醛酸主鏈而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知為木半乳糖醛酸聚糖水解酶。本文中，a -L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3. 2. I. 55)是能夠作用于a -L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作a-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。本文中，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(EC 3. 2. I. 99)是能夠催化1，5_阿拉伯聚糖中1，
5-a -阿拉伯呋喃糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也已知為內(nèi)切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切-I，5- a -L-阿拉伯糖苷酶，內(nèi)切-I，5- a -L-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切-a -I，5_阿拉伯聚糖酶；內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶或1，5- a -L-阿拉伯聚糖1，5- a -L-阿拉伯聚糖水解酶。本發(fā)明的組合物將一般包含至少一種纖維素酶和/或至少一種半纖維素酶和/或至少一種果膠酶(所述酶之一是根據(jù)本發(fā)明的多肽)。本發(fā)明的組合物可包含纖維二糖水解酶，內(nèi)切葡聚糖酶和/或3-葡糖苷酶。此類組合物也可以包含一種或多種半纖維素酶和/或一種或多種果膠酶。
本發(fā)明的組合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木質(zhì)酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶葡糖醛酸糖苷酶中的一種或多種(例如兩種、三種、四種或所有)?！暗鞍酌浮卑ㄋ怆逆I的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分如糖之間鍵的酶(糖肽酶)。許多肽酶根據(jù)EC 3. 4表征，適合在本發(fā)明中使用并且通過(guò)引用并入本文。一些特定類型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金屬內(nèi)切蛋白酶)?！爸久浮卑ㄋ庵|(zhì)、脂肪酸和?；视王?包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂質(zhì)被用作結(jié)構(gòu)組分，來(lái)限制水損失和病原體感染。這些脂質(zhì)包括來(lái)自脂肪酸的蠟質(zhì)，以及角質(zhì)和木栓素(suberin)?！澳举|(zhì)酶”包括能夠水解或分解木質(zhì)素聚合物結(jié)構(gòu)的酶。能夠分解木質(zhì)素的酶包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本領(lǐng)域中已知解聚或以其他方式分解木質(zhì)素聚合物的描述的其他酶。還包括在內(nèi)的是能夠水解在半纖維素糖(主要是阿拉伯糖)和木質(zhì)素之間形成的鍵的酶。木質(zhì)酶包括但不限于以下組的酶木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(EC1. 11. 14)、錳過(guò)氧化物酶(EC I. 11. I. 13)、漆酶(EC I. 10. 3. 2)和阿魏酸酯酶(EC3. I. I. 73)?！凹禾腔D(zhuǎn)移酶”(2. 4. I-)包括能夠轉(zhuǎn)移糖基、更特定地轉(zhuǎn)移幾糖基的酶。除了將糖基從含糖基的供體轉(zhuǎn)移至另一含糖基的化合物受體以外，所述酶還能夠?qū)⑻腔D(zhuǎn)移至作為受體的水。所述反應(yīng)也已知為水解反應(yīng)而不是轉(zhuǎn)移反應(yīng)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的己糖基轉(zhuǎn)移酶的例子是￠-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶。此類酶可以能夠催化(1，3) (1,4)葡聚糖和/或纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的降解。“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如P -葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。許多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可適合在本發(fā)明中使用，例如￠-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3. 2. I. 31)，透明質(zhì)酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3. 2. I. 36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3. 2. I. 56)，甘草酸P -葡糖醛酸糖苷酶(3. 2. I. 128)或a -D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3. 2. I. 139)。本發(fā)明的組合物可包含擴(kuò)展蛋白多肽或擴(kuò)展蛋白樣多肽，如膨脹因子(swollenin)(見(jiàn) Salheimo et al. , Eur. J. Biohem. 269,4202-4211, 2002)或膨脹因子樣多肽。
擴(kuò)展蛋白涉及植物細(xì)胞生長(zhǎng)期間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松弛。已經(jīng)提出擴(kuò)展蛋白破壞纖維素和其他細(xì)胞壁多糖之間的氫鍵，但不具有水解活性。認(rèn)為它們通過(guò)這種方式允許纖維素纖維的滑動(dòng)和細(xì)胞壁的擴(kuò)大。一種擴(kuò)展蛋白樣蛋白——膨脹因子，含有N端碳水化合物結(jié)合模塊家族I結(jié)構(gòu)域(CBD)和C端擴(kuò)展蛋白樣結(jié)構(gòu)域。就本發(fā)明的目的而言，擴(kuò)展蛋白樣蛋白或膨脹因子樣蛋白可包含此類結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種和/或可破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)(如破壞纖維素結(jié)構(gòu))，任選地不生產(chǎn)可檢測(cè)量的還原糖。本發(fā)明的組合物可包含纖維素整合蛋白、支架蛋白或支架樣蛋白的多肽產(chǎn)物，例如分別來(lái)自 Clostridium thermocellum 或 Clostridiumcellulolyticum 的 CipA 或 CipC0支架蛋白和纖維素整合蛋白是多功能整合亞基，其可將分解纖維素的亞基組合進(jìn)多酶復(fù)合物中。這通過(guò)兩類互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)域(即支架蛋白上的內(nèi)聚結(jié)構(gòu)域(cohesiondomain)和每個(gè)酶單元上的錨定結(jié)構(gòu)域(dockerindomain))的相互作用完成。支架蛋白亞基還帶有介導(dǎo)纖維體與其底物結(jié)合的纖維素結(jié)合模塊(CBM)。就本發(fā)明的目的而言，支架蛋白或纖維素整合蛋白可包含此類結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種。本發(fā)明的組合物可包含纖維素誘導(dǎo)的蛋白或調(diào)節(jié)蛋白，例如由來(lái)自Trichoderma·reesei/Hypocrea jacorina的cipl或cip2基因或類似基因所編碼的蛋白(見(jiàn)Foreman etal.，J. Biol. Chem. 278 (34) 31988-31997，2003)。這些基因的多肽產(chǎn)物是雙模塊蛋白，其含有纖維素結(jié)合模塊和其功能或活性不與已知的糖基水解酶家族相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。而纖維素結(jié)合模塊的存在和這些基因的表達(dá)與纖維素酶元件的共同調(diào)節(jié)表明在生物質(zhì)降解中具有潛在作用的先前未被認(rèn)識(shí)的活性。本發(fā)明的組合物可包含上文提到的多肽種類的任一成員、一個(gè)多肽種類的若干成員、或這些多肽種類的任何組合。在本發(fā)明的組合物可以由來(lái)自以下的多肽(例如酶)組成(1)供應(yīng)商；(2)克隆基因表達(dá)的多肽，例如酶；(3)復(fù)合發(fā)酵液(例如由培養(yǎng)基中微生物菌株的生長(zhǎng)得到的，其中所述菌株向培養(yǎng)基中分泌蛋白和酶)；(4)如(3)中生長(zhǎng)的菌株的細(xì)胞裂解物；和/或(5)植物材料表達(dá)的多肽，例如酶。本發(fā)明組合物中不同的多肽，例如酶可得自不同的來(lái)源。多肽的用途根據(jù)本發(fā)明的多肽和多肽組合物可用于許多不同的應(yīng)用中。例如，它們可被用于生產(chǎn)可發(fā)酵的糖?？砂l(fā)酵的糖隨后可(作為生物燃料方法的部分)被轉(zhuǎn)化成沼氣或乙醇、丁醇、異丁醇、2 丁醇或其他合適的物質(zhì)?；蛘?，多肽及其組合物可(例如在食物制品的生產(chǎn)中，在洗滌劑組合物中，在造紙工業(yè)和制漿工業(yè)中，和在抗菌配制物中，在藥物制品例如潤(rùn)喉片、牙膏和漱口水中)用作酶。這些用途中的一些將在下文中更詳細(xì)地闡述。在下文所述地用途和方法中，上述組合物的組分可共同(即本身作為單一組合物)或單獨(dú)或先后提供。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的￠-葡糖苷酶多肽和包含此類酶的組合物在工業(yè)方法中的用途。盡管用這些方法獲得了長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)，但是根據(jù)本發(fā)明的￠-葡糖苷酶多肽可具有優(yōu)于目前所使用的酶的大量顯著優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)具體的應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可包括下述方面，例如更低的生產(chǎn)成本，更高的底物特異性，降低的抗原性，更少的不想要的副活性，在合適的微生物、更合適的pH和溫度范圍中生產(chǎn)時(shí)更高的產(chǎn)量，不受疏水的、來(lái)自木質(zhì)素的產(chǎn)物抑制，或更少的產(chǎn)物抑制，或在食品工業(yè)情況下最終產(chǎn)物更好的口味或質(zhì)地，以及食品級(jí)別和猶太教戒律方面。原則上，￠-葡糖苷酶多肽或本發(fā)明的組合物可以在任何下述方法中使用，所述方法需要處理包含多糖的材料。因此，本發(fā)明的多肽或組合物可以在多糖材料的處理中使用。本文中，多糖材料是下述材料，所述材料包含一種或更典型地包含多于一種多糖或者基本由所述多糖組成。典型地，植物和源自它們的材料包含大量非淀粉的多糖材料。因此，本發(fā)明的多肽可以用于植物或真菌材料或源自它們的材料的處理。木質(zhì)纖維素植物非淀粉多糖材料的一個(gè)重要的組分是木質(zhì)纖維素(在本文中也稱作木質(zhì)纖維素生物質(zhì))。木質(zhì)纖維素是包含纖維素和半纖維素和木質(zhì)素的植物材料。碳水化合物聚 合物(纖維素和半纖維素)與木質(zhì)素通過(guò)氫鍵和共價(jià)鍵緊密結(jié)合。因此，本發(fā)明的多肽可以用于木質(zhì)纖維素材料的處理。本文中，木質(zhì)纖維素材料是包含木質(zhì)纖維素或基本由木質(zhì)纖維素組成的材料。因此，在用于處理非淀粉的多糖的本發(fā)明方法中，非淀粉的多糖可以是木質(zhì)纖維素材料/生物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了用于處理包含非淀粉多糖的底物的方法，其中所述處理包括纖維素和/或半纖維素和/或果膠物質(zhì)的降解和/或水解和/或改性。降解在本文上下文中表示導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素和/或半纖維素和/或果膠物質(zhì)的水解產(chǎn)物(即與類似的未經(jīng)處理的非淀粉多糖中存在的相比，由于處理而存在更短鏈的糖)的處理。因此，降解在本文上下文中可以導(dǎo)致寡糖和/或糖單體的釋放。所有植物都含有非淀粉的多糖，同樣，基本上所有來(lái)自植物的多糖材料也含有非淀粉的多糖。因此，在本發(fā)明的用于處理包含非淀粉多糖的底物的方法中，所述底物可以以植物或源自植物的材料或包含植物或源自植物的材料的形式提供，例如以植物漿體、植物提取物、食品或其成分、織物、紡織品或衣物。適合在本發(fā)明的方法中使用的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包括生物質(zhì)，并可包括原生生物質(zhì)(virgin biomass)和/或非原生生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì),商業(yè)有機(jī)物,建筑和拆除碎片，市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。常見(jiàn)的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢(shrubs)和草，小麥，小麥秸，甘蔗渣，玉米，玉米殼，玉米芯(corn cobs)，玉米粒(包括來(lái)自玉米粒的纖維)，來(lái)自谷物如玉米、小麥和大麥研磨(包括濕磨和干磨)的通常稱作麩或纖維的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是，但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，和紙漿和造紙廠殘余物?！稗r(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括樹枝，灌木(bushes),藤蔓(canes),玉米和玉米殼,能量作物,森林,水果,鮮花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，短期輪種木本作物(short-rotationwoody crops),灌木叢,柳枝稷,樹木,蔬菜，水果皮，蔓藤(vines),甜菜衆(zhòng),小麥麩皮(wheatmidlings)，燕麥殼，和硬木材或軟木材(不包括帶有有害材料的木材)。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物材料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動(dòng)，特定地包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述任一或其任何組合或混合物。合適的生物質(zhì)的其他例子是果園底料，樹叢，磨坊廢棄物，城市木材廢棄物，市政廢棄物，伐木廢棄物，森林疏伐廢棄物，短期輪種木本作物，工業(yè)廢棄物，小麥秸，燕麥秸，水稻秸，大麥秸，黑麥秸，亞麻秸，大豆殼，稻殼，水稻秸，玉米谷蛋白飼料，燕麥殼，甘蔗，玉米秸桿，玉米桿，玉米芯，玉米殼，牧場(chǎng)草，磨擦禾，狐尾草；甜菜漿，柑橘果實(shí)漿，種子殼，纖維素動(dòng)物糞便，草坪修剪廢棄物，棉花，海藻，樹木，灌木叢，草，小麥，小麥秸，甘蔗渣，玉米，玉米殼，玉米棒，玉米粒，來(lái)自玉米粒的纖維，來(lái)自谷物濕磨或干磨的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，市政固體廢棄物，廢紙，庭院廢棄物，草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，紙漿，造紙廠殘余物，樹枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米殼，能源作物，森林，水果，鮮花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜衆(zhòng)，小麥麩皮，燕麥殼，硬木材或軟木材，由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物材料，林業(yè)木材廢棄物，或其中任意兩種或更多的組合。除了已經(jīng)在食物和飼料或造紙和制漿工業(yè)中加工的原生生物質(zhì)或原料以外，生物質(zhì)/原料可額外地用熱、機(jī)械和/或化學(xué)改性或此類方法的任何組合預(yù)處理，從而增強(qiáng)酶降 解。
預(yù)處理為了以任何本領(lǐng)域已知的方式增強(qiáng)底物對(duì)酶水解的可接近性和/或水解半纖維素和/或溶解半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素，在酶處理之前，任選地可用熱、機(jī)械、和/或化學(xué)改性或此類方法的任何組合對(duì)原料預(yù)處理。預(yù)處理可包括將木質(zhì)纖維素材料暴露于(熱)水、蒸汽(蒸汽爆破)酸、堿、溶劑、熱、過(guò)氧化物、臭氧、機(jī)械擊打、粉碎、研磨或快速降壓，或其中任何兩種或更多的組合。所述化學(xué)預(yù)處理通常與熱預(yù)處理(例如150-220°C之間I到30分鐘)組合。預(yù)糖化預(yù)處理步驟后,可以使用涉及用酶或酶混合物孵育的液化/水解或預(yù)糖化步驟。預(yù)糖化步驟可以在許多不同的溫度下進(jìn)行，但是優(yōu)選預(yù)糖化在最適合要應(yīng)用的酶混合物的溫度下，或針對(duì)要應(yīng)用的酶預(yù)測(cè)的酶最適度下進(jìn)行。預(yù)糖化步驟的溫度范圍可以是從約10°C到約 95°C，約 20°C到約 85°C，約 30°C到約 70°C，約 40°C到約 60°C，約 37°C到約 50°C，優(yōu)選地約37°C到約80°C，更優(yōu)選地約60-70 V，進(jìn)一步更優(yōu)選地在65°C左右。預(yù)糖化混合物的pH可以在從約2. 0到約10. 0，但是優(yōu)選地約3. 0到約7. 0，更優(yōu)選地約4. 0到約6. 0，進(jìn)一步更優(yōu)選地約4. 0到約5. O。另外，pH可以被調(diào)節(jié)以最大化酶活性，并且可以通過(guò)添加酶來(lái)調(diào)節(jié)。液化/水解或預(yù)糖化步驟反應(yīng)可以進(jìn)行數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)，例如從約I小時(shí)到約120小時(shí)，優(yōu)選地從約2小時(shí)到約48小時(shí)，更優(yōu)選地從約2小時(shí)到約24小時(shí)，最優(yōu)選地從約2小時(shí)到約6小時(shí)。纖維素酶處理可進(jìn)行數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)，例如從約6小時(shí)到約120小時(shí)，優(yōu)選地約12小時(shí)到約72小時(shí)，更優(yōu)選地約24小時(shí)到48小時(shí)。糖化本發(fā)明提供了由木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)糖的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多肽與木質(zhì)纖維素材料接觸。此類方法允許由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)游離的糖(單體)和/或寡糖。這些方法涉及用本發(fā)明的多肽或組合物將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成游離糖和小寡糖。將復(fù)合碳水化合物如木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為糖的方法優(yōu)選地允許轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖。此類方法可以被稱作“糖化”。因此，本發(fā)明的方法可導(dǎo)致一種或多種己糖和/或戊糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、核糖和果糖中的一種或多種)的釋放。因此，本發(fā)明的另一方面包括下述方法，所述方法與其它酶或物理處理(例如溫度和pH) —起利用上文所述本發(fā)明的組合物的多肽，將木質(zhì)纖維素植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖和寡糖。盡管組合物已作為單一混合物被討論，但是認(rèn)為酶可以先后添加，其中溫度、pH和其他條件可以被改變，以提高每種個(gè)體酶的活性?；蛘?，可以針對(duì)酶混合物測(cè)定最適PH和溫度。酶在任何適當(dāng)?shù)臈l件下與底物反應(yīng)。例如，酶可以在約25°C，約30°C，約35°C， 約 37°C，約 40°C，約 45°C，約 50°C，約 55°C，約 60°C，約 65°C，約 70°C，約 75°C，約 80°C，約85 °C，約90 V或更高下孵育。也就是說(shuō)，它們可以在從約20 V到約95 °C下，例如在低到中等離子強(qiáng)度的緩沖液中和/或從低到中性PH下孵育?！爸械入x子強(qiáng)度”表示對(duì)任何單個(gè)離子組分而言，緩沖液具有約200毫摩爾(mM)或更少的離子濃度。pH可在從約pH 2. 5，約pH
3.0，約 pH 3. 5，約 pH 4. 0，約 pH 4. 5，約 pH 5，約 pH 5. 5，約 pH 6，約 pH 6. 5，約 pH 7，約 pH
7.5，約pH 8.0，到約pH 8. 5的范圍內(nèi)。通常，pH范圍會(huì)從約pH 3. 0到約pH 7。為了生產(chǎn)乙醇，優(yōu)選酸性介質(zhì)，例如PH = 4，而為了生產(chǎn)沼氣，期望中性pH例如pH = 7。在這些條件下孵育酶組合導(dǎo)致大量糖從木質(zhì)纖維素釋放或解離。大量表示可利用的糖的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多。多肽(例如酶)可以在微生物、酵母、真菌、細(xì)菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入例如木質(zhì)纖維素原料中?；蛘?，酶可以被生產(chǎn)但不分離，并且將粗制細(xì)胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米桿)等等可被加入例如原料中。或者，可以處理粗制細(xì)胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預(yù)防進(jìn)一步的微生物生長(zhǎng)(例如通過(guò)加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至例如原料中。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物。或者，酶可以在下述發(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵施用原料(例如玉米桿)對(duì)生產(chǎn)酶的生物提供營(yíng)養(yǎng)。通過(guò)這種方式，生產(chǎn)酶的植物自身可以發(fā)揮木質(zhì)纖維素原料的作用，并且被添加進(jìn)木質(zhì)纖維素原料中。糖的發(fā)酵可發(fā)酵的糖可以被轉(zhuǎn)化成有用的增值的(value-added)發(fā)酵產(chǎn)物，其非限制性例子包括氨基酸、維生素、藥物、動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑、特種化學(xué)品(specialty chemicals)、化學(xué)品原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機(jī)聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇。糖尤其可被用作用于原料，用于發(fā)酵成化學(xué)品、塑料、例如琥珀酸和(生物燃料)，包括乙醇、甲醇、丁醇合成液體燃料和沼氣。例如，在本發(fā)明的方法中，酶或酶的組合作用于發(fā)揮原料作用的木質(zhì)纖維素底物或植物生物質(zhì)上，從而將所述復(fù)合底物轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單的糖和寡糖，用于生產(chǎn)乙醇或其它有用的發(fā)酵產(chǎn)物。從生物量釋放的糖可被轉(zhuǎn)化成有用的發(fā)酵產(chǎn)物，例如包括但不限于，氨基酸、維生素、藥物、動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑、特種化學(xué)品，化學(xué)品原料，塑料，和乙醇，包括燃料乙醇。因此，本發(fā)明提供了用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括a.使用本文所述的方法降解木質(zhì)纖維素；以及b.對(duì)得到的材料進(jìn)行發(fā)酵；
由此制備發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵可在需氧或厭氧條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述方法在微需氧或氧受限的條件下進(jìn)行。厭氧發(fā)酵方法在本文中被定義為在不存在氧時(shí)運(yùn)行的，或者其中基本不消耗氧，優(yōu)選地消耗約5或更少、約2. 5或更少、或約lmmol/L/h或更少氧，并且其中有機(jī)分子既作為電子供體又作為電子受體的發(fā)酵方法。氧受限的發(fā)酵方法是其中氧消耗受到從氣體到液體的氧轉(zhuǎn)移限制的方法。氧限制程度由進(jìn)入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵設(shè)備的實(shí)際混合/物料轉(zhuǎn)移性質(zhì)決定。優(yōu)選地，在氧受限條件下進(jìn)行的方法中，氧消耗速率至少約5. 5，更優(yōu)選地至少約6，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約7mmol/L/h。用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法可任選地包括發(fā)酵產(chǎn)物的回收。
SSF發(fā)酵和糖化也可以按照同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)的模式進(jìn)行。這種模式的優(yōu)點(diǎn)之一是減少對(duì)酶促水解的糖抑制(對(duì)纖維素酶的糖抑制由Caminal B&B Vol XXVII Pp1282-1290 描述)。發(fā)酵產(chǎn)物可以根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑、特種化學(xué)品、化學(xué)原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機(jī)聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇(術(shù)語(yǔ)“乙醇”被理解為包括乙醇或乙醇和水的混合物)。可以通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的特定的增值產(chǎn)物包括但不限于生物燃料(包括乙醇和丁醇和沼氣)；乳酸；塑料；特種化學(xué)品；有機(jī)酸，包括檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸、衣康酸和順丁烯二酸；3_羥基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯；丙三醇；溶劑；動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑；藥物，如￠-內(nèi)酰胺抗生素或頭孢菌素；維生素；氨基酸，如賴氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，蘇氨酸和天冬氨酸；工業(yè)酶，如蛋白酶，纖維素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶；和化學(xué)原料。沼氣本發(fā)明還提供了本文所述的多肽或組合物在用于制備沼氣的方法中的用途。沼氣典型地表示由有機(jī)物質(zhì)(例如含有非淀粉碳水化合物的材料)在不存在氧時(shí)生物降解而生產(chǎn)的氣體。沼氣源自生物源材料，并且是一種生物燃料。一種沼氣由可生物降解的材料(例如生物質(zhì)、糞便或污水、市政廢棄物和能源作物)的厭氧消化或發(fā)酵生產(chǎn)。這種沼氣主要由甲烷和二氧化碳組成。氣體甲烷可以用氧燃燒或氧化。空氣含有21%的氧。該能量釋放允許沼氣被用作燃料。在許多國(guó)家中沼氣可被用作低成本燃料，用于任何加熱目的，例如烹飪。其也可以被用在現(xiàn)代廢棄物管理設(shè)備中，在那里其可以被用于運(yùn)行任何類型的熱引擎，從而產(chǎn)生機(jī)械力或電力。微生物沼氣生產(chǎn)的第一步由聚合物和復(fù)合底物(例如非淀粉碳水化合物)的酶促降解組成。因此，本發(fā)明提供了用于制備沼氣的方法，其中包含非淀粉碳水化合物的底物與本發(fā)明的多肽或組合物接觸，從而產(chǎn)生可發(fā)酵的材料，所述可發(fā)酵的材料可由生物(例如微生物)轉(zhuǎn)化成沼氣。在此類方法中，本發(fā)明的多肽可由生物提供，所述生物例如是表達(dá)此類多肽的微生物。
酶在食物制品中的用途本發(fā)明的多肽和組合物可在下述方法中使用，所述方法加工植物材料，從而降解或改性植物或真菌材料細(xì)胞壁的纖維素或半纖維素或果膠物質(zhì)組分。此類方法可用于制備食物制品。因此，本發(fā)明提供了制備食物制品的方法，所述方法包括在食物制品的制備期間摻入本發(fā)明的多肽或組合物。本發(fā)明還提供了加工植物材料的方法，所述方法包括將植物材料與本發(fā)明的多肽或組合物接觸，從而降解或改性(植物)材料中的纖維素。優(yōu)選地，植物材料是植物漿體或植物提取物，例如汁液。
植物和含有纖維素/半纖維素/果膠物質(zhì)的材料包括植物漿體、植物部分和植物提取物。在本發(fā)明的上下文中，來(lái)自植物材料的提取物是可通過(guò)提取(機(jī)械和/或化學(xué))、加工或其他分離技術(shù)源自植物材料的任何物質(zhì)。提取物可以是汁液、花蜜、堿或由其制成的濃縮物。植物材料可包含或源自蔬菜，例如胡蘿卜、芹菜、洋蔥、豆類或豆科植物(大豆、黃豆、豌豆)或水果，例如梨果或帶種子的水果(seed fruit)(蘋果、梨、柑橘等)、葡萄、西紅柿、柑橘(橙、檸檬、枸櫞、蜜桔)、甜瓜、洋李、櫻桃、黑醋栗、紅醋栗、覆盆子、草莓、蔓越莓、菠蘿和其他熱帶水果，樹及其部分(例如花粉，來(lái)自松樹)，或谷物(燕麥、大麥、小麥、玉米、水稻)。(要被水解的)材料也可以是農(nóng)業(yè)殘余物，例如甜菜漿、玉米芯(com cobs)、小麥秸、(粉碎的)堅(jiān)果殼，或可再生材料，例如(廢)紙。本發(fā)明的多肽因此可被用于處理植物材料，包括植物漿體和植物提取物。它們也可以被用于處理液體或固體食品或可食用的食品成分，或在植物油、淀粉的提取中使用，或被用作食物中的增稠劑。典型地，本發(fā)明的多肽被用作上文所述的組合物/酶制劑。所述組合物通常會(huì)被添加至可通過(guò)例如機(jī)械加工(如擠壓或研磨)植物材料獲得的植物漿體中。組合物與植物的孵育會(huì)典型地進(jìn)行從10分鐘到5小時(shí)、例如30分鐘到2小時(shí)、優(yōu)選地約I小時(shí)的時(shí)間。加工溫度優(yōu)選地從約10°C到約55°C，例如從約15°C到約25°C，任選地約20°C，每噸要處理的材料可以使用從約IOg到約300g，優(yōu)選地從約30g到約70g，任選地約50g的酶。使用的所有酶或它們的組合物可以被先后或同時(shí)添加至植物漿體中。根據(jù)酶制劑的組成，植物材料可首先被浸潰(例如至純凈)或液化。使用本發(fā)明的多肽，可以改進(jìn)加工參數(shù)，例如提取產(chǎn)率、提取物粘度和/或提取物品質(zhì)。或者，或除上文以外，本發(fā)明的多肽可以被添加至通過(guò)壓榨或液化植物漿體而獲得的粗制汁液中。在劑量、溫度和持續(xù)時(shí)間方面，粗制汁液的處理應(yīng)與植物漿體以類似的方式進(jìn)行。另外，可以包括其他酶，例如先前討論的酶。典型的孵育條件如前一段中所述。一旦用本發(fā)明的多肽孵育了粗制汁液，則隨后可以離心或過(guò)濾(超濾)汁液以生
產(chǎn)最終產(chǎn)物。用本發(fā)明的多肽處理后，可以對(duì)(終)產(chǎn)物進(jìn)行熱處理，例如在約100°C下進(jìn)行約I分鐘到約I小時(shí)，在使本發(fā)明多肽部分或完全失活的條件下進(jìn)行。含有本發(fā)明多肽的組合物也可以在水果泥或蔬菜泥的制備期間使用。在烘焙中，多肽可改善面團(tuán)結(jié)構(gòu)，修飾其粘性或柔韌性，改進(jìn)面包體積和/或碎屑結(jié)構(gòu)，或賦予更好的質(zhì)地特征，例如斷裂品質(zhì)、成條品質(zhì)或碎屑品質(zhì)。本發(fā)明因此涉及用于制備面團(tuán)或基于谷物的食物制品的方法，所述方法包括向面團(tuán)中摻入本發(fā)明的多肽或組合物。相對(duì)于其中未摻入多肽的面團(tuán)或基于谷物的食物制品而言，這可以改進(jìn)面團(tuán)或得自面團(tuán)的基于谷物的食物制品的一種或多種特性。根據(jù)本發(fā)明的基于谷物的食物制品的制備可包括本領(lǐng)域中已知的步驟，例如煮沸、干燥、油炸、蒸或烘焙獲得的面團(tuán)。由煮過(guò)的面團(tuán)制成的制品是例如煮過(guò)的面條、餃子，由炸過(guò)的面團(tuán)制成的制品是例如面包圈、beignets、油炸面條，由蒸過(guò)的面團(tuán)制成的制品是例如蒸慢頭和蒸面，由干燥的面團(tuán)制成的制品是意大利面和干面條，由烘焙的面團(tuán)制成的制品是面包、曲奇、蛋糕。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)改進(jìn)的特性”在本文中被定義為相對(duì)于其中未摻入根據(jù)本發(fā)明的多肽的面團(tuán)或制品而言，被根據(jù)本發(fā)明的多肽作用改進(jìn)的面團(tuán)和/或由面團(tuán)獲得的制品、尤其是基于谷物的食物制品的任何特性。經(jīng)改進(jìn)的特性可包括但不限于，提高的面團(tuán)強(qiáng)度，提高的面團(tuán)彈性，提高的面團(tuán)穩(wěn)定性，經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性，經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)醒發(fā)抗性，降低的面團(tuán)粘度，經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)延伸性，提高的基于谷物的食物制品體積，降低的基于谷物的食物制品發(fā)泡性，經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品碎屑結(jié)構(gòu)，經(jīng)改進(jìn)的基于谷物的食物制品的柔軟性，經(jīng)改進(jìn)的基于谷物的食物制品的風(fēng)味，經(jīng)改進(jìn)的基于谷物的食物制品的抗老化性(anti-staling)?！づc意大利面和面條類型的基于谷物的制品相關(guān)的經(jīng)改進(jìn)的特性是例如經(jīng)改進(jìn)的硬度，降低的粘度，經(jīng)改進(jìn)的凝聚性和降低的烹調(diào)損失。經(jīng)改進(jìn)的特性可通過(guò)添加或不添加本發(fā)明的多肽而制備的面團(tuán)和/或基于谷物的食物制品的比較來(lái)確定。感官品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中公認(rèn)的程序來(lái)評(píng)價(jià)，并且可包括使用例如受過(guò)訓(xùn)練的口味測(cè)試者小組。術(shù)語(yǔ)“面團(tuán)”在本文中被定義為足夠堅(jiān)硬到揉捏或滾動(dòng)的谷物粉和其他成分的混合物。谷物的例子是小麥、黑麥、玉米、玉蜀黍、大麥、水稻、米粒(groats)、蕎麥和燕麥。小麥在此處和下文中旨在包括Triticum屬的所有種,例如aestivum、durum和/或spelta。合適的其他成分的例子是根據(jù)本發(fā)明的P -葡糖苷酶多肽，額外的酶，化學(xué)添加劑和/或加工助劑。面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的、預(yù)制備的或預(yù)烘焙的。來(lái)自上述成分的面團(tuán)的制備是本領(lǐng)域公知的，并且包括將所述成分與加工助劑混合，和一個(gè)或多個(gè)塑型(moulding)和任選的發(fā)酵步驟。凍面團(tuán)的制備由Kulp andLorenz在Frozen and Refrigerated Doughsand Batters 中描述。術(shù)語(yǔ)“基于谷物的食物制品”在本文中被定義為由面團(tuán)制備的任何制品，無(wú)論具有軟的特征還是具有易碎的特征?？捎欣赝ㄟ^(guò)本發(fā)明生產(chǎn)的基于谷物的食物制品的例子(無(wú)論是白色、淺色或深色類型)是面包(尤其是白面包、仝麥面包或黑麥面包)，典型地是面包片或面包卷的形式，法棍型面包，意大利面，面條，面包圈，百吉餅，蛋糕，皮塔餅(pitabread),玉米餅(tortillas),墨西哥卷餅(tacos),蛋糕,煎餅,餅干，曲奇,派皮(piecrusts),蒸面包(steamed bread)和脆面包(crispbread)等等。術(shù)語(yǔ)“烘焙制品”在本文中被定義為通過(guò)烘焙面團(tuán)制備的任何基于谷物的食物制品。非淀粉多糖(NSP)能夠提高食糜(digesta)的粘度，這可進(jìn)而降低營(yíng)養(yǎng)可用度和動(dòng)物表現(xiàn)。本發(fā)明的￠-葡糖苷酶多肽的使用能夠提高磷利用，以及動(dòng)物食糜期間的陽(yáng)離子礦物質(zhì)和多肽。對(duì)飼料添加特定的養(yǎng)分會(huì)改進(jìn)動(dòng)物消化并從而降低飼料成本。目前正在使用大量飼料添加劑，并且持續(xù)開發(fā)出新的概念。使用特定的酶(例如非淀粉碳水化合物降解酶)能夠分解纖維，釋放能量，以及提高蛋白質(zhì)可消化性，因?yàn)槔w維分解時(shí)有更好的蛋白質(zhì)可達(dá)性。藉此，飼料成本能夠降低，并且飼料中的蛋白質(zhì)水平也能降低。非淀粉多糖(NSP)事實(shí)上也存在于植物來(lái)源的所有飼料成分中。NSP利用較差，并且在溶解時(shí)能夠顯示對(duì)消化的不良影響。外源酶能夠有助于更好地利用這些NSP，并因此降低任何抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)。本發(fā)明的非淀粉碳水化合物降解酶可在基于谷物的家禽膳食中被用于該目的，或者在更小的程度上用于豬和其他物種。本發(fā)明的非淀粉碳水化合物降解多肽/酶(包含本發(fā)明多肽/酶的組合物)可在洗滌劑工業(yè)中使用，例如用于從洗衣房中去除基于碳水化合物的污點(diǎn)。洗滌劑組合物可包含本發(fā)明的多肽/酶，另外包含一種或多種纖維素，半纖維素酶，果膠酶，蛋白酶，脂肪酶，角質(zhì)酶，淀粉酶或碳水化合物酶。 酶在洗滌劑組合物中的用途 包含本發(fā)明多肽或組合物的洗滌劑組合物可以是任何便利的形式，例如糊劑、凝膠、粉末或液體。液體洗滌劑可以是水性的，典型地含有最多約70%的水和從約0到約30%的有機(jī)溶劑或非水性材料。此類洗滌劑組合物可例如被配制為手洗洗滌劑組合物或機(jī)洗洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理臟污織物的洗衣添加組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物，或被配制成用于一般居家硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或被配制用于手洗或機(jī)洗的洗碗操作。通常，酶的特性應(yīng)當(dāng)與所選擇的洗滌劑相容(例如pH-最適度，與其他酶和/或非酶成分的相容性等等)，并且酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。洗滌劑組合物可包含表面活性劑，例如陰離子或非離子型表面活性劑，洗滌劑增量組分或復(fù)合劑，一種或多種聚合物，漂白系統(tǒng)(例如H2O2源)或酶穩(wěn)定劑。洗滌劑組合物也可包含任何其他常規(guī)的洗滌劑成分，例如護(hù)理劑包括粘土，泡沫加強(qiáng)劑，sud抑制劑，抗腐蝕劑，土壤懸浮劑，土壤再沉淀劑，染料，殺菌劑，光學(xué)增亮劑，助水溶物，晦暗抑制劑(tarnish inhibitor)或香料。酶在造紙和漿體加工中的用途本發(fā)明的多肽可用于造紙和制漿工業(yè)，尤其是漂白過(guò)程中，以增強(qiáng)被漂白的漿體的亮度，從而可以降低漂白階段中使用的氯，并且提高漿體在再循環(huán)造紙方法中的自由度(Eriksson, K. E. L. , Wood Science andTechnology 24(1990) :79-101 ；Paice, et al.,Biotechnol. and Bioeng. 32(1988) :235_239and Pommier et al.，Tappi Journal(1989)187-191)。另外，本發(fā)明的多肽或組合物可被用于處理木質(zhì)纖維素漿體，從而改進(jìn)其可漂白性。因此可以降低獲得令人滿意的漿體漂白所需要的氯量。本發(fā)明的多肽或組合物可被用于下述方法中，所述方法降低含纖維素的織物變得粗糙的速率，或降低含纖維素的織物的粗糙度，所述方法包括用上文所述的多肽或組合物處理含纖維素的織物。本發(fā)明還涉及為有色的含纖維素的織物提供色彩澄清的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或組合物處理有色的含有纖維素的織物，和在有色的含纖維素的織物中提供局部變化的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或組合物處理有色的含纖維素的織物。本發(fā)明的方法可以通過(guò)在洗滌期間處理含纖維素的織物來(lái)進(jìn)行。然而，需要時(shí)織物的處理也可以在浸泡或漂洗期間進(jìn)行，或簡(jiǎn)單地通過(guò)將上文所述的多肽或組合物添加至浸潰或要浸潰織物的水中來(lái)進(jìn)行。其他酶用途另外，本發(fā)明的多肽或組合物也可以被用于抗菌配制物中以及藥物制品例如潤(rùn)喉糖、牙膏和漱口水中。以下實(shí)施例闡述本發(fā)明
實(shí)施例材料和方法DNA 程序
除非另有說(shuō)明，如別處所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA程序(Sambrook et al. , 1989,Molecularcloning a laboratory manual,2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)。使用校正讀碼酶 Physion 聚合酶(Finnzymes)擴(kuò)增 DNA。限制性酶來(lái)自 Invitrogen 或 NewEngland Biolabs0纖維素酶樣品的制備源自Talaromyces emersonii 的纖維素酶在 Aspergillus niger 中表達(dá)。如W02004/030468所述產(chǎn)生酶的濃縮濾液。在對(duì)含有合適的表達(dá)質(zhì)粒的Aspergillus niger培養(yǎng)后，在4°C下在5000xg下通過(guò)對(duì)發(fā)酵液離心30分鐘，制備無(wú)細(xì)胞的上清液。任選的可用4N KOH將上清液調(diào)至pH = 5并且在2 (瓶頂)過(guò)濾器上用抽吸無(wú)菌過(guò)濾以去除任何真菌材料。而且，上清液可進(jìn)一步在GF/A Whatmann Glass微纖維過(guò)濾器(150mm 0 )上過(guò)濾以去除任何固體。將上清液超濾、濃縮并在4°C下存儲(chǔ)直至使用或在_20°C下冷凍。用于總蛋白測(cè)定的方法該方法是使用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白的組合，以去除干擾物質(zhì)并允許用雙縮脲比色反應(yīng)對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。在雙縮脲反應(yīng)中，銅(II)離子被還原為銅(I)，所述銅(I)離子在堿性溶液中與肽鍵的氮和碳形成復(fù)合物。紫色顏色表示存在蛋白。根據(jù)比爾-蘭伯特定律，顏色的強(qiáng)度與蛋白濃度成正比例，因而在546nm下的吸收與蛋白濃度成正比例。使用BSA(牛血清蛋白)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并且蛋白含量被表示為g蛋白(BSA當(dāng)量)/L或被表示為mg蛋白(BSA當(dāng)量)/ml。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方案計(jì)算蛋白含量，其通過(guò)繪制OD546對(duì)具有已知濃度的樣品的濃度的圖，隨后使用從校準(zhǔn)線產(chǎn)生的方程計(jì)算未知濃度樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于測(cè)定P -葡糖苷酶活性的方法使用在pH 4. 5的50mM乙酸鈉緩沖液中的I. 5mM濃度的對(duì)硝基苯基-P -葡糖苷，來(lái)測(cè)定3 -葡糖苷酶活性。在40°C下進(jìn)行孵育30分鐘。使用IM的碳酸氫鈉停止反應(yīng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，從在405nm下測(cè)定的消光和堿性條件下對(duì)硝基酚的摩爾消光系數(shù)來(lái)計(jì)算活性?；钚员硎緸槊糠昼娒縨l釋放的iimol pNP。用于P -葡糖苷酶活性測(cè)定的另一備選方法是用在50mM乙酸鈉緩沖液中的IOmM纖維二糖對(duì)酶進(jìn)行孵育。在40°C下30分鐘后，用氫氧化鈉停止反應(yīng)。將樣品超濾并使用有脈沖的安培檢測(cè)(Pulsed AmperometricDetection)的高效陰離子交換色譜(HPAEC-PAD)進(jìn)行分析。應(yīng)用在30°C下恒溫的CarboPac PA-20柱和以0. 5ml/min的流速的200mM NaOH,將葡萄糖和纖維二糖分離。3 -葡糖苷酶活性以每分鐘每ml釋放的ii mol葡萄糖表示。
洗滌的預(yù)處理的小麥秸底物的制備可如Linde, M.et al, Biomass and Bioenergy 32 (2008), 326-332 中所述并且可使用如 Schell,D. J. ,Applied Biochemistry and Biotechnology(2003) ,vol. 105-108,pp69-85中所述的裝置，獲得稀酸預(yù)處理的小麥秸。用水洗滌預(yù)處理的小麥秸直到具有小麥秸的溶液的PH為6.0或更高。濾出洗滌水。纖維素的延長(zhǎng)的水解以IOmL規(guī)模進(jìn)行酶組合物對(duì)在pH 4. 5的50mM乙酸鈉緩沖液中的2%洗滌的酸預(yù)處理的小麥秸(PWS)干物質(zhì)(dm)底物溶液的孵育。以相對(duì)于每克底物干物質(zhì)固定的蛋白劑量添加酶組合物。按時(shí)取樣，直到在65°C下孵育72小時(shí)。在給定的時(shí)間處終止反應(yīng)，隨后旋轉(zhuǎn)殘留物，吸取上清液并冷凍樣品直到分析。
使用流動(dòng)-NMR，進(jìn)行釋放的葡萄糖量的分析。在質(zhì)子頻率500MHz和探頭溫度27°C下操作的&'uker AVANCE II BEST NMR系統(tǒng)上記錄1HNMR光譜。實(shí)施例II. I.表汰質(zhì)粒的構(gòu)律使用EcoRI和SnaBI位點(diǎn)將SEQ ID NO 1的序列克隆到pGBTOP載體中(圖I)，其包含葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子和終止子序列。在轉(zhuǎn)化A.nigerCBS 513. 88之前通過(guò)NotI消化除去大腸桿菌(E. coli)部分。L 2. L niKer 的轉(zhuǎn)化A. niger WT-1 :該A. niger菌株是CBS 513. 88，其包含編碼葡萄糖淀粉酶(glaA)、真菌淀粉酶和酸性淀粉酶之基因的缺失。如EP 0 635 574B1所述用“MARKER-GENE FREE”法構(gòu)建 A. niger WT-1。根據(jù)Tilburn，J. et al. (1983) Gene 26，205-221 和 Kelly，J. & Hynes, M. (1985)EMBO J.，4，475-479所述方法，用表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染A. niger WT-I菌株，其中進(jìn)行以下修改-使孢子萌發(fā)并在30°C下在Aspergillus基本培養(yǎng)基(100ml)中在300rpm旋轉(zhuǎn)搖床中的搖瓶中培養(yǎng)16小時(shí)。Aspergillus基本培養(yǎng)基每升中含有6g NaNO3,0. 52g KCl, I. 52g KH2PO4,1. 12ml 4M K0H，0. 52gMgS04. 7H20，IOg 葡萄糖，Ig 酪蛋白氨基酸，22mg ZnSO4. 7H20,1 ImgH3BO3, 5mg FeSO4. 7H20,1. 7mg CoCl2. 6H20,1. 6mg CuSO4. 5H20,5mgMnCl2. 2H20,1. 5mg Na2MoO4. 2H20, 50mg EDTA, 2mg 核黃素，2mg 硫胺-HC1, 2mg 煙酰胺，Img批哆醇-HCL，0. 2mg泛酸，4g生物素，10ml青霉素(5000IU/ml)鏈霉素(5000UG/ml)溶液(Gibco)。-用Novozym234 (Novo Industries)代替螺旋酶來(lái)制備原生質(zhì)體；-形成原生質(zhì)體(60-90分鐘)后，加入KC緩沖液(0.8M KCl, 9. 5mM檸檬酸，pH
6.2)至終體積為45ml，將原生質(zhì)體懸液在吊桶式轉(zhuǎn)頭中在4°C下以3000rpm離心10分鐘。將原生質(zhì)體重懸于20ml KC緩沖液中，隨后加入25ml STC緩沖液(I. 2M山梨醇，IOmMTris-HCl pH 7. 5,50mM CaCl2)。將原生質(zhì)體懸液在吊桶式轉(zhuǎn)頭中在4°C下以3000rpm離心10分鐘，用STC緩沖液洗滌并以10E8原生質(zhì)體/ml的濃度重懸于STC緩沖液中；-向200毫升原生質(zhì)體懸液中，加入溶于IOmlTE緩沖液(IOmMTris-HCl pH 7. 5，
0.ImM EDTA)和 100ml PEG 溶液(20% PEG 4000 (Merck), 0. 8M 山梨醇，IOmM Tris-HCl pH
7.5,50mM CaCl2)中的 DNA 片段；
-將DNA-原生質(zhì)體懸液在室溫下孵育10分鐘后，緩慢加入I.5ml PEG溶液(60%PEG 4000 (Merck), IOmM Tris-HCl pH 7. 5，50mMCaCl2)，并將管反復(fù)混合。室溫孵育 20 分鐘后，用5ml I. 2M山梨醇稀釋懸液，顛倒混合并在室溫下以4000rpm離心10分鐘。將原生質(zhì)體輕柔地重懸于Iml I. 2M山梨醇中，并涂板到固體選擇再生培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基由不含核黃素、硫胺HCL、煙酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、酪蛋白氨基酸和葡萄糖的Aspergillus基本培養(yǎng)基組成。對(duì)于乙酰胺選擇的情況，培養(yǎng)基含有IOmM乙酰胺作為唯一氮源和IM蔗糖作為滲壓劑和碳源。或者，將原生質(zhì)體涂板到PDA(Potato Dextrose Agar, Oxoid)上，其中補(bǔ)充有l(wèi)-50ii g/ml腐草霉素和IM蔗糖作為滲壓劑。用2%瓊脂(瓊脂No. l,0xoid Lll)使再生平板固化。在30°C孵育6-10天后，將轉(zhuǎn)化體的分生孢子轉(zhuǎn)移至含有2%葡萄糖和1.5%瓊脂糖(Invitrogen)到Aspergillus選擇培養(yǎng)基(對(duì)于乙酰胺選擇的情況為含有乙酰胺作為唯一氮源的基本培養(yǎng)基，或者對(duì)于腐草霉素選擇的情況為補(bǔ)充1-50 ii g/ml腐草霉素至IJ PDA)并在30°C下孵育5-10天。分離單個(gè)轉(zhuǎn)化體，將這種選擇純化步驟重復(fù)一次，之后保存純化的轉(zhuǎn)化體。 轉(zhuǎn)化后，在含有乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體并純化集落。通過(guò)定量PCR估計(jì)拷貝數(shù)，并選擇低和高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化體。如EP635574所述，使用500ml帶擋板的搖瓶，在培養(yǎng)箱搖床中以34°C、170rpm將高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化體在搖瓶中培養(yǎng)在100ml CSM-MES培養(yǎng)基中。發(fā)酵3天和4天后，收獲上清液樣品以通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定表達(dá)。I. 3蛋白含量對(duì)表達(dá)0 -葡糖苷酶(TEMER06387)的轉(zhuǎn)化體的搖瓶發(fā)酵的超濾且濃縮的上清液，分析蛋白含量。蛋白含量被測(cè)定為4mg (作為BSA當(dāng)量)/ml。實(shí)施例22. I纖維素酶樣品的制備如針對(duì)TEMER06387的實(shí)施例I中所述的，分別制備都來(lái)自Talaromycesemersonii的纖維素酶增強(qiáng)蛋白——TEMER07589 (如在與本申請(qǐng)同日提交的共同待決專利申請(qǐng)DSM案號(hào)27666中所述的)和兩種外切葡聚糖酶——CBHII (如在與本申請(qǐng)同日提交的共同待決專利申請(qǐng)DSM案號(hào)27829中描述的)和在專利中請(qǐng)EP09158739. 4中描述的CBHI。測(cè)定這些樣品的蛋白含量，測(cè)得含量范圍從20mg至60mg蛋白(作為BSA當(dāng)量)/ml。另外，如上所述，還制備了 P -葡糖苷酶TEMER06387的最近的同源體之一，Sclerotiniasclerotiorum的3 -葡糖苷酶(XP_001591700 ；NCBI) 將該P(yáng) -葡糖苷酶表示為BG-SS。2. 24種酶混合物的延長(zhǎng)的水解以相對(duì)于混合物中總蛋白的9% TEMER06387,37% TEMER07589,30% CBHI 和 24%CBHII的相對(duì)量，將TEMER06387P-葡糖苷酶與3種其他水解纖維素的蛋白混合。也用BG-SS制備類似混合物，其中TEMER06387被BG-SS替代。在pH 4. 5和65°C下，將這些混合物在有2% DM預(yù)處理小麥秸的IOmL規(guī)模的延長(zhǎng)的水解中應(yīng)用。每一孵育中總蛋白劑量為每克預(yù)處理的小麥秸干物質(zhì)的15mg蛋白(BSA當(dāng)量)。孵育持續(xù)72小時(shí)并在若干時(shí)間間隔下取樣。將樣品旋轉(zhuǎn)，并將上清液冷凍直到通過(guò)NMR分析。葡萄糖和纖維二糖隨時(shí)間的釋放量在表I中示出。表I.通過(guò)含有相對(duì)于混合物的總蛋白的9%、30%、24%和37%的相對(duì)量的IBG (TEMER06387或BG-SS)、ICBHI、ICBHII、I纖維素酶增強(qiáng)蛋白的4種酶混合物，在pH 4. 5和65°C下對(duì)2% DM洗滌的預(yù)處理小麥秸孵育期間的葡萄糖和纖維二糖的釋放量，表示為mmol/L0
權(quán)利要求
1.多肽，其包含SEQID NO :2中示出的氨基酸序列或SEQ ID NO :1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或其變體多肽或變體多核苷酸，其中所述變體多肽與SEQ ID NO :2中示出的序列具有至少70%的序列同一性，或所述變體多核苷酸編碼與SEQ ID NO :2中示出的序列具有至少70%序列同一性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，其中所述多肽具有￠-葡糖苷酶活性。
3.多核苷酸，其包含 (a)SEQ ID NO :1中示出的核苷酸序列；或 (b)與是SEQID NO 1的反向互補(bǔ)體的多核苷酸選擇性雜交的核苷酸序列；或 (c)與SEQID NO : I的核苷酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；或 (d)長(zhǎng)度至少約100個(gè)核苷酸的(a)、(b)或(c)中定義的核苷酸序列的長(zhǎng)度至少約100個(gè)核苷酸的片段；或 (e)序列，其是作為遺傳編碼的結(jié)果的(a)、(b)、(c)或(d)任一中定義的序列的簡(jiǎn)并體；或 (f)核苷酸序列，其為(a)、(b)、(C)、(d)或(e)中任一項(xiàng)所定義的核苷酸序列的反向互補(bǔ)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，其為DNA序列。
6.包含根據(jù)權(quán)利要求3到5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建體，其中GC含量為56%或更多，58%或更多，或從58%至 65%。
8.載體,其中包括根據(jù)權(quán)利要求3到5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列。
9.細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求3到5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞選自由Aspergillus、Trichoderma/Hypocrea、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora^ Sporotrichum、Thielavia^ Chryosporium^Fusarium、Humicola、Neurospora 和 Talaromyces 屬構(gòu)成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是Aspergillusoryzae、Aspergillus so jae、Aspergillus nidulans 或 Aspergillus niger 的種。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)基因被完全或部分破壞、敲除或缺失，其中任選地所述基因編碼蛋白酶。
15.轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的核酸構(gòu)建體、根據(jù)權(quán)利要求8的載體或根據(jù)權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中任選地所述植物是玉米植物、高粱植物、番茄植物、小麥植物、油籽植物、油菜籽植物、大豆植物、大麥植物、草或煙草植物；或Anacardium、Arachis> ragus、Atropa、Avena、Brassica、Citrus、Citrullus、Capsicum、Carthamus、Cocos、Coffea、ferae、Cucumis、Cucurbita、Daucus、Elaeis、Fragaria、Glycine、Gossypium、Helianthus、Ocallis、Hordeum、Hyoscyamus> Lactuca、Linum、Lolium、Lupinus、Lycopersicon、Malus、Maj orana、Medicago、Nicotiana、Olea、Oryza、Panieum、Pannisetum、Persea、eolus、Pistachio、Pisum、Pyrus、Prunus、Raphanus、Ricinus、Secale、Senecio、Sinapis、Sorghum、Theobromus> Trigonella、Triticum、Vicia、Vitis、Vigna 或 Zea 屬的植物。
16.用于制備根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽的方法，所述多肽具有降解碳水化合物材料和/或水解碳水化合物的活性，所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9到14中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，以及任選地，回收所表達(dá)的多肽。
17.組合物，其包含⑴根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽；和(ii)纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶和/或?qū)儆贕H61家族的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述纖維素酶是纖維二糖水解酶、纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶11、內(nèi)切-P -I，4-葡聚糖酶、^ -葡糖苷酶或@ - (I，3) (I，4)-葡聚糖酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的組合物，其中所述半纖維素酶是內(nèi)切木聚糖酶、3 -木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙?；揪厶酋ッ?、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、a -半乳糖苷酶、3 -半乳糖苷酶、3 -甘露聚糖酶或3 -甘露糖苷酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述果膠酶是內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，P -半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ福瑑?nèi)切-果膠裂合酶，果膠酸裂合酶，a -鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ福罄畎肴樘侨┧峋厶前肴樘侨┧崴饷?，木半乳糖醛酸酶，a -阿拉伯呋喃糖苷酶或內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一項(xiàng)所述的組合物，其包含木質(zhì)酶、擴(kuò)展蛋白、擴(kuò)展蛋白樣多肽、膨脹因子或編碼纖維素整合蛋白或纖維素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的基因的多肽產(chǎn)物。
22.用于處理包含碳水化合物材料的底物、任選地處理植物材料的方法，所述方法包括使所述底物與根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽和/或根據(jù)權(quán)利要求17到21中任一項(xiàng)所述的組合物接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述底物是植物材料，所述植物材料以下述形式提供植物、植物漿體、植物提取物、食品或源于其的成分，或包含植物材料的織物、紡織品或衣物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22和/或權(quán)利要求23所述的方法，其中所述處理包括纖維素和/或半纖維素和/或果膠物質(zhì)的降解和/或改性。
25.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽和/或根據(jù)權(quán)利要求17到21中任一項(xiàng)所述的組合物用于從木質(zhì)-纖維素材料生產(chǎn)糖的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽，所述多肽包含SEQ ID NO2中示出的氨基酸序列或SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或其變體多肽或變體多核苷酸，其中變體多肽與SEQ ID NO2中示出的序列具有至少70％的序列同一性，或變體多核苷酸編碼與SEQ ID NO2中示出的序列具有至少70％序列同一性的多肽。本發(fā)明描述了新穎基因的全長(zhǎng)編碼序列以及全長(zhǎng)功能性多肽的氨基酸序列和所述基因或氨基酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及在工業(yè)方法中使用所述多肽的方法。本發(fā)明還包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的適用于生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N9/24GK102971338SQ201180032978
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者瑪格特·伊麗莎白·弗蘭克希斯·休恩瓦爾德-貝格曼斯, 威爾伯特·赫爾曼·馬里·海涅, 羅波圖斯·安東尼厄斯·戴維爾德, 芮妮·馬賽爾·德·鐘 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司