專(zhuān)利名稱(chēng)：使用雙重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和解鏈曲線分析對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria)的檢測(cè)。更具體而言,本發(fā)明涉及能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特異性核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的引物組、包含所述引物組的用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒、以及使用所述引物組通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR和解鏈曲線分析對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
非結(jié)核分枝桿菌廣泛分布于環(huán)境中，尤其是分布于濕土、沼澤地和河流中，并且在發(fā)現(xiàn)其機(jī)會(huì)致病特征(opportunistic character)前認(rèn)為其是非致病菌。在20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者中的肺病的機(jī)會(huì)致病菌。另夕卜，還已知所述細(xì)菌導(dǎo)致其他患者中的疾病。隨著對(duì)非結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制的報(bào)道，已逐漸認(rèn)識(shí)到其臨床意義。近年來(lái)，在結(jié)核病患病率低的美國(guó)和許多歐洲國(guó)家可見(jiàn)由非結(jié)核分枝桿菌引起的感染發(fā)病率的增高。韓國(guó)在結(jié)核病患病率方面已有所降低，但是在非結(jié)核分枝桿菌感染數(shù)方面相對(duì)增高。多虧韓國(guó)于2009年對(duì)進(jìn)行結(jié)核病菌液體培養(yǎng)給予醫(yī)療保險(xiǎn)的政策，設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行液體培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)目增多。比起固體培養(yǎng)，更常用液體培養(yǎng)來(lái)對(duì)非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)。報(bào)道顯示，當(dāng)通過(guò)液體培養(yǎng)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在約12%的痰涂片陽(yáng)性結(jié)核病病例中檢測(cè)到了非結(jié)核分枝桿菌，而分離自痰中的非結(jié)核分枝桿菌占日本、香港和韓國(guó)的肺病病例的約10 20%，占美國(guó)、加拿大和西歐的肺病病例的約40 50%。由非結(jié)核分枝桿菌引起的肺病類(lèi)似于結(jié)核病，發(fā)展緩慢，容易被誤診。然而，由于有效抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物不同于有效抑制非結(jié)核分枝桿菌的藥物，因此需要快速且準(zhǔn)確地分辨結(jié)核桿菌(tubercle bacilli)和非結(jié)核分枝桿菌，以便可以選擇合適的藥物。當(dāng)前所使用的檢測(cè)試劑并不僅是非結(jié)核分枝桿菌所固有的，而且還利用了結(jié)核分枝桿菌的核苷酸序列。傳統(tǒng)試劑在檢測(cè)和診斷的準(zhǔn)確度方面有問(wèn)題。例如，當(dāng)僅存在一定濃度的結(jié)核分枝桿菌時(shí)，所述試劑不對(duì)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的引物起反應(yīng)，而是僅對(duì)用于非結(jié)核分枝桿菌的引物起反應(yīng)，以致錯(cuò)誤地將非結(jié)核分枝桿菌鑒定為結(jié)核桿菌。另一方面，當(dāng)非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌同時(shí)存在時(shí)，只有非結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)傳統(tǒng)試劑加以檢測(cè)。因此，需要能夠識(shí)別在結(jié)核分枝桿菌中缺失、但在非結(jié)核分枝桿菌中固有的核苷酸序列的引物組，以及使用所述引物組快速且準(zhǔn)確地分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供對(duì)結(jié)核分枝桿菌所獨(dú)有的IS6110基因具有特異性的引物組，以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，二者分別適用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和診斷。本發(fā)明的另一目的是提供用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌所獨(dú)有的IS6110基因具有特異性的引物組以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，二者分別適用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和診斷。本發(fā)明的另一目的是提供用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和診斷的方法，所述方法使用基于所述引物組的雙重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及解鏈曲線。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物；選自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物；以及具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由`測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:4_6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物);將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID N0:21的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物)；將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物以及具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物由具有SEQID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物以及具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物);將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加 熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。有益效果如上所述，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的引物組(所述引物組能夠檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列)、使用所述引物組對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒和基于雙重實(shí)時(shí)PCR的方法。因?yàn)椴徊捎锰禺愋蕴结?，本發(fā)明的方法可成為用于低成本地對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的更高效的臨床診斷手段。


圖1為根據(jù)實(shí)施例1針對(duì)MTC進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖2為根據(jù)實(shí)施例1針對(duì)NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖3為根據(jù)實(shí)施例1針對(duì)MTC+NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖4為根據(jù)實(shí)施例2針對(duì)MTC進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖5為根據(jù)實(shí)施例2針對(duì)NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖6為根據(jù)實(shí)施例2針對(duì)MTC+NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖7為根據(jù)實(shí)施例3針對(duì)MTC進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。
圖8為根據(jù)實(shí)施例3針對(duì)NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。圖9為根據(jù)實(shí)施例3針對(duì)MTC+NTM進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR而獲得的擴(kuò)增子的解鏈曲線。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物。SEQ ID N03的核苷酸序列為非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA的特異性正向引物。SEQ ID NO: 3的核苷酸序列(5，-ggyrayctgccctgcac-3’)是指包含如下引物的引物組:5， -ggtaatctgccctgcac-3’ (SEQ ID N0:8)、5， -ggtaacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:9)>5，_ggcaatctgccctgcac _3， (SEQ ID NO:10)、5，-ggcaacctgccctgcac_3， (SEQ ID NO:11)、5，-ggtgatctgccctgcac_3’ (SEQ ID NO:12)、5，-ggtgacctgccctgcac_3， (SEQ ID NO:13)、5’ -ggcgatctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:14)和 5’ -ggcgacctgccctgcac-3’ (SEQ IDNO: 15)。例如，所述引物組可為將如下引物以約1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合的引物組5’ -ggtaatctgccctgcac-3J -ggtaacctgccctgcac-3> -ggcaatctgccctgcac-3> >5， -ggcaacctgccctgcac-3，、5， -ggtgatctgccctgcac-3，、5， -ggtgacctgccctgcac-3，、5，-ggcgatctgccctgcac-3J 和 5，-ggcgacctgccctgcac-3J SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6 的核苷酸序列(NTM-1)均為 16S rRNA的特異性反向引物。SEQ ID N0:7的核苷酸序列(NTM-2)也是非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性反向引物。非結(jié)核分枝桿菌16S rRNA基因的所有所述反向引物均被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)所有的目標(biāo)非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID NO:7 (5，-catcccacaccgctaccw-3’)的反向引物是指包含 5，-catcccacaccgctacct-3’ (SEQ ID NO: 16)和 5，_catcccacaccgctacca_3’(SEQ ID N0:17)的引物組。例如，SEQ ID NO:7的核苷酸序列可為以約1:1的比例將5’ -catcccacaccgctacct-3 和 5’ _catcccacaccgctacca_3’ 進(jìn)行混合的引物組。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物分別具有SEQ ID NO:1和SEQID N0:2的核苷酸序列的正向引物和反向引物。IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒包含對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列(NTM-1)所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列(NTM-2)的反向引物。非結(jié)核分枝桿菌16S rRNA基因的所述反向引物被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)非結(jié)核分枝桿菌種。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17。因此，在試劑盒中，SEQ ID N0:4的引物、5，-catcccacaccgctacct-3， (SEQ ID NO:16)和 5，_catcccacaccgctacca_3， (SEQ IDNO: 17)可按2:1:1的比例進(jìn)行混合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17。檢測(cè)試劑盒可進(jìn)一步包含通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。為了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，引物能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征基因進(jìn)行檢測(cè)，并可被設(shè)計(jì)使得能夠產(chǎn)生在解鏈溫度方面差異很大的PCR產(chǎn)物。因?yàn)镻CR產(chǎn)物的解鏈曲線因多種因素(包括DNA大小和GC比)而異，可在引物組的設(shè)計(jì)中兼顧這些因素。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可進(jìn)一步包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green,因?yàn)楫?dāng)以高濃度使用這種熒光染料時(shí)，它不僅抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還在產(chǎn)物解鏈的過(guò)程中重新分布，對(duì)高分辨 率解鏈曲線產(chǎn)生負(fù)面影響，所述高分辨率解鏈曲線可以幫助確定基因型。即，用于PCR和解鏈曲線分析的反應(yīng)混合物可包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解鏈曲線分析可使用含有EvaGreen的反應(yīng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，借助 Type-1t HRM PCR 試劑盒(QIAGEN Inc.，Germantown, MD, USA)完成實(shí)時(shí) PCR。這一試劑盒含有EvaGreen。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:4_6的核苷酸序列所組成的組中的至少一個(gè)反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物);將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)測(cè)量510nm處的吸光度進(jìn)行解鏈曲線的分析。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。SEQ ID N020的核苷酸序列為非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA的特異性正向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的所述正向引物被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID N0:20的核苷酸序列是指包含比例為約1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的如下引物的引物組5’ -catgtcttgtgggggaaagctt-3’ (SEQ ID N0:22)、5’ -catgttttgtgggggaaagctt-3’ (SEQ ID N0:23)、5’ -catgtcttctgggggaaagctt_3’(SEQ ID NO:2 4 ) λ 5 ^ -catgtcttgtggtggaaagctt-3，(SEQ ID N0:25)、5’ -catgtcttgtggggcaaagctt-3’ (SEQ ID N0:26)、5’ _catgttttctgggggaaagctt_3’(SEQ ID NO:2 7 ) λ 5 ^ -catgtcttctggtggaaagctt-3，(SEQ ID N0:28)、5’ -catgtcttgtggtgcaaagctt-3’ (SEQ ID N0:29)、5’ -catgttttgtggggcaaagctt_3’(SEQ ID NO:30)λ 5 ^ -catgtcttctggggcaaagctt-3，(SEQ ID N0:31)、5’ -catgttttgtggtggaaagctt-3’ (SEQ ID N0:32)、5’ -catgttttctggtggaaagctt_3’(SEQ ID NO:3 3 ) λ 5 ^ -catgttttctggggcaaagctt-3，(SEQ ID N0:34)、5’-catgttttgtggtgcaaagctt-3’ (SEQ ID NO:35)、5’-catgtcttctggtgcaaagctt_3’ (SEQID NO:36)和 5， -catgttttctggtgcaaagctt-3， (SEQ ID NO:37)。SEQ ID NO:21的核苷酸序列用作非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA的特異性反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID N0:21的核苷酸序列的反向引物。在用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的特異性引物組被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)，所述引物組包含如下引物`具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO: 19的核苷酸序列的反向引物。在用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性引物組被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)非結(jié)核分枝桿菌，所述引物組包含如下引物分別具有SEQ ID N0:20和SEQ ID NO:21的核苷酸序列的正向引物和反向引物。檢測(cè)試劑盒可進(jìn)一步包含通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。為了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，引物能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征基因進(jìn)行檢測(cè)，并可被設(shè)計(jì)使得能夠產(chǎn)生在解鏈溫度方面差異很大的PCR產(chǎn)物。因?yàn)镻CR產(chǎn)物的解鏈曲線因多種因素(包括DNA大小和GC比)而異，可在引物組的設(shè)計(jì)中兼顧這些因素。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可進(jìn)一步包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green,因?yàn)楫?dāng)以高濃度使用這種熒光染料時(shí)，它不僅抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還在產(chǎn)物解鏈的過(guò)程中重新分布，對(duì)高分辨率解鏈曲線產(chǎn)生負(fù)面影響，所述高分辨率解鏈曲線可以幫助確定基因型。即，用于PCR和解鏈曲線分析的反應(yīng)混合物可包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解鏈曲線分析可使用含有EvaGreen的反應(yīng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，借助 Type-1t HRM PCR 試劑盒(QIAGEN Inc.，Germantown, MD, USA)完成實(shí)時(shí) PCR。這一試劑盒含有EvaGreen。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ IDNO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的反向引物);將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。SEQ ID NO: 38 (NTM-1)、SEQ ID NO: 39 (NTM-2)和 SEQ ID NO: 40 (NTM-3)的核苷酸序列均為非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性正向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA的所述特異性正向引物被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種非結(jié)核分枝桿菌。所述正向引物可形成以約1:1的比例將5’ -tgtggtggaaagcttttgc-3’ (SEQ IDN0:41)和 5，-tttggtggaaagcttttgc-3，(SEQ ID NO:42)混合的引物組?；蛘?，所述正向引物可形成包含比例為約1:1的5’ -ggtgagtggtgcaaagctt-3’(SEQ ID N0:43)和 5’-ggtgtgtggtgcaaagctt-3’ (SEQ ID N0:44)的引物組。SEQ ID N0:21的核苷酸序列用作非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。在用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的特異性引物組被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO: 19的核苷酸序列的反向引物。在用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性引物組被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)各種目標(biāo)非結(jié)核分枝桿菌，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID NO: 38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及具有SEQID NO:21的核苷酸序列的反向引物。檢測(cè)試劑盒可進(jìn)一步包含通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。為了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒中，引物能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征基因進(jìn)行檢測(cè)，并可被設(shè)計(jì)使得能夠產(chǎn)生在解鏈溫度方面差異很大的PCR產(chǎn)物。因?yàn)镻CR產(chǎn)物的解鏈曲線因多種因素(包括DNA大小和GC比)而異，可在引物組的設(shè)計(jì)中兼顧這些因素。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒可進(jìn)一步包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green,因?yàn)楫?dāng)以高濃度使用這種熒光染料時(shí)，它不僅抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還在產(chǎn)物解鏈的過(guò)程中重新分布，對(duì)高分辨率解鏈曲線產(chǎn)生負(fù)面影響，所述高分辨率解鏈曲線可以幫助確定基因型。即，用于PCR和解鏈曲線分析的反應(yīng)混合物可包含熒光染料，如SYT09、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解鏈曲線分析可使用含有EvaGreen的反應(yīng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，借助 Type-1t HRM PCR 試劑盒(QIAGEN Inc.，Germantown, MD, USA)完成實(shí)時(shí) PCR。這一試劑盒含有EvaGreen。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ;通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物)和對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物由具有SEQID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物);將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。根據(jù)本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方式，可通過(guò)測(cè)量510nm處的吸光度進(jìn)行解鏈曲線的分析。實(shí)施例通過(guò)下述實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，而不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。參考例尋找結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列1.目標(biāo)和基因位點(diǎn)將下列分枝桿菌的16S核糖體RNA基因數(shù)據(jù)用于尋找結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列中膿腫分枝桿菌(M.abscessus) (AJ419970. UAJ416940. 1、AJ536038)、阿加普爾分枝桿菌(M. acapulcensis) (AF480575.1)、非洲分枝桿菌(M. africanum) (AF480605.1)、田野分枝桿菌(M. agri) (AJ429045.1)、愛(ài)知分枝桿菌(M. aichiense) (X55598.1)、河床分枝桿菌(M.alvei) (NR_024859.1)、亞洲分枝桿菌(M. asiaticum) (X55604.1)、金色分枝桿菌(M. aurum) (FJ172298.1)、南非分枝桿菌(M. austroafricanum) (GU121552.1)、鳥(niǎo)分枝桿菌(M.avium) (NR_025584. UAJ536037. UEF521892.1 )、波希米亞分枝桿菌(Μ· bohemicum)(NR_026054.1 )、波特尼分枝桿菌(M. botniense) (NR_028878.1 )、牛分枝桿菌(M. bovis)(GU142937.1)、布氏分枝桿菌(Μ· branderi) (AF480574.1)、霧分枝桿菌(Μ· brumae)(NR_025233.1)、隱藏分枝桿菌(M. celatum) (L08169.1)、龜分枝桿菌(M. chelonae)(AM884324.1、AJ419969.1)、千田分枝桿菌(M. chitae) (NR_029220.1)、氯酚分枝桿菌(M.chlorophenolicum) (NR_026173.1)、楚布分枝桿菌(M. chubuense) (X55596.1)、匯合分枝桿菌(M. confluentis) (AJ634379.1)、炫耀分枝桿菌(M. conspicuum) (X029298.1)、庫(kù)氏分枝桿菌(M. cookii) (X53896.1)、迪氏分枝桿菌(M. diernhoferi) (AF480599.1)、M. doricum (NR—025099.1)、杜氏分枝桿菌(M. duvalii) (NR—026073.1)、 M. engbaekii (AF480577.1)、詭詐分枝桿菌(M. fallax) (AF480600.1)、產(chǎn)鼻疽分枝桿菌 (M. farcinogenes) (X55592.1)、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌(M. flavescens) (AY734993.1)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum) (AY457066. UAF480580.1、⑶ 142933.1)、加地斯分枝桿菌(M. gadium) (NR—026087.1)、胃分枝桿菌(M. gastri) (GU142918.1)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(M. genavense) (NR—029223.1)、淺黃分枝桿菌(M. gilvum) (AB491971.1)、戈地分枝桿菌(M. goodii) (AY457079.1)、戈氏分枝桿菌(M. gordonae)(GU142923.1)、嗜血分枝桿菌(M. haemophilum) (V06638.1)、Μ· hassiacum (NR—026011.1)、海德堡分枝桿菌(Μ· heidelbergense) (NR—025268.1)、愛(ài)爾蘭分枝桿菌(M. hiberniae) (NR—026092.1)、霍德勤分枝桿菌 (M.hodleri) (NR—026286.1)、免疫原分枝桿菌(M.1mmunogen) (AJ011771.1)、居間分枝桿菌(M.1nterjectum) (X70961.1)、中間分枝桿菌(M.1ntermedium) (X67847.1)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.1ntracellulare) (AY652958. UAJ536036. 1、Χ52927· 1、M61684.1)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii) (M29575.1、X15916.1)、緩黃分枝桿菌(M. lentiflavum) (AF480583.1)、 M. mageritense (AY457076.1)、瑪爾摩分枝桿菌(M. malmoense) (GQ153278.1)、海分枝桿菌(M.marinum) (AF456238.1、AY513243.1)、田鼠分枝桿菌(M. microti) (NR—025234.1)、 M. monacense (GU142931.1)、莫里奧卡分枝桿菌(Μ· moriokaense) (AY859686.1)、 產(chǎn)粘液分枝桿菌(M. mucogenicum) (AF480585.1)、新金色分枝桿菌(M. neoaurum) (FJ172306.1 )、不產(chǎn)色分枝桿菌(M. nonchromogenicum) (DQ058406.1 )、奧布分枝桿菌 (M. obuense) (X55597.1)、石錯(cuò)分枝桿菌(M. paraffinicum) (GQl53282.1)、副偶然分枝桿菌(M. parafortuitum) (NR—026285.1)、外來(lái)分枝桿菌(M. peregrinum) (AY457069.1)、 草分枝桿菌(M. phlei) (AF480603.1)、豬分枝桿菌(M. porcinum) (AY457077.1)、海綿分枝桿菌(M. poriferae) (NR—025235.1)、灰塵分枝桿菌(M. pulveris) (NR—025528.1)、 羅得西亞分枝桿菌(M. rhodesiae) (NR—025529.1 )、療病分枝桿菌(M. scrofulaceum) (GQ153271. 1)、M. senuense (DQ536409.1)、膿毒性分枝桿菌(M. septicum) (AY457070.1)、 施氏分枝桿菌(M. shimoidei) (X82459.1)、猿分枝桿菌(M. simiae) (GQ153280.1)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis) (NR—025311.1)、泥炭蘇分枝桿菌(M. sphagni) (X55590.1)、蘇加分枝桿菌(M. szulgai) (X52926.1)、地分枝桿菌(M. terrae) (NR—029168.1)、耐熱分枝桿菌(M. thermoresistibile) (GU142928.1)、M. tilburgii (AJ580826.1)、三重分枝桿菌 (M. triplex) (GQ153279.1)、次要分枝桿菌(M. triviale) (DQ058405.1)、結(jié)核分枝桿菌 (M. tuberculosis)(⑶ 142936.1、⑶ 142935. UAY53603. UX55588. UX52917.1)、托斯卡分枝桿菌(M. tusciae) (NR—024903.1)、潰痕分枝桿菌(M. ulcerans) (Z13990.1)、母牛分枝桿菌(M. vaccae) (X55601.1)、沃林斯基分枝桿菌(M. wolinskyi) (AY457083.1)和膽分枝桿菌(M.xen0pi) (X52929.1)。從NCBI (美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得16S核糖體RNA基因的數(shù)據(jù)。
通過(guò)Sequencher4. 9對(duì)分枝桿菌種的16S rRNA基因序列的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到特征核苷酸序列，即，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特征核苷酸以及在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中缺失、 但在非結(jié)核分枝桿菌中固有的核苷酸。
實(shí)施例1 :結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌I的分離和檢測(cè)
1.檢測(cè)目標(biāo)和引物設(shè)計(jì)
待通過(guò)PCR和解鏈曲線分析進(jìn)行檢測(cè)的目標(biāo)基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)的IS6110基因和非結(jié)核分枝桿菌的 16S rRNA基因。將通用引物用作正向引物來(lái)擴(kuò)增分枝桿菌的16S rRNA基因。將非結(jié)核分枝桿菌特征性的NTM-1和NTM-2用作反向引物。使用Primerf程序設(shè)計(jì)用于目標(biāo)基因檢測(cè)的這些引物。
(I)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)
I)目標(biāo)基因IS6110
2)引物
a.正向引物5，-cgaactcaaggagcacatca-3，(SEQ ID NO:1)
b.反向引物5，-agtttggtcatcagccgttc-3，(SEQ ID NO:2)
3) PCR 產(chǎn)物大小135bp
4) PCR產(chǎn)物的平均解鏈溫度(Tm):約86. 18±0· 16°C (各批次的Tm稍有不同)
(2)非結(jié)核分枝桿菌(NTM)
I)目標(biāo)基因16S rRNA
2)引物
a.正向引物5，-ggyrayctgccctgcac-3，(SEQ ID NO:3)
b.反向引物
NTM-1 :5，_cccacaccgcaaaagctt_3’ (SEQ ID NO:4)、5，-cccacaccgcaaaagct-3， (SEQ ID NO:5)或 5，-tcccacaccgcaaaagct-3，(SEQ ID NO:6)
NTM-2 :5，-catcccacaccgctaccw-3’ (SEQ ID NO:7)
3) PCR 產(chǎn)物大小104bp
4) PCR產(chǎn)物的平均解鏈溫度(Tm):約80. 10°C -82. 10°C (Tm因非結(jié)核分枝桿菌種的不同而不同，但是均在約80°C _82°C的范圍內(nèi))。
〈實(shí)施例1-1.將SEQID NO:4的核苷酸序列用作對(duì)NTM進(jìn)行檢測(cè)的反向引物 NTM-1的雙重實(shí)時(shí)PCR和解鏈曲線分析>
(I)DNA 的分離
DNA分離自186個(gè)分枝桿菌種和78個(gè)非結(jié)核分枝桿菌種(均為在臨床受試者中鑒定的)，以及7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)ATCC分枝桿菌種(包括結(jié)核分枝桿菌(ATCC 25177)、胞內(nèi)分枝桿菌 (ATCC 13950)、瘰癘分枝桿菌(ATCC19981)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC 12478)、偶發(fā)分枝桿菌 (ATCC 6841)、膿腫分枝桿菌(ATCC 19977)和鳥(niǎo)分枝桿菌(ATCC 25291))。
將在臨床受試者中鑒定的種(包括186個(gè)分枝桿菌種和78個(gè)非結(jié)核分枝桿菌種) 在液體培養(yǎng)基(MGIT分枝桿菌培養(yǎng)基)或固體培養(yǎng)基(Ogawa培養(yǎng)基)中進(jìn)行檢測(cè)，或者直接從痰樣本中分離。將ATCC標(biāo)準(zhǔn)種在肉湯中培養(yǎng)。
依照如下方式，從在肉湯中培養(yǎng)的分枝桿菌中分離DNA。向1. 5mL管中移入500 μ L 培養(yǎng)有分枝桿菌的MGIT肉湯，并以14，OOOrpm離心5min。去除上清液，將沉淀溶于300 μ L 無(wú)菌蒸餾水中，并在沸水浴中加熱lOmin。在以14，OOOrpm離心5min后，將上清液用作PCR 中的模板。
依照如下方式，從在瓊脂平板上培養(yǎng)的分枝桿菌中分離DNA。用白金環(huán)(platinum loop)從瓊脂平板上取樣并溶于1. 5mL管中的500 μ L無(wú)菌蒸餾水中，并在沸水浴中加熱 IOmin0接著以14, OOOrpm離心5min。將上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式處理痰樣本。向15mL管或50mL管中的痰中加入I體積的IN NaOH, 然后靜置IOmin以使痰液化。接著以14，OOOrpm離心2min后，在ImL無(wú)菌蒸餾水中將沉淀充分混勻10秒。再次將混合物以14，OOOrpm離心2min，并在ImL無(wú)菌蒸餾水中將沉淀充分混勻10秒。以14, OOOrpm離心2min,并將沉淀與100 μ L的5%chelex樹(shù)脂(BioRad, USA) 和I μ L的10mg/mL蛋白酶K充分混勻。在56°C靜置15min后，將混合物在沸水浴中加熱 IOmin0以14，OOOrpm離心5min后,取上清液用作PCR中的模板。
(2)雙重PCR和解鏈曲線分析
使用Type-1t HRM PCR 試劑盒(QIAGEN Inc. , Germantown, MD, USA)在 Rotor-Gene6000 (QIAGEN Inc.，Germantown, MD, USA)上進(jìn)行，雙重實(shí)時(shí) PCR 從在約 95°C 下變性5min開(kāi)始；再以如下條件運(yùn)行40個(gè)循環(huán)在約95°C下變性10秒，在60°C下退火30 秒并延伸。這一試劑盒含有熒光染料EvaGreen。PCR完成后，在以0. 2°C /秒的升溫速度將PCR產(chǎn)物從約77°C加熱至約91. 5°C的同時(shí)，通過(guò)測(cè)量510nm處的吸光度進(jìn)行解鏈曲線分析。因?yàn)镻CR取決于各種因素(包括引物的濃度以及退火和延伸步驟的溫度和時(shí)間)，綜合考慮所述因素來(lái)確定對(duì)兩種目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)的最優(yōu)PCR條件。下表I總結(jié)了所述雙重實(shí)時(shí)PCR的組成。
在引物混合物中，以相同的量(lOpmole/μ L)包含正向引物和反向引物。因此，對(duì)于MTC，1. 75 μ L引物混合物包含含量各自為17. 5pmole的正向引物和反向引物。由于PCR 混合物的總體積為25 μ L，所以其以0. 7 μ Μ(17· 5pmole/25 μ L)的濃度含有引物。對(duì)于NTM， 正向引物和反向引物各自的含量為10 111016/11^，終濃度為0.411厘(10 111016/251^)。在這一背景下，NTM正向引物為如下引物的組5’-ggtaatctgccctgcac-3’ (SEQ ID N0:8)、 5，-ggtaacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:9)、5，-ggcaatctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:10)、 5，_ggcaacctgccctgcac_3， (SEQ ID NO:ll)、5，_ggtgatctgccctgcac_3， (SEQ ID NO:12)、 5，-ggtgacctgccctgcac_3，(SEQ ID NO:13)、5，-ggcgatctgccctgcac_3，(SEQ ID NO:14)和 5，-ggcgacctgccctgcac-3，(SEQ ID NO: 15)。在所述引物組中，SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO:10,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO: 15 的引物以約1:1:1:1:1:1:1:1的比例使用。即，所述引物組含有含量各自為1. 25pmole的如下引物SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13, SEQ ID N0:14 和 SEQ ID N0:15。另一方面，當(dāng) NTM-2 反向引物由 5pmole 的 5’ -catcccacaccgctacct-3> (SEQ ID NO:16)和 5pmole 的 5’ -catcccacaccgctacca-3J (SEQ ID NO: 17)組成時(shí)， NTM-1 反向引物(SEQ ID N0:4)和 NTM-2 反向引物(SEQ ID N0:7) 各自以lOpmole的量使用。
表I
權(quán)利要求
1.一種對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物 具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物； 選自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少ー個(gè)反向引物；以及 具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。
2.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含 對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的反向引物；以及 對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:4_6的核苷酸序列所組成的組中的至少ー個(gè)反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。
3.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含 由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ； 通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所組成的組中的至少ー個(gè)反向引物和具有SEQID NO:7的核苷酸序列的反向引物； 將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及 對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。
4.一種對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列的反向引物。
5.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含 對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及 對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
6.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含 由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ； 通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物；將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及 對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。
7.一種對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物 由具有SEQ ID NO :38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及 具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
8.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含 對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及 對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID NO: 38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物；以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
9.用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包含 由測(cè)試對(duì)象中分離DNA ； 通過(guò)雙重實(shí)時(shí)PCR使用如下引物組對(duì)所述DNA進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的反向引物；以及對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物由具有SEQ ID N0:38-40的核苷酸序列的各引物組成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物； 將所擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物加熱至不同溫度，以產(chǎn)生解鏈曲線；以及 對(duì)所述解鏈曲線進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)DNA的解鏈溫度。
全文摘要
本發(fā)明提供了對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的引物，所述引物分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性的IS6110基因和非結(jié)核分枝桿菌特異性的16S rRNA基因具有特異性；包含所述引物的結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒；以及通過(guò)使用所述引物的雙重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和通過(guò)解鏈曲線分析檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的方法。因?yàn)楸景l(fā)明不使用序列特異性探針，本發(fā)明可提供低成本地對(duì)結(jié)核分枝桿菌和/或非結(jié)核分枝桿菌同時(shí)且更有效地進(jìn)行快速檢測(cè)的臨床診斷手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103038347SQ201180036722
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者金廷昱 申請(qǐng)人:蔚山大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)