專利名稱：通過使用雙重實時聚合酶鏈式反應(yīng)對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria)的檢測。更具體而言,本發(fā)明涉及能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特異性核苷酸序列進行檢測的引物組和/或探針、包含所述引物組和/或探針的用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒、以及使用所述引物組和/或探針通過雙重實時PCR對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌同時進行檢測的方法。
背景技術(shù)：
非結(jié)核分枝桿菌廣泛分布于環(huán)境中，尤其是分布于濕土、沼澤地和河流中，并且在發(fā)現(xiàn)其機會致病特征(opportunistic character)前認為其是非致病菌。在20世紀80年代，發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者中的肺病的機會致病菌。另外，還已知所述細菌導(dǎo)致其他患者中的疾病。隨著對非結(jié)核分枝桿菌致病機制的報道，已逐漸認識到其臨床意義。近年來，在結(jié)核病患病率低的美國和許多歐洲國家可見由非結(jié)核分枝桿菌引起的感染發(fā)病率的增高。韓國在結(jié)核病患病率方面已有所降低，但是在非結(jié)核分枝桿菌感染數(shù)方面相對增高。多虧韓國于2009年對進行結(jié)核病菌液體培養(yǎng)給予醫(yī)療保險的政策，設(shè)計用來進行液體培養(yǎng)的實驗室數(shù)目增多。比起固體培養(yǎng)，更常用液體培養(yǎng)來對非結(jié)核分枝桿菌進行檢測。報道顯示，當通過液體培養(yǎng)進行測定 時，在約12%的痰涂片陽性結(jié)核病病例中檢測到了非結(jié)核分枝桿菌，而分離自痰中的非結(jié)核分枝桿菌占日本、香港和韓國的肺病病例的約10 20%，占美國、加拿大和西歐的肺病病例的約40 50%。由非結(jié)核分枝桿菌引起的肺病類似于結(jié)核病，發(fā)展緩慢，容易被誤診。然而，由于有效抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物不同于有效抑制非結(jié)核分枝桿菌的藥物，因此需要快速且準確地分辨結(jié)核桿菌(tubercle bacilli)和非結(jié)核分枝桿菌，以便可以選擇合適的藥物。當前所使用的檢測試劑并不僅是非結(jié)核分枝桿菌所固有的，而且還利用了結(jié)核分枝桿菌的核苷酸序列。傳統(tǒng)試劑在檢測和診斷的準確度方面有問題。例如，當僅存在一定濃度的結(jié)核分枝桿菌時，所述試劑不對用于檢測結(jié)核分枝桿菌的引物起反應(yīng)，而是僅對用于非結(jié)核分枝桿菌的引物起反應(yīng)，以致錯誤地將非結(jié)核分枝桿菌鑒定為結(jié)核桿菌。另一方面，當非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌同時存在時，只有非結(jié)核分枝桿菌可通過傳統(tǒng)試劑加以檢測。因此，需要能夠識別在結(jié)核分枝桿菌中缺失、但在非結(jié)核分枝桿菌中固有的核苷酸序列的引物組和/或探針，以及使用所述引物組和/或探針快速且準確地分別對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供對結(jié)核分枝桿菌所獨有的IS6110基因具有特異性的引物組，以及對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，二者分別適用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行準確檢測和診斷。本發(fā)明的另一目的是提供用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行準確檢測和診斷的探針，所述探針分別對結(jié)核分枝桿菌特異性的IS6110基因或16S rRNA基因以及非結(jié)核分枝桿菌特異性的16S rRNA基因進行選擇性檢測。本發(fā)明的另一目的是提供用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含所述引物組和/或探針。本發(fā)明的另一目的是提供用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行準確檢測和診斷的方法，所述方法使用基于所述引物和/或探針的雙重實時聚合酶鏈式反應(yīng)。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO :9的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO :3的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQID NO :5-7的核苷酸序列所組成的`組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 9的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO3的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 9的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ IDNO :22的核苷酸序列的正向引物；選自于由SEQ ID NO :5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物；以及具有SEQ IDNO 8的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 23的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物和具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 23的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDN021的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO :23的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO :26的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方 面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO :25的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:26的核苷酸序列；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID N0:27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :25的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(包含如下探針具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針);以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N021的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ IDNO 61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQID NO 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 8的核苷酸序列的引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N061的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ ID NO :5的核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO 8的核苷酸序列的引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 63的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDN0:21或SEQ ID NO :60的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ ID NO 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 8的核苷酸序列的引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 62或SEQ ID N0:63的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID NO 65的核苷酸序列的引物、具有SEQID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :67的核苷酸序列的引物；以及包含SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21或SEQ ID NO :64的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ IDNO :65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO : 39或SEQ ID NO:68的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物)、用 于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21或SEQ ID NO 64的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID N0:65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID N0:39或SEQ ID NO :68的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 75的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO :27的核苷酸序列的探針和具有SEQ IDNO 76的核苷酸序列的探針。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 59的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 60的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 75的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(包含如下探針具有SEQ ID NO :27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO :76的核苷酸序列的探針)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。有益效果如上所述，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的引物組和/或探針(所述引物組和/或探針能夠檢測結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列)、檢測試劑盒以及使用所述引物組和/或探針或所述試劑盒對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的基于雙重實時PCR的方法。由于所述引物和/或探針對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌來說是獨有的，本發(fā)明的方法可在臨床上應(yīng)用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌同時進行高效檢測。


圖1和圖2為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖3和圖4為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖5和圖6為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖7和圖8為分別繪制了黃色通道和綠色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖9和圖10為分別繪制了黃色通道和綠色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖11和圖12為分別繪制了黃色通道和綠色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖13和圖14為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖15和圖16為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖17和圖18為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。 圖19和圖20為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖21和圖22為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖23和圖24為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖25和圖26為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖27和圖28為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖29和圖30為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖31和圖32為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖33和圖34為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖35和圖36為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖37和圖38為分別 繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖39和圖40為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。圖41和圖42為分別繪制了綠色通道和黃色通道中的熒光強度的圖，所述熒光強度與MTC+NTM的實時PCR的循環(huán)數(shù)相對應(yīng)。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 9的核苷酸序列。在一個實施方式中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6_TAMRA、BHQ-1, 2, 3 和 MGBNFQ (結(jié)合分子溝槽的非突光淬滅劑(molecular grove bindingnon-fluorescence quencher))。為了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，具有SEQID NO 9的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物、選自于由具有SEQ ID NO :5的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :7的核苷酸序列的引物所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQID NO 8的核苷酸序列的反向引物。為此，本發(fā)明設(shè)想出了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ IDNO 3的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQIDNO 9的核苷酸序列。所述檢測試劑盒可進一步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 9的核苷酸序列)和用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO3的核苷酸序列)可用不同的可檢測工具進行標記。這種可檢測工具是指可綴合、連接或附加至探針以提供可定量的指標(如密度、濃度、數(shù)量等)的化合物、生物分子或仿生材料(biomimetics)。可檢測的工具的實例包括突光標記物、發(fā)光材料(Iuminescents)、生物發(fā)光材料(bioluminescents)和放射性同位素，但是不限于此。必須計入考慮的是當將熒光標記物在PCR反應(yīng)中一起使用時，是否能分別檢測出所述熒光標記物，因為如果熒光標記物的激發(fā)波長和發(fā)射波長根據(jù)其類型而不同，則所述熒光標記物的用法也不同。如果兩個或多個熒光標記物一起使用，其顏色可不同。熒光標記物的詳細信息和選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物分別具有SEQ ID NO 1和SEQID NO 2的核苷酸序列的正向引物和反向引物。IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 9的核苷酸序列)可為Taqman探針。 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 3的核苷酸序列)對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含包含如下引物分別具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列的正向引物和反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性。SEQ ID NO :4 (5，-ggyrayctgccctgcac-3’)的引物可為包含如下引物的引物組5’ -ggtaatctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO :12)、5，-ggtaacctgccctgcac-3’ (SEQ IDNO :13)、5，-ggcaatctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO :14)、5，-ggcaacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO :15)、5，-ggtgatctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:16)、5，-ggtgacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO :17)、5，-ggcgatctgccctgcac-3’ (SEQIDNO 18)和 5’ -ggcgacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO :19)。例如，所述引物組為以約1:1 :1 :1 :1 :1 :1 :1的比例將如下引物進行混合的引物組5， -ggtaatctgccctgcac-3，、5， -ggtaacctgccctgcac-3，、5， -ggcaatctgccctgcac-3，、5， -ggcaacctgccctgcac-3，、5， -ggtgatctgccctgcac-3，、5， -ggtgacctgccctgcac-3，、5，-ggcgatctgccctgcac-3 和 5，-ggcgacctgccctgcac-3 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7 的核苷酸序列(NTM-1)均為 16S rRNA的特異性反向引物。SEQ ID NO 8的核苷酸序列(NTM-2)為非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性反向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的所有反向引物均被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID NO :8 (5’-catcccacaccgctaccw_3，)的反向引物是指包含 5，-catcccacaccgctacct-3，(SEQ ID NO 10)和 5，-catcccacaccgctacca-3，(SEQID NO 11)的引物組。例如，SEQ ID NO :8的核苷酸序列可為以約1:1的比例將5’ -catcccacaccgctacct-3 和 5’ -catcccacaccgctacca-3 進行混合的引物組。在本發(fā)明的另一實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED, RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。例如，當用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端可用FAM標記、3’端可用MGBNFQ標記時，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端可用VIC標記、3’端可用MGBNFQ標記。在一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 8的核苷酸序列的反向引物，后者以I I的比例包含SEQ ID NO: 10和SEQ IDNO : 11。因此，在所述試劑盒中，可按2 I I的比例將 SEQ ID NO 5 的引物、5，_catcccacaccgctacct_3，和 5J-catcccacaccgctacca-3 進行混合。在本發(fā)明的另一實施方`式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO :6和SEQ IDNO :8的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO 10和SEQ ID NO :11。在本發(fā)明的另一實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO :7和SEQ IDNO :8的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO 10和SEQ ID NO :11。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO3的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物(NTM-1)以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物(NTM-2))、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 9的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ IDNO :22的核苷酸序列的正向引物；選自于由SEQ ID NO :5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物；以及具有SEQ IDNO 8的核苷酸序列的反向引物。具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性。SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7 的核苷酸序列(NTM-1)均為 16SrRNA的特異性反向引物。SEQ ID NO :8的核苷酸序列(NTM-2)為非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因的特異性反向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的所有反向引物均被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID NO :8 (5，-catcccacaccgctaccw-3’)的反向引物是指以例如約1:1的比例包含5’ -catcccacaccgctacct-3’ (SEQ IDNO :10)和5，-catcccacaccgctacca-3’ (SEQ ID NO 11)的引物組。此外，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，設(shè)想了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 23的核苷酸序列。在一個實施方式中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX, RED610、TEXAS RED、RED670 和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1，2，3 和 MGBNFQ。用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 23的核苷酸序列)對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物、選自于由具有SEQ ID NO :5的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :7的核苷酸序列的引物所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ IDNO 8的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N021的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物和具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 23的核苷酸序列。所述檢測試劑盒可進一步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針 (具有SEQID NO 23的核苷酸序列)和用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列)可用不同的可檢測工具進行標記。這種可檢測工具是指可綴合、連接或附加至探針以提供可定量的指標(如密度、濃度、數(shù)量等)的化合物、生物分子或仿生材料?？蓹z測工具的實例包括熒光標記物、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性同位素，但是不限于此。必須計入考慮的是當將熒光標記物在PCR反應(yīng)中一起使用時，是否能分別檢測出所述熒光標記物，因為如果熒光標記物的激發(fā)波長和發(fā)射波長根據(jù)其類型而不同，則所述熒光標記物的用法也不同。如果兩個或多個熒光標記物一起使用，其顏色可不同。熒光標記物的詳細信息和選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物分別具有SEQ ID NO 1和SEQID NO 20的核苷酸序列的正向引物和反向引物。結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 23的核苷酸序列)可為Taqman探針。用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21的核苷酸序列)對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行PCR所得到的，所述引物組包含包含如下引物分別具有SEQID NO 1和SEQ ID NO 20的核苷酸序列的正向引物和反向引物。SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7 的核苷酸序列(NTM-1)均為 16S rRNA的特異性反向引物。SEQ ID NO 8的核苷酸序列(NTM-2)為非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的特異性反向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的所有反向引物均被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID NO :8 (5’-catcccacaccgctaccw-3’)的反向引物是指包含 5，-catcccacacc gctacct-3J (SEQ ID NO 10)和 5，-catcccacaccgctacca-3J (SEQID N011)的引物組。例如，SEQ ID NO :8的核苷酸序列可為以約1:1的比例將5’ -catcccacaccgctacct-3 和 5’ -catcccacaccgctacca-3 進行混合的引物組。在本發(fā)明的另一實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED, RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-了41狀、8即-1，2，3和1 ^即0。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。例如，當用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端可用FAM標記、3’端可用BHQ-1標記時，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端可用HEX標記、3’端可用BHQ-1標記。在一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 8的核苷酸序列的反向引物，后者以I I的比例包含SEQ ID NO: 10和SEQ IDNO : 11。因此，在所述試劑盒中，可按2 I I的比例將 SEQ ID NO 5 的引物、5，_catcccacaccgctacct_3，和 5J-catcccacaccgctacca-3 進行混合。在本發(fā)明的另一實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO :6和SEQ IDNO :8的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO 10和SEQ ID NO :11。
在本發(fā)明的另一實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO :7和SEQ IDNO :8的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO 10和SEQ ID NO :11。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO :5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID NO :8的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO :23的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，在所述探針的5 ’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、T ET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1，2，3 和 MGBNFQ。為了用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，具有SEQ IDNO 26的核苷酸序列的探針對結(jié)核分枝桿菌相關(guān)產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的通用引物存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述通用引物包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 25的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針。為了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，具有SEQID NO 27和SEQID NO :28的核苷酸序列的探針對非結(jié)核分枝桿菌相關(guān)產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的通用引物存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述通用引物包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :25的核苷酸序列的反向引物。在本發(fā)明的一個實施方式中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1，2，3 和 MGBNFQ。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO :25的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO :26的核苷酸序列；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID N0:27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針。所述檢測試劑盒可進一步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 26的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(包含如下探針具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針)可用不同的可檢測工具進行標記。這種可檢測工具是指可綴合、連接或附加至探針以提供可定量的指標(如密度、濃度、數(shù)量等)的化合物、生物分子或仿生材料。可檢測工具的實例包括熒光標記物、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性同位素，但是不限于此。必須計入考慮的是當將熒光標記物在PCR反應(yīng)中一起使用時，是否能分別檢測出所述熒光標記物，因為如果熒光標記物的激發(fā)波長和發(fā)射波長根據(jù)其類型而不同，則所述熒光標記物的用法也不同。如果兩個或多個熒光標記物一起使用，其顏色可不同。熒光標記物的詳細信息和選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物與具有SEQ ID N0:25的核苷酸序列的反向引物一起形成引物組，所述引物組可通用地擴增分枝桿菌(包括MTC和NTM)的16SrRNA基因。在本發(fā)明的一個實施方式中，具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物是指以約1:1 的比例包含 5’ -ggataagcctgggaaactgg-3’ (SEQ ID NO :29)和5’-ggataagcttgggaaactgg-3’ (SEQ ID NO :30)的引物組。另外，具有 SEQ ID NO :25 的核苷酸序列的反向引物是指以約1:1的比例將5’-accccaccaacaagctgata_3’(SEQ ID NO 31)和 5’ -accccaccaactagctgata-3’ (SEQ ID NO :32)進行混合的引物組。

在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28的核苷酸序列)可為Taqman探針。用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 26的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28的核苷酸序列)被設(shè)計來靶向16S rRNA區(qū)域。在另一實施方式中，具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的NTM-2探針可以約1:1的比例包含 5’-FAM-tggaaagcgtttggtagc-MGB-3’ (SEQ ID NO :33)和 5’-FAM-tggaaagtgtttggtagc-MGB-3’ (SEQ ID NO :34)。在本發(fā)明的另一實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28的核苷酸序列)的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列)5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO :27和SEQ ID NO :28的核苷酸序列)的5’端標記的熒光標記物不同。例如，當用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端可用FAM標記、3’端可用MGBNFQ標記時，用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端可用VIC標記、3’端可用MGBNFQT 己 O根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:25的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 26的核苷酸序列)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(包含如下探針具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO 28的核苷酸序列的探針);以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。在本發(fā)明的另一實施方式中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1， 2，3和MGBNFQ (結(jié)合分子溝槽的非熒光淬滅劑)。為了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，具有選自于由SEQ ID NO:37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO 1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。所述檢測試劑盒可進一步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這一試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有選自于由SEQID NO 37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列)和用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列)可用不同的可檢測工具進行標記。這種可檢測工具是指可綴合、連接或附加至探針以提供可定量的指標(如密度、濃度、數(shù)量等)的化合物、生物分子或仿生材料。可檢測的工具的實例包括熒光標記物、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性同位素，但是不限于此。必須計入考慮的是當將熒光標記物在PCR反應(yīng)中一起使用時，是否能分別檢測出所述熒光標記物，因為如果熒光標記物的激發(fā)波長和發(fā)射波長根據(jù)其類型而不同，則所述熒光標記物的用法也不同。如果兩個或多個熒光標記物一起使用，其顏色可不同。熒光標記物的詳細信息和選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
如上所述，用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO :20的核苷酸序列的反向引物。結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列)可為Taqman探針。為了用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測，具有SEQ ID NO 21的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物。為了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，具有選自于由SEQ ID NO:37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物。SEQ ID NO :35的核苷酸序列可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物。對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的所述正向引物被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQID NO :35的核苷酸序列為包含如下引物的引物 :5，_catgtcttgtgggggaaagctt_3，(SEQ ID NO :40)、5，_catgttttgtgggggaaagctt_3，(SEQ ID NO 41)、5’ -catgtcttctgggggaaagctt-3’ (SEQ ID NO :42)、5’ -catgtcttgtggtggaaagctt-3，(SEQ ID NO :43)、5，-catgtcttgtggggcaaagctt-3，(SEQ ID NO :44)、5，-catgttttctgggggaaagctt-3’ (SEQ ID NO :45)、5’_catgtcttctggtggaaagctt_3’ (SEQ ID NO :46)、5，-catgtcttgtggtgcaaagctt-3，(SEQ ID NO :47)、5，-catgttttgtggggcaaagctt-3，(SEQID NO 48)、5，-catgtcttctggggcaaagctt-3J (SEQ ID NO :49)、5，-catgttttgtggtggaaagctt_3’ (SEQ ID NO :50)、5’-catgttttctggtggaaagctt-3’ (SEQ ID NO :51)、5’-catgttttctggggcaaagctt-3，(SEQ ID NO :52)、5’-catgttttgtggtgcaaagctt-3’ (SEQ ID N0:53)、5，_catgtcttctggtgcaaagctt-3J (SEQ ID NO :54)和 5’-catgttttctggtgcaaagctt-S’ (SEQ IDNO :55)。例如，在具有SEQ ID NO :35的核苷酸序列的引物組中，具有SEQ ID NO :40-55的核苷酸序列的各引物可以基本上相同的量存在。在本發(fā)明的另ー實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED, RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。例如，當用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端可用FAM標記、3’端可用BHQ-1標記時，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端可用HEX標記、3’端可用BHQ-1標記。根據(jù)ー個實施方式，在用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒中，用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO :38的核苷酸序列)可以約1:1 的比例包含 FAM-cctgagagggtgaccgg-BHQl (SEQ ID NO :56)和FAM-cctgagagggtgtccgg-BHQl(SEQ ID NO :57)。 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO : 20的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDN021的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有選自于由SEQ ID NO :37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ IDNO 61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQID NO 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 8的核苷酸序列的引物。SEQ ID NO 61的核苷酸序列可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物。SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :8的核苷酸序列(NTM-1和NTM-2)各自可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的反向引物。16S rRNA基因的所述特異性反向引物被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID NO :8的核苷酸序列(5，-catcccacaccgctaccw-3，)為以約1:1 的比例包含 5，-catcccacaccgctacct-3，(SEQID NO :10)和 5，-catcccacaccgctacca-3’ (SEQ ID NO :11)的引物組。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21或SEQ ID NO :60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ ID NO :5的核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO 8的核苷酸序列的引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 63的核苷酸序列。所述檢測試劑盒可進ー步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這ー試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 60的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 62或SEQ ID NO 63的核苷酸序列)可用不同的可檢測工具進行標記。如上所述，在用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒(所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組)中，使用對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物。結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 60的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 59的核苷酸序列的反向引物。

在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 60的核苷酸序列)可為Taqman探針。SEQ ID NO 61的核苷酸序列可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物。SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 8的核苷酸序列(NTM-1和NTM-2)各自可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的反向引物。具有SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 63的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:61的核苷酸序列的正向引物和包含具有SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :8的核苷酸序列的各引物的反向引物。在一個實施方式中，用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的各探針(具有SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 63的核苷酸序列)可為Taqman探針。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3’ 端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1，2，3和MGBNFQ。在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21或SEQ ID NO 60的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ ID NO 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 8的核苷酸序列的引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 62或SEQ ID NO :63的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID NO 65的核苷酸序列的引物、具有SEQID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :67的核苷酸序列的引物；以及具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物。S EQ ID NO 65, SEQ ID NO :66 和 SEQ ID NO :67 的各核苷酸序列(NTM-1、NTM-2和NTM-3)可一起用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物。非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因的所述特異性正向引物被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。SEQ ID N0:65的核苷酸序列(5，-tktggtggaaagcttttgc-3’)為包含5，-tgtggtggaaagcttttgc-3，(SEQ ID NO :69)和 5，-tttggtggaaagcttttgc-3，(SEQID NO 70)的引物組。在這ー引物組中，SEQ ID N0:69和SEQ ID N0:70例如可以約I I的比例存在。SEQ ID NO 66的核苷酸序列(5’-ggtgwgtggtgcaaagctt_3，)可為以約1:1的比例包含 5，-ggtgagtggtgcaaagctt-3’ (SEQ ID NO :71)和 5’ -ggtgtgtggtgcaaagctt-3’ (SEQID NO 72)的引物組。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21或SEQ ID NO :64的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ IDNO :65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO 67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO 36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:39或SEQ ID NO:68的核苷酸序列。所述檢測試劑盒可進ー步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這ー試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 64的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(具有SEQID NO 39或SEQ ID NO 68的核苷酸序列)可用不同的可檢測工具進行標記。如上所述，在用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒中，使用對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物。結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因的所述特異性引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 64的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 20的核苷酸序列的反向引物。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 64的核苷酸序列)可為Taqman探針。SEQ ID NO :65、SEQ ID NO 66和SEQ ID NO 67的各序列可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物，而SEQ IDNO :36的核苷酸序列可用作對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的反向引物。

具有SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 68的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物包含具有SEQ ID NO :65-67的核苷酸序列的各引物的正向引物和具有SEQ ID NO :36的核苷酸序列的反向引物。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 68的核苷酸序列)可為Taqman探針。具有SEQ ID NO 68 的核苷酸序列的探針(5，-FAM-cctgagagggtgwccg-MGB-3’ )可為以1:1 的比例包含 5’ -FAM-cctgagagggtgaccg-MGB-3’ (SEQ ID NO :73)和 5’ -FAM-cctgagagggtgtccg-MGB-3’ (SEQ ID NO :74)的探針。在本發(fā)明的另ー實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET,J0E、HEX、CY3、CY5、R0X、RED610、TEXASRED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3’ 端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :20的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 21或SEQ ID NO 64的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID N0:65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO :66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO :36的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 68的核苷酸序列)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO 60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO :75的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO :27的核苷酸序列的探針和具有SEQ IDNO 76的核苷酸序列的探針。所述檢測試劑盒可進ー步包含通過PCR擴增DNA所必需的試劑。這ー試劑可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 60的核苷酸序列)和用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 27和SEQ IDNO 76的核苷酸序列(NTM-1和NTM-2))可用不同的可檢測工具進行標記。
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如上所述，在用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒中，使用對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物。對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的所述引物組被設(shè)計來檢測所有的目標分枝桿菌種(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，MTC)。為了用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測，具有SEQ ID NO 60的核苷酸序列的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ ID NO 60的核苷酸序列)可為Taqman探針。如上所述，在用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒中，使用對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :75的核苷酸序列的反向引物。具有SEQ ID NO :24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :75的核苷酸序列的反向引物一起形成引物組，所述引物組通用地擴增MTC和NTM的16S rRNA基因。SEQ ID NO : 24 的核苷酸序列(5，-ggataagcytgggaaactgg-3’)可作為對分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的正向引物，并可為以約1:1的比例包含5，-ggataagcctgggaaactgg-3，(SEQ ID NO :29)和 5，-ggataagcttgggaaactgg-3，(SEQ IDNO 30)的引物組。SEQ ID NO :36的核苷酸序列可為對分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的反向引物。為了用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測，包含具有SEQ ID NO 27和SEQ ID NO :76的核苷酸序列的各探針的探針對產(chǎn)物具有特異性，所述產(chǎn)物是通過在對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組存在的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)所得到的，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO 75的核苷酸序列的反向引物。用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(包含具有SEQ ID NO 27和SEQ ID NO :76的核苷酸序列的探針)被設(shè)計來檢測所有的目標非結(jié)核分枝桿菌種。在本發(fā)明的另ー實施方式中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET,J0E、HEX、CY3、CY5、R0X、 RED610、TEXASRED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3’ 端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET, JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ。在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物可與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的熒光標記物不同。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含由測試對象中分離DNA ;通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO :58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO :59的核苷酸序列的反向引物)、用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針(具有SEQ IDNO 60的核苷酸序列)、對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組(包含如下引物具有SEQ ID NO 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO 75的核苷酸序列的反向引物)、以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針(包含如下探針具有SEQ ID NO :27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO :76的核苷酸序列的探針)；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。實施例通過下述實施例將更好地理解本發(fā)明，所述實施例用來對本發(fā)明進行說明，而不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明進行限定。參考例尋■找結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列1.目標和基因位點
將下列分枝桿菌的16S核糖體RNA基因數(shù)據(jù)用于尋■找結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特征核苷酸序列中膿腫分枝桿菌(M.abscessus) (AJ419970.1、AJ416940.1、AJ536038)、阿加普爾分枝桿菌(M. acapulcensis) (AF480575.1)、非洲分枝桿菌(M. africanum) (AF480605.1)、田野分枝桿菌(M. agri) (AJ429045.1)、愛知分枝桿菌(M. aichiense) (X55598.1)、河床分枝桿菌(M. alvei) (NR—024859.1)、亞洲分枝桿菌(M. asiaticum) (X55604.1)、金色分枝桿菌(M. aurum) (FJ172298.1)、南非分枝桿菌(M. austroafricanum) (GU121552.1)、鳥分枝桿菌(M. avium) (NR—025584.1、AJ536037.1、EF521892.1)、波希米亞分枝桿菌(M. bohemicum) (NR—026054.1)、波特尼分枝桿菌(M. botniense) (NR—028878.1)、牛分枝桿菌(M. bovis) (GU142937.1)、布氏分枝桿菌(M. branderi) (AF480574.1)、霧分枝桿菌(M. brumae) (NR—025233.1)、隱藏分枝桿菌(M. celatum) (L08169.1)、龜分枝桿菌(M. chelonae) (AM884324.1、AJ419969.1)、千田分枝桿菌(M. chitae)(NR—029220.1)、氯酚分枝桿菌(M. chlorophenolicum) (NR—026173.1)、楚布分枝桿菌(M. chubuense) (X55596.1)、匯合分枝桿菌(M. confluentis) (AJ634379.1)、炫耀分枝桿菌(M. conspicuum) (X029298.1)、庫氏分枝桿菌(M. cookii) (X53896.1)、迪氏分枝桿菌(M. diernhoferi) (AF480599.1)、M. doricum(NR_025099.1)、杜氏分枝桿菌(M. duvalii)(NR—026073.1)、M. engbaekii (AF480577.1)、詭詐分枝桿菌(M. fallax) (AF480600.1)、產(chǎn)鼻痕分枝桿菌(M. farcinogenes) (X55592.1)、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌(M. f Iavescens)(AY734993.1)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum) (AY457066.1、AF480580.1、GU142933.1)、カロ地斯分枝桿菌(M. gadium) (NR—026087.1)、胃分枝桿菌(M. gastri) (GU142918.1)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(M. genavense) (NR—029223.1)、淺黃分枝桿菌(M. gilvum) (AB491971.1)、戈地分枝桿菌(M. goodii) (AY457079.1)、戈氏分枝桿菌(M. gordonae) (GU142923.1)、嗜血分枝桿菌(M. haemophilum) (V06638.1)、M. hassiacum(NR—026011.1)、海德堡分枝桿菌(M. heidelbergense) (NR—025268.1)、愛爾蘭分枝桿菌(M. hiberniae)(NR—026092.1)、霍德勤分枝桿菌(M. hodleri) (NR—026286.1)、免疫原分枝桿菌(M.1mmunogen) (AJ011771.1)、居間分枝桿菌(M.1nterjectum) (X70961.1)、中間分枝桿菌(M.1ntermedium) (X67847.1)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.1ntracellulare) (AY652958. UAJ536036.1、X52927.1、M61684.1)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii) (M29575.1、X15916.1)、緩黃分枝桿菌(M. lentiflavum) (AF480583.1)、M. mageritense (AY457076.1)、瑪爾摩分枝桿菌(M. malmoense) (GQ153278.1)、海分枝桿菌(M. marinum) (AF456238.1、AY513243.1)、田鼠分枝桿菌(M. microti) (NR—025234.1)、M. monacense (GU142931.1)、莫呈奧卡分枝桿菌(M. moriokaense) (AY859686.1)、產(chǎn)粘液分枝桿菌(M. mucoxenicum) (AF480585.1)、新金色分枝桿菌(M. neoaurum) (FJ172306.1)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)(DQ058406.1)、奧布分枝桿菌(M. obuense) (X55597.1)、石錯分枝桿菌(M. paraffinicum)(GQ153282.1)、副偶然分枝桿菌(M. parafortuitum) (NR—026285.1)、外來分枝桿菌(M. peregrinum) (AY457069.1)、草分枝桿菌(M. phlei) (AF480603.1)、豬分枝桿菌(M.porcinum) (AY457077.1)、海綿分枝桿菌(M. poriferae) (NR—025235.1)、灰塵分枝桿菌(M. pulveris) (NR—025528.1) 、羅得西亞分枝桿菌(M. rhodesiae) (NR—025529.1)、瘰病分枝桿菌(M. scrofulaceum) (GQ153271.1)、M. senuense (DQ536409.1)、胺韋性分枝桿菌(M. septicum) (AY457070.1)、施氏分枝桿菌(M. shimoidei) (X82459.1)、猿分枝桿菌(M. simiae) (GQ153280.1)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis) (NR_025311.1)、泥炭蘚分枝桿菌(M. sphagni) (X55590.1)、蘇加分枝桿菌(M. szulgai) (X52926.1)、地分枝桿菌(M. terrae) (NR_029168.1)、耐熱分枝桿菌(M. thermoresistibile) (GU142928.1) >M. tilburgii (AJ580826.1)、三重分枝桿菌(M. triplex) (GQ153279.1)、次要分枝桿菌(M.triviale) (DQ058405.1)、結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)(⑶ 142936.1、⑶ 142935.1、AY53603.1、X55588.1、X52917.1)、托斯卡分枝桿菌(M. tusciae) (NR_024903.1)、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans) (Z13990.1)、母牛分枝桿菌(M. vaccae) (X55601.1)、沃林斯基分枝桿菌(M. wolinskyi) (AY457083.1)和蟾分枝桿菌(M. xenopi) (X52929.1)。從NCBI (美國國家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中獲得16S核糖體RNA基因的數(shù)據(jù)。通過Sequencher4. 9對分枝桿菌種的16S rRNA基因序列的數(shù)據(jù)進行分析得到特征核苷酸序列，即，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特征核苷酸以及在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中缺失、但在非結(jié)核分枝桿菌中固有的核苷酸。實施例1 :結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌I的分離和檢測1.檢測目標和引物設(shè)計待檢測的目標基因為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC :結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)的IS61 10基因和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的16S rRNA基因。在所述目標基因的檢測中使用利用Primer3程序設(shè)計的引物和Taqman探針。(I)MTCI)目標基因IS61102)引物a.正向引物5，-cgaactcaaggagcacatca-3，(SEQ ID NO :1)b.反向引物5，-agtttggtcatcagccgttc-3，(SEQ ID NO :2)3) Taqman 探針5，-VIC-agtgtggctaaccctgaa-MGB-3’ (SEQ ID NO :3)4)卩0 產(chǎn)物大小135ゎロ(2) NTMI)目標基因16S rRNA2)引物a.正向引物5，-ggyrayctgccctgcac-3，(SEQ ID NO :4)b.反向引物NTM-l:5’-cccacaccgcaaaagctt_3’(SEQ ID NO 5 ) >5，-cccacaccgcaaaagct-3’ (SEQ ID NO :6)或 5，-tcccacaccgcaaaagct-3，(SEQID NO :7)NTM-2 :5，-catcccacaccgctaccw-3J (SEQ ID NO :8)3) Taqman 探針5，-FAM-cggtattagacccagtttcc-MGB-3’ (SEQ ID NO :9)4)卩0 產(chǎn)物大小10仙ロ〈實施例1-1.將SEQID NO :5的核苷酸序列用作對NTM進行檢測的反向引物NTM-1的雙重實時PCR>
(I)DNA 的分離DNA分離自186個分枝桿菌種和78個非結(jié)核分枝桿菌種(均為在臨床受試者中鑒定的)，以及7個標準ATCC分枝桿菌種(包括結(jié)核分枝桿菌(ATCC25177)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、瘰癘分枝桿菌(ATCC19981)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6841)、膿腫分枝桿菌(ATCC19977)和鳥分枝桿菌(ATCC25291))。DNA分離自186個分枝桿菌種和78個非結(jié)核分枝桿菌種(均為在臨床受試者中鑒定的)，以及7個標準ATCC分枝桿菌種(包括結(jié)核分枝桿菌(ATCC25177)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、瘰癘分枝桿菌(ATCC19981)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6841)、膿腫分枝桿菌(ATCC19977)和鳥分枝桿菌(ATCC25291))。將在臨床受試者中鑒定的種(包括186個分枝桿菌種和78個非結(jié)核分枝桿菌種)在液體培養(yǎng)基(MGIT分枝桿菌培養(yǎng)基)或固體培養(yǎng)基(Ogawa培養(yǎng)基)中進行檢測，或者直接從痰樣本中分離。將ATCC標準種在肉湯中培養(yǎng)。依照如下方式，從在肉湯中培養(yǎng)的分枝桿菌中分離DNA。向1. 5mL管中移入500 u L培養(yǎng)有分枝桿菌的MGIT肉湯，并以14，OOOrpm離心5min。去除上清液，將沉淀溶于300 y L無菌蒸餾水中，并在沸水浴中加熱lOmin。在以14，OOOrpm離心5min后，將上清液用作PCR中的模板。依照如下方式，從在瓊脂平板上培養(yǎng)的分枝桿菌中分離DNA。用白金環(huán)(platinumloop)從瓊脂平板上取樣并溶于1. 5mL管中的500 ii L無菌蒸餾水中，并在沸水浴中加熱IOmin0接著以14，OOOrpm離心5min。將上清液用作PCR中的模板。依照如下方式處理痰樣本。向15mL管或50mL管中的痰中加入I體積的IN NaOH,然后靜置IOmin以使痰液化。接著以14，OOOrpm離心2min后，在ImL無菌蒸餾水中將沉淀充分混勻10秒。再次將混合物以14，OOOrpm離心2min,并在ImL無菌蒸懼水中將沉淀充分混勻10秒。以14, OOOrpm離心2min,并將沉淀與100 u L的5% chelex樹脂(BioRad,USA)和I ii L的10mg/m L蛋白酶K充分混勻。在56°C靜置15min后，將混合物在沸水浴中加熱IOmin0以14，OOOrpm離心5min后,取上清液用作PCR中的模板。(2)雙重實時PCR在Rotor-GeneQ(QIAGEN Inc. ,Germantown,MD,USA)上使用 Rotor-Gene 多重PCR試劑盒(QIAGEN Inc. ,Germantown,MD,USA)進行，雙重實時PCR從在約95°C下變性5min開始；再以如下條件運行40個循環(huán)在約95°C下變性15秒，在66°C下退火15秒并延伸。下表I中總結(jié)了所述雙重實時PCR的組成。在引物-探針混合物中，包含相同含量(lOpmole/UL)的正向引物和反向引物以及4pmole/iiL的探針。因此，對于MTC，1. 25 y L引物-探針混合物包含含量各自為12. 5pmole的正向引物和反向引物以及含量為5pmole的探針。由于PCR混合物的總體積為25 u L，所以其以0. 5 uM(12. 5pmole/25 u L)的濃度含有引物，并以0. 2uM(5pmole/25uL)的濃度含有探針。對于NTM，以與MTC中相同的濃度和體積使用正向引物、反向引物和探針。將SEQ ID NO :5和SEQID NO :8的核苷酸序列分別用作NTM-1和NTM-2反向引物。對于NTM-2反向引物，以相同的量使用5’-catcccacaccgctacct-3’ (SEQID NO 10)和 5’ -catcccacaccgctacca-3’ (SEQ ID NO 11) NTM 正向引物為如下引物的組5，_ggtaatctgccctgcac_3’ (SEQ ID NO : 1 、5，-ggtaacctgccctgcac-3’ (SEQID NO:13)、5，-ggcaatctgccctgcac-3，(SEQ ID NO : 14)、5，-ggcaacctgccctgcac-3，(SEQ ID NO:15)、5’ -ggtgatctgccctgcac-3’ (SEQ IDNO : 16)、5’ -ggtgacctgccctgcac-3’ (SEQ ID NO:17)、5，-ggcgatctgccctgcac-3，(SEQ ID NO :18)和 5，-ggcgacctgccctgcac-3，(SEQID NO:19)。在所述引物組中，以約1:1:1:1:1:1:1:1的比例使用如下引物SEQID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :15、SEQID NO :16、SEQ ID NO 17,SEQID NO :18 和 SEQ ID NO :19。表 I
權(quán)利要求
1.用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ IDNO:9的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的探針，其中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ (結(jié)合分子溝槽的非熒光淬滅劑)。
3.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDN0:2的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ ID N0:8的核苷酸序列的反向引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ；以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
5.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ； 通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:2的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID N0:5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物以及具有SEQ IDNO:8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列；以及 對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
6.對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物 具有SEQ ID NO:22的核苷酸序列的正向引物； 選自于由SEQ ID N0:5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物；以及 具有SEQ ID N0:8的核苷酸序列的反向引物。
7.用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ IDNO:23的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的探針，其中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3 和 MGBNFQ。
9.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDN0:20的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ ID NO:5_7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物和具有SEQ ID N0:8的核苷酸序列的反向引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ;以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
11.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ； 通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO: 21的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 22的核苷酸序列的正向引物、選自于由SEQ IDNO:5-7的核苷酸序列所組成的組中的至少一個反向引物和具有SEQ IDNO:8的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO: 23的核苷酸序列；以及 對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
12.用于對結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ IDNO:26的核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的探針，其中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3 和 MGBNFQ。
14.用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO:27的核苷酸序列的探針和具有SEQID NO:28的核苷酸序列的探針。
15.如權(quán)利要求14所述的探針，其中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3 和 MGBNFQ。
16.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO: 26的核苷酸序列；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO:27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO:28的核苷酸序列的探針。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-l，2，3和MGBNFQ ;以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
18.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ；通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行擴增的通用引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 25的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQID NO: 26的核苷酸序列；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO:27的核苷酸序列的探針和具有SEQ ID N0:28的核苷酸序列的探針；以及 對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
19.用于對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO:37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的探針，其中，在所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3 和 MGBNFQ。
21.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDN0:20的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID N0:35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的反向引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQID NO:37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ；以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
23.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ； 通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 35的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有選自于由SEQ ID NO: 37-39的核苷酸序列所組成的組中的一種核苷酸序列；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
24.對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物 具有SEQ ID NO:61的核苷酸序列的正向引物；以及 包含如下引物的反向引物具有SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的引物。
25.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:59的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:60的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ IDNO: 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63的核苷酸序列。
26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ；以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
27.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ；通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:21或SEQ ID NO:60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:61的核苷酸序列的正向引物和包含如下引物的反向引物具有SEQ IDNO: 5的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:62或SEQID NO:63的核苷酸序列；以及 對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
28.對非結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物 正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID NO:65的核苷酸序列的引物、具有SEQ IDNO: 66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 67的核苷酸序列的引物；以及具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的反向引物。
29.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:20的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:64的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID NO:65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的引物和具有SEQID NO:67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的反向引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ；以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
31.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ； 通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:20的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:21或SEQ ID N0:64的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物正向引物，所述正向引物包含具有SEQ ID NO:65的核苷酸序列的引物、具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO:67的核苷酸序列的引物，以及具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:68的核苷酸序列；以及 對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
32.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:59的核苷酸序列的反向引物； 用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID N0:60的核苷酸序列； 對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:75的核苷酸序列的反向引物；以及 用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO:27的核苷酸序列的探針和具有SEQ IDNO:76的核苷酸序列的探針。
33.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670 和 NED ;并在所述探針的 3，端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ；以及 在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的所述探針的5’端標記有選自于由如下熒光標記物所組成的組中的熒光標記物FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610,TEXAS RED、RED670和NED ;并在所述探針的3’端標記有選自于由如下熒光淬滅劑所組成的組中的熒光淬滅劑6-TAMRA、BHQ-1, 2，3和MGBNFQ ； 其中，在用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物與在用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針5’端標記的所述熒光標記物不同。
34.用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法，所述方法包含 由測試對象中分離DNA ； 通過雙重實時PCR使用如下引物組和探針對所述DNA進行擴增和檢測對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 58的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:59的核苷酸序列的反向引物；用于對結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因進行檢測的探針，所述探針具有SEQ ID NO: 60的核苷酸序列；對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因具有特異性的引物組，所述引物組包含如下引物具有SEQ ID NO: 24的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:75的核苷酸序列的反向引物；以及用于對非結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因進行檢測的探針，所述探針包含如下探針具有SEQ ID NO: 27的核 苷酸序列的探針和具有SEQ ID NO:76的核苷酸序列的探針；以及對所述雙重實時PCR的產(chǎn)物進行分析。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的引物組和/或探針，所述引物組和/或探針對結(jié)核分枝桿菌特異性的IS6110基因或16S rRNA基因以及非結(jié)核分枝桿菌特異性的16S rRNA基因具有特異性；用于對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含所述引物組和/或探針；以及使用所述引物組和/或探針通過雙重實時聚合酶鏈式反應(yīng)對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進行檢測的方法。本發(fā)明可提供能夠同時且更加有效地對結(jié)核分枝桿菌和/或非結(jié)核分枝桿菌進行檢測和分析的臨床診斷手段。
文檔編號C12R1/32GK103038348SQ201180036998
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者金廷昱 申請人:蔚山大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團