專利名稱：微生物核酸的定性和定量檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用至少第一對照核酸，或不同濃度的第一和第二對照核酸來定性和定量檢測微生物核酸的新的方法和用途。該方法基于核酸的擴增，優(yōu)選地，聚合酶鏈式反應。進一步提供了包含用于實施所述方法和用途的組分的試劑盒。發(fā)明背景 在分子診斷學領域中，使用核酸擴增反應對微生物核酸進行檢測和量化發(fā)揮重要的作用。針對丙肝病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、和/或乙肝病毒(HBV)的存在的獻血常規(guī)篩選是核酸擴增和檢測反應大規(guī)模應用的一個例子。后者包含多種不同技術，最常使用的技術是由Kary Mullis在1984年引入的聚合酶鏈式反應(PCR)。基于PCR的分析的自動化系統(tǒng)經(jīng)常利用PCR過程期間對產物擴增的實時檢測。這類方法的關鍵是使用攜帶報告基團或標記物的經(jīng)修飾的寡核苷酸。生物學樣品中微生物核酸的定性檢測對于例如識別個體感染是至關重要的。由此，用于檢測微生物感染的測定法的一項重要的要求是避免假陰性或假陽性結果，因為這類結果幾乎會不可避免地導致就相應患者的治療而言的嚴重后果。因此，特別是在基于PCR的方法中，向檢測混合物添加定性內部對照核酸。所述對照對于確定測試結果的有效性是特別重要的至少在就微生物核酸而言陰性結果的情況中，定性內部對照反應在給定背景內必須表現(xiàn)為反應性的，即必須檢測出定性內部對照，否則認為該測試自身是不起作用的。然而，在定性設置中，在陽性結果的情況中沒有必要必須檢出所述定性內部對照。對于定性測試，特別重要的是，保證反應的靈敏度，并且因此對其嚴格控制。因此，定性內部對照的濃度必須相對較低，從而即使在例如略微抑制的情況中，沒有檢測出定性內部對照，并且因此該測試是無效的。在另一方面并且在僅檢測樣品中微生物核酸的存在或缺乏外，測定所述核酸的量也經(jīng)常是重要的。舉例而言，病毒性疾病的階段和嚴重性可以基于病毒載量評估。此外，任何療法的監(jiān)測需要關于個體中存在的病原體量的信息以估計療法的成功與否。對于定量測定法，必需引入定量標準核酸，其充當用于測定微生物核酸的絕對量的參照物?？梢酝ㄟ^參照外部校準物或通過執(zhí)行內部定量標準品來實行定量。在外部校準物的情況中，使用已知量的相同或相當?shù)暮怂嵩诜珠_的反應中創(chuàng)建標準曲線。然后，通過比較用分析樣品獲得的結果與所述標準函數(shù)來確定微生物核酸的絕對量。然而，外部校準具有的缺點在于，可能的提取規(guī)程、其變化的效力、和抑制擴增和/或檢測反應的媒介物的可能的且經(jīng)常不可預測的存在在對照中沒有得到反映。此情況適用于任何樣品相關效應。因此，可能的情況是，樣品由于不成功的提取規(guī)程或其它基于樣品的因素而判斷為呈陰性，而要檢測并量化的微生物核酸實際上存在于該樣品中。出于這些和其它原因，向測試反應自身添加的內部定量標準品具有優(yōu)點。內部定量標準品在定量測試中至少具有下列兩項功能i)其監(jiān)測反應的有效性。
)其在滴度計算中充當參照物，如此補償抑制效應，并且控制制備和擴增過程以容許更準確的定量。因此，與定性測試中僅必須在靶物陰性反應中呈陽性的定性內部對照核酸形成對比，定量測試中的定量標準核酸具有兩項功能反應控制和反應校準。因此，它在靶物陰性和靶物陽性反應中都必須呈陽性且是有效的。此外，它必須適合于為高核酸濃度的計算提供可靠的參照值。因此，內部定量標準核酸的濃度需要是相對較高的。定性內部對照核酸和/或內部定量標準核酸可以是競爭性、非競爭性或部分競爭性的。競爭性定性內部對照核酸和/或內部定量標準核酸攜帶與靶物基本上相同的引物結合位點，并且如此與靶物競爭相同引物。競爭性設置的優(yōu)點之一是例如必須在測定法中引入的不同引物組較少，如此降低其成本和總體復雜性。此外，監(jiān)測引物的功能性，亦監(jiān)測靶物引物特異性的抑制效應。非競爭性定性內部對照核酸和/或內部定量標準核酸與靶物具有不同引物結合位點，并且如此結合不同引物。這類設置的優(yōu)點包含如下的事實，即反應混合物中不同核酸的單一擴增事件可以在沒有任何競爭效應的情況中彼此獨立發(fā)生，等等。在使用部分競爭性內部定量標準核酸的PCR中，相應的對照核酸和至少一種靶核酸競爭相同引物，而至少一種其它靶核酸結合不同引物。由于如上文所描述的定量和定性測定法的原理在彼此比較時展示不同的要求，又考慮到各個國家的規(guī)章要求，在本領域中使用的常見辦法是對同一靶核酸開發(fā)不同定量和定性測定法，參見例如 Yang 等，J Agr Food Chem2005, 53，6222-6229。本發(fā)明提供了一種展示數(shù)種優(yōu)點的備選解決辦法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于同時定性和定量檢測微生物核酸的新的方法和用途。該方法基于核酸的擴增，優(yōu)選地，聚合酶鏈式反應。簡言之，使用一種或多種特異性引物對來擴增并檢測微生物核酸和至少第一對照核酸的特定序列部分。因此，本發(fā)明的一個主題是

用于同時檢測并量化生物學樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括a)分離并純化所述微生物核酸，b)提供反應混合物，其包含至少第一對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及所述對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與由所述一種或多種引物對擴增的每種序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述對照核酸與不同探針雜交，c)向所述反應混合物添加所述生物學樣品，d)實施一個或多個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟，所述擴增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴增產物，并且生成自所述對照核酸衍生的擴增產物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對擴增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應的接受熒光模塊標記，且每種探針攜帶不同的熒光染料，e)檢測并測量由所述擴增產物生成并與所述對照核酸和所述微生物核酸的濃度成比例的熒光信號，其中所述對照核酸的擴增產物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴增產物的情況中也指示所述反應混合物中發(fā)生擴增。本發(fā)明展示了與現(xiàn)有技術相比的許多優(yōu)點。特別地，如此，本發(fā)明容許使用相同試劑進行的針對任何給定微生物核酸的定性和定量測定法的常見設計。在一些實施方案中，上文所描述的第一對照核酸可以充當內部定量標準核酸和定性內部對照核酸兩者。因此，它分別消除了對兩次分開的測試或測試試劑盒的需要。實施兩次分開的測試由于額外的抽血而給患者帶來負擔，并且在定量和定性測試都報銷的情況下，潛在地給健康護理系統(tǒng)強加額外的成本。此外，在與連續(xù)的定性和定量實驗相比時，既定性又定量的測試的獲得結果時間縮短。優(yōu)選地，依照不同標準評估所述第一對照核酸以獲得定性和定量結果。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對兩種不同測試參數(shù)設置分析實時PCR期間獲得的一組相同的原始數(shù)據(jù)。與應用于定量結果輸出所需要的內部定量標準品的參數(shù)設置相比，應用于有效定性對照核酸的定性測試參數(shù)設置是 更嚴格的。在定量反應中用于內部定量標準核酸的設置不能如此嚴格，因為靶物的存在可能影響內部定量標準核酸的相應增長曲線(參見圖la)。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是上文所描述的方法，其中依照不同標準分析第一對照核酸以充當定量標準核酸或充當定性內部對照核酸。在其它實施方案中，由于以下原因以不同濃度采用第一和第二對照核酸可以是有利的通常，定量測試中的一種或多種內部定量標準核酸具有相當高的濃度，從而使得它們在具有高濃度靶核酸的樣品中仍然得到擴增并檢出。因此，有時沒有給予其作為對照用于檢測接近檢測限(LOD)的低陽性樣品的可用性，特別是若擴增反應受到部分抑制的話。在該情況中，高度濃縮的對照核酸的檢出不能充當相應測定法的足夠靈敏性的度量。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選方面如下用于同時檢測并量化生物學樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括a)分離并純化所述微生物核酸，b)提供反應混合物，其包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及所述對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與由所述一種或多種引物對擴增的每種序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述第一對照核酸以及所述第二對照核酸與不同探針雜交，c)向所述反應混合物添加所述生物學樣品d)實施一個或多個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟，所述擴增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴增產物，并且生成自所述第一對照核酸和所述第二對照核酸衍生的擴增產物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對擴增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應的接受熒光模塊標記，且每種探針攜帶不同熒光染料，e)檢測并測量由所述第一對照核酸和所述微生物核酸的擴增產物生成并與其濃度成比例的熒光信號，和/或同時檢測由所述第二對照核酸的所述擴增產物生成的熒光信號，其中所述第二對照核酸的擴增產物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴增產物的情況中也指示反應混合物中發(fā)生擴增。依照本發(fā)明在同一對照試劑內采用不同濃度的第一和第二對照核酸克服了上文所述的問題。具有較低或最低濃度的核酸對應于用于定性測定法的定性內部對照核酸，并且確保判斷陰性結果有效與否的能力，即在未檢測到內部對照核酸的情況中，陰性結果不是有效的。
依照本發(fā)明，技術人員可以如下利用開發(fā)定量和定性設置之間的協(xié)同，即在單個測定法中實施這兩者，如此降低開發(fā)成本、需要較少的材料和勞動力、降低制造成本，而且還縮短建立測定法需要的時間。此外，避免由于額外的抽血給患者帶來負擔的患者雙重測試，以及降低健康護理系統(tǒng)的成本(在定量和定性測試都報銷的情況下)。定性內部對照核酸和/或內部定量標準核酸可以是競爭性、非競爭性或部分競爭性的?！案偁幮浴币馕吨诎锏臄U增反應中，相應的對照核酸和一種或多種靶核酸至少具有基本上相同的引物結合位點，并且如此競爭相同引物。競爭性設置的優(yōu)點之一是，例如必須在測定法中引入的不同引物組較少，如此降低其成本和總體復雜性。此外，監(jiān)測弓I物的功能性，亦監(jiān)測靶物弓I物特異性的抑制效應。“非競爭性”意味著相應的對照核酸和一種或多種靶核酸具有不同引物結合位點，并且如此結合不同引物。這類設置的優(yōu)點包含如下的事實，即反應混合物中不同核酸的單一擴增事件可以在沒有任何競爭效應的情況中彼此獨立發(fā)生，等等?！安糠指偁幮浴币馕吨鄳膶φ蘸怂岷椭辽僖环N靶核酸競爭相同引物，而至少一種其它靶核酸結合不同引物 。依照本發(fā)明的一種或多種方法通過使用內部定量標準核酸作為第一對照核酸，使可能同時干擾定量標準核酸和微生物核酸的擴增和檢測反應的樣品特異性，而且還有樣品非特異性抑制效應(不依賴于靶區(qū)的抑制)相等，從而得到更準確的滴度?！皟炔俊币馕吨c微生物核酸在同一反應混合物內，而不是在分開的實驗中擴增、檢測并量化第一對照核酸。本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一對照核酸是定量標準核酸，而所述第二對照核酸是定性內部對照核酸。本領域技術人員可以從同一個實驗中提取可靠的定性，而且任選地還有同樣可靠的定量信息。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及以下內容上文描述的方法，進一步包括在步驟e)中通過比較由所述微生物核酸和所述第一對照核酸生成的信號來測定所述生物學樣品中所述微生物核酸的量。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一對照核酸和第二對照核酸具有基本上相同的序列。優(yōu)選地，它們具有相同的引物結合位點，但不同的探針結合位點。這具有的優(yōu)點在于，用于定性和定量測量的對照核酸可以基于相同的選定結合序列，并且就測定法性能而言并考慮一種或多種分析物序列共享相同的有利特性。在文獻中解釋了本領域技術內的分子生物學和核酸化學的常規(guī)技術。參見，例如 Sambrook J 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Gait, M.J.編，1984;NucleicAcid Hybridization, Hames, B. D.和 Higgins, S. J.編，1984;以及叢書，Methods inEnzymology, Academic Press, Inc.“同時”在本發(fā)明的意義中意味著在同一反應或反應混合物內實施兩種行為，諸如例如檢測并量化核酸。如本發(fā)明中使用的，“反應混合物”至少包含促進生物學或化學反應的所有組分。它是沒有任何分開區(qū)室的單一體積，即存在于所述“反應混合物”中的所有組分彼此直接接觸?！吧飳W樣品”可以是天然起源的任何樣品。優(yōu)選地，“生物學樣品”自人衍生，并且是體液。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，“生物學樣品”是血液。如本領域中已知的，“核苷”是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見的這類雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶?！昂塑账帷笔沁M一步包含與核苷的糖部分共價連接的磷酸根基團的“核苷”。對于那些包含呋喃戊糖基糖的“核苷”，磷酸根基團可以與糖的2’、3’或5’羥基模塊連接?！昂塑账帷笔恰肮押塑账帷?本文中更一般稱為“寡聚化合物”)，或“多核苷酸”(更一般稱為“多聚化合物”)的“單體單元”。前述物質的另一種一般表述是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。依照本發(fā)明，“寡聚化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述“單體單元”可以是單獨的“核苷酸”或單獨的“非天然化合物”(見下文)，更特別地是“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)或“非核苷酸化合物”，或其組合。“寡核苷酸”和“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)在本發(fā)明的背景中是“寡聚化合物”的亞組。在本發(fā)明的背景中，術語“寡核苷酸”指自多個作為“單體單元”的“核苷酸”形成的“多核苷酸”，即“寡核苷酸”屬于具有“單體單元”的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特定亞組。磷酸根基團通常稱為形成“寡核苷酸”的核苷間主鏈。RNA和DNA 的正常連接或主鏈是3’至5’磷酸二酯連接?？梢院铣梢勒毡景l(fā)明的“寡核苷酸”和“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(見下文)，如主要在本領域中描述的且本領域中熟練人員已知的。用于制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領域中已知的，并且包括例如合適序列的克隆和限制以及直接化學合成?；瘜W合成方法可以包括例如由Narang S. A.等，Methods in Enzymology68 (1979) 90-98描述的憐酸三酉旨方法、由 Brown E. L.等，Methods in Enzymology68 (1979) 109-151 披露的磷酸二酯方法、在 Beaucage 等，Tetrahedron Letters22 (1981) 1859 中披露的亞磷酰胺方法、在 Garegg等，Chem. Scr. 25(1985)280-282中披露的H-膦酸鹽方法以及在US4，458，066中披露的固體支持物方法。對于上文描述的方法，核酸可以以雙鏈或者單鏈形式存在，其中在實施該方法前通過加熱(即熱變性)使雙鏈核酸變性，即變成單鏈。在另一個實施方案中，引物/探針可以是經(jīng)化學修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸?！敖?jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)與天然“核苷酸”相差一些修飾，但是仍然由堿基、呋喃戊糖基糖、磷酸根部分、堿基樣、呋喃戊糖基糖樣和磷酸根樣部分或其組合組成。例如，可以將“標記物”附著于“核苷酸”的堿基部分，由此獲得“經(jīng)修飾的核苷酸”?！昂塑账帷敝械奶烊粔A基也可以用例如7-脫氮嘌呤替換，由此也獲得“經(jīng)修飾的核苷酸”。術語“經(jīng)修飾的核苷酸”或“核苷酸類似物”在本申請中可以互換使用?！敖?jīng)修飾的核苷”(或“核苷類似物”)以如上文對“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)所概述的方式與天然核苷相差一些修飾?！胺呛塑账峄衔铩辈煌谔烊弧昂塑账帷?，但是在本發(fā)明的意義中仍然能夠(類似于“核苷酸”)是“寡聚化合物”的“單體單元”。因此，“非核苷酸化合物”必須能夠與“核苷酸”形成“寡聚化合物”。然而，即使“非核苷酸化合物”可以含有堿基樣、呋喃戊糖基糖樣或磷酸根樣部分，它們并不都同時存在于“非核苷酸化合物”中?！敖?jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)，屬于另一特定亞組的“寡聚化合物”，擁有一種或多種“核苷酸”、一種或多種“非核苷酸化合物”或“經(jīng)修飾的核苷酸”作為“單體單元”。因此，術語“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)指以與“寡核苷酸”基本上相似的方式發(fā)揮功能的結構，并且貫穿本申請可以互換使用。從合成觀點來看，可以例如通過對磷酸根主鏈、核糖單元或核苷酸堿基的適當修飾通過化學修飾“寡核苷酸”來生成“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)(Uhlmann和Peyman, ChemicalReviews90(1990)543;Verma S.和 Eckstein F.，Annu. Rev. Biochem. 67(1998)99-134)。代表性修飾包括用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷間連接替換磷酸二酯核苷間連接；用脫氮或氮雜嘌呤和嘧啶替換天然的嘌呤和嘧啶堿基，在第5位或第6位具有取代基基團的嘧啶堿基；在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脫氮嘌呤)具有改變的取代基基團的嘌呤堿基；攜帶烴基/烷基(alkyl)、烯基、炔基或芳基豐旲塊，例如低級經(jīng)基/燒基(alkyl)基團諸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戍基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，或芳基基團如苯基、芐基、萘基的堿基；在例如其2’位置具有取代基基團的糖；或碳環(huán)或無環(huán)糖類似物。與本發(fā)明的精神一致的其它修飾是本領域的技術人員已知的。這類“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)最好描述為與天然“寡核苷酸”(或沿天然路線的合成“寡核苷酸”)在功能上可互換，但在結構上不同。更為詳細地，例不性修飾披露于 Verma S.和 Eckstein F. , Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134或TO02/12263中。另外，可以做出如下的修飾，其中核苷單元經(jīng)由取代核苷間磷酸酯或糖磷酸酯連接的基團連接。這類連接包括那些披露于Verma S.和Eckstein F. , Annu. Rev.Biochem. 67(1998)99-134中的。當利用磷酸酯以外的連接來連接核苷單元時，這類結構也已經(jīng)描述為“寡核苷”?！昂怂帷币约啊鞍泻怂帷被颉拔⑸锖怂帷笔恰昂塑账帷钡亩嗑刍衔铮绫绢I域熟練技術人員已知的。“靶核酸”或“微生物核酸”在本文中用于指樣品中應該分析，即應該測定樣品中其存在、不存在和/或量的“核酸”。因此，在此情況中，核酸是靶物，并且因此也可以稱為“靶核酸”。依照本發(fā)明，因為靶核酸是微生物起源的，所以靶核酸也稱為“微生物核酸”。例如，如果必須測定血液是否含有HCV，那么“靶核酸”或“微生物核酸”是HCV的核酸?！拔⑸铩币庵溉魏尾《尽⒓毦?、古細菌、真菌或任何單細胞真核生物體?！拔⑸锏摹币馕吨浴拔⑸铩毖苌驅儆凇拔⑸铩?。“檢測”意味著測定特定對象諸如靶物或信號的存在或缺乏。“量化”意味著測定特定對象諸如靶物或信號的量。“測量”意味著至少測定特定對象諸如靶物或信號的相對值。在使用第一和第二對照核酸的本發(fā)明的某些實施方案的意義中，所述第一對照核酸充當“內部定量標準核酸”。“內部定量標準核酸”是“核酸”，并且如此是“核苷酸”的多聚化合物，如本領域熟練技術人員已知的。在“內部定量標準核酸”的情況中，核酸往往是并且同時用作反應有效性的對照及參 照以“量化”靶核酸，即測定“靶核酸”或“微生物核酸”的量。出于此目的，“內部定量標準核酸”與“靶核酸”或“微生物核酸”一起經(jīng)歷所有可能的樣品制備步驟。此外，它貫穿整個方法在同一反應混合物內加工。“內部定量標準核酸”必須在存在或沒有靶核酸的這兩種情況中都直接或間接地生成可檢測信號。出于此目的，在每項測試中必須仔細優(yōu)化“內部定量標準核酸”的濃度，以不干擾靈敏度，而且以例如在非常高的靶物濃度也生成可檢測信號。優(yōu)選地，“內部定量標準核酸”，即第一對照核酸的濃度范圍會包含每個反應100個拷貝至每個反應100000個拷貝的范圍?！皟炔慷繕藴屎怂帷钡目赡軡舛瓤梢允抢鐚τ贖iv 1000個拷貝/反應，對于HCV 7500個拷貝/反應，但是可以對特定測定法改變這些濃度，如本領域技術人員已知的。就相應測定法的檢測限(LOD)而言，優(yōu)選地，“內部定量標準核酸”的濃度范圍是20-5000倍L0D，更優(yōu)選地，20-1000倍L0D，最優(yōu)選地，20-500倍L0D。反應混合物中“內部定量標準核酸”的終濃度取決于實現(xiàn)的定量測量范圍?！皟炔慷繕藴屎怂帷笨梢允抢鏒NA、RNA或PNA、裝甲的(armored)DNA或裝甲的RNA及其經(jīng)修飾形式。此外，在本發(fā)明的意義中，所述第二對照核酸充當“定性內部對照核酸”。“定性內部對照核酸”對于確定定性檢測測定法的測試結果的有效性是特別重要的至少在陰性結果的情況中，必須檢測出定性內部對照核酸，否則認為該測試自身是不起作用的。然而，在定性設置中，在陽性結果的情況中沒有必要必須檢出定性內部對照核酸。對于定性測試，重要的是反應的靈敏度得到保證，并且如此受到嚴格控制。因此，定性內部對照核酸的濃度必須相對較低，從而即使在略微抑制的情況中，認為測試是無效的。必須注意使其適應相應的測定法及其靈敏度。優(yōu)選地，“定性內部核酸”，即第二對照核酸的濃度范圍包含每個反應I個拷貝至每個反應1000個拷貝的范圍。就相應測定法的檢測限(LOD)而言，優(yōu)選地，其濃度在測定法的LOD和LOD的25倍數(shù)值之間。更優(yōu)選地，其在2倍和20倍LOD之間、或在2倍和15倍LOD之間、或在2倍和10倍LOD之間。甚至更優(yōu)選地，其在3倍和7倍LOD之間?！皺z測限”或“ LOD ”意指在預先規(guī)定的命中率的情況中樣品中可檢出的最低的核酸量或濃度。低“L0D”對應于高靈敏度，反之亦然?！癓0D”通常依靠單位“cp/ml”(特別是在核酸是病毒核酸時)，或者以IU/ml表示。“cp/ml”意指“每毫升的拷貝”，其中“拷貝”是相應核酸的拷貝。IU/ml代表“國際單位/ml”，指WHO標準。根據(jù)靶物，臨床分子診斷測定法中的LOD值通常低于1000cp/ml。優(yōu)選地，在本發(fā)明背景中實施的測定法中的LOD在I和500cp/ml 之間。

一種廣泛用于計算LOD的方法是“Probit (概率單位)分析”，其是一種分析刺激物(劑量)和可數(shù)性(quantal)(全有或全無)響應之間關系的方法。在典型的可數(shù)性響應實驗中，對動物組給予不同劑量的藥物。記錄每個劑量水平的百分比瀕死。然后，可以使用Probit分析來分析這些數(shù)據(jù)。Probit模型假定百分比響應與對數(shù)劑量的關系呈累積正態(tài)分布。也就是說，可以使用對數(shù)劑量作為變量來從累積法線(cumulative normal)中讀出百分比瀕死。使用正態(tài)分布而不是其它概率分布，影響在可能的劑量的高和低末端處的預測響應率，但是接近中間具有很少的影響。“Probit分析”可以以獨特的“命中率”應用。如本領域中已知的，“命中率”通常以百分比[%]表示，并且指示在特定濃度的分析物時陽性結果的百分比。因此，例如，LOD可以以95%命中率測定，這意味著對95%有效結果呈陽性的背景計算L0D。術語“引物”在本文中如本領域熟練技術人員已知的那樣使用，指能夠通過模板依賴性DNA聚合酶“引發(fā)” DNA合成的“寡聚化合物”，主要指“寡核苷酸”，但也指“經(jīng)修飾的寡核苷酸”，即例如寡核苷酸的3’端提供游離的3’ -OH基團，可以通過建立3’至5’磷酸二酯連接的模板依賴性DNA聚合酶對所述游離的3’ -OH基團附著其它“核苷酸”，其中使用三磷酸脫氧核苷且其中釋放焦磷酸。術語“探針”在本發(fā)明上下文中也是寡核苷酸，但是具有特定功能其與反應混合物中的其它核酸雜交，優(yōu)選地，以實現(xiàn)其檢出。因此，優(yōu)選地，探針特異性結合某些核酸。優(yōu)選地，探針攜帶至少一種標記物。例如，可以用不同染料標記探針，從而可以彼此獨立地檢測并測量相應的探針?！皹擞浳铩保?jīng)常稱為“報告基團”，一般是使核酸，特別是“寡聚化合物”或“經(jīng)修飾的寡核苷酸”，以及任何與其結合的核酸與樣品的剩余部分可區(qū)別的基團(已經(jīng)附著“標記物”的核酸也可以稱作經(jīng)標記的核酸結合化合物、經(jīng)標記的探針或僅探針)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的標記物是熒光標記物，其是例如“熒光染料”，如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料。依照本發(fā)明的優(yōu)選的“熒光染料”是FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan、CY5. 5、LC-紅 640、LC-紅 705。 對于上文描述的方法，核酸可以以雙鏈或者單鏈形式存在，其中在實施該方法前通過加熱(即熱變性)使雙鏈核酸變性，即變成單鏈。在另一個優(yōu)選的實施方案中，引物和/或探針可以是經(jīng)過化學修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。“可檢測信號”是由化合物諸如“微生物核酸”、“內部對照核酸”或“定量標準核酸”“生成”的信號，其使所述化合物與樣品的剩余部分可區(qū)別。依照本發(fā)明，可以以定性方式量化或分析所述“可檢測信號”。“可檢測信號”可以是例如放射性或光學諸如發(fā)光信號。依照本發(fā)明的優(yōu)選的“可檢測信號”是由“熒光染料”發(fā)射的熒光信號。PCR反應的“抑制”或“阻抑”指與大多數(shù)樣品中觀察到的標準反應相比不太有效的PCR反應。可以在對照和/或靶物增長曲線的熒光水平降低中、在延遲的CT值中、在增長曲線的斜率變化中、在轉折點或反應特征的其它特征的變化中看到“抑制”或“阻抑”效應?！耙种啤被颉白枰帧毙梢栽醋宰兓臉悠分苽湫ЯΑ悠废嚓P效應、抑制擴增和/或檢測反應的媒介物的可能的且經(jīng)常不可預測的存在、和其它原因。因此，可能的情況是，樣品由于不成功的提取規(guī)程或其它基于樣品的因素而判斷為呈陰性，而要檢測并量化的微生物核酸實際上存在于該樣品中?！吧伞币馕吨苯踊蜷g接地產生。因此，在“可檢測信號”的上下文中，“生成”可以意指“直接產生”(例如在發(fā)射熒光信號的熒光染料的情況中)，或者“間接產生”(在“引發(fā)”或“誘導”的意義中)，諸如“微生物核酸”經(jīng)由“標記物”(諸如“熒光染料”)，或者經(jīng)由攜帶“標記物”(諸如“熒光染料”)的核酸探針“生成” “可檢測信號”。如本領域技術人員已知的，術語“特異性”或“特異性雜交”在引物和探針的上下文中暗指對獨特的核酸“特異性”的引物或探針在嚴格條件下結合所述核酸。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的方法中使用的引物和探針與微生物核酸和/或第一和第二對照核酸的序列部分至少80%相同?！熬酆厦告準椒磻?(PCR)披露于美國專利 No. 4，683，202,4, 683，195,4, 800，159和4，965，188等等，并且是用于本發(fā)明方法的最優(yōu)選的核酸擴增技術。PCR通常采用兩種或更多種結合選擇的核酸模板(例如DNA或RNA)的寡核苷酸引物。在本發(fā)明中有用的引物包括能夠在微生物核酸或定量標準核酸的核酸序列內充當核酸合成的起始點的寡核苷酸。可以通過常規(guī)方法從限制性消化物純化引物，或者其可以合成生成。優(yōu)選地，引物是單鏈以在擴增中實現(xiàn)最大效率，但是引物也可以是雙鏈。首先，將雙鏈引物變性，即處理以將鏈分開。使雙鏈核酸變性的一種方法通過加熱進行。“熱穩(wěn)定性聚合酶”是熱穩(wěn)定的酶聚合酶，即其是催化形成與模板互補的引物延伸產物，并且在受到升高的溫度處理達實現(xiàn)雙鏈模板核酸變性必需的時間時沒有不可逆地變性的酶。一般地，合成在每條引物的3’端起始，并且沿著模板鏈以5’到3’方向進行。熱穩(wěn)定性聚合酶已經(jīng)例如自黃色棲熱菌(Thermus f Iavus)、紅色棲熱菌(T. rubber)、嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)、水生棲熱菌(T. aquaticus)、乳棲熱菌(T.1acteus)、紅色棲熱菌(T. rubens)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)和熾熱甲燒嗜熱菌(Methanothermus fervidus)分離。不過，非熱穩(wěn)定性聚合酶也可以在PCR測定法中采用，只要該酶得到補充。如果模板核酸是雙鏈的，那么有必要在可以使用其作為PCR中的模板前將兩條鏈分開?？梢酝ㄟ^任何合適的變性方法，包括物理、化學或酶手段來實現(xiàn)鏈分開。一種分開核酸鏈的方法牽涉加熱核酸，直至其變性占優(yōu)勢(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性)。使模板核酸變性必需的加熱條件會取決于例如緩沖鹽濃度和變性的核酸的長度和核苷酸組成，但是范圍通常為約90° C至約105° C達某個時間，該時間取決于反應特征諸如溫度和核酸長度。變性通常實施約3秒至4分鐘(例如5秒至2分30秒，或10秒至1. 5分鐘)。如果通過加熱來使雙鏈模板核酸變性，那么允許反應混合物冷卻至如下的溫度，該溫度促進每條引物在微生物核酸和/或內部標準核酸上與其靶序列退火。用于退火的溫度通常是從約35° C至約75° C(例如約40° C至約70° C、約45° C至約66° C)。退火時間可以是從約5秒至約I分鐘(例如約10秒至約50秒；約15秒至約40秒)。然后，將反應混合物調節(jié)至促進或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以自退火引物發(fā)生延伸以生成與微生物核酸和/或內部標準核酸互補的產物的溫度。溫度應該足以從與核酸模板退火的每條引物合成延伸產物，但是不應高得以致于延伸產物從其互補模板變性(例如，一般地，用于延伸的溫度范圍為約35。C至約80。C(例如約40。C至約75。C;約45。C至約72。C)。延伸時間可以是約5秒至約5分鐘(例如約10秒至3分鐘；約15秒至約2分鐘；約20秒至約I分鐘)。新合成的鏈形成雙鏈分子，其可以在反應的隨后步驟中使用?？梢愿鶕?jù)需要經(jīng)常重復鏈分開、退火、和延伸步驟以產生期望量的與微生物核酸和/或定量標準核酸對應的擴增產物。反應中的限制因素是反應中存在的引物、熱穩(wěn)定性酶、和三磷酸核苷的量。優(yōu)選地，將循環(huán)步驟(即變性、退火、和延伸)至少重復一次。為了在檢測中使用，循環(huán)步驟數(shù)目會取決于例如樣品的性質。如果樣品是核酸的復雜混合物，那么將需要更多的循環(huán)步驟來擴增足以檢出的靶序列。一般地，將循環(huán)步驟至少重復約20次，但是可以重復多達40、60或甚至100次。除PCR以外的核酸擴增反應包含連接酶鏈式反應(LCR;Wu D. Y.和Wallace R. B. , Genomics4 (1989) 560-69 ；及 Barany F. , Proc. Natl. Acad. Sc1.USA88 (1991) 189-193);聚合酶連接酶鏈式反應(Barany F.，PCR Methodsand Applic. 1(1991)5-16)；缺口 -LCR(TO90/01069);修復鏈式反應(ItepairChain Reaction) (EP04 39182A2) > 3SR (Kwoh D. Y.等，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA86(1989) 1173-1177;Guatelli J. C.等,Proc. Natl. Acad. Sc1. USA87(1990) 1874-1878;W092/08808)、以及 NASBA(US5, 130，238)。此外，有鏈置換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)和Q-beta-擴增(關于綜述，參見例如WhelenA. C.和PersingD. H. , Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson R. D.和 Myers T. ff. , Curr OpinBiotechnol4(1993)41-47)。合適的核酸檢測方法是本領域技術人員已知的，并且記載于標準教科書如Sambrook J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 及 Ausubel F.等:CurrentProtocols in Molecular Biologyl987, J. Wiley and Sons, NY。在實施核酸檢測步驟前也可以有進一步的純化步驟，如例如沉淀步驟。檢測方法可以包括但不限于結合或插入特定的染料如溴化乙啶，其插入雙鏈DNA中，此后改變其熒光。也可以任選地在限制性消化后通過電泳方法分離純化的核酸，此后將其顯現(xiàn)。還有基于探針的測定法，其采用寡核苷酸與特定序列的雜交及隨后對雜合物的檢測。也有可能在本領域技術人員已知的其它步驟后對核酸測序。優(yōu)選的模板依賴性核酸聚合酶是ZOOTNA聚合酶及其突變。在本發(fā)明中有用的其它模板依賴性核酸聚合酶是Taq聚合酶和Tth聚合酶?？捎糜谝勒毡景l(fā)明方法的其它核酸聚合酶是熟練技術人員已知的。

在本發(fā)明的上下文中，微生物核酸和每種對照核酸結合攜帶不同標記物的不同探針，從而使其在檢測期間彼此可區(qū)別。因此，優(yōu)選地，所述不同探針攜帶不同熒光染料，其發(fā)射不同波長的熒光。可以在熒光檢測器的不同通道中彼此獨立地有利地檢測這些不同的熒光信號，如用于實施實時PCR的大多數(shù)裝置中使用的。還優(yōu)選地，在一個顯示器上在不同蔽片(mask)中，或在不同顯示器中顯現(xiàn)微生物核酸、第一對照核酸和第二對照核酸的結果。在本發(fā)明的意義中，核酸的“純化”、“分離”或“提取”指如下的情況在可以在上文提及的測定法之一中分析核酸前，必須從含有不同組分的復雜混合物的生物學樣品純化、分離或提取它們。經(jīng)常，對于第一步，使用允許核酸富集的方法。為了釋放細胞或病毒顆粒的內容物，可以用酶或化學品處理它們以溶解、降解或變性細胞壁或病毒顆粒。此過程通常稱為裂解。所得的含有這類裂解材料的溶液稱為溶胞物。在裂解過程中經(jīng)常遇到的問題是降解感興趣組分的其它酶，例如降解核酸的脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在裂解規(guī)程的過程中與感興趣的組分接觸。這些降解酶也可以存在于細胞外部或者可以在裂解前已經(jīng)在不同細胞區(qū)室中空間分開。當發(fā)生裂解時，感興趣的組分變得暴露于所述降解酶。在此過程期間釋放的其它組分可以例如是屬于脂多糖類家族的內毒素，其對細胞有毒性，并且可以對意圖用于人或動物療法的產品引起問題。有多種手段來處理上文提及的問題。當意圖釋放核酸時，常見的是使用離液劑諸如硫氰酸胍或陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解先前描述的酶或不想要的蛋白質的蛋白酶也是一項優(yōu)點。然而，這可能產生另一個問題，因為所述物質或酶在隨后的步驟中可以干擾試劑或組分?？梢栽谏衔奶峒暗倪@類裂解或樣品制備過程中有利地使用的酶是如下的酶，其切割蛋白質底物中的酰胺連接，并且分類為蛋白酶，或(互換地)肽酶(參見 Walsh,1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, ff. H. Freeman and Company, SanFrancisco，第3章)。現(xiàn)有技術中使用的蛋白酶包含堿性蛋白酶(W098/04730)或酸性蛋白酶(US5，386，024)。在現(xiàn)有技術中已經(jīng)在核酸分離中廣泛用于樣品制備的蛋白酶是來自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白酶K (參見例如Sambrook J.等，MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 1989),其在中性pH左右是有活性的，并且屬于本領域技術人員稱為枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶家族。對上文提及的裂解或樣品制備方法中的使用特別有利的是酶Esperase,即一種在高堿度和于高溫兩者都保留其活性的強力的蛋白酶(EP1201753)。在裂解步驟后的樣品制備步驟中，進一步富集感興趣的組分。如果感興趣的非蛋白質性組分是例如核酸，那么通常在將它們在基于探針的測定法中使用前從復雜的裂解混合物提取它們。有數(shù)種用于核酸純化的方法-序列依賴性的或生物特異性的方法如例如·親和層析·與固定化的捕捉寡核苷酸雜交-不依賴于序列的或物理化學的方法如例如·用例如酚-氯仿進行的液體-液體萃取·用例如純乙醇進行的沉淀·用濾紙進行的提取·用微團形成劑如鯨蠟基三甲基溴化銨進行的提取

·結合固定化的嵌合染料，例如吖啶衍生物·吸附至娃膠或娃藻土(diatomic earth) 在離液序列高的(chaotropic)條件下吸附至磁性玻璃顆粒(MGP)或有機娃燒顆粒。對于純化目的特別感興趣的是將核酸吸附至玻璃表面，盡管其它表面也是有可能的。近年來已經(jīng)提出了許多用于將核酸自其天然環(huán)境分離的規(guī)程，這通過使用其對玻璃表面的結合行為來進行。如果未修飾的核酸是靶物，那么優(yōu)選將核酸直接結合至具有硅土表面的材料，因為核酸不必進行修飾，而且甚至可以結合天然核酸，等等。這些方法由多份文件詳細地描述。例如，在 Vogelstein B.等，Proc. Natl. Acad. USA76 (1979)615-9 中，提出了一種用于將來自瓊脂糖凝膠的核酸在存在碘化鈉的情況下結合到磨砂火石玻璃的規(guī)程。在存在過氯酸鈉的情況下在玻璃粉上自細菌純化質粒DNA記載于Marko Μ. A.等，Anal.Biochem. 121 (1982)382-387。在DE-A3734442中，描述了在玻璃纖維濾器上分離單鏈M13噬菌體DNA，其通過使用乙酸將噬菌體顆粒沉淀,并用高氯酸鹽裂解噬菌體顆粒來進行。清洗結合到玻璃纖維濾器的核酸，然后用含有甲醇的Tris/EDTA緩沖液洗脫。一種用于從λ噬菌體純化DNA的類似規(guī)程記載于Jakobi R.等，Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201。該規(guī)程需要使核酸在離液鹽溶液中選擇性結合玻璃表面，并將核酸與污染物諸如瓊脂糖、蛋白質或細胞殘留物分開。為了將玻璃顆粒與污染物分開，可以將該顆粒離心或者將流體抽過玻璃纖維濾器。然而，這是一個限制步驟，其阻止該規(guī)程用于加工大量樣品。在通過添加鹽和乙醇進行沉淀后使用磁性顆粒來固定化核酸是更有利的，并且記載于例如AldertonR. P.等，S·，Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 和 PCT GB91/00212 中。在此規(guī)程中，將核酸與磁性顆粒一起凝集。通過應用磁場并實施清洗步驟將凝集物與初始溶劑分開。在一個清洗步驟后，將核酸溶解于Tris緩沖液中。然而，此規(guī)程具有的缺點在于沉淀對于核酸不是選擇性的。更確切地，也將多種固體和溶解的物質凝集。因此，不可以使用此規(guī)程來除去可能存在的、特定酶促反應的大量的任何抑制劑。磁性多孔玻璃也是市場上可購得的，其在多孔特殊玻璃基質中含有磁性顆粒，并且用含有鏈霉親合素的層覆蓋。如果生物學材料例如蛋白質或核酸在復雜的制備步驟中修飾，從而它們共價結合生物素，那么可以使用此產品來分離它們。可磁化的特殊吸附劑證明為對于自動樣品制備是非常有效且合適的。出于此目的，使用亞鐵磁性和鐵磁性以及超順磁性(superparamagnetic)色素。最優(yōu)選的MGP和使用磁性玻璃顆粒的方法是那些記載于W001/37291中的。依照R. Boom等(J ClinMicrobiol. 28(1990),495-503)的方法特別可用于本發(fā)明上下文中的核酸分離。在將包含靶核酸的核酸自其天然環(huán)境純化或分離后，可以檢測靶核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括避免污染的步驟。例如，一種利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法記載于美國專利No. 5，035, 996,5, 683，896和5，945，313以降低或消除一次熱循環(huán)儀運行和下一次之間的污染。另外，標準的實驗室防護實踐和規(guī)程在實施本發(fā)明的方法時是期望的。防護實踐和規(guī)程包括但不限于為方法的不同步驟分開工作區(qū)、防護罩、屏障濾器移液管尖端和專用排氣式移液管。全體人員的一致防護實踐和規(guī)程對于診斷實驗室操作臨床樣品中的準確度是必需的。優(yōu)選地，上文所列的方法基于供體熒光模塊和接受熒光模塊之間的熒光共振能量轉移(FRET)。代表性的供體熒光模塊是熒光素，而代表性的相應接受熒光模塊包括LC-紅640,LC-紅705、Cy5、和Cy5. 5。通常，檢測步驟包括以供體熒光模塊吸收的波長激發(fā)樣品，并且顯現(xiàn)和/或測量由相應的接受熒光模塊發(fā)射的波長。依照本發(fā)明，檢測繼之以定量FRET。優(yōu)選地，在每個循環(huán)步驟后實施檢測步驟。最優(yōu)選地，實時實施檢測步驟。通過使用商品化實時PCR儀(例如LightCycIer 或TaqMan :)，PCR擴增和擴增產物的檢測可以
以顯著縮短的循環(huán)時間在單個封閉的反應區(qū)室，諸如例如小杯中組合。由于檢測與擴增同時發(fā)生，實時PCR方法消除對操作擴增產物的需要，并且降低擴增產物間交叉污染的風險。實時PCR大大地縮短周轉時間，并且是臨床實驗室中常規(guī)PCR技術的一種有吸引力的備選。下列專利申請描述了如在LightCycler 技術中使用的實時PCR :W097/46707、W097/46714和W097/46712。LightCycler 儀是一種與利用高質量光學鏡的微體積熒光計組合的快速熱循環(huán)儀。此快速熱循環(huán)技術使用薄玻璃小杯作為反應容器。反應室的加熱和冷卻通過交替加熱的和周圍的空氣來控制。由于空氣的質量低以及小杯的表面積與體積的比率高，可以在熱室內實現(xiàn)非常快速的溫度交換速率。TaqMan 技術利用用兩種熒光模塊標記的單鏈雜交探針。當?shù)谝粺晒饽K用 合適波長的光激發(fā)時，吸收的能量依照FRET的原理轉移到第二熒光模塊。一般地，第二熒光模塊是猝滅劑分子。以此形式使用的典型熒光染料是例如FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5. 5，等等。在PCR反應的退火步驟期間，經(jīng)標記的雜交探針結合靶核酸(即擴增產物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到Taq或如熟練技術人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的Z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。結果，激發(fā)的熒光模塊和猝滅劑模塊變成彼此空間分開。因此，在沒有猝滅劑的情況中激發(fā)第一熒光模塊后，可以檢出來自第一突光模塊的突光發(fā)射。在上文描述的兩種檢測形式中，發(fā)射信號的強度可以與初始靶核酸分子數(shù)目相關聯(lián)。
作為FRET的一種備選，可以使用雙鏈DNA結合染料諸如熒光DNA結合染料(例如SYBRGREEN I 或SYBRGOLD (Molecular Probes))來檢測擴增產物。在與雙鏈核酸相互作用后，這類熒光DNA結合染料在用合適波長的光激發(fā)后發(fā)射出熒光信號。也可以使用雙鏈DNA結合染料諸如核酸嵌入染料。當使用雙鏈DNA結合染料時，通常實施解鏈曲線分析以確認擴增產物的存在。使用本發(fā)明的實時PCR方法，也可以使用與FRET結合的分子信標來檢測擴增產物的存在。分子信標技術使用用第一熒光模塊和第二熒光模塊標記的雜交探針。第二熒光模塊一般是猝滅劑，并且熒光標記物通常位于探針的每個末端。分子信標技術使用具有允許二級結構形成(例如發(fā)夾)的序列的探針寡核苷酸。由于探針內二級結構形成，兩種熒光模塊在探針在溶液中時為空間接近。在與擴增產物雜交后，探針的二級結構受到破壞，并且熒光模塊變得彼此分開，使得在用合適波長的光激發(fā)后，可以檢出第一熒光模塊的發(fā)射。因此，使用FRET的上文描述的方法在依照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，其中所述探針包含允許所述第一和第二熒光模塊之間的空間接近的核酸序列。僅可以在熒光模塊直接局 部接近時，且在供體熒光模塊的發(fā)射光譜與接受熒光模塊的吸收光譜重疊時發(fā)生有效的FRET。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述供體和接受熒光模塊在所述探針上在彼此的不超過5個核苷酸內。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述接受熒光模塊是猝滅劑。如上文描述的，在TaqMan形式中，在PCR反應的退火步驟期間，經(jīng)標記的雜交探針結合靶核酸(即擴增產物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到Taq或如熟練技術人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的Z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在依照本發(fā)明的方法中，擴增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。依照本發(fā)明的方法可以有利地應用于病毒核酸。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物核酸是病毒核酸。在病毒核酸中，有利地，可以對HCV應用依照本發(fā)明的方法。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物核酸是HCV的核酸。然而，必須理解的是也可以對任何其它微生物核酸應用本發(fā)明。在下文中描述了如何基于內部標準品在TaqMan形式中實施定量結果計算的例子。從來自整個PCR運行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)計算滴度。含有靶核酸諸如微生物核酸和充當內部定量標準核酸的第一對照核酸的一組樣品在使用如規(guī)定的溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷PCR。在PCR概況期間的選定溫度和時間，通過過濾光照明樣品，并且對每份樣品針對靶核酸和內部定量標準核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成PCR運行后，處理熒光讀數(shù)以產生內部定量標準核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。在數(shù)次似真性檢查后，對定量標準核酸和靶核酸計算肘值(elbow value) (CT)。肘值定義為祀核酸或內部定量標準核酸的突光與預定閾值(突光濃度)相交的點。滴度測定基于如下的假定，即靶核酸和內部定量標準核酸以相同的效率擴增，且在計算的肘值，擴增并檢測相等量的靶核酸和定量標準核酸的擴增子拷貝。因此，(CTQS - CT靶物)與對數(shù)(靶物濃度/QS濃度)呈線性，其中“QS”代表內部定量標準核酸。然后，可以例如通過使用如下述等式中的多項式校正式計算滴度T T，=10(a(CTQS-CI^M^)2+b(CTQS-CI^M^)+c)已知多項式常數(shù)和內部定量標準核酸的濃度，因此該等式中唯一的變量是差(CTQS - CT 靶物)。在下文中描述了如何在TaqMan中實施定性結果計算的例子對來自整個PCR運行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)進行分析?？赡芎邪泻怂嶂T如微生物核酸和充當定性內部對照核酸的對照核酸的一組樣品在使用如規(guī)定的溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷PCR。在PCR概況期間的選定溫度和時間，通過過濾光照明樣品，并且對每份樣品針對靶核酸和定性內部對照核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成PCR運行后，處理熒光讀數(shù)以產生定性內部對照核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。對定性內部對照核酸和靶核酸(若存在的話)計算肘值(CT)。肘值定義為靶核酸或內部定量標準核酸的熒光與預定閾值(熒光濃度)相交的點。如果獲得在規(guī)定范圍內的CT并且如果熒光超過預定的最小熒光強度，那么定性內部對照是有效的。如果未獲得靶物CT，那么定性內部對照就必須是有效的。如果獲得指示樣品中靶核酸存在的靶物CTjP么定性內部對照可以是有效或無效的。在本發(fā)明的意義中優(yōu)選的是上文描述的方法之任一，其中在一種對照試劑內提供所述第一和所述第二對照核酸。有利地，可以對靶向微生物核酸的任何相應測定法使用如下的概念，即具有不同濃度的第一和第二對照核酸的對照試劑用于可靠的定性檢測并且同時用于可靠的量化。因此，本發(fā)明的另一個方面是不同濃度的第一和第二對照核酸用于通過實時PCR來同時檢測并量化微生物核酸的用途。進一步優(yōu)選的是上文描述的用途，其中通過相同引物對或不同引物對擴增所述第一和第二對照核酸，但是它們與不同探針雜交。

特別有利的是此概念在依照本發(fā)明的方法中的用途。因此，在另一個方面，本發(fā)明關注不同濃度的第一和第二對照核酸依照上文描述的一種或多種方法用于同時檢測并量化微生物核酸的用途。本發(fā)明還提供了用于通過實時PCR來同時檢測并量化生物學樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及所述第一和第二對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與由所述一種或多種引物對擴增的每種序列特異性雜交的探針，其中在一種對照試劑內提供所述第一和第二對照核酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于依照上文描述的任何方法同時檢測并量化生物學樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及所述第一和第二對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與由所述一種或多種引物對擴增的每種序列特異性雜交的探針。本發(fā)明的一個進一步的優(yōu)選方面是如上文所描述的試劑盒，其中通過相同引物對擴增所述第一和第二對照核酸，但是它們與不同探針雜交，如此提供競爭性設置。然而，必須理解的是本發(fā)明也包括非競爭性或部分競爭性測定法和用于實施相應方法的試劑盒。如本領域中已知的，這類試劑盒可以進一步包含可以在樣品制備規(guī)程期間使用的塑料器皿(如例如96孔或384孔形式的微量滴定板或者由例如Eppendorf, Hamburg, Germany制造的普通反應管)和用于實施依照本發(fā)明方法的任何其它試劑。因此，所述試劑盒可以另外含有對核酸具有親和力的材料，優(yōu)選地，對核酸具有親和力的材料包含具有硅土表面的材料。優(yōu)選地，具有硅土表面的材料是玻璃。最優(yōu)選地，對核酸具有親和力的材料是包含磁性玻璃顆粒的組合物。試劑盒可以進一步或另外包含蛋白酶試劑和含有例如離液劑、去污劑或醇或其混合物的裂解緩沖液，從而允許裂解細胞。可以在管或貯存容器中分開地提供依照本發(fā)明的試劑盒的這些組分。根據(jù)組分的性質，這些甚至可以在單個管或貯存容器中提供。試劑盒可以進一步或另外包含適合于在核酸與磁性玻璃顆粒結合時對其進行清洗步驟的清洗溶液。此清洗溶液可以在如上文所描述的具有酸性PH且沒有乙醇和/或離液劑的一種或多種緩沖溶液中含有乙醇和/或離液劑。清洗溶液或其它溶液經(jīng)常以儲備溶液提供，所述儲備溶液在使用前必須稀釋。所述試劑盒可以進一步或另外包含洗脫液或洗脫緩沖液，即用于洗脫與磁性玻璃顆粒結合的核酸的溶液或緩沖液(例如IOmM Tris, ImM EDTA, pH8. O)或純水。此外，可以存在別的試劑或緩沖溶液，其可以用于核酸的純化過程。優(yōu)選地，所述試劑盒含有具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。還優(yōu)選的是，所述試劑盒含有具有逆轉錄酶活性的酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒含有具有5’至3’外切核酸酶活性和逆轉錄酶活性的酶聚合酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，將依照本發(fā)明的方法插入分析系統(tǒng)內實施的方法的順序中，由此優(yōu)選地，形成可自動化的過程。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選方面是以下內容用于通過實時PCR來同時檢測并量化生物學樣品中的微生物核酸的分析系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含-包含裂解緩沖液和容器的樣品制備模塊，用于分離和純化所述微生物核酸-包含反應接受器的擴增和檢測模塊，其中實施上文描述的方法-如上文描述的試劑盒。有利地，樣品制備模塊可以包含用于上文描述的樣品制備規(guī)程的組分，即例如磁性玻璃顆粒和用于將它們與溶液分開的磁體、蛋白酶試劑、離液鹽溶液和一個或多個含有粗制樣品和樣品制備需要的試劑的容器。擴增和檢測模塊中的反應接受器可以例如是微量滴定板、離心瓶、裂解管、或適合于含有依照本發(fā)明的反應混合物的任何其它類型的容器。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述分析系統(tǒng)含有貯存模塊，其含有用于實施本發(fā)明方法的試劑。所述貯存模塊可以進一步含有對本發(fā)明的方法有用的其它組分，例如一次性用品諸如移液管尖端或甚至要在擴增和檢測模塊內用作反應接受器的容器。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述分析系統(tǒng)包含預分析系統(tǒng)模塊，用于將生物學樣品從初級管轉移到分析系統(tǒng)上可用的容器。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的 實施方案中，所述分析系統(tǒng)含有轉移模塊，用于將生物學樣品從樣品制備模塊轉移到擴增和檢測模塊。
盡管手動實施所述轉移是有可能的，但是優(yōu)選的是使用自動化系統(tǒng)，其中例如通過機器人裝置諸如例如如電動機驅動的移動架或機器人擺動臂實施轉移。可自動化方法意味著方法的步驟適合于用儀器或機器實施，所述儀器或機器能夠在很少或沒有人為外部控制或影響的情況中運行。自動化方法意味著用儀器或機器實施可自動化方法的步驟，所述儀器或機器能夠在很少或沒有人為外部控制或影響的情況中運行。僅可能必須手動完成該方法的制備步驟，例如必須將貯存容器充滿并放好位置，必須人為實施樣品的選擇以及本領域技術人員已知的其它步驟，例如控制計算機的操作。儀器或機器可以例如自動添加液體，混合樣品或于特定溫度實施溫育步驟。典型地，這類機器或儀器是由計算機控制的機器人，該計算機實施規(guī)定單一步驟和命令的程序。因此，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進一步包含用于控制系統(tǒng)組件的控制單元。這類控制單元可以包含用于確保所述分析系統(tǒng)的不同組件正確且以正確的時機工作并相互作用(例如以協(xié)調方式將組件諸如樣品移動到反應模塊)的軟件?？刂茊卧€可以包含運行實時操作系統(tǒng)(RTOS)(其是意圖用于實時應用的多任務操作系統(tǒng))的處理器。換言之，該系統(tǒng)處理器能夠管理實時約束，即從事件到系統(tǒng)應答的操作最后期限(與系統(tǒng)加載無關)。其以實時控制系統(tǒng)內的不同單元依照給定的指令正確運行并響應。依照本發(fā)明的用途、試劑盒和分析系統(tǒng)的所有其它優(yōu)選實施方案和實施方案的具體描述是那些對依照本發(fā)明的方法提述的。附圖描述



圖1a 在圖中顯示了商業(yè)COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1測試的定量實時PCR反應的內部對照增長曲線。PCR反應含有跨越5個IoglO范圍的HIV-1靶物濃度和靶物陰性樣品。如果反應中存在較高的靶物濃度(參見“靶物高度陽性”)，那么內部定量標準核酸(QS)達到的熒光水平顯著低于在不存在HIV-1靶物的PCR反應(參見“靶物陰性”)的情況中的。因為QS在所有靶物濃度都必須是有效的，從而能夠計算定量結果輸出的滴度，所以QS的最小熒光強度水平設置(“RFImin”)較低。表I中給出了三種商業(yè)測試COBASAmpIiPi^p/COBAS TaqMan HBV、HCV和HIV-1中定量結果輸出的RFImin設置。圖1b 在圖中顯示了商業(yè)COBAS AmpIiPr印/COBAS TaqMan HIV-1測試的實時PCR反應的內部對照增長曲線。所有PCR反應都含有HIV-1靶物陰性樣品。內部對照增長曲線的熒光水平約束在較窄的范圍內，并且定性內部對照核酸(IC)的最小熒光強度水平設置(“RFImin”)較高。在靶物陽性反應中，IC可以落到RFImin之下，并且可以變?yōu)闊o效；在靶物存在的情況中，PCR反應的結果仍然有效。表I中給出了如對測試COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV、HCV和HIV-1的定性結果輸出優(yōu)化的RFImin設置。圖2 裝甲的RNA顆粒的生成用于生成裝甲的RNA顆粒的表達載體和裝甲的RNA顆粒的電子顯微術。在大腸桿菌(E. coli)中構成裝甲的RNA顆粒。誘導Iac操縱子后，mRNA受到轉錄，其包含MS-2外殼蛋白的MS-2噬菌體基因、控制序列、包裝信號和在TrrnB終止子上游的質粒序列。在外殼蛋白翻譯后，自發(fā)發(fā)生顆粒組成，其包裝一個拷貝的mRNA。圖3
對含有HCV靶物、第一對照核酸和第二對照核酸的實時PCR反應獲得的標準化增長曲線。圖 4a HCV-RNA和QS的同時擴增。QS和HCV-RNA兩者的信號強度都低于在產生標準信號的反應中的(參見圖4b)。圖 4b HCV-RNA和QS的同時擴增。這兩種反應都產生標準熒光強度。為了與受抑制的熒光曲線比較(參見圖4a)，還要注意兩幅圖中的不同幅度。
實施例實施例1 :依照用于 獲得定性和定量結果輸出的不同標準來評估第一對照核酸。COBAS AmpIiPr印/COBAS TaqMan HBV、HCV 和 HIV-1 測試是商品化的實時 PCR 測試，其已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化以準確量化病毒靶物HBV、HCV和HIV-1。在全自動化COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng)(其包含用于將PCR反應混合物從樣品制備單元自動化轉移到擴增/檢測單元的對接(docking)站)上或者在手動轉移的COBAS AmpIiPr印/COBAS TaqMan系統(tǒng)上或者在COBASAmpIiPr印/COBAS TaqMan48系統(tǒng)上使用該測定法。使用COBAS AmpIiPr印/COBAS TaqMan HCV測試作為一個例子來調查用一組相同試劑提供同時的定量和定性測試結果的辦法。該測試具有15IU/mL的檢測限，并且顯示現(xiàn)有技術的靈敏度，與市場上的定量而且也是定性的HCV測試相當或比它們好。由于此較高的靈敏度，已經(jīng)有也使用該測試作為定性HCV測試的嘗試。定量測試的主要焦點是提供準確的HCV滴度，而定性測試的主要焦點是確保測定法的高靈敏度。由于最初開發(fā)COBASAmpIiPrep/COBAS TaqMan HCV測試用于定量監(jiān)測治療成功與否，對該測定法是否也可以在沒有任何變化的情況中使用以提供可靠的定性結果進行分析。對數(shù)據(jù)的審查揭示，在不太有效的PCR的罕見事件中，具有其目前數(shù)據(jù)分析設置的定量測試沒有保證15IU/mL的靈敏度。在下文給出了受到抑制，但是顯示有效的QS結果且不能檢出靶物(2183IU/mL)的PCR反應的一個例子在圖4a中顯示了受抑制的PCR反應，其產生由于有效的QS所致的有效結果和“未檢出靶物”的結果。QS是有效的，因為其超過對應于O. 8個相對熒光單位的熒光閾值設置。相同樣品的重復測試顯示了標準的PCR反應和2183IU/mL的HCV滴度結果(圖4b)。因此，沒有任何變化的定量COBAS AmpI iPrep/COBAS TaqMan HCV測試不能用作定性測試。使用上文提及的測試，優(yōu)化IC/QS對照核酸的數(shù)據(jù)分析參數(shù)設置從而實現(xiàn)可靠的定性結果輸出。為了證明普遍適用性，另外，在COBASAmp I iPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng)上對所有三種商業(yè)HBV、HCV和HIV-1測定法采取優(yōu)化。通過顯著提高參數(shù)設置中的最小相對熒光強度(RFImin)閾值，確保所有三種定量測試的靈敏度，從而可以使用它們來提供可靠的定性結果輸出。在下文表I中顯示了相關參數(shù)設置表1:商品化定量應用和定性應用中三種COBAS Amp I iPrep/COBAS TaqMan測試的內部對照的RFImin設置。
權利要求
1.一種用于同時檢測及量化生物學樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括 a)分離并純化所述微生物核酸， b)提供反應混合物，其包含至少第一對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及與所述對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與每一種由所述一種或多種引物對擴增的序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述對照核酸與不同探針雜交， c)向所述反應混合物添加所述生物學樣品， d)實施一個或多個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟，所述擴增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴增產物，并且生成自所述對照核酸衍生的擴增產物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對擴增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應的接受熒光模塊標記，且每種探針攜帶不同熒光染料， e)檢測及測量由所述擴增產物生成并且與所述對照核酸和所述微生物核酸的濃度成比例的熒光信號，其中所述對照核酸的擴增產物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴增產物的情況中指示所述反應混合物中發(fā)生擴增。
2.權利要求1的方法，其中依照不同標準來分析所述第一對照核酸以充當定量標準核酸或定性內部對照核酸。
3.一種用于同時檢測及量化生物學樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括 a)分離并純化所述微生物核酸， b)提供反應混合物，其包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及與所述對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與每一種由所述一種或多種引物對擴增的序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述第一對照核酸和所述第二對照核酸與不同探針雜交， c)向所述反應混合物添加所述生物學樣品， d)實施一個或多個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟，所述擴增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴增產物，并且生成自所述第一對照核酸和所述第二對照核酸衍生的擴增產物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對擴增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應的接受熒光模塊標記，且每種探針攜帶不同熒光染料， e)檢測及測量由所述第一對照核酸和所述微生物核酸的擴增產物生成并與其濃度成比例的熒光信號，和/或同時檢測由所述第二對照核酸的所述擴增產物生成的熒光信號，其中所述第二對照核酸的擴增產物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴增產物的情況中指示所述反應混合物中發(fā)生擴增。
4.權利要求3的方法，其中所述第一對照核酸是定量標準核酸，而所述第二對照核酸是定性內部對照核酸。
5.前述權利要求中任一項的方法，進一步包括 在步驟e)中通過比較由所述微生物核酸和所述第一對照核酸生成的信號來測定所述生物學樣品中所述微生物核酸的數(shù)量。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中擴增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。
7.權利要求3的方法，其中所述第一對照核酸以所述微生物核酸的檢測限的20-5000倍的濃度存在，且其中所述第二對照核酸以所述微生物核酸的檢測限的1-25倍的濃度存在。
8.權利要求3的方法，其中在一種對照試劑內提供所述第一和所述第二對照核酸。
9.不同濃度的第一和第二對照核酸用于通過實時PCR來同時檢測及量化微生物核酸的用途。
10.權利要求9的用途，其中所述第一和第二對照核酸通過相同引物對或不同引物對來擴增，但是與不同探針雜交。
11.一種用于通過實時PCR來同時檢測及量化生物學樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及與所述第一和第二對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與每一種由所述一種或多種引物對擴增的序列特異性雜交的探針，其中在一種對照試劑內提供所述第一和第二對照核酸。
12.一種用于依照權利要求1至8中任一項的方法同時檢測及量化生物學樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對照核酸、與所述微生物核酸的獨特序列部分以及與所述第一和第二對照核酸的獨特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對、和與每一種由所述一種或多種引物對擴增的序列特異性雜交的探針。
13.權利要求11或12中任一項的試劑盒，其中所述第一和第二對照核酸通過相同引物對來擴增，但是與不同探針雜交。
14.一種用于通過實時PCR來同時檢測及量化生物學樣品中的微生物核酸的分析系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含 -包含裂解緩沖液和容器的樣品制備模塊，用于分離和純化所述微生物核酸， -包含反應接受器的擴增和檢測模塊，其中實施依照權利要求1至8中任一項的方法， -依照權利要求11至13中任一項的試劑盒。
15.權利要求14的分析系統(tǒng)，其另外包含轉移模塊，用于將所述生物學樣品從所述樣品制備模塊轉移到所述反應接受器。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用至少第一對照核酸、或不同濃度的第一和第二對照核酸來定性和定量檢測微生物核酸的新的方法和用途。該方法基于核酸的擴增，優(yōu)選地，聚合酶鏈式反應。進一步提供了包含用于實施所述方法和用途的組分的試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GK103069007SQ201180039653
公開日2013年4月24日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權日2010年7月29日
發(fā)明者D.西茲曼, R.巴比爾, F.伯格曼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司