專利名稱：動物模型及治療分子的制作方法
動物模型及治療分子
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及非人動物和細(xì)胞，它們被工程化而含有外源DNA，如人免疫球蛋白基因DNA，本發(fā)明還涉及它們在醫(yī)學(xué)和疾病研究中的應(yīng)用，產(chǎn)生非人動物和細(xì)胞的方法，以及由這種動物產(chǎn)生的抗體和抗體鏈及其衍生物。為了解決人源化抗體的問題，許多公司著手產(chǎn)生具有人免疫系統(tǒng)的小鼠。使用的策略是敲除ES細(xì)胞中的重鏈和輕鏈基因座并且用設(shè)計為表達(dá)人重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)這些遺傳損害。盡管可以產(chǎn)生完全人抗體，但是這些模型具有一些主要限制:(i)重鏈和輕鏈基因座的大小(均幾Mb)使得在這些模型中不能導(dǎo)入完整基因座。結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因品系具有非常有限的V區(qū)組成部分，喪失了大多數(shù)恒定區(qū)并且重要的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)未包含在轉(zhuǎn)基因中。(ii)產(chǎn)生大插入物轉(zhuǎn)基因品系的極低效率以及將這些雜交進(jìn)重鏈和輕鏈敲除品系以及使它們再次純合的復(fù)雜性和所需要的時間，限制了可以被分析而優(yōu)化表達(dá)的轉(zhuǎn)基因
品系數(shù)量。(iii)個體抗體親和性很少會達(dá)到從完整動物(非轉(zhuǎn)基因)中可獲得的程度。W02007117410揭示了表達(dá)嵌合抗體的嵌合構(gòu)建體。W02010039900揭示了具有編碼嵌合抗體的基因組的敲入(knock in)細(xì)胞和哺乳動物。本發(fā)明提供了在非人類哺乳動物中產(chǎn)生包含人類Ig可變區(qū)的抗體的方法，本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生這種抗體的非人動物模型。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)；(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合抗體輕鏈或重鏈的所有組成成分(repertoire)。一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重 鏈的所有組成成分。
一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)。一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生非人類細(xì)胞或哺乳動物的方法，包括在非人類哺乳動物細(xì)胞基因組例如ES細(xì)胞基因組中插入:(a)多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)在宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游 '及(b)任選地，一或多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)在宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游和/或一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λJ區(qū)在宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游；所述插入是使得所 述非人類細(xì)胞或哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體的所有組成成分，其中步驟(a)和(b)可以任意順序進(jìn)行并且(a)和(b)步驟的每一步可以逐步或單步進(jìn)行。插入可以通過同源重組實現(xiàn)。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生特異于希望抗原的抗體或抗體鏈的方法，所述方法包括用希望抗原免疫本文揭示的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物及回收所述抗體或抗體鏈。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生完全人源化抗體的方法，包括用希望抗原免疫本文揭示的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，回收所述抗體或產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞，然后例如通過蛋白質(zhì)或DNA工程用人類恒定區(qū)置換非人類哺乳動物恒定區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化抗體和抗體鏈，所述抗體和抗體鏈均是嵌合的(例如小鼠-人類)及完全人源化形式，以及所述抗體和抗體鏈的片段和衍生物，以及涉及所述抗體、抗體鏈和片段在醫(yī)學(xué)包括診斷中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及本文揭示的非人類哺乳動物作為模型檢測藥物和疫苗的應(yīng)用。附圖簡述

圖1-8示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人類BAC的重復(fù)過程。圖9-18更詳細(xì)示出針對IgH和κ基因座的圖1_8的過程。圖19和20示出在嵌合小鼠中的抗體產(chǎn)生原理。圖21示出在小鼠染色體中人類DNA的可能插入位點。圖22-26示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人類BAC的另一重復(fù)過程。
圖27-29示出宿主VDJ區(qū)倒位的機(jī)制。圖30示出使用RMCE方法插入質(zhì)粒的原理證據(jù)。圖31示出在著陸區(qū)(Landing Pad)中相繼的RMCE-整合。圖32示出證實成功插入著陸區(qū)中。圖33示出3’末端消除(End Curing)的PCR證實。圖34示出BAC#1插入和PCR診斷。圖35示出JH和JK使用。圖36示出DH使用。圖37示出在來自嵌合小鼠的人類VDJCy轉(zhuǎn)錄物中⑶R-H3長度分布。圖38示出在IGH-VDI或IGK-VJ連接中缺失和插入核苷酸數(shù)的分布。圖39示出每個VH內(nèi)JH使用的分布。圖40示出每個VH內(nèi)DH使用的分布。圖41示出在V J連接點核苷酸獲得或喪失產(chǎn)生IGK變體。圖42示出J區(qū)內(nèi)的超變產(chǎn)生IGK變體。圖43示出連接多樣性產(chǎn)生功能性⑶S。SEQ ID No:1是大鼠轉(zhuǎn)換序列。SEQ ID No: 2是著陸區(qū)祀向載體的序列(長版本)。SEQ ID No: 3是著陸區(qū)靶向載體的序列(較短版本)。SEQ ID No:4是小鼠品系129轉(zhuǎn)換序列。SEQ ID No: 5是小鼠品系C57轉(zhuǎn)換序列。SEQ ID No:6是著陸區(qū)的5’同源臂。SEQ ID No:7 是寡核苷酸 HV2-5SEQ ID No:8 是寡核苷酸 HV4-4SEQ ID No: 9 是寡核苷酸 HV1-3SEQ ID No: 10 是寡核苷酸 HV1-2SEQ ID No: 11 是寡核苷酸 HV6-1SEQ ID No: 12 是寡核苷酸 CμSEQ ID No: 13 是寡核苷酸 KV1-9SEQ ID No: 14 是寡核苷酸 KV1-8SEQ ID No: 15 是寡核苷酸 KV1-6SEQ ID Νο:16 是寡核苷酸 KV1-5SEQ ID No: 17 是寡核苷酸 C κ。一般描述除非特別指出，小鼠的所有核苷酸坐標(biāo)是相應(yīng)于小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37的那些，例如 April2007ENSEMBL Release55.37h,如 NCBI37July2007(NCBI build37)(如 UCSC version mm9, 見 www.genome, ucsc.edu 和 http://genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.himl)。除非特別指出，人核苷酸坐標(biāo)是相應(yīng)于GRCh37(如UCSC versionhgl9, http://genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)、Feb2009ENSEMBL Release55.37的那些或者是相應(yīng)于NCBI36，Ensemble release54的那些。除非特別指出，大鼠核苷酸是相應(yīng)于 RGSC3.4Dec2004ENSEMBL release55.34w 或者 Baylor College of Medicine HGSCv3.4Nov2004 的那些(例如 UCSC rn4,見 www.genome, ucsc.edu 和 http: //genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)。在本發(fā)明中，我們揭示了在非人類哺乳動物如小鼠中構(gòu)建嵌合人類重鏈和輕鏈基因座的方法。在小鼠中進(jìn)行的研究只是為了例證，除非特別指出，在小鼠中進(jìn)行的研究可以包括所有非人類哺乳動物，優(yōu)選小鼠作為非人類哺乳動物?！矫?，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物κ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或抗體鏈的所有組成成分。另一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物κ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)，及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類 J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體的所有組成成分。任選地，所述非人類哺乳動物基因組被修飾為阻止完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。一方面，插入的人類DNA包含至少50%的人類重鏈可變(V)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個方面全部人類V基因。一方面，插入的人類DNA包含至少50%的人類重鏈多樣性(D)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個方面全部人類D基因。一方面，插入的人類DNA包含至少50%的人類重鏈連接(J)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個方面全部人類J基因。一方面，插入的人類DNA包含至少50%的人類輕鏈可變(V)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個方面全部人類輕鏈V基因。一方面，插入的人類DNA包含至少50%的人類輕鏈連接(J)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個方面全部人類輕鏈J基因。插入的人類基因可衍生自相同或不同個體，或者是合成的或者代表人類共有序列。一方面，盡管V、D和J區(qū)的數(shù)目在人類個體之間是可變的，但是據(jù)認(rèn)為在重鏈上有51個人類V基因、27個D基因和6個J基因，在κ輕鏈上有40個人類V基因和5個J基因以及在λ輕鏈上有29個人類V基因和4個J基因(Janeway andTravers, Immunobiology, Third edition)。一方面，插入所述非人類哺乳動物中的人類重鏈基因座含有人類V、D和J區(qū)的所有組成成分，在基因組中其與非人類哺乳動物恒定區(qū)功能性排列，由此在人類可變區(qū)與非人類哺乳動物恒定區(qū)之間可以產(chǎn)生功能性嵌合抗體。全部插入的人類重鏈遺傳物質(zhì)在本文稱作人類IgH VDJ區(qū)，包含來自人類基因組的DNA，其編碼編碼人類V、D和J部分的所有外顯子及適當(dāng)?shù)匾舶嚓P(guān)內(nèi)含子。相似地，本文提及人類Ig輕鏈κ V和J區(qū)是指包含編碼人類基因組的V和J區(qū)的所有外顯子及適當(dāng)?shù)匾舶嚓P(guān)內(nèi)含子。本文提及人類Ig輕鏈λ V和J區(qū)是指包含人類基因組的編碼V和J區(qū)的所有外顯子及適當(dāng)?shù)匾舶嚓P(guān)內(nèi)含子的人類DNA。人類可變區(qū)適當(dāng)?shù)夭迦朐诜侨祟惒溉閯游锖愣▍^(qū)上游，后者包含編碼全部恒定區(qū)或者所述恒定區(qū)足夠部分所需的所有DNA，以形成能特異性識別抗原的有效的嵌合抗體。一方面，所述嵌合抗體或抗體鏈具有一部分宿主恒定區(qū)，足以提供在宿主哺乳動物中天然發(fā)生的抗體中可見的一或多種效應(yīng)物功能，例如其能與Fe受體相互作用和/或結(jié)合補(bǔ)體。本文提及具有宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)的嵌合抗體或抗體鏈因此不限于完整恒定區(qū)，也包括具有所有宿主恒定區(qū)或者其足以提供一或多種效應(yīng)物功能的一部分的嵌合抗體或抗體鏈。這也適用于本發(fā)明的非人類哺乳動物和細(xì)胞及方法，其中人類可變區(qū)DNA可插入宿主基因組中，由此形成具有全部或部分宿主恒定區(qū)的嵌合抗體鏈。一方面，全部的宿主恒定區(qū)與人類可變區(qū)DNA可操縱地連接。本文所述宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)優(yōu)選是內(nèi)源宿主野生型恒定區(qū)，位于合適的重鏈或輕鏈的野生型基因座。例如，人類重鏈DNA適當(dāng)?shù)夭迦朐谛∈笕旧w12上，適當(dāng)?shù)嘏c小鼠重鏈恒定區(qū)相鄰。 一方面，人類DNA如人類VDJ區(qū)的插入靶向于在小鼠基因組IgH基因座中J4外顯子與C μ基因座之間的區(qū)域，及一方面插入在坐標(biāo)114，667，090與114,665，190之間，或者在坐標(biāo)114，667，091，在114，667，090之后。一方面，人類DNA如人類輕鏈κ VJ的插入靶向于小鼠染色體6中坐標(biāo)70，673，899與70，675，515之間，適當(dāng)?shù)卦谖恢?0，674，734，或者在染色體16上λ小鼠基因座等價位置。—方面，形成嵌合抗體的宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)可以在不同的(非內(nèi)源)染色體基因座。在這種情況中，插入的人類DNA如人類可變VDJ或VJ區(qū)然后可被插入非人類基因組中，位于與天然發(fā)生的重鏈或輕鏈恒定區(qū)不同的位置。所述天然恒定區(qū)可以在與天然位置不同的染色體基因座插入基因組中或者在基因組中復(fù)制，由此其與人類可變區(qū)功能性排列，由此仍可產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合抗體。一方面，所述人類DNA插入在內(nèi)源宿主野生型恒定區(qū)，位于宿主恒定區(qū)與宿主VDJ區(qū)之間的野生型基因座。提及位于非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的可變區(qū)的位置是指存在兩個抗體部分可變區(qū)與恒定區(qū)的合適的相對位置，以使得所述可變區(qū)與恒定區(qū)在哺乳動物體內(nèi)形成嵌合抗體或抗體鏈。因此，插入的人類DNA和宿主恒定區(qū)是彼此功能性排列的以產(chǎn)生抗體或抗體鏈。一方面，插入的人類DNA通過同種型轉(zhuǎn)換而能與不同的宿主恒定區(qū)一起表達(dá)。一方面，同種型轉(zhuǎn)換不需要或包含反式轉(zhuǎn)換。人類可變區(qū)DNA插入在與相關(guān)宿主恒定區(qū)相同染色體上意味著不需要反式轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換。如上所述，用于現(xiàn)有技術(shù)模型的轉(zhuǎn)基因基因座是人源的，因此即使在所述轉(zhuǎn)基因能互補(bǔ)小鼠基因座以便小鼠產(chǎn)生產(chǎn)生完全人類抗體的B細(xì)胞的情況中，各個抗體親和性也很少達(dá)到可得自完整(非轉(zhuǎn)基因)動物的那些親和性水平。主要原因是(除了上述所有組成成分和表達(dá)水平之外)所述基因座的控制元件是人類的事實。因此，例如激活高親和性抗體超變和選擇的信號傳導(dǎo)成分被損害。相反，在本發(fā)明中，宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)得以保持，且優(yōu)選至少一個非人類哺乳動物增強(qiáng)子或其他控制序列如轉(zhuǎn)換區(qū)保持與非人類哺乳動物恒定區(qū)功能性排列，由此如在宿主哺乳動物中所見的所述增強(qiáng)子或其他控制序列的作用在轉(zhuǎn)基因動物中得以全部或部分發(fā)揮。這種方法被設(shè)計為允許取樣的人類基因座的完全多樣性、允許與非人類哺乳動物控制序列如增強(qiáng)子達(dá)到相同高的表達(dá)水平，及由此在B細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)例如使用轉(zhuǎn)換重組位點的同種型轉(zhuǎn)換將仍使用非人類哺乳動物序列。具有這種基因組的哺乳動物將產(chǎn)生具有人類可變區(qū)與非人類哺乳動物恒定區(qū)的嵌合抗體，但是這些抗體可易于例如在一個克隆步驟中人源化。此外，這些嵌合抗體的體內(nèi)效力可以在這些相同動物中評估。一方面，插入的人類IgH VDJ區(qū)在種系構(gòu)型中包含來自于人類的所有V、D和J區(qū)及插入序列。一方面，將800_1000kb的人類IgH VDJ區(qū)插入非人類哺乳動物IgH基因座，及一方面，插入940、950或960kb片段。適當(dāng)?shù)兀@包括來自人類染色體14的堿基105，400，051-106，368，585。一方面，插入的IgH人類片段由來自染色體14的堿基105，400，051-106，368，5 85組成。一方面，插入的人類重鏈DNA如由來自染色體14的堿基105，400，051-106，368，585組成的DNA插入在小鼠染色體12中小鼠J4區(qū)末端與E μ區(qū)之間，適當(dāng)?shù)卦谧鴺?biāo)114，667, 090與114，665，190之間，或者在坐標(biāo)114，667，091，在114，667，090之后。一方面，所述插入在坐標(biāo)114，667，089與114，667，090之間(坐標(biāo)參照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37)，或者在另一非人類哺乳動物基因組的等價位置。一方面，插入的人類KVJ區(qū)在種系構(gòu)型中包含來自人類的所有V和J區(qū)及插入序列。合適地，這包括來自人類染色體2的堿基88，940，356-89，857，000，適當(dāng)?shù)貫榇蠹s917kb。另一方面，所述輕鏈VJ插入物可包含僅V節(jié)段和J節(jié)段的近端簇(proximalcluster)。這種插入物為大約473kb。一方面,人類輕鏈κ DNA如來自人類染色體2的堿基88，940, 356-89，857，000的人類IgK片段被適當(dāng)?shù)夭迦胄∈笕旧w6中坐標(biāo)70，673，899與70，675，515之間，適當(dāng)?shù)卦谖恢?0，674，734。這些坐標(biāo)對于人類基因組是指NCBI36，ENSEMBL Release54，對于小鼠基因組是指與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的NCBM37?！矫妫鋈祟惁?VJ區(qū)在種系構(gòu)型中包含來自人類的所有V和J區(qū)及插入序列。適當(dāng)?shù)兀@包括來自人類染色體2的針對κ片段選擇的那些堿基的類似堿基。在一個實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或非人類哺乳動物包含在小鼠染色體12坐標(biāo)114，666，183 與 114，666，725 之間如在 114，666，283 與 114，666，625 之間、任選地在坐標(biāo) 114，666，335 與 114，666，536 之間、任選地在 114，666，385 與 114，666，486 之間或者在 114，666,425 與 114，666，446 之間或者在 114，666,435 與 114，666，436 之間或者在不同小鼠品系的小鼠染色體12的等價位置或者在另一非人類脊椎動物如大鼠基因組中等價位置插入人類重鏈可變區(qū)DNA，所述小鼠染色體12參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBM37。在與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的坐標(biāo)114, 666,435與114，666，436之間的插入與參照geneBank登記號NT114985.2的129/Sv J基因組序列的染色體2上坐標(biāo)1207826與1207827之間的插入等價?？梢栽诹硪换蚪M如另一小鼠基因組中等價位置插入。在這個實施方案的實例中，本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含人類IgH VDJ區(qū)，其包含或由參照GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫的人類染色體14的106，328，851-107, 268，544位核苷酸如 106，328，901-107, 268，494 位核苷酸如 106，328，941-107，268，454 位核苷酸、如106，328，951-107，268，444位核苷酸組成，或者插入來自不同人類序列或數(shù)據(jù)庫的染色體14的等價核苷酸。所述人類插入可以在上述區(qū)域之間進(jìn)行。在一個實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含人類K VJ區(qū)的插入，其在種系構(gòu)型中適當(dāng)?shù)匕蛴蓙碜匀祟惖乃蠽和J區(qū)及插入序列組成，人類DNA的插入在小鼠染色體6的坐標(biāo)70，673，918-70，675，517之間如在坐標(biāo)70,674,418與70,675,017之間、如在坐標(biāo) 70，674，655-70，674，856 之間、如在坐標(biāo) 70，674，705-70，674，906 之間、如在坐標(biāo) 70，674，745-70，674，766 之間、如在坐標(biāo) 70，674，755 與 70，674，756 之間，編號參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBIM37，或者包含在另一基因組如另一小鼠基因組的等價位置的插入。在這個實施方案的一個實例中，本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含插入?yún)⒄誈RCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫的人類染色體2的89，159，079-89，630，437和/或89，941，714-90，266，976位核苷酸(或者來自不同的人類序列或數(shù)據(jù)庫的染色體2的等價核苷酸)，如插入沒有插入序列的這兩個分離的片段，或者插入完整的89，159，079-90，266，976 區(qū)域。所述插入物可包含或由如下核苷酸組成:⑴任選地除了下述片段(ii)之外，核苷酸89，158，979-89，630，537，如89，159，029-89，630，487，如 `89，159，069-89，630，447，如 89，159，079-89，630，437，(ii)任選地除了片段⑴之夕卜，核苷酸89，941，614-90，267，076，如89，941，664-90，267，026，如 89，941，704-90，266，986，如 89，941，714-90，266，976，(iii)核苷酸 89，158，979-90，267，076，如核苷酸 89，159，079-90，266，976。人類插入物可以在上述區(qū)域之間。在一個實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含插入人類λ區(qū)，其包含至少一個人類J λ區(qū)(例如種系區(qū))和至少一個人類C λ區(qū)(例如種系區(qū))，任選地CA6和/或CJ0例如，所述細(xì)胞或哺乳動物包含多個人類JX區(qū)，任選地夂1、夂2、夂6和JA7中的兩或更多個，任選地所有Ja 1、Ja2> ^6和Ja7。在一個實例中，所述細(xì)胞或哺乳動物包含至少一個人類Ja_Ca簇，任選地至少Ja7-Ca7。一方面，所述人類JC簇插入在最后的內(nèi)源J λ區(qū)的3’或者插入在最后的內(nèi)源J κ區(qū)的3’，適當(dāng)?shù)鼐o鄰這些序列的3’，或者基本上緊鄰這些序列的3’。一方面，插入小鼠λ基因座中是在內(nèi)源Cl基因節(jié)段的下游，例如在存在3’ JlCl簇的情況中，適當(dāng)?shù)鼐o鄰Cl節(jié)段的3’，或者基本上緊鄰該節(jié)段的3’。
一方面(如細(xì)胞或非人類哺乳動物)，人類JC簇插入在κ基因座中，任何所得細(xì)胞或動物在該基因座是雜合的，由此所述細(xì)胞具有其中在κ基因座插入人類λ DNA的一條染色體，及在內(nèi)源κ基因座具有人類κ DNA的另一條染色體。在一個實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含人類E λ增強(qiáng)子。本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物包含插入的人類XVJ區(qū)，適當(dāng)?shù)卦诜N系構(gòu)型中包含或由來自人類的所有V和J區(qū)以及插入序列組成，插入的區(qū)域包含或由來自參照GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫的人類染色體22的核苷酸22，375，509-23，327，984如核苷酸 22，375，559-23，327，934、如核苷酸 22，375，599-23，327，894、如核苷酸22，375，609-23，327，884組成，或者來自另一人類序列或數(shù)據(jù)庫的等價DNA。在小鼠基因組中的插入可以在小鼠染色體16的坐標(biāo)19,027，763與19，061，845之間，如在坐標(biāo)19,037, 763與19，051，845之間，如在坐標(biāo)19,047,451與19，047，652之間，如在坐標(biāo)19,047,491與19，047，602之間，如在坐標(biāo)19,047, 541與19,047, 562之間，如在坐標(biāo)19，047，551與19，047，552之間(參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBIM37,等價于序列文件NT_039630.4中129SvJ基因組序列的坐標(biāo)1，293，646-1，293，647)，或者可以插入在其它基因組如另一小鼠基因組中的等價位置。人類λ核酸插入在小鼠基因組中或者可以在小鼠染色體6的坐標(biāo)70，673，918與70，675，517之間，如在坐標(biāo)70，674，418與70,675,017之間，如在坐標(biāo)70, 674, 655與70，674，856之間，如在坐標(biāo)70, 674, 705與70，674，806之間，如在坐標(biāo)70，674，745與70，674，766之間，如在坐標(biāo)70，674，755與70，674，756之間(參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBM37)或者另一基因組的等價位置。人類插入物可以在上述區(qū)域之間。上述所有人類特異性片段的長度可以變化，可例如比上述更長或更短，如500堿基，IKB, 2Κ，3Κ，4Κ，5ΚΒ, 10ΚΒ, 20KB, 30KB, 40ΚΒ或50ΚΒ或更多，適當(dāng)?shù)匕炕虿糠秩祟怴(D) J區(qū)域，同時適當(dāng)?shù)貎?yōu)選保持最后插入的需求以包含編碼完整重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的人類遺傳材料。一方面，上述人類插入物的5’末端的長度增加。在所述插入物是以逐步方式產(chǎn)生的情況中，所述長度增加通常是關(guān)于上游(5，)克隆。一方面，最后插入的人類基因、通常是要插入的最后的人類J基因的3’末端距人類-小鼠連接區(qū)少于2kb，優(yōu)選少于1KB。一方面，所述非人類哺乳動物包含本文所述一些或全部人類輕鏈κ VJ區(qū)，但是無人類輕鏈λ VJ區(qū)。一方面，所述細(xì)胞或非人類哺乳動物包含完全的人類λ基因座(來自人類的λ VJC區(qū))，嵌合的K基因座(與宿主K恒定區(qū)可操縱地連接的人類K VJ區(qū))及嵌合的重鏈基因座，其具有與宿主重鏈恒定區(qū)可操縱地連接的人類VDJ區(qū)。另一方面，所述基因組包含在重鏈基因座和一個輕鏈基因座或者在重鏈基因座和兩個輕鏈基因座插入本文所述的V、D (只是重鏈)和J基因。優(yōu)選所述基因組在一個、兩個或所有三個基因座是純合的。另一方面，所述基因座在一或多個基因座可以是雜合的，如對于編碼嵌合抗體鏈和天然(宿主細(xì)胞)抗體鏈的DNA是雜合的。一方面， 所述基因組對于能編碼本發(fā)明兩個不同抗體鏈例如包含2個不同的嵌合重鏈或2個不同的嵌合輕鏈的DNA可以是雜合的。
一方面，本發(fā)明涉及本文所述的非人類哺乳動物或細(xì)胞，以及產(chǎn)生所述哺乳動物或細(xì)胞的方法，其中插入的人類DNA如人類IgH VDJ區(qū)和/或輕鏈V、J區(qū)僅在所述哺乳動物或細(xì)胞的一個等位基因而不是兩個等位基因上發(fā)現(xiàn)。在此方面，哺乳動物或細(xì)胞具有表達(dá)內(nèi)源宿主抗體重鏈或輕鏈及嵌合重鏈或輕鏈的潛力。 另一方面，所述人類VDJ區(qū)或輕鏈VJ區(qū)不作為整體使用，而是可以使用來自其它物種的等價人類VDJ或VJ區(qū)的部分如外顯子，如來自其它物種的一或多個V、D或J外顯子或者來自其它物種的調(diào)節(jié)序列。一方面，代替人類序列使用的序列不是人類或小鼠序列。一方面，使用的序列可以來自嚙齒類動物或者靈長類動物如黑猩猩。例如，來自除了人類之外的靈長類動物的1、2、3、4或更多個或全部J區(qū)可用于置換本發(fā)明細(xì)胞和動物的VDJ/VJ區(qū)中的1、2、3、4或更多個或全部人類J外顯子。另一方面，插入的人類DNA如人類IgH VDJ區(qū)和/或輕鏈VJ區(qū)可以如此插入，由此其在基因組中與來自非人類非小鼠物種如嚙齒類動物或靈長類動物序列如大鼠序列的mu恒定區(qū)可操縱地連接。在本發(fā)明中從中可以使用的DNA元件的其它非人類非小鼠物種包括兔、lamas、單峰駱駝、羊駝、駱駝和鯊魚。一方面，插入的人類DNA如人類VDJ或VJ區(qū)與內(nèi)源宿主mu序列不是可操縱地連接，而是與非宿主mu序列可操縱地連接?？刹倏v地連接適當(dāng)?shù)卦试S產(chǎn)生包含所述人類可變區(qū)的抗體重鏈或輕鏈。一方面，插入的人類DNA如人類IgH VDJ區(qū)(和/或輕鏈VJ區(qū))可以與mu恒定區(qū)核酸一起插入宿主染色體中，所述mu恒定區(qū)核酸不是宿主mu恒定區(qū)核酸，優(yōu)選是來自非小鼠非人類物種的的mu恒定區(qū)。適當(dāng)?shù)?，插入的人類DNA如人類VDJ區(qū)(和/或輕鏈VJ區(qū))與非人類非小鼠mu序列可操縱地連接，且能形成嵌合抗體重鏈或輕鏈。在另一方面，非小鼠非人類mu可以插入宿主染色 體中與人類可變區(qū)分開的遺傳元件上，或者在基因組中不同的位置，適當(dāng)?shù)嘏c可變區(qū)可操縱地連接，由此可以形成嵌合抗體重鏈或輕鏈。另一方面，本發(fā)明涉及非人類哺乳動物或細(xì)胞，其基因組包含多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，位于宿主非人類哺乳動物輕鏈恒定區(qū)上游，排列成所述細(xì)胞或哺乳動物能表達(dá)嵌合抗體鏈。本發(fā)明還涉及非人類哺乳動物或細(xì)胞，其基因組另外或或者包含多個人類Ig輕鏈V區(qū)和一或多個人類J區(qū)，位于宿主非人類哺乳動物重鏈恒定區(qū)上游，由此所述細(xì)胞或哺乳動物能表達(dá)嵌合抗體鏈。所述細(xì)胞或哺乳動物可以能表達(dá)具有重鏈和輕鏈包括如上述至少一個嵌合抗體鏈的抗體。插入的人類重鏈可變區(qū)可以是本文所述任一個，可以插入在上述位置以插入入和κ恒定區(qū)的5’。同樣，插入的人類輕鏈可變區(qū)可以是上述那些，可以插入在上述位置以插入重鏈恒定區(qū)的5’。例如，本發(fā)明的基因組或細(xì)胞或非人類哺乳動物可編碼抗體，所述抗體包含具有位于小鼠輕鏈恒定區(qū)上游的人類重鏈可變區(qū)的抗體鏈，或者包含具有位于小鼠重鏈恒定區(qū)上游的人類輕鏈可變區(qū)的抗體鏈，組合如下一個鏈:完全的人類抗體輕鏈；完全的人類抗體重鏈；非人類脊椎動物(例如小鼠或大鼠)抗體輕鏈；
非人類脊椎動物(例如小鼠或大鼠)抗體重鏈；嵌合的非人類脊椎動物(例如小鼠或大鼠)_人類抗體鏈；具有位于非人類脊椎動物(例如小鼠或大鼠)輕鏈恒定區(qū)上游的人類重鏈可變區(qū)的抗體鏈；具有位于非人類脊椎動物(例如小鼠或大鼠)重鏈恒定區(qū)上游的人類輕鏈可變區(qū)的抗體鏈。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因，其編碼位于宿主非人類哺乳動物輕鏈恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，任選地包含于載體內(nèi)。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因，其編碼位于宿主非人類哺乳動物重鏈恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈V區(qū)和一或多個人類輕鏈J區(qū)，任選地包含于載體內(nèi)。一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞或非人類哺乳動物，其基因組包含:位于全部或部分人類κ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞或非人類哺乳動物，其基因組包含:位于全部或部分人類λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)。適當(dāng)?shù)?，所述輕鏈V J和C區(qū)能形成在體內(nèi)可與抗原特異性反應(yīng)的抗體鏈。一方面，本發(fā)明涉及在插入的輕鏈區(qū)中沒有非人類編碼序列。在此方面，如本文所述，人類κ和/或λ區(qū)插入基因組中，組合插入重鏈VDJ區(qū)或其一部分，位于宿主重鏈恒定區(qū)上游。本發(fā)明的細(xì)胞或非人類哺乳動物可包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)；及(b)位于全部或部分非人類κ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)，其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有包含非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的抗體鏈的抗體的所有組成成分。本發(fā)明的細(xì)胞或非人類哺乳動物可包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)；及位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有包含非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的抗體鏈的抗體的所有組成成分。適當(dāng)?shù)?，如上述插入人類VJC輕鏈DNA或其一部分是在等價的小鼠基因座進(jìn)行的。一方面，所述人類輕鏈KVJC DNA或其一部分插入在小鼠κ VJC區(qū)的緊鄰上游或下游。一方面，所述人類輕鏈λ VJC區(qū)或其一部分插入在小鼠λ VJC區(qū)的緊鄰上游或下游。一方面，僅插入人類κ VJC基因座而不是人類λ VJC基因座。一方面，僅插入人類λ VJC基因座而不是人類κ VJC基因座?？梢允褂帽疚乃龅募夹g(shù)進(jìn)行插入，及適當(dāng)?shù)夭粡幕蚪M中除去宿主序列。一方面，所述非人類哺乳動物宿主VJC序列可以是一些方式失活的，通過突變或倒位、或者通過插入人類可變區(qū)DNA或者通過任何其它方式。一方面，本發(fā)明的細(xì)胞或非人類哺乳動物可包含插入完整的Vjc人類區(qū)域。所述人類κ可變區(qū)DNA可插入在基因組中，與λ恒定區(qū)功能性排列，例如插入在λ恒定區(qū)上游?；蛘撸祟惁藚^(qū)可變DNA可與κ恒定區(qū)功能性排列插入，例如插入在κ恒定區(qū)上游。一方面，一或多個非人類哺乳動物控制序列如增強(qiáng)子序列保持在非人類哺乳動物Mu恒定區(qū)上游，適當(dāng)?shù)鼐推渑c所述恒定區(qū)的距離而言是在其天然位置。一方面，一或多個非人類哺乳動物控制序列如增強(qiáng)子序列保持在非人類哺乳動物Mu恒定區(qū)下游，適當(dāng)?shù)鼐推渑c所述恒定區(qū)的距離而言是在其天然位置。一方面，非人類哺乳動物轉(zhuǎn)換序列、適當(dāng)?shù)貫閮?nèi)源轉(zhuǎn)換序列保持在非人類哺乳動物Mu恒定區(qū)上游，適當(dāng)?shù)鼐推渑c所述恒定區(qū)的距離而言是在其天然位置。在這種位置中，所述宿主增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)換序列在體內(nèi)與宿主恒定區(qū)序列是可操縱的。一方面，轉(zhuǎn)換序列既不是人類序列，也不是非人類哺乳動物中天然的，例如一方面，非人類哺乳動物轉(zhuǎn)換序列不是小鼠或人類轉(zhuǎn)換序列。所述轉(zhuǎn)換序列可以是例如嚙齒類動物或靈長類動物序列，或者是·合成的序列。特別地，所述轉(zhuǎn)換序列可以是大鼠序列，其中所述非人類哺乳動物是小鼠。例如，小鼠或人類恒定區(qū)mu序列可以置于來自大鼠或黑猩猩的轉(zhuǎn)換序列或者其它轉(zhuǎn)換序列的控制下，適當(dāng)?shù)啬茉试S在體內(nèi)發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換。一方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換序列是這樣的轉(zhuǎn)換序列，其包含重復(fù)序列GGGCT的3、4、5、6或更多次連續(xù)重復(fù)，如大鼠轉(zhuǎn)換序列?！按笫筠D(zhuǎn)換序列”在本文是指所述轉(zhuǎn)換序列是相應(yīng)于來自大鼠基因組的轉(zhuǎn)換序列的野生型轉(zhuǎn)換序列或者衍生自這種轉(zhuǎn)換序列的序列。一方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)換序列是包含如下重復(fù)的大鼠轉(zhuǎn)換序列:GAGCT(296次重復(fù))，GGGGT (50次重復(fù))和GGGCT (83次重復(fù))。在一個實例中，所述大鼠轉(zhuǎn)換序列包含或者由SEQ ID No:l所示序列組成。在這些實施方案中，及其中所述非人類哺乳動物是小鼠或者所述細(xì)胞是小鼠細(xì)胞的情況中，轉(zhuǎn)換序列任選地是如本文所述大鼠轉(zhuǎn)換序列。或者，本發(fā)明細(xì)胞或哺乳動物中存在的轉(zhuǎn)換序列是小鼠轉(zhuǎn)換序列，例如來自小鼠如小鼠129品系或小鼠C57品系，或者來自衍生于其的品系，任選地包含或由SEQ ID No:4或5所示序列組成?！靶∈筠D(zhuǎn)換序列”在本文是指所述轉(zhuǎn)換序列是相應(yīng)于來自小鼠基因組的轉(zhuǎn)換序列的野生型轉(zhuǎn)換序列或衍生自這種轉(zhuǎn)換序列的序列。在這個實施方案中，及其中所述非人類哺乳動物是小鼠或者所述細(xì)胞是小鼠細(xì)胞的情況中，所述小鼠轉(zhuǎn)換序列任選地是內(nèi)源轉(zhuǎn)換序列或者是來自另一小鼠品系的小鼠轉(zhuǎn)換序列。本發(fā)明的細(xì)胞或哺乳動物可因此包含人類或非人類哺乳動物轉(zhuǎn)換序列及一或多個人類或非人類哺乳動物增強(qiáng)子區(qū)域。其可以在人類或非人類哺乳動物恒定區(qū)上游。優(yōu)選地，所述控制序列能指導(dǎo)包含與其相關(guān)的恒定區(qū)的抗體表達(dá)或者另外控制抗體的產(chǎn)生。一種可以想見的組合是在小鼠細(xì)胞中大鼠轉(zhuǎn)換序列與小鼠增強(qiáng)子序列及小鼠恒定區(qū)。一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞優(yōu)選非人類細(xì)胞或非人類哺乳動物，其包含具有來自3或更多個物種的DNA的免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因座。例如，所述細(xì)胞或動物可包含宿主細(xì)胞恒定區(qū)DNA，一或多個人類V、D或J編碼序列及一或多個非人類非宿主DNA區(qū)，其能控制免疫球蛋白基因座區(qū)域，如能控制Ig DNA的體內(nèi)表達(dá)或同種型轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換序列、啟動子或增強(qiáng)子。一方面，所述細(xì)胞或動物是小鼠，及另外包含來自人類Ig基因座的人類DNA以及另外包含非小鼠DNA序列，如能調(diào)節(jié)小鼠或人類DNA的大鼠DNA序列。另一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞優(yōu)選非人類細(xì)胞或非人類哺乳動物，其包含具有來自2或更多個不同人類基因組的DNA的免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因座。例如，其在重鏈或輕鏈內(nèi)可以包含來自一個以上人類基因組的重鏈V(D)J序列，或者來自一個基因組的重鏈VDJDNA及來自不同基因組的輕鏈VJ序列。一方面，本發(fā)明涉及DNA片段或細(xì)胞或非人類哺乳動物，其包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因座或者其一部分，具有來自2或更多個物種的DNA，其中一個物種提供非編碼區(qū)如調(diào)節(jié)區(qū)，其它物種提供編碼區(qū)如V、D、J或恒定區(qū)。一方面，與不同的人類V、D或J區(qū)相關(guān)的人類啟動子和/或其它控制元件在將人類VDJ插入小鼠基因組中之后保留。另一方面，優(yōu)化人類區(qū)域如人類V區(qū)的一或多個啟動子元件或者其它控制元件以與非人類哺乳動物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用。適當(dāng)?shù)?，人類編碼序列可以置于合適的非人類哺乳動物啟動子的控制下，其使得人類DNA在合適的非人動物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄。一方面，所述人類區(qū)域是人類V區(qū)編碼序列，人類V區(qū)置于非人類哺乳動物啟動子控制下。人類啟動子或其它控制區(qū)由非人類哺乳動物啟動子或控制區(qū)的功能性置換可以通過使用重組工程或者其它重組DNA技術(shù)進(jìn)行，以將一部分人類Ig區(qū)(如人類V區(qū))插入含有非人類Ig區(qū)的載體(如BAC)中。所述重組工程/重組技術(shù)適當(dāng)?shù)赜萌祟怚g區(qū)置換一部分非人類(如小鼠)DNA，因此將人類Ig區(qū)置于非人類哺乳動物啟動子或其它控制區(qū)的控制下。適當(dāng)?shù)兀?人類V區(qū)的人類編碼區(qū)置換小鼠V區(qū)編碼序列。適當(dāng)?shù)?，人類D區(qū)的人類編碼區(qū)置換小鼠D區(qū)編碼序列。適當(dāng)?shù)?，人類J區(qū)的人類編碼區(qū)置換小鼠J區(qū)編碼序列。以此方式，人類V、D或J區(qū)可以置于非人類哺乳動物啟動子如小鼠啟動子的控制下。一方面，插入非人類哺乳動物細(xì)胞或動物中的唯一人類DNA是V、D或J編碼區(qū)，這些區(qū)域被置于宿主調(diào)節(jié)序列或其它(非人類非宿主)序列控制下，一方面，提及人類編碼區(qū)包括人類內(nèi)含子和外顯子，或者在另一方面僅是外顯子而無內(nèi)含子，其可以是cDNA形式。也可以使用重組工程或者其它重組DNA技術(shù)，將非人類哺乳動物(如小鼠)啟動子或其它控制區(qū)如V區(qū)啟動子插入含有人類Ig區(qū)的BAC中。然后重組步驟將一部分人類DNA置于小鼠啟動子或其它控制區(qū)的控制下。本文所述方法也可以用于將來自人類重鏈的一些或全部V、D和J區(qū)插入輕鏈恒定區(qū)上游而不是重鏈恒定區(qū)上游。同樣，一些或全部人類輕鏈V和J區(qū)可以插入在重鏈恒定區(qū)上游。插入可以在內(nèi)源恒定區(qū)基因座，例如在內(nèi)源恒定區(qū)與J區(qū)之間，可以只是一些或全部V、D或J基因，無啟動子或增強(qiáng)子序列，或者可以是一些或全部V、D或J基因，具有一或多個或全部各自的啟動子或增強(qiáng)子序列。一方面，種系構(gòu)型中V、D或J片段的所有組成成分可以插入在宿主恒定區(qū)上游并與其功能性排列。因此，本發(fā)明允許來自人類或任何物種的V和/或D和/或J區(qū)插入來自不同物種的細(xì)胞的包含恒定區(qū)的染色體中，使得嵌合抗體鏈被表達(dá)。一方面，本發(fā)明僅需要一些人類可變區(qū)DNA插入非人類哺乳動物的基因組中，與在內(nèi)源重鏈恒定區(qū)基因座區(qū)域的一些或全部人類重鏈恒定區(qū)可操縱地排列，由此可以產(chǎn)生抗體鏈。在本發(fā)明的這個方面及在另外插入人類輕鏈DNA的情況中，輕鏈DNA插入可以是完全人類構(gòu)建體形式，具有人類可變DNA和人類恒定區(qū)DNA，或者具有人類可變區(qū)DNA和來自非人類非宿主物種的恒定區(qū)DNA。其它變化也是可能的，如插入輕鏈人類可變區(qū)和宿主基因組恒定區(qū)。此外，所述輕鏈轉(zhuǎn)基因的插入不需要在等價內(nèi)源基因座，可以在基因組中的任何位置。在這種方案中，所述細(xì)胞或哺乳動物可以產(chǎn)生嵌合重鏈(包含人類可變區(qū)DNA和小鼠恒定區(qū)DNA)及包含人類可變區(qū)和人類恒定區(qū)DNA的輕鏈。因此，在本發(fā)明的一方面，所述λ和/或κ人類可變區(qū)DNA可以插入在內(nèi)源基因座上游或下游，或者實際在與內(nèi)源基因座的不同染色體上，與或不與恒定區(qū)DNA —起插入。鑒于 人類輕鏈DNA插入在宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游，本發(fā)明另一方面還涉及將一或兩個輕鏈人類可變區(qū)插入在等價內(nèi)源基因座恒定區(qū)下游或者基因組中其它位置。通常，優(yōu)選在受體基因組中的等價內(nèi)源基因座或者與其鄰近處插入人類可變區(qū)DNA，例如在宿主免疫球蛋白基因座邊界(上游或下游)1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOkb內(nèi)插入。因此，一方面，本發(fā)明可涉及細(xì)胞或非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)；及(b) 一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū),和/或一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分。在一個特殊方面，所述細(xì)胞或非人類哺乳動物的基因組包含:位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，位于宿主非人類哺乳動物κ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)，及位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)，任選地其中所述人類λ可變區(qū)可以插入在內(nèi)源宿主λ基因座的上游或下游，與人類λ恒定區(qū)可操縱地連接，由此所述非人類哺乳動物或細(xì)胞可產(chǎn)生完全人類抗體輕鏈和嵌合重鏈。在本發(fā)明另一不同方面，使用本發(fā)明的方法可以通過相繼插入以逐步方式構(gòu)建基因座，及因此使得可以在非人類宿主細(xì)胞的基因座中的任何合適位置插入人類可變DNA及人類或非人類恒定區(qū)DNA。例如，本發(fā)明的方法可用于將人類免疫球蛋白可變區(qū)DNA及來自宿主基因組的恒定區(qū)DNA插入非人類宿主細(xì)胞基因組中任何位置，使得從在內(nèi)源重鏈區(qū)之外的位置產(chǎn)生嵌合抗體鏈。上述任何人類重鏈或輕鏈DNA構(gòu)建體可以插入非人類宿主細(xì)胞基因組中任何希望的位置，使用本文描述的技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明因此還涉及具有包含這種插入的基因組的細(xì)胞和哺乳動物。本發(fā)明還涉及載體，如BAC，其包含與非人類哺乳動物啟動子或其它控制序列功能性排列的人類V、D或J區(qū)，由此人類V、D或J區(qū)在非人類哺乳動物細(xì)胞如ES細(xì)胞中的表達(dá)在非人類哺乳動物啟動子的控制下，特別是在一旦插入該細(xì)胞的基因組的情況中。本發(fā)明還涉及細(xì)胞和含有所述細(xì)胞的非人類哺乳動物，所述細(xì)胞或哺乳動物具有人類V、D或J區(qū)，與非人類哺乳動物啟動子或其它控制序列功能性排列，由此人類V、D或J區(qū)在所述細(xì)胞或哺乳動物中的表達(dá)在所述非人類哺乳動物啟動子的控制下。通常，本發(fā)明一方面涉及非人類哺乳動物宿主細(xì)胞，其能在宿主啟動子或控制區(qū)的控制下表達(dá)人類V、D或J編碼序列，所述表達(dá)能產(chǎn)生具有人類可變結(jié)構(gòu)域和非人類哺乳動物恒定區(qū)的人源化抗體。一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞，如非人類哺乳動物細(xì)胞，如ES細(xì)胞，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，及(b)任選地存在的位于宿主非人類哺乳動物κ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞，如非人類哺乳動物細(xì)胞，如ES細(xì)胞，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物κ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈κ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈κ J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)，及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)。一方面，所 述細(xì)胞是ES細(xì)胞，其能發(fā)育成能產(chǎn)生是嵌合的抗體的所有組成成分的非人類哺乳動物，所述嵌合抗體具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)。任選地，所述細(xì)胞的基因組被修飾為阻止完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。一方面，所述細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。一方面，所述細(xì)胞是分離的非人類哺乳動物細(xì)胞。一方面，本文揭示的細(xì)胞優(yōu)選是非人類哺乳動物細(xì)胞。一方面，所述細(xì)胞是來自選自 C57BL/6、M129 如 129/SV、BALB/c 以及C57BL/6、M129如129/SV或者BALB/c的任何雜種的小鼠品系的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及從本文所述細(xì)胞中生長或另外衍生的細(xì)胞系，包括永生化細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可包含如本文所述插入的人類V、D或J基因，在種系構(gòu)型中或在體內(nèi)成熟重排之后。所述細(xì)胞可以通過與腫瘤細(xì)胞融合而永生化，以提供產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和細(xì)胞系，或者通過直接細(xì)胞永生化產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明的載體。一方面，這種載體是BAC(細(xì)菌人工染色體)。應(yīng)意識到在本發(fā)明中可以使用其它克隆載體，及因此在本文提及BAC時可以一般是指任何合適載體。一方面，修剪用于產(chǎn)生待插入的人類DNA如VDJ或VJ區(qū)的BAC，由此當(dāng)與原始人類基因組序列相比時在所述非人類哺乳動物中在最終的人類VDJ或VJ區(qū)或其一部分中沒有序列復(fù)制或丟失。一方面，本發(fā)明涉及包含插入物的載體，優(yōu)選包含來自一些人類VDJ或VJ基因座的人類DNA的區(qū)域，側(cè)翼是不是來自該基因座的DNA。側(cè)翼DNA可包含一或多個可選擇標(biāo)記或者一或多個位點特異性重組位點。一方面，所述載體包含2或更多個如3個異種特異性和不相容的位點特異性重組位點。一方面,所述位點特異性重組位點可以是1xP位點或其變體，或者FRT位點或其變體。一方面,所述載體包含一或多個轉(zhuǎn)座子ITR(末端反向重復(fù))序列。一方面，本發(fā)明的非人動物適當(dāng)?shù)夭划a(chǎn)生任何完全人源化抗體。一方面，這是因為沒有插入的DNA來自人類恒定區(qū)。或者，在基因組中沒有能與插入的人類可變區(qū)DNA成分聯(lián)合形成抗體的人類恒定區(qū)DNA，例如由于任何人類恒定區(qū)DNA內(nèi)的突變或者與任何恒定區(qū)人類DNA和人類可變區(qū)DNA的距離所致。一方面，人類輕鏈恒定區(qū)DNA可以包含在細(xì)胞基因組中，由此可以產(chǎn)生完全人類λ或κ人類抗體鏈，但是這僅能與嵌合重鏈形成抗體，而不能產(chǎn)生具有人類可變區(qū)和恒定區(qū)的完全人類抗體。一方面，所述非人類哺乳動物基因組被修飾為阻止完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。完全宿主物種特異性抗體是具有來自宿主生物體的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。在這種情況中，術(shù)語“特異性”不是描述由本發(fā)明的細(xì)胞或動物產(chǎn)生的抗體的結(jié)合，而是描述編碼這些抗體的DNA的來源。

一方面，所述非人類哺乳動物基因組被修飾為阻止天然(完全宿主物種特異性)抗體在哺乳動物中的表達(dá)，通過失活全部或部分宿主非人類哺乳動物Ig基因座進(jìn)行。一方面，這通過全部或部分非人類哺乳動物VDJ區(qū)或VJ區(qū)的倒位、任選地通過在所述基因組中插入一或多個位點特異性重組酶位點及然后在重組酶介導(dǎo)的切割或全部或部分非人類哺乳動物Ig基因座的倒位中使用這些位點實現(xiàn)。一方面，可以應(yīng)用雙重倒位，第一次是從內(nèi)源基因座中移除V(D)J,然后更局部的倒位將其以正確方向放置。一方面，使用單一 1xP位點以將非人類哺乳動物VDJ區(qū)倒位為著絲?；蜃蚨肆；蜃Ｒ环矫?，其中插入人類DNA的非人類哺乳動物包含內(nèi)源V、(D)和J區(qū)，而且內(nèi)源序列未缺失。本發(fā)明包含一種方法，該方法是將多個DNA片段插入DNA靶中，適當(dāng)?shù)匦纬蛇B續(xù)插入，其中插入的片段無插入序列而直接連接在一起。所述方法尤其可用于將大DNA片段插入宿主染色體中，可以以逐步方式進(jìn)行。一方面，所述方法包括將第一 DNA序列插入靶中，所述序列具有DNA載體部分和感興趣的第一序列(Xl);將第二 DNA序列插入第一序列的載體部分，第二 DNA序列具有感興趣的第二序列(Χ2)和第二載體部分；然后切割任何載體序列DNA分離Xl與Χ2以在所述靶內(nèi)提供連續(xù)的Χ1Χ2或Χ2Χ1序列。任選地在先前的DNA序列的載體部分中插入進(jìn)一步的一或多個DNA序列，每個DNA序列具有進(jìn)一步的感興趣序列(Χ3，...)和進(jìn)一步的載體部分，以在所述靶中構(gòu)建連續(xù)DNA片段。插入第一 DNA序列的DNA靶可以是特定細(xì)胞基因組中的特異性位點或任何位點。本文描述的是涉及插入人類VDJ區(qū)元件的一般方法，但是可用于插入來自任何生物體的任何DNA區(qū)，及特別插入>100kB的大DNA片段，如100_250kb或者甚至更大，如TCR或HLA。本文描述的關(guān)于VDJ插入的特點和方法可同樣用于揭示的任何方法。一方面，插入的DNA是人類DNA，如人類VDJ或VJ區(qū)，在細(xì)胞如ES細(xì)胞的基因組中以逐步方式建立，對于每個重鏈或輕鏈區(qū)使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多次單獨插入。片段適當(dāng)?shù)叵嗬^插入在相同或基本上相同的細(xì)胞基因座，如ES細(xì)胞基因座，形成完整的VDJ或VJ區(qū)或其一部分。本發(fā)明還涉及包含中間產(chǎn)物的細(xì)胞和非人動物，在加工中其基因組可僅包含部分VDJ區(qū)，如僅人類可變區(qū)DNA。另一方面，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法包括將人類VDJ或VJ區(qū)插入在宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游，通過同源重組逐步插入多個片段，優(yōu)選使用重復(fù)過程。適當(dāng)?shù)兀迦雭碜匀祟怴DJ和VJ基因座的大約100KB的片段，適當(dāng)?shù)卦谧罱K重復(fù)插入過程之后形成部分或完整的VDJ或VJ區(qū)，如本文所述。一方面，所述插入過程在其中起始盒(initiation cassette)已經(jīng)插入細(xì)胞如ES細(xì)胞的基因組中的位置開始，提供獨特的靶向區(qū)。一方面，所述起始盒插入非人類哺乳動物重鏈基因座中，用于插入人類重鏈DNA。相似地，起始盒可以插入非人類哺乳動物輕鏈基因座中，用于插入人類輕鏈VJ DNA。所述起始盒適當(dāng)?shù)匕d體主鏈序列，可以將其與在同一主鏈序列中具有人類DNA片段的載體重組以將人類DNA插入細(xì)胞(如ES)基因組中，及所述起始盒適當(dāng)?shù)匕x擇標(biāo)記如陰性選擇標(biāo)記。適當(dāng)?shù)?，所述載體主鏈序列是BAC文庫序列，使得BAC可用于構(gòu)建ES細(xì)胞和哺乳動物。然而所述載體主鏈序列可以是作為靶位點的任何序列，其中可插入同源序列，例如通過同源重組進(jìn)行，如RMCE，且優(yōu)選不是編碼任何VDJ或恒定區(qū)的DNA。一方面，將第一 DNA片段插入起始盒之后將第二 DNA片段插入第一 DNA片段的一部分中，適當(dāng)?shù)夭迦氲诙?DNA片段的一部分載體主鏈。一方面，插入的DNA片段包含一部分人類VDJ區(qū)，側(cè)翼是不是來自人類VDJ區(qū)的5’和/或3’序列。一方面，所述5’和/或3’側(cè)翼序列可均含有一或多個選擇標(biāo)記，或者在插入基因組中時能產(chǎn)生可選擇系統(tǒng)。一方面，一或兩個側(cè)翼序列可以在插入后在體外或體內(nèi)從基因組中除去。一方面，所述方法包括插入DNA片段，隨后選擇在人類VDJ DNA側(cè)翼的插入片段的5’和3’末端。一方面，重復(fù)插入是通過在先前插入片段的5’末端插入DNA片段進(jìn)行，在這方面可以在體內(nèi)缺失分離插入的人類DNA序列的載體DNA，提供連續(xù)人類DNA序列。一方面，將人類VDJ DNA插入基因組中可以不用在基因組中留下任何側(cè)翼DNA而實現(xiàn)，例如通過轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)DNA切割進(jìn)行。一種合適的轉(zhuǎn)座酶是Piggybac轉(zhuǎn)座酶。一方面，第一人類可變區(qū)片段通過同源重組插入在起始盒主鏈序列，隨后通過重組酶靶序列之間的重組除去任何陰性選擇標(biāo)記和起始盒的DNA，在這個實例中使用FRT，F(xiàn)LPase表達(dá)。通常，重復(fù)進(jìn)行在(如BAC)主鏈起始序列的重復(fù)靶向插入及隨后通過重組酶靶序列之間的重排除去以構(gòu)建位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的全部人類VDJ區(qū)。一方面，在所述方法中可以使用選擇標(biāo)記或系統(tǒng)。所述標(biāo)記可以在將DNA片段插入基因組中時產(chǎn)生，例如形成與基因組中已經(jīng)存在的DNA元件聯(lián)合的選擇標(biāo)記。一方面，所述細(xì)胞(如ES)基因組在加工期間不同時含有2個相同的選擇標(biāo)記?？梢姴迦肱c選擇的重復(fù)過程可以僅使用2個不同的選擇標(biāo)記進(jìn)行，如在本文實施例中揭示，及例如第三選擇標(biāo)記可以與第一標(biāo)記相同，等到插入第三載體片段時，第一載體片段和第一標(biāo)記已經(jīng)除去。一方面，正確的插入事件是在進(jìn)行任何多步驟克隆過程的下一步驟之前證實的，例如通過使用高密度基因組 陣列篩選ES細(xì)胞以鑒別具有完整BAC插入的那些細(xì)胞、測序及PCR確認(rèn)證實BAC結(jié)構(gòu)。
起始盒(也稱作“著陸區(qū)”)本發(fā)明還涉及多核苷酸“著陸區(qū)”序列，所述多核苷酸包含與靶染色體區(qū)域同源的核酸區(qū)以使得可以通過同源重組插入靶染色體中，及包含允許重組酶驅(qū)動的將核酸插入著陸區(qū)的核酸位點。本發(fā)明還涉及載體、細(xì)胞和哺乳動物，其包含如本文揭示的插入細(xì)胞基因組中的著陸區(qū)。所述著陸區(qū)任選地包含非內(nèi)源S-mu，如大鼠S_mu轉(zhuǎn)換序列。所述著陸區(qū)任選地包含(5，至3’方向)小鼠Εμ序列、非人類非小鼠(如大鼠)轉(zhuǎn)換μ序列及至少一部分小鼠Cy或完整小鼠Cy。大鼠轉(zhuǎn)換序列任選地包含或者由SEQ ID NO:1組成。所述著陸區(qū)任選地包含SEQ ID NO:6的5’同源臂。所述著陸區(qū)任選地具有SEQ ID:2或SEQ ID N0:3所示序列。本發(fā)明的方法包括其中所述著陸區(qū)序列包含如本文所述任何構(gòu)型或序列的方法。本發(fā)明的另一方法包括通過在小鼠J1-4與小鼠C mu序列之間的同源重組將著陸區(qū)插入小鼠染色體中的步驟。本發(fā)明另一方法包括通過在小鼠J1-4與E mu之間的同源重組將著陸區(qū)插入小鼠染色體12中的步驟。一方面，所述方法 使用位點特異性重組將一或多個載體插入細(xì)胞如ES細(xì)胞的基因組中。位點特異性重組酶系統(tǒng)為本領(lǐng)域熟知，可包括Cre-1ox和FLP/FRT或其組合，其中重組發(fā)生在具有序列同源性的2個位點之間。除了本文所述任何特定的Cre/Lox或FLP/FRT系統(tǒng)之外，可用于本發(fā)明中的其它重組酶和位點包括Dre重組酶、rox位點及PhiC31重組酶。合適的BAC 可得自 Sanger 中心，見 “A genome-wide, end-sequencedl29Sv BAClibrary resource for targeting vector construction，，Adams DJ,Quail MA, CoxT, van der Weyden L, Gorick BD,Su Q, Chan Wl, Davies R, Bonfield JK, Law F, HumphrayS, Plumb B, Liu P, Rogers J, Bradley A.Genomics.2005Dec;86(6):753-8.Epub20050ct27.The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB101SA，UKo 含有人類DNA的BAC也可得自例如Invitrogen。合適的文庫在Osoegawa K ef al, GenomeResearch2001.11:483-496 中描述。一方面，本發(fā)明的方法特別包括:(I)將第一 DNA片段插入非人類ES細(xì)胞中，所述片段含有人類VDJ或VJ區(qū)DNA的第一部分及含有第一選擇標(biāo)記的第一載體部分；(2)任選地缺失一部分第一載體部分；(3)將第二 DNA片段插入含有第一 DNA片段的非人類ES細(xì)胞中，所述插入發(fā)生在第一載體部分內(nèi)，第二 DNA片段含有人類VDJ或VJ區(qū)的第二部分及含有第二選擇標(biāo)記的第二載體部分；(4)缺失第一選擇標(biāo)記和第一載體部分，優(yōu)選通過重組酶作用實現(xiàn)；(5)將第三DNA片段插入含有第二 DNA片段的非人類ES細(xì)胞中，所述插入發(fā)生在第二載體部分，第三DNA片段含有人類VDJ或VJ區(qū)的第三部分及含有第三選擇標(biāo)記的第三載體部分；
(6)缺失第二選擇標(biāo)記和第二載體部分；及(7)如果需要，重復(fù)插入和缺失第四及更進(jìn)一步的人類VDJ或VJ區(qū)的片段的步驟，以產(chǎn)生具有如本文所述插入的一部分或全部人類VDJ或VJ區(qū)的ES細(xì)胞，及適當(dāng)?shù)爻S細(xì)胞基因組內(nèi)的所有載體部分。另一方面，本發(fā)明包括:1.在細(xì)胞基因組中插入形成起始盒的DNA ；2.將第一 DNA片段插入起始盒中，第一 DNA片段包含人類DNA的第一部分及含有第一選擇標(biāo)記或者在插入時產(chǎn)生選擇標(biāo)記的第一載體部分；3.任選地除去部分載體DNA ；4.將第二 DNA片段插入第一 DNA片段的載體部分中，第二 DNA片段含有人類DNA的第二部分及第二載體部分，第二載體部分含有第二選擇標(biāo)記或者在插入時產(chǎn)生第二選擇標(biāo)記；5.任選地除去任何載體DNA以使得第一和第二人類DNA片段形成連續(xù)序列 '及6.如果需要，重復(fù)插入人類VDJ DNA及除去載體DNA的步驟，以產(chǎn)生具有全部或部分人類VDJ或VJ區(qū)的細(xì)胞，其足以能與宿主恒定區(qū)聯(lián)合產(chǎn)生嵌合抗體；其中插入一或多個或全部DNA片段使用位點特異性重組進(jìn)行。一方面，所述非 人類哺乳動物能產(chǎn)生至少I X IO6個不同的功能性嵌合免疫球蛋白序列組合的多樣性。一方面，所述靶向在衍生自C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv小鼠品系的ES細(xì)胞中進(jìn)行。一方面，非人動物如小鼠在RAG-1或RAG-2缺陷背景下或者在阻止成熟宿主B和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的其它合適遺傳背景下產(chǎn)生。一方面，所述非人類哺乳動物是嚙齒類動物，適當(dāng)?shù)厥切∈?，本發(fā)明的細(xì)胞是嚙齒類動物細(xì)胞或ES細(xì)胞，適當(dāng)?shù)厥切∈驟S細(xì)胞。本發(fā)明的ES細(xì)胞可用于通過使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生動物，包括將ES細(xì)胞注射進(jìn)胚泡中，隨后將嵌合的胚泡移植入雌性動物以產(chǎn)生具有所需插入的可以針對純合重組體進(jìn)行繁殖和選擇的后代。一方面，本發(fā)明涉及包含ES細(xì)胞衍生組織和宿主胚胎衍生組織的嵌合動物。一方面，本發(fā)明涉及遺傳改變的后代動物世代，其包括具有VDJ和/或VJ區(qū)純合重組體的動物。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生特異于希望抗原的抗體的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物并回收所述抗體(見例如Harlow, E.&Lane, D.1998, 5th edition, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Lab.Press, Plainview, NY;和 Pasqualini and Arap,Proceedings of theNational Academy of Sciences (2004) 101:257-259)。適當(dāng)?shù)?給予免疫原性量的抗原。本發(fā)明還涉及檢測靶抗原的方法，包括用識別如上述產(chǎn)生的抗體的一部分的二級檢測劑檢測抗體。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生完全人源化抗體的方法，包括用希望的抗原免疫上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，回收所述抗體或表達(dá)所述抗體的細(xì)胞，然后用人類恒定區(qū)置換非人類哺乳動物恒定區(qū)。這可以通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)在DNA水平進(jìn)行以用合適的人類恒定區(qū)DNA序列置換非人類哺乳動物恒定區(qū)-見例如Sambrook，J and Russell, D.(2001，3’d edition)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLab.Press, Plainview, NY)。另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化抗體和抗體鏈，其均是嵌合及完全人源化形式，本發(fā)明還涉及所述抗體在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及包含這種抗體及藥物可接受載體或其它賦形劑的藥物組合物。含有人類序列的抗體鏈如嵌合人類-非人類抗體鏈由于存在人類蛋白質(zhì)編碼區(qū)而在本文被認(rèn)為是人源化的。完全人源化抗體可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從編碼本發(fā)明嵌合抗體鏈的DNA產(chǎn)生。產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域熟知，本發(fā)明涉及在本發(fā)明非人類哺乳動物中應(yīng)答抗原攻擊時產(chǎn)生的嵌合或完全人源化抗體的多克隆和單克隆抗體。再一方面，可以對本發(fā)明產(chǎn)生的嵌合抗體或抗體鏈進(jìn)行操縱，適當(dāng)?shù)卦贒NA水平操縱，以產(chǎn)生具有抗體樣性質(zhì)或結(jié)構(gòu)的分子，如來自重鏈或輕鏈的人類可變區(qū)不存在恒定區(qū)，例如結(jié)構(gòu)域抗體；或者人類可變區(qū)具有來自相同或不同物種的重鏈或輕鏈的任何恒定區(qū)；或者人類可變區(qū)具有非天然發(fā)生的恒定區(qū)；或者人類可變區(qū)具有任何其它融合配偶體。本發(fā)明涉及衍生自根據(jù)本發(fā)明鑒別的嵌合抗體的所有這樣的嵌合抗體衍生物。再一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的動物在準(zhǔn)-人類抗體所有組成成分的情況中分析藥物和疫苗的可能作用。

本發(fā)明還涉及鑒別或確認(rèn)藥物或疫苗的方法,所述方法包括將所述疫苗或藥物輸送給本發(fā)明的哺乳動物并監(jiān)測如下一或多項:免疫應(yīng)答，安全性譜，對疾病的作用。本發(fā)明還涉及包含如本文所述抗體或抗體衍生物以及使用這種抗體的說明書或者合適的實驗室試劑如緩沖液、抗體檢測試劑的試劑盒。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生抗體或其一部分的方法，所述方法包括提供:(i)編碼根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體或其一部分的核酸；或者(ii)序列信息，從中編碼根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體或其一部分的核酸可以被表達(dá)以使得抗體產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地C ga_a*C mu),其中所述抗體由相應(yīng)于細(xì)胞(任選地B細(xì)胞、ES細(xì)胞或雜交瘤)的嵌合重鏈基因座的核苷酸序列的核苷酸序列編碼，所述基因座包含非人類脊椎動物恒定區(qū)核苷酸序列和通過人類V區(qū)、人類D區(qū)和人類J區(qū)的體內(nèi)重排產(chǎn)生的重排VDJ核苷酸序列，所述V區(qū)選自V1-3區(qū)、V2-5區(qū)、V4-4區(qū)、V1-2區(qū)或V6-1區(qū)之一，任選地是V1-3或V6-1節(jié)段。任選地，所述J區(qū)是任何JHl、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6任一，及一方面是JH4或JH6。一方面，所述D區(qū)是任何D3-9、D3-10、D6-13或D6-19。在一個實例中，重排VDJ核苷酸序列通過人類V1-3和JH4(任選地與D3-9、D3-10、D6-13或D-19)、或者 V1-3 和 JH6(任選地與 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)、或者 V6-1 和 JH4(任選地與 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)、或者 V6-1 和 JH6 (任選地與 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)的體內(nèi)重排產(chǎn)生。在一個實例中，重排VDJ核苷酸序列通過人類V6-1DH3-10、V1-3DH3-10、V1-3DH6-19、Vl-3Dh3-9或V6-1DH6-19的體內(nèi)重排產(chǎn)生。一方面，所述抗體包含在本文實施例和圖表中舉例的任何組合。任選地，所述體內(nèi)重排是在衍生自與恒定區(qū)序列(例如小鼠B細(xì)胞或ES細(xì)胞)相同的非人類脊椎動物物種的細(xì)胞中(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞)。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合重鏈基因座。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合重鏈基因座。本發(fā)明還涉及具有編碼嵌合抗體的基因組的非人類脊椎動物或哺乳動物，所述嵌合抗體包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地C gamma或C mu),所述哺乳動物:表達(dá)比V2-5、V4-4、V1-2或V6-1抗體更多的V1-3抗體；和/或表達(dá)比任意單獨的V1-3JH1、V1-3JH2、V1-3JH3或V1-3JH5抗體更多的V1-3JH4或V1-3JH6抗體；和/或表達(dá)比任意單獨 的V6-1JH1、V6-1JH2、V6-1JH3或V6-1JH5抗體更多的V6-1JH4或V6-1JH6抗體；和/或表達(dá)比具有任何其它D區(qū)的V1-3抗體更多的V1-3DH3-10抗體?？贵w的表達(dá)可以通過為本領(lǐng)域技術(shù)人類員易于獲得的及本領(lǐng)域常規(guī)的方法評估。例如，表達(dá)可以在mRNA水平評估，如下文實施例所示。本發(fā)明還涉及嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地輕鏈恒定區(qū))，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，其基因組包含抗體鏈基因座，所述抗體鏈基因座包含種系人類κ V1-8和種系人類κ Jl序列，及其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中V1-8和Jl序列的體內(nèi)重組獲得，及其中所述抗體具有可變區(qū)序列，其與由種系人類kV1-8和種系人類Kjl序列編碼的序列不同。因此，在本發(fā)明的這個方面，人類種系序列能經(jīng)歷生產(chǎn)性重排(productiverearrangement)以形成編碼序列，所述編碼序列與非人類恒定區(qū)序列聯(lián)合可以被表達(dá)為具有至少完整的人類可變區(qū)和非人類恒定區(qū)的嵌合抗體鏈。這與種系人類kV1-8與種系人類κ Jl序列自身組合相反(如下文實施例所示)，其不提供抗體編碼序列(由于包含終止密碼子)。一方面，嵌合抗體的重排序列是體細(xì)胞超變的結(jié)果。一方面，所述抗體是κ抗體，另一方面，所述抗體包含非人類重鏈恒定區(qū)(例如大鼠或小鼠C gamma或C mu)。所述抗體序列任選地包含X1X2T F G Q，其中X1X2=PR、RT或PW，任選地X1X2T F G Q G T K VEIKRAD A基序。這種基序在種系序列的等價位直未發(fā)現(xiàn)，如實施例所不。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含如這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地輕鏈恒定區(qū))，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，其基因組包含包含種系人類KV1-6和種系人類Kjl序列的抗體鏈基因座，其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中V1-6和Jl序列的體內(nèi)重組獲得，及其中所述抗體具有可變區(qū)序列，其與由種系人類kV1-6和種系人類κ Jl序列編碼的序列不同。因此，在本發(fā)明的這個方面，人類種系序列能經(jīng)歷生產(chǎn)性重排以形成編碼序列，所述編碼序列與非人類恒定區(qū)序列聯(lián)合可以被表達(dá)為具有至少完整人類可變區(qū)和非人類恒定區(qū)的嵌合抗體鏈。這與種系人類κ V1-6和種系人類κ Jl序列自身的組合相反(如下文實施例所示)，其不提供抗體編碼序列(由于包含終止密碼子)。一方面，嵌合抗體的重排序列是體細(xì)胞超變的結(jié)果。一方面，所述抗體是K抗體；另一方面，所述抗體包含非人類重鏈恒定區(qū)(例如大鼠或小鼠C gamma或C mu)。所述抗體序列任選地包含X3X4T F G Q，其中X3X4=PR或PW，任選地X3X4T FGQGTKVEIKRAD A基序。這種基序在種系序列中等價位置未發(fā)現(xiàn)，如實施例所示。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地C ga_a*C mu或Ck )，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，其基因組包含包含種系人類KV1-5和種系人類K Jl序列的抗體鏈基因座，及其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中V1-5和Jl序列的體內(nèi)重組獲得。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含如這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地C ga_a*C mu或Ck )，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，其基因組包含包含種系人類KV1-5和種系人類K J4序列的抗體鏈基因座，及其中所述抗體可以通過在所述哺乳動物中V1-5和J4序列的 體內(nèi)重組獲得。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明還涉及非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含如在這個段落上述的嵌合抗體鏈基因座。本發(fā)明的抗體可以是分離的，一方面分離自抗體在其中表達(dá)的細(xì)胞或生物體。在某些方面，本發(fā)明涉及:非人類哺乳動物，其基因組包含:(a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的人類IgH VDJ區(qū)；及(b)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的人類Ig輕鏈K V和J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的人類Ig輕鏈λ V和J區(qū)；其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體的所有組成成分，及任選地其中所述非人類哺乳動物基因組被修飾為阻止完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。非人類哺乳動物ES細(xì)胞，其基因組包含:(a)位于非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的人類IgH V、D和J區(qū)；及(b)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的人類Ig基因座輕鏈K V和J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的人類Ig基因座輕鏈λ V和J區(qū)；其中所述ES細(xì)胞能發(fā)育成非人類哺乳動物，能產(chǎn)生嵌合的具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的抗體的所有組成成分。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法，所述哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體的所有組成成分，所述方法包括通過同源重組將如下區(qū)域插入非人類哺乳動物ES細(xì)胞基因組中:(a)人類IgH VDJ區(qū)，位于宿主非人類哺乳動物重鏈恒定區(qū)上游，及(b)針對λ或K鏈的人類IgL VJ區(qū)，分別位于宿主非人類哺乳動物λ或Κ鏈恒定區(qū)上游，由此所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體的所有組成成分，其中步驟(a)和(b)可以任意順序進(jìn)行，步驟(a)和(b)每步可以逐步或作為單一步驟進(jìn)行。一方面，人類VDJ或VJ區(qū)插入在宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游是通過同源重組逐步插入多個片段實現(xiàn)的。一方面，所述逐步插入是在起始盒已經(jīng)插入ES細(xì)胞基因組(提供獨特的由BAC主鏈序列和陰性選擇標(biāo)記組成的靶向區(qū))中的位點開始。一方面，第一人類可變區(qū)片段通過同源重組插入起始盒BAC主鏈序列，所述陰性選擇標(biāo)記和起始盒隨后通過在重組酶靶序列之間的重組除去。一方面，重復(fù)進(jìn)行在BAC主鏈起始序列的重復(fù)靶向插入及隨后通過重組酶靶序列之間的重排除去所述主鏈以構(gòu)建位于宿主非哺乳動物恒定區(qū)上游的完整人類VDJ區(qū)。其它方面包括:產(chǎn)生特異于希望抗原的抗體的方法，所述方法包括用希望抗原免疫如本文所述非人類哺乳動物并回收所述抗體或產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。產(chǎn)生完全人源化抗體的方法，包括免疫本文所述非人類哺乳動物，然后適當(dāng)?shù)赝ㄟ^編碼所述抗體的核酸的工程化用人類恒定區(qū)置換與所述抗原特異性反應(yīng)的抗體的非人類哺乳動物恒定區(qū)。本文揭示的方法、細(xì)胞或哺乳動物，其中人類編碼區(qū)DNA序列與非人類哺乳動物控制序列功能性排列，由此該DNA的轉(zhuǎn)錄由所述非人類哺乳動物控制序列控制。一方面，所述人類編碼區(qū)V、D或J區(qū)與小鼠啟動子序列功能性排列。本發(fā)明還涉及根據(jù)本文揭示的任何方法產(chǎn)生的人源化抗體及如此產(chǎn)生的人源化抗體在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。應(yīng)理解本文所述特殊的實施方案是舉例說明而非限制本發(fā)明。本發(fā)明的主要特點在不偏離本發(fā)明范圍的前提下可以用于不同的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過常規(guī)研究將意識到或者能確定本 文描述的特定程序的眾多等價物。這種等價物被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)且為權(quán)利要求書所覆蓋。本說明書中提及的所有出版物和專利申請代表本發(fā)明所述領(lǐng)域中技術(shù)人員技術(shù)水平。本文提及的所有出版物和專利申請均援引加入本文參考，就如同每個單獨的出版物或?qū)＠暾埍惶禺悅€別表示援引加入。在權(quán)利要求書和/或說明書中，單詞“一個”當(dāng)與術(shù)語“包含”聯(lián)合使用可以是指“一個”，但是也可以是指“一或多個”、“至少一個”及“一或一個以上”。除非明確指出是唯一選項或選項是互斥的，權(quán)利要求書中術(shù)語“或”的使用是指“和/或”，盡管本文支持描述唯一選項及“和/或”的定義。在本申請書中，術(shù)語“大約”用于描述這樣的數(shù)值，其包括設(shè)備、用于確定該數(shù)值的方法的固有誤差變量，或者研究對象中存在的變量。如本說明書和權(quán)利要求書所用，單詞“包含”(及任何形式)、“具有(及任何形式)”、“包括”(及任何形式)或“含有”(及任何形式)是包括或開放式的，不排除另外的未列舉的元件或方法步驟。如本文所用，術(shù)語“或其組合”是指該術(shù)語之前列舉項目的所有排列與組合。例如，“A、B、C或其組合”是指包括至少如下之一:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果順序在特定場合中是重要的，還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)這個實例，顯然包括含有一或多個項目或術(shù)語的重復(fù)組合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除非根據(jù)上下文很明顯，則典型地對于任何組合中項目或術(shù)語的數(shù)目無限制。除非根據(jù)上下文很明顯，本文的任何部分均可以組合本文的任何其它部分。根據(jù)本發(fā)明揭示可以不用過度實驗而產(chǎn)生和實施本文揭示和請求保護(hù)的所有組合物和/或方法。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)在優(yōu)選的實施方案中描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識到在不偏離本發(fā)明觀點、精神和范圍的前提下可以對所述組合物和/或方法及所述方法的步驟或步驟順序加以改變。為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有這些相似的替代和修飾被認(rèn)為在所附權(quán)利要求書要求的本發(fā)明的精神、范圍和觀點內(nèi)。本發(fā)明在如下非限制性實施例中得以更詳細(xì)描述。實施例3揭示了已經(jīng)獲得的實驗數(shù)據(jù)，支持本發(fā)明某些方面的觀點的證據(jù)，而實施例1和2為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了實施本發(fā)明的詳細(xì)指導(dǎo)。實施例1總體策略本發(fā)明的小鼠模型可 以通過在小鼠恒定區(qū)上游插入含有所有V、D和J區(qū)的 960kb人類重鏈基因座和在小鼠恒定區(qū)上游插入473kb人類K區(qū)而獲得?；蛘呋蛳嗬^地，將人類λ區(qū)插入在小鼠恒定區(qū)上游。這種插入通過使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在ES細(xì)胞中基因靶向而實現(xiàn)。在每個基因座中以其天然(野生型)構(gòu)型高保真插入完整V-D-J區(qū)適當(dāng)?shù)赝ㄟ^在該基因座中插入人類細(xì)菌人工染色體(BAC)而實現(xiàn)。適當(dāng)?shù)?，對BAC進(jìn)行修剪，由此在最終基因座中與原始相比沒有序列復(fù)制或者丟失。這種修剪可以通過重組工程進(jìn)行。覆蓋這些基因座的合適修剪的相關(guān)人類BAC的大小平均為90kb。在一種方法中，人類D和J元件的完全互補(bǔ)物以及七或八個人類V區(qū)由在下述實驗性插入方案中插入的第一 BAC覆蓋。在IgH和IgK基因座中插入的第一 BAC可含有如下V 區(qū)。IgH:V6-1, VI1-1-1, Vl-2, VII1-2-1, Vl-3, V4-4, V2-5 以及 IgK:V4-1, V5-2, V7-3,V2-4, Vl-5, Vl-6, V3-7, V1-8。適當(dāng)?shù)?，每個基因座的性能在第一次BAC插入后評估，使用嵌合小鼠進(jìn)行，以及在每次隨后的加入BAC之后進(jìn)行。見下文關(guān)于這個性能測試的詳細(xì)描述。IgH基因座需要9個額外的BAC插入，IgK需要5個，以提供分別覆蓋所有0.96Mb和0.473Mb的IgH和IgK基因座的人類V區(qū)的完全互補(bǔ)物。當(dāng)插入ES細(xì)胞基因組中時，不是所有的BAC均保持其野生型構(gòu)型。因此我們利用高密度基因組陣列篩選ES細(xì)胞以鑒別具有完整BAC插入的那些細(xì)胞(Barrett，Μ.Τ.，Schefferj A.，Ben-Dorj A.，Sampasj N.，Lipsonj D.，Kincaid, R.，Tsangj P.，Curry, B.,Baird, K., Meltzerj P.S., ef al.(2004).Comparative genomic hybridization usingoligonucleotide microarrays and total genomic DNA.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of AmericalOlj 17765-17770)。這種篩選也能使技術(shù)人員可鑒別并選擇其中ES細(xì)胞基因組被損害(compromised)并因此不能繁殖為(populate)嵌合動物種系的ES克隆。便于這種評估的其它合適的基因組工具包括測序和PCR證實。因此，一方面，正確的BAC結(jié)構(gòu)在進(jìn)行下一步驟之前被證實。從上文描述中可以看出為了對具有90kb BAC的基因座進(jìn)行完全工程化，對于IgH需要進(jìn)行最少10個靶向步驟，對于IgK需要5個步驟。具有IgL基因座的小鼠可以與IgK基因座相似方式產(chǎn)生。需要另外的步驟以除去支持基因靶向的選擇標(biāo)記。由于這些操縱是在ES細(xì)胞中逐步進(jìn)行的，因此一方面，在這個過程中保持種系傳遞能力(germlinetransmission capacity)。通過多輪操縱保持ES細(xì)胞克隆的性能而不需要在每個步驟檢測ES細(xì)胞系的種系潛力對于本發(fā)明是重要的。目前用于KOMP和EUCOMM整體敲除方案的細(xì)胞系在其用于這個方案之前已經(jīng)被修飾兩次，其種系傳遞速度與親代細(xì)胞相比不改變(這些細(xì)胞系可公開獲得，見WWW.komp.0rg和www.eucomm.0rg)。稱作JM8的這個細(xì)胞系在公開的培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生100%ES細(xì)胞衍生的小鼠(Pettitt, S.J.，Liang, Q.，Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, Η.Μ., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, ff.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.Nature Methods.)。這些細(xì)胞具有已經(jīng)證實的使用標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件可再現(xiàn)地有助于嵌合動物的體細(xì)胞和種系組織的能力。這種能力可用在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)細(xì)胞系(SNL)培養(yǎng)的細(xì)胞及甚至無飼養(yǎng)細(xì)胞的僅在明膠包被組織培養(yǎng)平板上生長的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。一種特殊的亞系JM8A3保持了在幾次系列亞克隆循環(huán)之后繁殖為嵌合體的種系的能力。通過例如同源重組進(jìn)行的廣泛遺傳操縱-如在本發(fā)明的情況中-不能損害細(xì)胞的多能性。產(chǎn)生具有這種高百分比ES細(xì)胞衍生組織的嵌合體的能力具有其它優(yōu)勢。首先，高水平嵌合性與種系傳遞潛力相關(guān)并對種系傳遞提供了替代分析，僅需5-6周。其次，由于這些小鼠是10096ES細(xì)胞衍生的，因此工程化的基因座可以直接被檢測，除去由于育種導(dǎo)致的延遲。在嵌合體中檢測新的Ig基因座的完整性是可能的，因為宿主胚胎衍生自RAG-1基因突變的動物，如下文所述?？梢允褂玫牧硪患?xì)胞系是HPRT-ve細(xì)胞系，如AB2.1，如“Chromosome engineering in mice,Ramirez-Solis R,Liu P and BradleyA, Nature 1995; 378; 6558; 720-4” 所示。RAG-1 互補(bǔ)雖然許多克隆將產(chǎn)生IOOffiS衍生小鼠，但是一些不能。因此，在每一步驟，小鼠在RAG-1缺陷背景中產(chǎn)生。這提供了具有1009ffiS-衍生B-和T-細(xì)胞的小鼠，其可直接用于免疫和抗體產(chǎn)生?？梢允褂镁哂蠷AG-2缺陷背景或者組合的RAG-1/RAG-2缺陷背景的細(xì)胞，或者其中小鼠僅產(chǎn)生ES細(xì)胞衍生B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的等價突變。為了在這些小鼠中僅人類-小鼠IgH或IgK基因座是有活性的，可以將人類-小鼠IgH和IgK基因座在其中IgH或IgK基因座的一個等位基因已經(jīng)被失活的細(xì)胞系中工程化。或者，宿主Ig基因座如IgH或IgK基因座的失活可以在插入后進(jìn)行。

具有RAG-1基因突變的小鼠品系是免疫缺陷的，因為其不具有成熟的B-或T-淋巴細(xì)胞(US5，859，307)。如果正確的V (D) J重組發(fā)生，T-和B-淋巴細(xì)胞僅分化。由于RAG-1是這個重組的關(guān)鍵酶，因此沒有RAG-1的小鼠是免疫缺陷的。如果宿主胚胎是遺傳RAG-1純合突變體，如果動物的淋巴組織衍生自宿主胚胎，則通過注射這種胚胎產(chǎn)生的嵌合體將不能產(chǎn)生抗體。然而，JM8細(xì)胞和AB2.1細(xì)胞例如通常提供超過80%的嵌合動物的體細(xì)胞組織并因此通常居于淋巴組織。JM8細(xì)胞具有野生型RAG-1活性及因此在嵌合動物中產(chǎn)生的抗體將僅由工程化的JM8ES細(xì)胞基因組編碼。因此，嵌合動物可以通過免疫接種用抗原攻擊，隨后產(chǎn)生該抗原的抗體。這樣使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可以檢測工程化的人類/小鼠IgH和IgK基因座的性能，如在本發(fā)明中所述。見圖19和20。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用所述嵌合動物以確定抗體多樣性的程度(見例如Harlow, E.&Lane, D.1998, 5th edition, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Lab.Press, Plainview, NY)。例如，嵌合動物血清中某些抗體表位的存在可以通過與特異性抗獨特型抗血清結(jié)合而確定，例如在ELISA測定中。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以對衍生自嵌合動物的B細(xì)胞克隆的基因組進(jìn)行測序并將所述序列與野生型序列對比以確定超變水平，這種超變表示正常抗體成熟。本領(lǐng)域技術(shù)人員也使用所述嵌合動物檢驗抗體功能，其中所述抗體從工程化的Ig基因座編碼(見例如 Harlow, E.&Lane, D.1998，5th edition, Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Lab.Press, Plainview, NY)。例如，可以檢測抗血清與抗原的結(jié)合，所述抗原用于免疫嵌合動物。這種測量可以通過ELISA測定進(jìn)行?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以檢測抗原的中和，通過加入從適當(dāng)免疫的嵌合動物收集的抗血清進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知任何這些檢測的陽性結(jié)果證實工程化的Ig基因座編碼具有人類可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體的能力，這是本發(fā)明的主題，所述抗體能以野生型抗體的形式起作用。實驗技術(shù)產(chǎn)生載體以用于在ES細(xì)胞中同源重組的重組工程在例如W09929837和W00104288中揭示，該技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。一方面，人類DNA的重組工程使用BAC作為所述人類DNA的來源進(jìn)行。使用Qiagen BAC純化試劑盒分離人類BAC DNA。使用重組工程將每個人類BAC的主鏈修飾為與已插入小鼠IgH區(qū)中的BAC精確相同或相似的構(gòu)型。使用重組工程修剪每個人類BAC的基因組插入物，以便一旦插入BAC，則在小鼠IgH或IgK基因座將形成人類V(D)J基因組區(qū)的無縫連續(xù)部分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過電穿孔和基因分型進(jìn)行 BAC DNA 轉(zhuǎn)染(Prosser, H.M., Rzadzinska, A.K., Steel, K.P., and Bradley, A.(2008).Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin Vila inactin dynamics of stereocilia.Molecular and Cellular Biology28, 1702-1712;Ramirez-Solis, R., Davis, A.C., and Bradley,A.(1993).Gene targeting in embryonicstem cells.Methods in Enzymology225, 855-878.)。 使用由 Pentao Liu and DonCourt’s實驗室揭示的方法和試劑進(jìn)行重組工程(Chan, ff., Costantino, N., Li, R., Lee, S.C., Su, Q., Melvin, D., Court, D.L., and Liu, P.(2007).A recombineering based approachfor high-throughput conditional knockout targeting vector construction.NucleicAcids Research3 5, e64)。關(guān)于BAC衍生染色體片段的基因靶向及重組進(jìn)非人類哺乳動物如小鼠基因組中的這些及其它技術(shù)在例如 http://www.eucomm.0rg/information/targeting/ 和 http://www.eucomm.0rg/information/publications 中揭不。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行C57BL/6N-衍生細(xì)胞系如JM8雄性ES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。所述JM8ES細(xì)胞已經(jīng)示出有能力廣泛有助于體細(xì)胞組織和種系,及在Sanger Institute如EUCOMM 和 KOMP 用于大的小鼠誘變程序(Pettitt, S.J.，Liang, Q.，Rairdan, X.Y.，Moran, J.L., Prosser, Η.Μ., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, ff.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.NatureMethods.)。對 JM8ES 細(xì)胞(1.0XlO7)進(jìn)行電穿孔(500 μ F，230V ;BioRad)，使用 10 μ g1-Scel線性化的人類BAC DNA。用嘌呤霉素(3 μ g/ml)或G418 (150 μ g/ml)選擇轉(zhuǎn)染物。所述選擇在電穿孔后24小時(用G418)或48小時(用嘌呤霉素)開始,進(jìn)行5天。IOyg線性化人類BAC DNA可以產(chǎn)生直至500個嘌呤霉素或G418抗性ES細(xì)胞集落。挑取抗生素抗性ES細(xì)胞集落置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中進(jìn)行基因分型以鑒別被靶向的克隆。一旦鑒別了被靶向的小鼠ES細(xì)胞克隆，通過陣列比較基因組雜交(CGH)分析其總體基因組完整性(Chung, Y.J., Jonkers, J., Kitson, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C, Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, 1., Velds, A., ef al.(2004).A whole-genome mouseBAC microarray withl-Mb resolution for analysis of DNA copy number changesby array comparative genomic hybridization.Genome researchl4,188-196.和Liang,Q., Conte, N., Skarnes, ff.C, and Bradley,A.(2008).Extensive genomic copynumber variation in embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of Americal05, 17453-17456.)。具有異常基因組的 ES細(xì)胞不有效有助于嵌合小鼠的種系。BAC完整性通過PCR擴(kuò)增BAC中每個已知功能性V基因而檢驗。例如，在一種方法中，針對IgH基因座選擇的第一個人類BAC具有6個功能性V基因。為證實這個BAC存在這6個IGH V基因的完整性，設(shè)計至少14對PCR引物并用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增來自被靶向的ES細(xì)胞的基因組DNA。這些片段的人類野生型大小和序列將保證插入的BAC未重排。更詳細(xì)的CGH也證實插入的`BAC的完整性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用寡核苷酸aCGH平臺，這是由Agilent Technologies公司開發(fā)的。這個平臺不僅使得技術(shù)人員能在高分辨度研究基因組型DNA拷貝數(shù)改變(Barrett, Μ.Τ.，Scheffer, A.，Ben-Dor, A.,Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., efal.(2004).Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarraysand total genomic DNA.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of AmericalOl, 17765-17770.),而且允許使用用戶設(shè)計的陣列檢測特異性基因組區(qū)域。與依賴于cDNA探針或完整BAC探針的傳統(tǒng)aCGH技術(shù)相比，所述60-聚體寡核苷酸探針可以保證需要的特異性雜交及高敏感性和精確性以檢測我們制備的工程化染色體改變。例如，設(shè)計為在沿著插入的BAC全長以規(guī)律間隔雜交的寡核苷酸將檢測甚至非常短的缺失、插入或其它重排。這個平臺也提供了定制微陣列設(shè)計的最大靈活性。被靶向的ES細(xì)胞基因組DNA和正常人類個體基因組DNA分別用染料標(biāo)記并與陣列雜交。使用Aglient Technologies DNA微陣列掃描儀掃描陣列玻片。每個重鏈圖像上染料Cy5和染料Cy3的交互(Reciprocal)突光強(qiáng)度及l(fā)og2比率值通過使用Bluefuse軟件(Bluegnome)獲得。在標(biāo)準(zhǔn)化所有l(wèi)og2比率值之前，排除具有不一致熒光模式的斑點(〃置信度"〈0.29或者〃質(zhì)量〃=0)。在實驗中，來自任何寡核苷酸探針的信號的在-0.29與+0.29之間的Log2比率被認(rèn)為無拷貝數(shù)改變?！皬?fù)制”的log2比率閾值通常>0.29999，對于缺失是〈0.29999。一旦第一個人類BAC插入小鼠IgH基因座中并證實是其完整的天然構(gòu)型，F(xiàn)RT-側(cè)翼BAC主鏈將通過使用Flp位點特異性重組酶切除。如果規(guī)律的Flp-催化的FRT重組不足夠高，可以使用Flo，這是改良形式的Flpo重組酶，其在某些實驗中在ES細(xì)胞中比原始Flp更有效3-4倍。在切除BAC主鏈之后，ES細(xì)胞變得對嘌呤霉素(或G418)敏感，及對FIAU有抗性(因為喪失TK盒)。所述切除事件通過PCR擴(kuò)增連接片段而進(jìn)一步鑒定，使用人類基因組DNA引物進(jìn)行。這些無FRT-側(cè)翼BAC主鏈的ES細(xì)胞用于下一輪人類BAC插入及胚泡注射。靶向ES細(xì)胞的基因組以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過使用附圖1-18解釋的方案進(jìn)行。圖1說明了三種基本主鏈載體,分別為起始盒及2個大插入載體I和2。所述起始盒包含與插入小鼠基因組中希望位點同源的序列，這些位點側(cè)翼是進(jìn)行基于PCR基因分型的選擇標(biāo)記和填充引物序列，以證實BAC的正確插入。填充引物序列提供了對每個BAC添加步驟進(jìn)行基因分型的基礎(chǔ)。這個序列被認(rèn)為提供PCR引物的經(jīng)有力確認(rèn)的序列模板，可以位于IScel位點，理想地與BAC插入物相距 lkb。大插入載體包含質(zhì)粒上的人類DNA，所述質(zhì)粒具有選擇標(biāo)記和獨特的限制位點以線性化所述質(zhì)粒，以幫助同源重組進(jìn)ES細(xì)胞的基因組中。圖2說明了通過在小鼠J4與C alpha外顯子之間的同源重組將起始盒插入小鼠基因組中。嘌呤霉素選擇使得可以鑒別具有所述盒插入的ES細(xì)胞。pu(Delta) tk是在嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puro)與截短形式 的單純皰疹病毒I型胸苷激酶(DeltaTk)之間的一種雙功能融合蛋白。用PU (Delta) tk轉(zhuǎn)染的鼠胚胎干(ES)細(xì)胞變得對嘌呤霉素抗性及對1-(-2-脫氧-2-氟-1-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)敏感。與其它HSVltk轉(zhuǎn)基因不同，puDeltatk易于通過雄性種系傳遞。因此，pu (Delta) tk是常規(guī)陽性/陰性選擇標(biāo)記，其可廣泛用于許多ES細(xì)胞應(yīng)用中。圖3說明了大插入載體I靶向小鼠ES細(xì)胞基因組。所述載體的線性化在與填充引物序列相同位置進(jìn)行，這使得可以進(jìn)行本領(lǐng)域熟知的缺口修復(fù)基因分型策略，見Zheng etal NAR1999, Vol27, 11，2354-2360所述。本質(zhì)上，在基因組中隨機(jī)插入靶向載體不“修復(fù)”缺口，而同源重組事件將修復(fù)所述缺口。合適的PCR引物序列的并置使得集落被單獨篩選表示正確插入的陽性PCR片段。使用G418的陽性選擇使得可以鑒別含有neo選擇標(biāo)記的小鼠ES細(xì)胞?？梢詫λ嘘P(guān)鍵V、D和J區(qū)進(jìn)行PCR確認(rèn)。陣列比較基因組雜交可用于確認(rèn)BAC結(jié)構(gòu)。圖4說明了在FIAU中使用Flpe和選擇來缺失puro-delta_tk盒和BAC質(zhì)粒主鏈。由于Flpe在小鼠ES細(xì)胞中無效(5%缺失瞬時Flpe表達(dá))，期望在大多數(shù)情況中，在BAC主鏈側(cè)翼的兩個FRT位點之間發(fā)生重組。也可以檢測Flpo以發(fā)現(xiàn)相距IOkb的兩個FRT位點之間的重組效力。鑒于FRT缺失步驟是可選擇的，因此可以集合FIAU抗性克隆及立即進(jìn)入與克隆分析平行的下一步驟?；蛘撸ㄟ^短程PCR可以令人滿意地示出人類序列目前與所示小鼠那些序列相鄰(Hu-引物I和Mo-引物)。在此階段，將插入200kb人類基因座。圖5說明了第二個大插入載體靶向于ES細(xì)胞染色體中。將人類BAC靶向于小鼠IgH基因座，使用相同起始盒插入、隨后進(jìn)行IScel BAC線性化，BAC靶向于起始盒以及缺口修復(fù)基因分型策略。如前述進(jìn)行BAC插入確認(rèn)。圖6說明了通過Flpo缺失大插入載體2的FRTY側(cè)翼BAC主鏈及neo標(biāo)記。注意，這不是可選擇的，因此在此點必須進(jìn)行克隆分析。這樣使得可以證實人類2插入物與人類I插入物的并置及其它確認(rèn)結(jié)果。在此階段，將插入 200kb人類基因座。圖7說明了靶向小鼠IgH基因座的下一個大插入載體。然后除去pu-delta TK盒，如圖4所示?？梢灾貜?fù)這個程序以摻入其它BAC。圖8說明了最終預(yù)測的EA細(xì)胞構(gòu)建體。圖9-18提供了這種方法的進(jìn)一步詳細(xì)描述。實施例2在本發(fā)明的進(jìn)一步方法中，也可以使用位點特異性重組。位點特異性重組(SSR)在最近20年已經(jīng)廣泛用于將轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)指定染色體基因座中。SSR涉及同源DNA序列之間的重組?；赟SR的染色體靶向的第一代涉及(i)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中單一重組靶位點(RT)如1xP或FRT與(ii)由前一整 合提供的染色體RT位點之間的重組。這種方法的主要問題是插入事件是罕見的，因為切除總是比插入更有效。引入稱作RMCE(重組酶介導(dǎo)的盒交換)的 SSR第二代，如 Schlake and Bode 在 1994 (Schlake, Τ.; J.Bode (1994)."Use of mutatedFLP-recognition-target-(FRT_)sites for the exchange of expression cassettes atdefined chromosomal loci〃.Biochemistry33:12746-12751)所述。其方法基于在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中使用兩個異種特異性和不相容RT，其可以與染色體上相容RT位點重組，導(dǎo)致一部分DNA置換為另一部分-或者盒交換。這種方法已經(jīng)成功用于多種有效的染色體靶向中，包括大于 50kb 的 BAC 插入物的整合(Wallace, H.A.C.et al.(2007)."Manipulating themouse genome to engineering precise functional syntenic replacements with humansequence".Cell128:197-209;Prosser, H.M.et al.(2008)."Mosaic complementationdemonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics ofStereocilia".Mol.Cell.Biol.28:1702-12)。BAC的最大插入物大小是大約300-kb，及因此這是RMCE的盒大小的上限。在本發(fā)明中，我們利用稱作順序RMCE(sequential RMCE, SRMCE)的新的基于SSR的技術(shù)，其使得可以在相同基因座中連續(xù)插入BAC插入物。所述方法包括如下步驟:1.將形成起始盒(在本文也稱作著陸區(qū))的DNA插入細(xì)胞基因組中；2.將第一 DNA片段插入所述插入位點，所述第一 DNA片段包含人類DNA的第一部分和第一載體部分，所述載體部分含有第一選擇標(biāo)記或在插入時產(chǎn)生選擇標(biāo)記；3.除去載體DNA的一部分；4.將第二 DNA片段插入第一 DNA片段的載體部分中，所述第二 DNA片段含有人類DNA的第二部分和第二載體部分，所述載體部分含有第二選擇標(biāo)記或者在插入時產(chǎn)生第二選擇標(biāo)記；5.除去任何載體DNA，以使得第一和第二人類DNA片段形成連續(xù)序列；以及6.如果需要，重復(fù)插入一部分人類V (D) J DNA和除去載體DNA的步驟，以產(chǎn)生具有足以能與宿主恒定區(qū)聯(lián)合產(chǎn)生嵌合抗體的全部或部分人類VDJ或VJ區(qū)的細(xì)胞，其中至少一個DNA片段的插入使用位點特異性重組。在一具體方面，所述方法利用三個異種特異性和不相容1xP位點。所述方法包括如下步驟，并在圖22-26中說明:1.將著陸區(qū)靶向于指定基因座中。將含有側(cè)翼為反向PiggyBac(PB) ITR的HPRT小基因的進(jìn)入載體靶向指定區(qū)域(例如=IGHJ與Ey或者IGKJ與E K或者IGLCl與E λ 3_1之間的區(qū)域)以作為BAC靶向的著陸區(qū)。所述HPRT小基因包含兩個合成外顯子和相關(guān)內(nèi)含子。所述5’HPRT外顯子側(cè)翼是兩個異種特異性和不相容1xP位點(一個是野生型位點，另一個是突變的位點1οΧ5171)，彼此是相反方向(圖22)。這兩個1xP位點提供了通過RMCE進(jìn)行BAC插入的重組位點。2.將第一個修飾的BAC插入靶向的著陸區(qū)中。所述第一個BAC具有一段DNA，其插入側(cè)翼被工程化修飾的基·因組中。所述5’修飾(loxP-neo基因_lox2272_PGK啟動子-PB5’LTR)和 3’ 修飾(PB3’LTR-puroATK 基因-1οχ5171)在圖 23 中與 1x 位點和 PBLTR的相對方向一起示出。通過從共電穿孔的載體中瞬時CRE表達(dá)，所述DNA序列通過RMCE被插入指定基因座中。其中已經(jīng)發(fā)生正確插入的細(xì)胞如下選擇:(i)嘌呤霉素抗性(所述pirn) Λ TK基因具有從著陸區(qū)中獲得的啟動子-PGK)，(ii)6TG-抗性(所述HPRT小基因被破壞)及(iii)G418-抗性(通過5’區(qū)PGK-neo排列針對任何插入選擇)?？梢允褂眠@些選擇方案的任何組合。在5’末端針對正確事件進(jìn)行G418-和6TG-抗性選擇，而在3’末端上針對正確事件進(jìn)行嘌呤霉素抗性選擇。3.去除(除去)第一次插入的3’修飾。正確插入的第一個BAC導(dǎo)致3’末端具有PUiO Λ TK基因，側(cè)翼是反向PB LTR(圖24)-本質(zhì)上正確的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。這個轉(zhuǎn)座子然后可以通過PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的瞬時表達(dá)而除去(從電穿孔的載體中)。具有正確切除事件的細(xì)胞可以通過FIAU抗性選擇-即從pirn) Λ TK基因無胸苷激酶活性。這完全除去了 3’修飾，無剩余痕量核苷酸。4.在第一次插入的5’末端插入第二個修飾的BAC。第二個BAC具有被插入基因組中的一段DNA序列(通常與用第一個BAC插入的DNA是連續(xù)的)，側(cè)翼是工程化修飾。所述5，修飾(1xP - HPRT小基因5’部分_lox5171 - PGK啟動子-ΡΒ5，LTR)和3，修飾(ΡΒ3’ LTR-puro Δ TK-lox2272)在圖25中與1x位點和PB LTR的相對方向一起描述。通過從共電穿孔的載體中瞬時CRE表達(dá)，通過RMCE所述DNA序列將被插入指定基因座?？梢匀缦逻x擇其中已經(jīng)發(fā)生正確插入的細(xì)胞:(i)HAT-抗性(HPRT小基因通過正確的插入事件重構(gòu)，即5’和3’外顯子結(jié)構(gòu)在一起)，及(ii)嘌呤霉素抗性(puro Λ TK具有從著陸區(qū)中獲得的啟動子-PGK)。5.去除(除去)第二次插入的3’修飾。正確插入的第二個BAC導(dǎo)致3’末端具有PUIO Λ TK基因，側(cè)翼是反向PB LTR (圖26)-本質(zhì)上正確的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，與成功的第一次BAC插入的結(jié)果精確相似。因此這個轉(zhuǎn)座子同樣可通過PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的瞬時表達(dá)而除去(從電穿孔載體中)?？梢酝ㄟ^FIAU抗性選擇具有正確切除事件的細(xì)胞，即從puro Λ TK基因中無胸苷激酶活性。這完全去除了 3’修飾，無剩余痕量核苷酸。6.在除去第二次BAC插入的3’修飾之后，所述著陸區(qū)變得與原始相同?？梢灾貜?fù)多次這個全部過程，即步驟2-5，以在基因組中進(jìn)行大的插入。當(dāng)完成時，除了希望的插入之外沒有剩余的殘余核苷酸。通過將奇數(shù)BAC插入Ig基因座中，內(nèi)源VDJ或VJ序列可以通過如下所述染色體工程的倒位而失活(見圖27-29):1.將“ 翻轉(zhuǎn)(flip-over)”盒靶向與內(nèi)源VDJ或VJ相距10-40兆堿基的5’區(qū)域蟲。所述翻轉(zhuǎn)載體(PB3’ LTR - PGK啟動子-HPRT小基因5’部分-loxP-puro Λ TK - CAGGS啟動子-ΡΒ3’ LTR)在圖27中與1x位點和PB LTR的相對方向一起描述。2.瞬時CRE表達(dá)將導(dǎo)致“翻轉(zhuǎn)”盒中1xP位點與5’修飾中1xP位點之間的重組。這個5’修飾如上述步驟2和3所述-在已經(jīng)除去3’修飾后，實質(zhì)上所述修飾得自奇數(shù)BAC的插入。所述1xP位點相互反向，因此所述重組事件導(dǎo)致倒位,如圖28所述。具有正確倒位的細(xì)胞是HAT-抗性的，因為HPRT小基因通過正確倒位重構(gòu)。3.正確倒位也使得在“翻轉(zhuǎn)”盒和5’修飾的側(cè)翼剩余兩個轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。二者均可以通過瞬時PiggyBAC轉(zhuǎn)座酶表達(dá)而切除，無任一修飾剩余(圖29)。具有正確切除的細(xì)胞可以如下選擇:(i)6TG-抗性(HPRT小基因缺失)及(ii)FIAU-抗性(puro Λ TK基因缺失)。如在Ig基因座中所述倒位將分別從Ey或Ek增強(qiáng)子區(qū)域除去內(nèi)源IGH-VDJ或IGK-VJ區(qū)，導(dǎo)致內(nèi)源IGH-VDJ或IGK-VJ區(qū)失活。本發(fā)明的插入方法適當(dāng)?shù)靥峁┤缦乱换蚨鄠€結(jié)果:在插入的DNA片段的5’和3’末端的選擇；有效去除3’修飾，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的DNA切除進(jìn)行；通過倒位使內(nèi)源IGH或IGK活性失活；以及切除修飾，在染色體中無核苷酸痕量剩余。實施例3所述方法概念的證實在圖30中揭示。在圖30中，如圖22所示的著陸區(qū)通過同源重組插入小鼠基因組中，隨后通過ere-介導(dǎo)的位點特異性重組將R21質(zhì)粒插入該著陸區(qū)中。所述插入事件產(chǎn)生許多一般插入事件，360個G418抗性集落，其中通過HRPT小基因座的破壞而證實 220個插入希望的基因座中。R21載體在5’和3’末端模擬第一次BAC插入載體，包括所有選擇元件和重組酶靶向位點。代替BAC序列，有一個小“填充”序列。這個載體既測試本發(fā)明設(shè)計的所有重要因素，也允許容易測試結(jié)果，即跨填充序列的PCR是可行的并且因此使得插入的兩端易于被檢測。R21與ere-表達(dá)載體共電穿孔進(jìn)在IGH基因座攜帶著陸區(qū)的ES細(xì)胞中。平行轉(zhuǎn)染四組轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后置于不同的選擇方案下，如圖30所示。G418選擇(neo基因表達(dá))由于不需要特異性著陸區(qū)整合而產(chǎn)生最大數(shù)目的集落。任何R21整合進(jìn)基因組中將提供導(dǎo)致G418-抗性的neo表達(dá)。Puro選擇產(chǎn)生與Puro+6TG或G418+6TG相似的集落數(shù),提示Puro選擇的嚴(yán)格性是由于Puro Δ TK缺失載體中的啟動子所致。Puio表達(dá)僅在整合發(fā)生在啟動子元件附近時才獲得，在此設(shè)計中最大可能特異性在著陸區(qū)中。這些結(jié)論由在圖31中示出的連接PCR(junction PCR)的結(jié)果支持。
本發(fā)明下一步驟是“去除”整合的BAC載體的3’末端，在插入與側(cè)翼基因組之間實現(xiàn)無縫轉(zhuǎn)換。我們通過擴(kuò)增上述個體克隆(R21插入著陸區(qū)中)及在這個克隆中通過轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒而表達(dá)PiggyBac重組酶證實了這種去除。用FIAU選擇其中切除3’修飾的集落，即通過在PiggyBac末端重復(fù)之間喪失PGK-puro Δ TK元件而切除。從IO6個細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中獲得50個這樣的克隆，檢測其中6個克隆的期望的基因組結(jié)構(gòu)。成功去除導(dǎo)致在引物組之間的陽性PCR，圖32中標(biāo)記為“3”。在這6個克隆中，4個具有正確切除，I個克隆保持原始構(gòu)型，及另I個具有缺失。這些數(shù)據(jù)證實使用上述方法，在指定基因組基因座，DNA重復(fù)插入著陸區(qū)中。實施例4實施例3證實本發(fā)明的設(shè)計能將檢測載體插入基因組中指定位置，在這種情況中是將R21載體插入小鼠IGH基因座中。合適的選擇培養(yǎng)基的使用及ere-重組酶的表達(dá)導(dǎo)致具有預(yù)期結(jié)構(gòu)的基因組改變。將本發(fā)明描述的相同設(shè)計元件加入到BAC插入物的5’和3’末端。所述插入物包含來自IGH基因座的人類序列，大約166-kb。將這個工程化的BAC與ere-表達(dá)質(zhì)粒DNA —起電穿孔進(jìn)在小鼠IGH基因座攜帶著陸區(qū)的小鼠ES細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群在含有puro的培養(yǎng)基中生長以選擇適當(dāng)?shù)牟迦胧录?。分離7個獲得的克隆并進(jìn)一步分析。預(yù)期的重組事件和所得結(jié)構(gòu)在圖33中示出?；趤碜詫嵤├?所述的R21實驗的數(shù)據(jù)，當(dāng)轉(zhuǎn)染的群體在含有puro的培養(yǎng)基中選擇時，預(yù)期嚴(yán)格選擇出正確的克隆。這是因為puro-編碼區(qū)需要啟動子元件，且這優(yōu)先由重組后的著陸區(qū)提供。因此，如診斷性PCR確定，這7個分離的克隆的大多數(shù)已經(jīng)正確插入基因組中著陸區(qū)。診斷正確插入 的引物在圖33中示出。如果在引物“A”與“X”之間擴(kuò)增610-bp片段并且在引物“Y”和“B”之間擴(kuò)增478-bp片段，則在基因組中存在正確連接(圖33和34)。注意在“A”與“I”引物及“2”與“B”引物之間有擴(kuò)增的片段表示存在親代基因組(即只有著陸區(qū))。來自親代細(xì)胞的這些結(jié)果內(nèi)部存在于puro選擇下的細(xì)胞集落中，其由于集落的幾何形狀而逃避選擇。在將所述集落通過含有PU1X)的培養(yǎng)基傳代后，這些親代連接片段消失表示所述親代細(xì)胞從該群中除去。此外，正如預(yù)期，如果HPRT基因通過正確插入事件失活，所有克隆均示出是6-TG抗性的。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明揭示的將大部分人類IG基因座插入小鼠基因組中指定位置的策略使得可以構(gòu)建具有位于小鼠恒定區(qū)上游的多個人類IG區(qū)的可變區(qū)的小鼠。實施例5產(chǎn)生細(xì)菌人工染色體(BAC)，其中BAC具有人類Ig基因節(jié)段(人類V、D和/或J基因節(jié)段)的插入物。使用本文所述方法，在小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中構(gòu)建嵌合Ig基因座的方法中使用著陸區(qū)，由此提供嵌合IgH和IgK基因座，其中人類基因節(jié)段功能性插入在內(nèi)源恒定區(qū)上游。為了檢測衍生自人類BAC插入的ES細(xì)胞克隆的嵌合小鼠中人類IgH-VDJ或IgK-VJ基因節(jié)段是否適當(dāng)重排和表達(dá)，我們對來自這些小鼠的白細(xì)胞的RNA樣品進(jìn)行了 RT-PCR，使用的是人類可變(V)區(qū)和小鼠恒定(C)區(qū)的引物對。寡核苷酸序列如下所示。每個V寡核苷酸與C寡核苷酸配對(HV與C μ，KV與C K
權(quán)利要求
1.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一個或多個人類D區(qū)及一個或多個人類J區(qū)；以及 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)及人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合重鏈的所有組成成分， 其中人類DNA插入在非人類哺乳動物恒定區(qū)與最后的3’非人類哺乳動物J區(qū)之間，以及 其中所述哺乳動物包含完整VJC人類輕鏈區(qū)的插入。
2.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)，以及 其中人類DNA插入在非人類哺乳動物恒定區(qū)與最后的3’非人類哺乳動物J區(qū)之間，以及 其中所述哺乳動物包含完整VJC人類輕鏈區(qū)的插入。
3.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)及一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)； 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分， 其中插入的人類IgH VDJ區(qū)包含在種系構(gòu)型中來自人類的所有V、D和J區(qū)及插入序列。
4.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)， 其中插入的人類IgH VDJ區(qū)包含在種系構(gòu)型中來自人類的所有V、D和J區(qū)及插入序列。
5.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)， 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分； 或者非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)； 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分， 其中插入DNA的所述非人類哺乳動物基因組包含未被缺失的內(nèi)源V(D) J區(qū)，以及 其中人類重鏈DNA插入在所述非人類哺乳動物恒定區(qū)與最后的3’非人類哺乳動物J區(qū)之間。
6.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)， 或者非人類哺乳動物細(xì)胞，其 基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)，及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)， 其中插入DNA的所述非人類哺乳動物基因組包含未被缺失的內(nèi)源V(D) J區(qū)，以及 其中人類重鏈DNA插入在非人類哺乳動物恒定區(qū)與最后的3’非人類哺乳動物J區(qū)之間。
7.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)及一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)； 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分； 或者非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)；以及(b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)； 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合輕鏈或重鏈的所有組成成分， 其中所述非人類哺乳動物基因組通過所有或部分非人類哺乳動物VDJ區(qū)或VJ區(qū)的倒位而被修飾為阻止天然(完全宿主物種特異性)抗體的表達(dá)。
8.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，以及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)； 或者非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)，及 (b)任選地，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J 區(qū)， 其中所述非人類哺乳動物基因組通過所有或部分非人類哺乳動物VDJ區(qū)或VJ區(qū)的倒位被修飾為阻止天然(完全宿主物種特異性)抗體的表達(dá)。
9.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)，一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)， 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合重鏈的所有組成成分， 其中所述哺乳動物是小鼠，并且人類重鏈DNA插入在小鼠基因組中小鼠染色體12的坐標(biāo)114，667，090與114，665，190之間(坐標(biāo)參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBIM37)或者在另一非人類哺乳動物基因組的等價位置。
10.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)， 其中所述哺乳動物是小鼠，并且人類重鏈DNA插入在小鼠基因組中小鼠染色體12的坐標(biāo)114，667, 090與114，665，190 (坐標(biāo)參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBIM37)之間或者在另一非人類哺乳動物基因組的等價位置。
11.非人類哺乳動物，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)， 其中所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合重鏈的所有組成成分，其中所述人類IgH VDJ區(qū)包含來自人類染色體14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐標(biāo)參照人類基因組NCB136，ENSEMBL Release54)或者來自另一人類的等價人類區(qū)域。
12.非人類哺乳動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)， 其中所述人類IgH VDJ區(qū)包含來自人類染色體14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐標(biāo)參照人類基因組NCB136，ENSEMBL Release54)或者來自另一人類的等價人類區(qū)域。
13.權(quán)利要求3-4、7-8或11-12的細(xì)胞或哺乳動物，其中人類DNA插入在非人類哺乳動物恒定區(qū)與最后的3’非人類哺乳動物J區(qū)之間。
14.權(quán)利要求1-8或11-13任一項的細(xì)胞或非人類哺乳動物，其中所述哺乳動物是小鼠或者所述細(xì)胞是小鼠細(xì)胞，其中人類重鏈DNA插入在小鼠基因組中小鼠染色體12的坐標(biāo).114，667，090 與 114，665，1 90 之間，例如在坐標(biāo) 114，667，089 與 114，667，090 之間(坐標(biāo)參照與小鼠品系C57BL /6J相關(guān)的NCBI m37)或者在另一非人類哺乳動物基因組中的等價位置。
15.權(quán)利要求1-8、11-13的細(xì)胞或非人類哺乳動物，其中人類重鏈DNA插入在位置.114，667，090 與 114，667，091 之間。
16.權(quán)利要求1-14的細(xì)胞或非人類哺乳動物，其中參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBM37，人類重鏈DNA插入在小鼠染色體12的坐標(biāo)114，666，183與114，666，725之間，如在坐標(biāo)114，666，335與114，666，536之間，任選地在坐標(biāo)114，666，385與.114，666，486之間，任選地在坐標(biāo)114，666，425與114，666，446之間，如在坐標(biāo)14，666，435與114，666，436之間，或者在來自不同小鼠品系的小鼠染色體12的等價位置或者另一非人類脊椎動物基因組的等價位置。
17.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其中人類IgHVDJ區(qū)包含來自人類染色體.14的105，400, 051-106, 368，585位核苷酸，坐標(biāo)參照人類基因組NCBI36，或者包含來自不同人類序列或數(shù)據(jù)庫的染色體14的等價核苷酸。
18.權(quán)利要求1-16的細(xì)胞或哺乳動物，其中參照GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫，人類IgH VDJ區(qū)包含或由人類染色體14的106，328，851-107, 268，544位核苷酸如 106，328，901-107, 268，494 位核苷酸、如 106，328，941-107，268，454 位核苷酸、如106，328，951-107，268，444位核苷酸或者來自不同人類序列或數(shù)據(jù)庫的染色體14的等價核苷酸組成。
19.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其包含插入的人類KVJ區(qū)，所述人類KVJ區(qū)包含在種系構(gòu)型中的來自人類的所有V和J區(qū)及插入序列。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞或哺乳動物，其中人類KDNA插入在小鼠染色體6的坐標(biāo) 70，673，918-70，675，517 之間，如在坐標(biāo) 70，674，655-70，674，856 之間，如在坐標(biāo) 70，674，705-70，674，906 之間，如在坐標(biāo) 70，674，745-70，674，766 之間，如在坐標(biāo).70，674，755-70, 674，756之間(參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCBM37)，或者在另一基因組的等價位置。
21.權(quán)利要求19或20的細(xì)胞或哺乳動物，其中插入的KDNA包含或者由人類染色體2的片段組成，編號參照GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫，或者來自不同的人類序列或數(shù)據(jù)庫的染色體2的等價核苷酸，所述片段選自如下一或多項: (i)89,158，979-89，630，537 位核苷酸，如 89，159，029-89，630，487 位核苷酸，如89，159，069-89，630，447位核苷酸，如89，159，079-89，630，437位核苷酸，任選地加上片段(ii)， (ii)89，941，614-90，267,076位核苷酸，如 89, 941, 664-90, 267,026 位核苷酸，如89，941，704-90，266，986位核苷酸，如89，941，714-90，266，976位核苷酸，任選地加上片段(i)， (iii)89,158，979-90，267，076 位核苷酸，如 89，159，079-90，266，976 位核苷酸。
22.權(quán)利要求3-21任一項的細(xì)胞或哺乳動物，其包含插入的人類λ區(qū)，所述人類λ區(qū)包含至少一個人類J λ區(qū)和至少一個人類C λ區(qū)，任選地(^6和/或(^7。
23.權(quán)利要求3-22任一項 的細(xì)胞或哺乳動物，其包含多個人類JX區(qū)，任選地Ja1、^2、^6和Ja7中的兩或更多個，任選地所有夂1、夂2、夂6和Ja7。
24.權(quán)利要求3-23任一項的細(xì)胞或哺乳動物，其包含至少一個人類Ja-Ca簇，任選地至少 Ja7_Ca7。
25.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其包含人類Eλ增強(qiáng)子。
26.權(quán)利要求3-25任一項的細(xì)胞或哺乳動物，其包含插入的人類λVJ區(qū)，所述人類λ VJ區(qū)包含在種系構(gòu)型中的來自人類的所有V和J區(qū)及插入序列。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述區(qū)域包含或由來自參照GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫的人類染色體22的22，375，509-23，327，984位核苷酸如22，375，559-23，327，934位核苷酸、如22，375，599-23，327，894位核苷酸、如22，375，609-23, 327，884位核苷酸或者來自不同人類序列或數(shù)據(jù)庫的人類染色體22的等價核苷酸組成。
28.權(quán)利要求26或27的細(xì)胞或哺乳動物，其中在小鼠基因組中的插入可以在參照小鼠基因組NCBM37的小鼠染色體16的坐標(biāo)19,027, 763與19，061，845之間，如在坐標(biāo)19，047，451與19，047，652之間，如在坐標(biāo)19，047，491與19，047，602之間，如在坐標(biāo)19,047, 541與19,047, 562之間，如在坐標(biāo)19,047, 551與19,047, 552之間，或者在其它基因組的等價位置。
29.權(quán)利要求26或27的細(xì)胞或哺乳動物，其中在小鼠基因組中的插入可以在參照與小鼠品系C57BL/6J相關(guān)的小鼠基因組NCB頂37的小鼠基因組中小鼠染色體6的坐標(biāo)70,673,918與70,675, 517之間，如在坐標(biāo)70, 674, 655與70，674，856之間，如在坐標(biāo)70，674，705與70，674，806之間，如在坐標(biāo)70，674，745與70，674，766之間，如在坐標(biāo)70，674，755與70，674，756之間，或者在另一基因組的等價位置。
30.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述人類輕鏈KVJCDNA或者其一部分插入在小鼠K VJC區(qū)的立即上游。
31.權(quán)利要求1-6和9-30的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述細(xì)胞或哺乳動物基因組被修飾為阻止或降低完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。
32.權(quán)利要求31的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述非人類哺乳動物基因組通過所有或部分非人類哺乳動物VDJ區(qū)或VJ區(qū)的倒位而被修飾。
33.權(quán)利要求1-4和7-32的細(xì)胞或哺乳動物，其中插入DNA的所述非人類哺乳動物基因組包含未被缺失的內(nèi)源V(D)J區(qū)。
34.前述任何權(quán)利要求的非人類細(xì)胞或哺乳動物，其在阻止成熟的宿主B和T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生的遺傳背景中產(chǎn)生。
35.在Rag-1或Rag-2缺陷背景中產(chǎn)生的權(quán)利要求34的非人類哺乳動物。
36.權(quán)利要求2、4、6、8、10、12-35任一項的細(xì)胞，其是能發(fā)育成非人類哺乳動物的ES細(xì)胞、造血干細(xì)胞或者其它細(xì)胞,所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生嵌合抗體或嵌合抗體鏈的所有組成成分，所述嵌合抗體或抗體鏈具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)。
37.權(quán)利要求2、4、6、8、10、12-36任一項的細(xì)胞，其是能有助于非人類哺乳動物的組織或器官的ES細(xì)胞、造血干細(xì)胞或者其它細(xì)胞,所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生嵌合抗體或者嵌合抗體鏈的所有組成成分，所述嵌合抗體或抗體鏈具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)。
38.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其包含插入的來自至少人類重鏈和人類輕鏈的人類可變區(qū)DNA。
39.權(quán)利要求1-38的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述細(xì)胞或哺乳動物在編碼嵌合抗體鏈的DNA的一個、兩個或所有三個免疫球蛋白基因座是純合的。
40.權(quán)利要求1-39的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述細(xì)胞或哺乳動物在編碼嵌合重鏈或輕鏈的DNA的一個、兩個或所有三個免疫球蛋白基因座是雜合的。
41.權(quán)利要求3-40的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述細(xì)胞的基因組不包含來自另一細(xì)胞或生物體的恒定區(qū)DNA。
42.權(quán)利要求2、4、6、10、12-41的細(xì)胞，其是永生化的。
43.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其基因組包含非人類非宿主轉(zhuǎn)換序列，如S-mu0
44.權(quán)利要求43的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)換序列是大鼠轉(zhuǎn)換序列。
45.權(quán)利要求44的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述大鼠轉(zhuǎn)換序列 包含或由GAGCT (296次重復(fù))、GGGGT (50次重復(fù))及GGGCT (83次重復(fù))組成，和/或 包含序列GGGCT的3、4、5、6或更多次連續(xù)重復(fù)。
46.權(quán)利要求45的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述大鼠轉(zhuǎn)換序列具有SEGID NO:1所示序列。
47.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)換序列來自小鼠129品系，任選地具有SEG ID NO:4所示序列。
48.權(quán)利要求1-46的細(xì)胞或哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)換序列來自小鼠C57品系，任選地具有SEG ID NO:5所示序列。
49.前述任何權(quán)利要求的細(xì)胞，其是ES細(xì)胞系A(chǔ)B2.1或者選自C57BL/6、M129的小鼠品系如129/SV、BALB/c以及C57BL/6、M129的任何雜種如129/SV或者BALB/c的細(xì)胞。
50.產(chǎn)生非人類哺乳動物或細(xì)胞的方法，所述方法包括在非人類哺乳動物基因組中插入: (a)多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)的上游，及(b)任選地一或多個人類Ig輕鏈K V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游和/或一或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈入J區(qū)于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游； 所述插入使得所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者抗體重鏈或輕鏈的所有組成成分，其中步驟(a)和(b)可以任意順序進(jìn)行，步驟(a)和(b)各自可以逐步進(jìn)行或者作為單一步驟進(jìn)行。
51.產(chǎn)生非人類哺乳動物或細(xì)胞的方法,所述方法包括在非人類哺乳動物細(xì)胞基因組中插入: (a)多個人類Ig輕鏈KV區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈K J區(qū)于宿主非人類哺乳動物K恒定區(qū)上游和/或多個人類Ig輕鏈λ V區(qū)和一或多個人類Ig輕鏈λ J區(qū)于宿主非人類哺乳動物λ恒定區(qū)上游，以及 (b)任選地一或多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游， 所述插入使得所述非人類哺乳動物能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合抗體或者嵌合抗體重鏈或輕鏈的所有組成成分，其中步驟(a)和(b)可以任意順序進(jìn)行，步驟(a)和(b)各自可以逐步進(jìn)行或者作為單一步驟進(jìn)行。
52.權(quán)利要求50或51的方法，其中所述非人類哺乳動物基因組然后被修飾為阻止天然(完全宿主物種特異性)抗體在所述哺乳動物中表達(dá)，任選地通過全部或部分非人類哺乳動物VDJ或VJ區(qū)的倒位、任選地通過在基因組中插入一或多個位點特異性重組酶位點及隨后在重組酶介導(dǎo)的切割中 使用這些位點或者全部或部分非人類哺乳動物Ig基因座的倒位而實現(xiàn)。
53.權(quán)利要求50-52的方法，其中所述細(xì)胞是ES細(xì)胞。
54.權(quán)利要求50-53的方法，其中人類VDJ或VJ區(qū)插入在宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游是通過同源重組逐步插入多個片段實現(xiàn)的。
55.權(quán)利要求50-54的方法，其中所述插入過程在起始盒已經(jīng)插入ES細(xì)胞基因組中提供獨特靶向區(qū)的位點開始。
56.權(quán)利要求50-55的方法，其中一或多個插入事件利用位點特異性重組。
57.權(quán)利要求56的方法，其利用由一或多個Frt位點、Flp重組酶:Dre重組酶、Rox位點或PhiC31重組酶介導(dǎo)的重組或涉及一或多個Frt位點、Flp重組酶:Dre重組酶、Rox位點或PhiC31重組酶的重組。
58.權(quán)利要求50-57的方法，其中所述方法包括如下步驟: I在細(xì)胞基因組中插入DNA形成起始盒(在本文也稱作著陸區(qū))； 2將第一 DNA片段插入插入位點中，所述第一 DNA片段包含人類DNA的第一部分及第一載體部分，所述第一載體部分含有第一選擇標(biāo)記或在插入時產(chǎn)生選擇標(biāo)記； 3任選地除去部分載體DNA ； 4在第一 DNA片段的載體部分中插入第二 DNA片段，所述第二 DNA片段含有人類DNA的第二部分及第二載體部分，所述第二載體部分含有第二選擇標(biāo)記或者在插入時產(chǎn)生第二選擇標(biāo)記； 5除去任何載體DNA，以使得第一和第二人類DNA片段形成連續(xù)序列 '及6如果需要，重復(fù)插入部分人類V(D)J DNA及除去載體DNA的步驟，以產(chǎn)生具有足以能與宿主恒定區(qū)聯(lián)合產(chǎn)生嵌合抗體的全部或部分人類VDJ或VJ區(qū)的細(xì)胞， 其中至少一個DNA片段的插入利用位點特異性重組。
59.權(quán)利要求50-58任一項的方法，其中插入的著陸區(qū)序列包含SEQID NO:6所示序列或是SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示任何序列。
60.權(quán)利要求50-59任一項的方法，其中所述著陸區(qū)通過小鼠J1-4與小鼠Cmu序列之間的同源重組而插入小鼠染色體中。
61.權(quán)利要求50-60的方法，其中所述著陸區(qū)通過在小鼠J1-4與Emu序列之間的同源重組而重組進(jìn)小鼠染色體中。
62.權(quán)利要求50-61的方法，其中所述著陸區(qū)包含非內(nèi)源S-mu，如大鼠S-mu轉(zhuǎn)換序列。
63.權(quán)利要求1-60的方法、細(xì)胞或哺乳動物，其中將人類編碼區(qū)DNA序列與非人類哺乳動物控制序列功能性排列，由此人類DNA的轉(zhuǎn)錄由非人類哺乳動物控制序列控制。
64.產(chǎn)生特異于希望抗原的抗體或抗體重鏈或輕鏈的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫權(quán)利要求1、3、5、7、9、11、13-48的非人類哺乳動物以及回收所述抗體或抗體鏈或者回收產(chǎn)生所述抗體或重鏈或輕鏈的細(xì)胞。
65.產(chǎn)生完全人源化抗體或抗體鏈的方法，包括免疫權(quán)利要求64的非人類哺乳動物，然后適當(dāng)?shù)赝ㄟ^對編碼所述抗體的核酸的工程化而用人類恒定區(qū)置換與抗原特異性反應(yīng)的抗體的非人類哺乳動物恒定區(qū)。
66.根據(jù)權(quán)利要求64或65產(chǎn)生的人源化抗體或抗體鏈。
67.根據(jù)權(quán)利要求64或65產(chǎn)生的人源化抗體或抗體鏈在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
68.根據(jù)權(quán)利要求64或65產(chǎn)生的人源化抗體或抗體鏈用于醫(yī)學(xué)中。
69.包含權(quán)利要求64或65的抗體及藥物可接受的載體或其它賦形劑的藥物組合物。
70.根據(jù)權(quán)利要求64產(chǎn)生的嵌合抗體的嵌合抗體衍生物。
71.小鼠，其基因組包含在小鼠染色體12的坐標(biāo)114，667，090與114，665，190之間例如在坐標(biāo)114，667，089與114，667，090之間插入的人類IgH VDJ DNA，所述插入包含來自人類染色體14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐標(biāo)參照人類基因組NCBI36及小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分別在另一人類染色體14序列或另一小鼠基因組中的等價坐標(biāo))，所述插入位于宿主非人類哺乳動物恒定區(qū)上游，由此所述小鼠能產(chǎn)生具有非人類哺乳動物恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合重鏈的所有組成成分，其中所述哺乳動物也包含完整VJC人類輕鏈區(qū)的插入，由此可以產(chǎn)生能與嵌合重鏈形成抗體的完全人類λ或κ人類抗體鏈。
72.小鼠，其基因組包含在小鼠染色體12的坐標(biāo)114,667,090與114,667,091之間插入的人類IgH VDJ DNA，所述插入包含或由來自人類染色體14的105，400, 051-106, 368，585位核苷酸組成(坐標(biāo)參照人類基因組NCBI36及小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分別在另一人類染色體14序列或另一小鼠基因組中的等價坐標(biāo))，所述插入位于小鼠恒定區(qū)上游，由此所述小鼠能產(chǎn)生具有小鼠恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合重鏈的所有組成成分，其中所述小鼠也包含完整VJC人類輕鏈區(qū)的插入，由此可以產(chǎn)生能與嵌合重鏈形成抗體的完全人 類λ或K人類抗體鏈。
73.小鼠，其基因組包含在小鼠染色體12的坐標(biāo)114，667，090與114，665，190之間插入的人類IgH VDJ DNA，其中坐標(biāo)參照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者在另一小鼠品系中等價位置的插入，所述插入包含或由來自人類染色體14的106，328,951-107, 268, 444位核苷酸或者另一人類染色體14序列中等價位置的相同核苷酸組成，其中坐標(biāo)參照人類GRCH37/hgl9序列數(shù)據(jù)庫，所述插入位于宿主小鼠恒定區(qū)上游，由此所述小鼠能產(chǎn)生具有小鼠恒定區(qū)和人類可變區(qū)的嵌合重鏈的所有組成成分，其中所述小鼠也包含完整VJC人類輕鏈區(qū)的插入，其可以產(chǎn)生能與嵌合重鏈形成抗體的完全人類λ或K人類抗體鏈。
74.權(quán)利要求48的小鼠，其中所述插入位于小鼠染色體12的坐標(biāo)114,666,435與114，666，436 之間。
75.非人類哺乳動物或細(xì)胞，其基因組包含位于宿主非人類哺乳動物輕鏈恒定區(qū)上游的多個人類IgH V區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)，由此所述細(xì)胞或哺乳動物能表達(dá)嵌合抗體鏈。
76.非人類哺乳動物或細(xì)胞，其基因組包含位于宿主非人類哺乳動物重鏈恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈V區(qū)和一或多個人類J區(qū)，由此所述細(xì)胞或哺乳動物能表達(dá)嵌合抗體鏈。
77.權(quán)利要求75或76的細(xì)胞或哺乳動物，其能表達(dá)具有重鏈和輕鏈的抗體，包括一個嵌合抗體鏈。
78.轉(zhuǎn)基因，其編碼位于宿主非人類哺乳動物輕鏈恒定區(qū)上游的多個人類IgHV區(qū)、一或多個人類D區(qū)和一或多個人類J區(qū)。
79.轉(zhuǎn)基因，其編碼位于宿主非人類哺乳動物重鏈恒定區(qū)上游的多個人類Ig輕鏈V區(qū)和一或多個人類輕鏈J區(qū)。
80.多核苷酸著陸區(qū)序列，所述多核苷酸包含與靶染色體區(qū)同源的核酸區(qū)，以允許通過同源重組插入靶染色體中，并且包含核酸位點，其允許重組酶驅(qū)動的核酸插入著陸區(qū)中，其中所述多核苷酸序列包含一或 多個: (i)非人類非小鼠序列，如大鼠轉(zhuǎn)換序列，任選地SEQID NO:1序列； (ii)5’至3’方向的小鼠Εμ序列、非人類非小鼠轉(zhuǎn)換序列及小鼠Cy； (iii)具有SEQID NO:6序列的3’同源臂。
81.細(xì)胞或非人類哺乳動物，其包含已經(jīng)插入細(xì)胞基因組中的權(quán)利要求79的著陸區(qū)序列。
82.權(quán)利要求80或81的細(xì)胞、哺乳動物或著陸區(qū)，其中大鼠轉(zhuǎn)換序列包含序列GGGCT的3、4、5、6或更多個連續(xù)重復(fù)，任選地是SEQ ID NO:1。
83.權(quán)利要求80-82的細(xì)胞、哺乳動物或著陸區(qū)，其中著陸區(qū)序列包含SEQID NO:2的序列。
84.權(quán)利要求80-82的細(xì)胞、哺乳動物或著陸區(qū)，其中著陸區(qū)序列包含SEQID NO:3的序列。
85.非人類細(xì)胞或非人類哺乳動物，其包含: 完全人類λ基因座，其包含來自人類的基本上全部的λ VJC區(qū)， 嵌合Κ基因座，其包含與非人類宿主K恒定區(qū)可操縱連接的基本上全部的人類KVJ區(qū)，以及 嵌合重鏈基因座，其具有與非人類宿主重鏈恒定區(qū)可操縱連接的人類VDJ區(qū)。
86.嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地C gamma或C mu), 其中所述抗體由相應(yīng)于細(xì)胞(任選地B細(xì)胞、ES細(xì)胞或雜交瘤)的嵌合重鏈基因座的核苷酸序列的核苷酸序列編碼，所述基因座包含非人類脊椎動物或哺乳動物恒定區(qū)核苷酸序列及通過人類V節(jié)段、人類D節(jié)段和人類J節(jié)段的體內(nèi)重排產(chǎn)生的重排的VDJ核苷酸序列， 所述V區(qū)選自來自人類的V1-3區(qū)、V2-5區(qū)、V4-4區(qū)、V1-2區(qū)或V6-1區(qū)之一，任選地V1-3或V6-1節(jié)段。
87.權(quán)利要求86的嵌合抗體，其中所述J區(qū)是JH4或JH6。
88.權(quán)利要求86或87的嵌合抗體，其中所述D區(qū)是D3-9、D3-10、D6-13或D-19。
89.權(quán)利要求86-88 的嵌合抗體，其包含:V1-3JH4，V1-3JH6，V6-1D3-10, V6-1D6-19，V1-3D3-9, V1-3D3-10, V1-3D6-19。
90.非人類脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其編碼權(quán)利要求86-89的嵌合抗體。
91.非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其具有編碼權(quán)利要求86-90任一嵌合抗體的基因組。
92.非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其具有編碼權(quán)利要求86-91任一嵌合抗體的基因組，所述哺乳動物表達(dá)比V2-5、V4-4、V1-2或V6-1抗體更多的V1-3抗體。
93.非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其具有編碼權(quán)利要求86-92任一嵌合抗體的基因組，所述哺乳動物表達(dá)比單獨V1-3JH1、V1-3JH2、V1-3JH3或V1-3JH5任一抗體更多的V1-3JH4或V1-3JH6抗體。
94.非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其具有編碼權(quán)利要求86-93任一嵌合抗體的基因組，所述哺乳動物表達(dá)比單獨V6-1JH1、V6-1JH2、V6-1JH3或V6-1JH5任一抗體更多的V6-1JH4或V6-1JH6抗體。
95.非人類脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其具有編碼權(quán)利要求86-94任一嵌合抗體的基因組，所述哺乳動物表達(dá)V1-3DH10抗體的量比具有任何其它D區(qū)的V1-3抗體的量更大。
96.嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地輕鏈恒定區(qū))，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，所述哺乳動物基因組包含抗體鏈基因座，所述抗體鏈基因座包含種系人類K V1-8和種系人類K Jl序列，其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中所述V1-8和Jl序列的體內(nèi)重組而獲得，并且其中所述抗體具有與由種系人類K V1-8和種系人類K Jl序列編碼的序列不同的可變區(qū)序列。
97.權(quán)利要求96的嵌合抗體，其中所述抗體序列包含:X1X2TF G Q，其中X1X2=PR、RT或 PW,任選地是 X1X2T FGQGTKVEIKRAD A 基序。
98.嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類脊椎動物或哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地輕鏈恒定區(qū))，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，所述哺乳動物基因組包含抗體鏈基因座，所述抗體鏈基因座包含種系人kV1-6和種系人Kjl序列，其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中所述V1-6和Jl序列的體內(nèi)重組而獲得，并且其中所述抗體具有與由種系人kV1-6和種系人K Jl序列編碼的序列不同的可變區(qū)序列。
99.權(quán)利要求98的嵌合抗體，其中所述抗體序列包含X3X4TF G Q，其中X3X4=PR或PW,任選地是 X3X4T FGQGTKVEIKRAD A 基序。
100.嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地Cga_a*C mu或Ck )，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，所述哺乳動物基因組包含抗體鏈基因座，所述抗體鏈基因座包含種系人KV1-5和種系人K Jl序列，并且其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中所述V1-5和Jl序列的體內(nèi)重組而獲得。
101.嵌合抗體，其包含人類可變區(qū)和非人類(任選地大鼠或小鼠)恒定區(qū)(任選地Cga_a*C mu或Ck )，其中所述抗體可得自哺乳動物(任選地大鼠或小鼠)，所述哺乳動物基因組包含抗體鏈基因座，所述抗體鏈基因座包含種系人K V1-5和種系人K J4序列，并且其中所述抗體可通過在所述哺乳動物中所述V1-5和J4序列的體內(nèi)重組獲得。
102.非人脊椎動物或哺乳動物細(xì)胞(例如B細(xì)胞或ES細(xì)胞或雜交瘤)，其基因組包含權(quán)利要求100或101的嵌合抗體鏈基因座。
103.非人脊椎動物或哺乳動物(例如小鼠或大鼠)，其基因組包含權(quán)利要求100或101的嵌合抗體 鏈基因座。
全文摘要
本發(fā)明揭示了產(chǎn)生嵌合人-非人抗體及嵌合抗體鏈的方法，如此產(chǎn)生的抗體和抗體鏈，以及包括完全人源化抗體的其衍生物，本發(fā)明揭示了包含所述抗體、抗體鏈及衍生物的組合物，以及適用于所述方法中的細(xì)胞、非人哺乳動物和載體。
文檔編號C12N15/90GK103228130SQ201180039668
公開日2013年7月31日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者A·布拉德利, E-C·李, 梁琦, 汪瑋 申請人:科馬布有限公司