專利名稱：中性pH糖化和發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
能夠在5. 0-8. 0范圍內(nèi)的pH下有效水解淀粉底物的葡糖淀粉酶可用于同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)以生產(chǎn)終產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
工業(yè)發(fā)酵主要利用糖作為原料來(lái)生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)、酶、醇和其他化工終產(chǎn)品。通常，葡萄糖是淀粉加工的產(chǎn)品，淀粉加工在常規(guī)上是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的兩步酶促過(guò)程。在液化過(guò)程中，不溶性顆粒淀粉在水中調(diào)成漿液，經(jīng)加熱糊化，并被熱穩(wěn)定性a -淀粉酶水解。在糖化過(guò)程中，液化中產(chǎn)生的可溶性糊精進(jìn)一步被葡糖淀粉酶水解，產(chǎn)生含有95%以上的葡萄糖的高葡萄糖糖漿。葡糖淀粉酶屬外切作用糖酶，能夠水解淀粉(例如直鏈淀粉和支鏈淀粉)的直鏈和支鏈糖苷鍵。在商業(yè)上，葡糖淀粉酶通常在酸性PH范圍(小于5.0的pH)內(nèi)使用，以從經(jīng)酶液化的淀粉底物產(chǎn)生可發(fā)酵糖?？砂l(fā)酵糖，例如低分子量糖如葡萄糖，然后可通過(guò)其他酶(例如葡萄糖異構(gòu)酶)轉(zhuǎn)化為果糖；可進(jìn)行結(jié)晶；或者可用于發(fā)酵以生產(chǎn)各種各樣的終產(chǎn)品(例如醇、谷氨酸一鈉、琥珀酸、維生素、氨基酸、1，3-丙二醇和乳酸)。一種將(I)糖化和(2)發(fā)酵組合在一起的系統(tǒng)被稱為同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)。SSF取代經(jīng)典的雙步驟發(fā)酵，即首先生產(chǎn)可發(fā)酵糖，然后進(jìn)行生產(chǎn)終產(chǎn)品的發(fā)酵過(guò)程。在SSF中，可將接種物隨同淀粉水解酶一起加入，以并行地糖化淀粉底物和將糖化產(chǎn)物(即可發(fā)酵糖)轉(zhuǎn)化為期望的終產(chǎn)品。接種物通常是能夠產(chǎn)生終產(chǎn)品的微生物。SSF的好處包括但不限于以下I)通過(guò)提供連續(xù)的葡萄糖進(jìn)料促進(jìn)持續(xù)的微生物生長(zhǎng)；2)通過(guò)降低滲透脅迫改善碳轉(zhuǎn)化效率；3)通過(guò)容納更高的干物質(zhì)提升發(fā)酵能力；以及4)由于逆反應(yīng)產(chǎn)物和非可發(fā)酵糖的生成減少而提升終產(chǎn)品產(chǎn)量和有利于下游加工。在小反應(yīng)器體積中存在高濃度底物的情況中，SSF尤其有前景。參見(jiàn)例如John等人，《生物技術(shù)進(jìn)展》(Biotechnol. Adv.)，第27卷，第145-152頁(yè)，2009年。仍需要通過(guò)選擇對(duì)糖化和發(fā)酵都最適合的條件例如溫度、pH、酶等來(lái)優(yōu)化SSF。例如，在使用谷物作為原料生產(chǎn)燃料醇的過(guò)程中，酵母發(fā)酵的PH與糖化的葡糖淀粉酶活性匹配。尤其對(duì)于最適在PH6.0以上進(jìn)行的發(fā)酵而言，這個(gè)需要是明顯的。大多數(shù)商業(yè)糖化酶類例如黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)僅在4. 2-5. 5的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的糖化酶活性。葡糖淀粉酶在6. O以上的發(fā)酵pH下表現(xiàn)出顯著降低的活性。當(dāng)發(fā)酵和糖化的最適條件不一致時(shí)，采用了額外的步驟如預(yù)處理或預(yù)糖化來(lái)產(chǎn)生發(fā)酵原料。例如，如在WO 2003/066816中公開(kāi)，使?jié){液在65°C下經(jīng)歷巴氏滅菌14小時(shí)，然后在34°C下進(jìn)行SSF以生產(chǎn)1，3_丙二醇。類似地，可使產(chǎn)乳酸微生物在酸性pH下經(jīng)歷四十至五十次系列轉(zhuǎn)移，然后應(yīng)用于SSF以生產(chǎn)乳酸。參見(jiàn)WO 2003/095659。

發(fā)明內(nèi)容
諸如灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、里氏木霉(Trichodermareesei)葡糖淀粉酶(TrGA)和米根霉/得氏根霉(Rhizopus oryzae/niveus.)葡糖淀粉酶(RhGA)的葡糖淀粉酶(GA)表現(xiàn)出與其他已知的葡糖淀粉酶不同的pH譜(pH profile),所述已知的葡糖淀粉酶例如來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶(AnGA)和來(lái)自埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)的葡糖淀粉酶(TeGA)。在6. 0或6. 0以上的pH下，HgGA和TrGA均相對(duì)于分別在pH4. 25或pH3. 75下的最大活性保持至少50%的活性。HgGA和TrGA均能夠在5. 0-8. 0范圍內(nèi)的pH下有效糖化淀粉底物。這個(gè)性質(zhì)使得HgGA和TrGA能夠用于同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)以從淀粉底物生產(chǎn)終產(chǎn)品。本發(fā)明設(shè)想的實(shí)施方案提供了在pH5. 0-8. 0下處理淀粉產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法?？砂l(fā)酵糖是通過(guò)在這樣的葡糖淀粉酶的存在下糖化淀粉底物產(chǎn)生的，該葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性。糖化可在6. 0-7. 5或者任選地7. 0-7. 5范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行。糖化是在約300C至約600C或者任選地約30°C至約40°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。在一個(gè)方面,淀粉底物來(lái)自玉米、小麥、黑麥、大麥、高粱、木薯(cassava)、木薯(capioca)、馬鈴薯以及它們的任何組合。在另一個(gè)方面，淀粉底物是顆粒淀粉或液化淀粉。在又一個(gè)方面，淀粉底物為約15% -50%、約15% -30%或約15% -25%干物質(zhì)(DS)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，該方法還包括在與進(jìn)行糖化相同的pH下將可發(fā)酵糖發(fā)酵成終產(chǎn)品。終產(chǎn)品可選自甲醇、乙醇、丁醇、谷氨酸一鈉、琥珀酸、1，3_丙二醇、維生素、氨基酸和乳酸。任選地，終產(chǎn)品為乙醇、1，3_丙二醇或琥珀酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖化和發(fā)酵作為同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)過(guò)程來(lái)進(jìn)行，該過(guò)程通常在pH6. 5-7. 5下進(jìn)行。在一個(gè)方面,葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO :3的灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO :6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO : 9的根霉(Rhizopus p.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體。變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。任選地，變體與親本葡糖淀粉酶相比具有一個(gè)氨基酸修飾。在另一個(gè)方面，HgGA為SEQ ID NO :3，且任選地從里氏木霉(Trichodermareesei)宿主細(xì)胞產(chǎn)生。在又一個(gè)方面，TrGA為SEQ ID No :6。在又另一個(gè)方面，RhGA為SEQ ID NO:9。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶以約0.1至約2. O、約0.2至約1.0或者0.5至1. OGAU/克干物質(zhì)淀粉的范圍加入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖化還包括加入a-淀粉酶。a-淀粉酶為來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)的物種，或?yàn)槠渥凅w。a-淀粉酶為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) a -淀粉酶(AmyE)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ct-淀粉酶、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶、脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus) a-淀粉酶或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一種其他酶存在下在pH5. 0-8. 0下將淀粉底物糖化為可發(fā)酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在pH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO 3的灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉屬物種(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體,其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，并且其中所述其他酶選自蛋白酶、支鏈淀粉酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(glycotransferase)、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質(zhì)酶、木聚糖酶和a -葡萄糖苷酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一種其他非淀粉多糖水解酶存在下在pH5. 0-8. 0下將淀粉底物糖化為可發(fā)酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO :3的灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6 的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含 SEQ ID NO 9 的根霉屬物種(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體,其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，并且其中所述非淀粉多糖水解酶選自纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。


本說(shuō)明書包括附圖，附圖提供各個(gè)實(shí)施方案的非限制性例證。在附圖中圖1示出32°C下HgGA、TrGA、AnGA和TeGA的pH譜。pH譜是按占實(shí)例I中描述的糖化條件下的最大活性的百分比作出。

圖2示出在HgGA、TrGA和AnGA催化的48小時(shí)糖化反應(yīng)后高級(jí)糖類的存在。糖化反應(yīng)在實(shí)例4中描述。圖3示出用HgGA和a -淀粉酶在pH6. 4下處理的玉米、小麥和木薯淀粉的掃描電子顯微照片。各淀粉樣品是在實(shí)例7中描述的條件下由HgGA和a-淀粉酶水解。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及能夠在中性pH下(例如在pH5. 0-8. 0之間)有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶。在6.0或6.0以上的pH下，葡糖淀粉酶相對(duì)于最大活性保持至少約50%活性。具有所述不尋常性質(zhì)的葡糖淀粉酶可包括例如HgGA、TrGA和RhGA。本發(fā)明還包括使用該葡糖淀粉酶在中性PH下進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)以生產(chǎn)終產(chǎn)品例如1，3_丙二醇、琥珀酸、賴氨酸、谷氨酸一鈉和乳酸的方法。在一些方面，本發(fā)明的實(shí)施方案依賴于遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方法。以下資料包括對(duì)可根據(jù)本發(fā)明使用的一般方法學(xué)的描述=Samtoook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第 2 版，I989 年)；Kreigler,《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)指南》(Gene Transfer And Expression ；A LaboratoryManual), 1990年；以及Ausubel等人編輯，《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Current ProtocolsIn Molecular Biology), 1994年。除非本文另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。以下文獻(xiàn)給技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般詞典Singleton等人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology),第 2 版,約翰威立父子出版公司，紐約(John Wiley and Sons, New York), 1994 年；以及 Hale & Markham,《哈普克林生物學(xué)詞典》(he Harper Collins Dictionary Of Biology)Harper Perennial 出版社，紐約(Harper Perennial,N. Y.), 1991年。本文描述代表性的方法和材料,不過(guò)任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。本文提供的標(biāo)題并非對(duì)各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，這些方面或?qū)嵤┓桨缚梢酝ㄟ^(guò)參閱本說(shuō)明書全文而獲得。1.定義和縮寫根據(jù)本“具體實(shí)施方式
”，應(yīng)用下面的縮寫和定義。應(yīng)該指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指代物。因此，例如，提及“酶”則包括多個(gè)這種酶。1.1.定義 本文所用的“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“多肽”和/或術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”同義。在一些情況中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“肽”同義；在一些情況中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“酶”同義。本文所用的“核苷酸序列”或“核酸序列”指基因組來(lái)源、合成來(lái)源或重組來(lái)源的序列，且不論代表正義鏈還是反義鏈都可以是雙鏈的或單鏈的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”可以指基因組DNA、cDNA、合成DNA或RNA。核酸的殘基可含有本領(lǐng)域中通常已知和使用的任何化學(xué)修飾?！胺蛛x的”意指該材料至少基本上不含有至少一種與其天然相關(guān)且天然存在的其它組分。“純化的”指該材料處于相對(duì)純的狀態(tài)，例如至少約90%純、至少約95%純、至少約98%純或者至少約99%純?！肮烟恰币庵赣?-20個(gè)單糖組成的碳水化合物分子。如本文所用，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括已通過(guò)使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。通常通過(guò)向細(xì)胞插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列而進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列，即這樣的序列，其對(duì)于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言可以是并非天然的，如融合蛋白。本文所用的“淀粉”指任何由植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的材料，由具有式(C6HltlO5)x(其中“X”可以是任何數(shù)字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。具體地講，該術(shù)語(yǔ)指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體地講，指小麥、大麥、玉米、黑麥、稻米、高粱、糠、木薯(cassava)、小米、馬鈴薯、甘薯和木薯(tapioca)。本文所用的“顆粒淀粉”指未經(jīng)過(guò)糊化的未蒸煮過(guò)(生)的淀粉。本文所用的“淀粉糊化”意指使淀粉分子增溶形成粘性懸浮液。本文所用的“糊化溫度”指淀粉底物發(fā)生糊化時(shí)的最低溫度。確切溫度取決于具體的淀粉底物，還可取決于淀粉得自的植物物種的特定品種和生長(zhǎng)條件。
“DE”或“葡萄糖當(dāng)量”為用于度量總還原糖的濃度的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算為已轉(zhuǎn)化為還原糖的總固形物的百分比。尚未被水解的顆粒淀粉的DE為約零(0)，而D-葡萄糖的DE為約 100。本文所用的“淀粉底物”指使用精制淀粉、全磨谷粒或分級(jí)谷粒的顆粒淀粉或液化淀粉。本文所用的“液化淀粉”指已經(jīng)歷過(guò)增溶處理，例如常規(guī)的淀粉液化處理的淀粉。本文所用的“葡萄糖糖漿”指含有葡萄糖固形物的含水組合物。葡萄糖糖漿將具有至少約20的DE。在一些實(shí)施例中，葡萄糖糖漿可含有不超過(guò)約21%的水，而以葡萄糖計(jì)算含有至少約25 %的還原糖。在一個(gè)實(shí)施例中，葡萄糖糖漿可包含至少約90 %的D-葡萄糖，在另一個(gè)實(shí)施例中，葡萄糖糖漿可包含至少約95%的D-葡萄糖。在一些實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)葡萄糖和葡萄糖糖漿可互換使用?！熬酆隙?DP) ”是指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單位的數(shù)目(n)。DPl的例子是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP4+( > DP4)表示聚合度大于4的聚合物。本文所用的“可發(fā)酵糖”指能夠在發(fā)酵條件下被代謝的糖類。這些糖類通常指葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖(DP1、DP2和DP3)。本文所用的“總糖含量”是指淀粉組合物中存在的總糖含量。本文所用的“ds”是指溶液中溶解的固形物。術(shù)語(yǔ)“干物質(zhì)含量(DS) ”指以干重計(jì)漿液的總固體，單位％。術(shù)語(yǔ)“漿液”指含有不溶性固體的含水混合物。
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本文所用的“淀粉液化酶”是指催化顆粒淀粉的水解或分解的酶。示例性的淀粉液化酶包括a -淀粉酶(EC 3. 2.1.1)?！暗矸勖浮币庵赣绕涫悄軌虼呋矸劢到獾拿?。例如￠-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1.20 ； a -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3. 2.1. 3 ； a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可從淀粉產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的麥芽寡糖。“a-淀粉酶(EC3. 2.1.1)”是指以隨機(jī)方式切割淀粉分子內(nèi)部的a-D-(l —4)0-糖苷鍵的內(nèi)切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶如P -淀粉酶(EC3. 2. 1.2 ；a t-D-(l — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如產(chǎn)麥芽糖a -淀粉酶(EC3. 2.1. 133)從底物的非還原端切割淀粉分子。這些酶也被描述成在含有l(wèi)，4_a -連接的D-葡萄糖單位的多糖中實(shí)現(xiàn)l，4-a-D-糖苷鍵的外切水解或內(nèi)切水解的酶。用于描述這些酶的另一術(shù)語(yǔ)是糖原酶。示例性的酶包括a-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。本文所用的“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡萄糖苷酶類的酶(EC3. 2.1. 3，葡糖淀粉酶，6 -1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些酶是從直鏈淀粉和/或支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡萄糖殘基的外切作用酶。這些酶也能夠水解a-l，6和a-1，3鍵，但是水解速率要比a-1，4鍵的水解慢得多。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非淀粉多糖水解酶”是能夠水解復(fù)合碳水化合物聚合物如纖維素、半纖維素和果膠的酶。例如，纖維素酶(內(nèi)切和外切葡聚糖酶、￠-葡萄糖苷酶)、半纖維素酶(木聚糖酶)和果膠酶是非淀粉多糖水解酶。本文所用的“最高活性”指在最有利的條件下例如在最佳pH下測(cè)量的酶活性。本文所用的“最佳pH”指在其他條件相等的情況下酶表現(xiàn)出最高活性時(shí)的pH值。
詞語(yǔ)蛋白質(zhì)或多肽的“成熟形式”指該蛋白質(zhì)或多肽的最終功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺乏信號(hào)肽和/或起始甲硫氨酸。葡糖淀粉酶的成熟形式可從其天然宿主例如通過(guò)內(nèi)源表達(dá)來(lái)產(chǎn)生?；蛘?葡糖淀粉酶的成熟形式可從其非天然宿主例如通過(guò)外源表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。外源表達(dá)的葡糖淀粉酶只要保持了葡糖淀粉酶活性，與內(nèi)源表達(dá)的對(duì)等物相比可具有改變的糖基化模式。術(shù)語(yǔ)“親本”或“親本序列”指宿主細(xì)胞中天然的或自然存在的序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”用來(lái)指與親本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。變體與親本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一個(gè)使其在序列上與親本葡糖淀粉酶不同的置換、缺失或插入。在一些情況中，變體經(jīng)過(guò)了操縱和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一個(gè)使其在序列上與親本不同的置換、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶變體可保留親本葡糖淀粉酶的功能特性，例如保持的葡糖淀粉酶活性達(dá)親本葡糖淀粉酶活性的至少約50%、約60%、約70%、約80%或約90%。本文所用的“淀粉的水解”是指通過(guò)加入水分子來(lái)切割糖苷鍵。本文所用的“無(wú)蒸煮”指不用常規(guī)的高溫淀粉液化過(guò)程，將顆粒淀粉底物例如生淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過(guò)程。本文所用的“終產(chǎn)品”或“期望的終產(chǎn)品”指酶和/或微生物將淀粉底物轉(zhuǎn)化成的分子或化合物。本文所用的“接觸”或“混合”指將相應(yīng)的酶設(shè)置成與相應(yīng)的底物充分靠近，使得該酶能夠?qū)⒃摰孜镛D(zhuǎn)化為終產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到將酶溶液與相應(yīng)底物混合可實(shí)現(xiàn)接觸或混合。1. 2.縮寫除非另有指明， 否則應(yīng)用下述縮寫AkAA 白曲霉(Aspergillus kawachii) a -淀粉酶AmyE 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) a -淀粉酶AmyL 地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶AmyR SPEZYME XTRA 淀粉酶AmyS 嗜熱脂肪地芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophi lus) a -淀粉酶AnGA 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶BAA 細(xì)菌a-淀粉酶cDNA 互補(bǔ) DNADE葡萄糖當(dāng)量DI 蒸餾的，去離子的DNA 脫氧核糖核酸DP3 具有三個(gè)亞單位的聚合度DPn 具有n個(gè)亞單位的聚合度DS或ds干物質(zhì)dss 干物質(zhì)淀粉EC 進(jìn)行酶分類的酶學(xué)委員會(huì)g克
gpm 加侖每分鐘GAU 葡糖淀粉酶單位HGA 灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶HgGA 灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶HPLC 高壓液相色譜法kg千克MOPS 3- (N-嗎啉代)丙磺酸MT公噸MW 分子量NCBI 美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心nm納米OD光密度PCR 聚合酶鏈反應(yīng)PEG 聚乙二醇pi等 電點(diǎn)ppm 份每一百萬(wàn)份RhGA 根霉屬物種(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶RNA 核糖核酸RO 反滲透rpm 轉(zhuǎn)每分鐘slpm 標(biāo)準(zhǔn)升每分鐘SSF 同時(shí)糖化和發(fā)酵TeGA 埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)葡糖淀粉酶TrGA 里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶w/v 重量/體積w/w 重量/重量Wt野生型u L 微升2.淀粉加工中的酶2.1.葡糖淀粉酶2.1.1.結(jié)構(gòu)和功能葡糖淀粉酶由細(xì)菌、真菌、酵母和植物的許多菌株(株系)產(chǎn)生。許多真菌葡糖淀粉酶是胞外產(chǎn)生的真菌酶，例如來(lái)自以下各屬的菌株曲霉屬(Aspergillus) (Svensson等人，《嘉士伯研究通訊》(Carlsberg Res. Commun.)，第 48 卷，第 529-544 頁(yè)，1983 年；Boel等人，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMB0 J.)，第3卷，第1097-1102頁(yè)，1984年；Hayashida等人，《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》(Agric. Biol. Chem ，第53卷，第923-929頁(yè)，1989年；美國(guó)專利第5,024,941 號(hào)；美國(guó)專利第 4,794，175 號(hào)和 WO 88/09795);籃狀菌屬(Talaromyces)(美國(guó)專利第4，247，637號(hào)；美國(guó)專利第6，255，084號(hào)；和美國(guó)專利第6，620，924號(hào));根霉屬(Rhizopus) (Ashikari 等人,《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》(Agric. Biol. Chem.)，第 50 卷，第 957-964 頁(yè)，1986年；Ashikari等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App. Microbio. Biotech.),第32卷，第 129-133 頁(yè)，1989 年;和美國(guó)專利第 4，863，864 號(hào));腐質(zhì)霉屬(Humicola) (WO 05/052148和美國(guó)專利第4，618, 579號(hào))；以及毛霉屬(Mucor) (Houghton-Larsen等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App1. Microbiol. Biotechnol.)，第 62 卷，第 210-217 頁(yè)，2003 年)。許多編碼這些酶的基因已被克隆并在酵母、真菌和/或者細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。在商業(yè)上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已被用于許多需要水解淀粉(例如用于從淀粉產(chǎn)生葡萄糖和其他單糖)的應(yīng)用中。葡糖淀粉酶被用來(lái)生產(chǎn)高果糖玉米甜味劑，其占美國(guó)甜味劑市場(chǎng)的50%以上。一般而言，葡糖淀粉酶可以并且通常與a-淀粉酶一起在淀粉水解過(guò)程中使用，以將淀粉水解成糊精，然后水解成葡萄糖。然后葡萄糖可通過(guò)其他酶(例如葡萄糖異構(gòu)酶)轉(zhuǎn)化為果糖；可進(jìn)行結(jié)晶；或者可用于發(fā)酵以生產(chǎn)各種各樣的終產(chǎn)品(例如乙醇、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸中間體、谷氨酸、甘油、1，3-丙二醇和乳酸)。葡糖淀粉酶由多達(dá)三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)是在所有葡糖淀粉酶中結(jié)構(gòu)上保守的、大約450個(gè)殘基的催化域，通常接著是一個(gè)由30-80個(gè)殘基組成的接頭區(qū)域，該接頭區(qū)域連接到一個(gè)大約100個(gè)殘基的淀粉結(jié)合域。所有三個(gè)區(qū)域均完整的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)被測(cè)定至1. 8埃分辨率。參見(jiàn)WO 2009/048488和TO 2009/048487。采用測(cè)得的坐標(biāo)，將結(jié)構(gòu)與來(lái)自之前測(cè)定的泡盛曲霉(Aspergillusawamori)X100 的葡糖淀粉 酶的催化域的坐標(biāo)(Aleshin, A. E. , Hoffman, C. , Firsov,L. M.和Honzatko R. B., “來(lái)自泡盛曲霉(Aspergillus awamori) XlOO變種的葡糖淀粉酶的精修晶體結(jié)構(gòu)” (Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori^!■]100.)，《分子生物學(xué)雜志》0^01.8101.)，第238卷，第575-591頁(yè)，1994年)進(jìn)行比對(duì)。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。這兩個(gè)葡糖淀粉酶的催化域的結(jié)構(gòu)重疊得非常緊密，可以基于這個(gè)結(jié)構(gòu)重合來(lái)鑒定對(duì)等的殘基。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。還認(rèn)為所有的葡糖淀粉酶都具有基本的結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。鑒于各種葡糖淀粉酶的公知的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，已成功產(chǎn)生和表征了具有改變的性質(zhì)的葡糖淀粉酶變體。所述變體與親本葡糖淀粉酶相比可表現(xiàn)出改善的性質(zhì)。改善的性質(zhì)可包括但不限于提高的熱穩(wěn)定性和提高的比活性。例如，WO 2009/067218中描述了制備和表征具有改變的性質(zhì)的TrGA變體的方法。2.1. 2.具有期望的PH譜的葡糖淀粉酶本發(fā)明的實(shí)施方案利用在中性pH下能夠有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶，所述中性 pH 例如在 pH5. 0-8. 0,5. 5-7. 5,6. 0-7. 5,6. 5-7. 5 或 7. 0-7. 5 之間。在 6. 0 或 6. 0 以上的pH下，該葡糖淀粉酶相對(duì)于最大活性保持至少約50%、約51 %、約52%、約53%、約54%或約55%的活性。具有期望的pH譜的葡糖淀粉酶包括但不限于灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)、里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和根霉葡糖淀粉酶(RhGA)。HgGA可以是包含SEQ ID NO :3氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其在美國(guó)專利第4，618，579號(hào)和第7，262，041號(hào)中詳細(xì)描述。這個(gè)HgGA還被描述為顆粒淀粉水解酶(GSHE)，因?yàn)樗軌蛩忸w粒形式的淀粉。編碼來(lái)自灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola griseavar. thermoidea)的HgGA的基因組序列以SEQ ID NO :1示出，其含有三個(gè)推定的內(nèi)含子(位置233-307、752-817和950-1006)。來(lái)自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然HgGA具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其包括含有30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽(SEQ ID NO 2的位置1_30)。切割信號(hào)肽即得到具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的成熟HgGA。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括從木霉屬(Trichoderma)宿主細(xì)胞例如里氏木霉細(xì)胞產(chǎn)生的HgGA。參見(jiàn)美國(guó)專利第7，262，041號(hào)。TrGA可以是來(lái)自里氏木霉QM6a(ATCC登記號(hào)13631)的葡糖淀粉酶。這個(gè)TrGA包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，其例如在美國(guó)專利第7，413，879號(hào)中描述。編碼來(lái)自里氏木霉QM6a的TrGA的cDNA序列以SEQ ID NO :4示出。該天然TrGA具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列，其包括含有33個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽(SEQ ID NO 4的位置1_33)。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。切割信號(hào)肽即得到具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的成熟TrGA。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。TrGA的催化域以SEQ ID N0:7示出。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括內(nèi)源表達(dá)的TrGA。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。RhGA可以是來(lái)自得氏根霉(Rhizopus niveus)或米根霉的葡糖淀粉酶。參見(jiàn)美國(guó)專利第4，514，496號(hào)和第4，092，434號(hào)。來(lái)自米根霉的天然RhGA具有SEQ ID NO :8的氨基酸序列，其包括含有25個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽(SEQ ID NO 8的位置1_25)。切割信號(hào)肽即得到具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列的成熟RhGA。典型的RhGA可以是商品名為⑶.CONC(新日本化學(xué)株式會(huì)社，日本)或Ml (Biocon India，印度班加羅爾)的葡糖淀粉酶。本發(fā)明的實(shí)施方案的葡糖淀粉酶也可以是HgGA、TrGA或RhGA的變體。該變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。在一些實(shí)施方案中，該變體與親本葡糖淀粉酶具有至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%或至少90%序列同一性。任選地，該變體與親本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸修飾。任選地，該變體與親本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有超過(guò)六個(gè)氨基酸(例如 7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55 或 60個(gè))修飾。該變體在5. 0-8.0范 圍內(nèi)的pH下具有期望的pH譜和糖化淀粉底物的能力。在一些實(shí)施方案中，該變體可具有其他改進(jìn)的性質(zhì)，如改進(jìn)的熱穩(wěn)定性和改進(jìn)的特異性。2.1. 3.葡糖淀粉酶的產(chǎn)生適合于本發(fā)明的實(shí)施方案的葡糖淀粉酶可用重組DNA技術(shù)在各種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)宿主細(xì)胞包括用來(lái)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的變體葡糖淀粉酶的細(xì)胞、所述細(xì)胞的子代和從所述細(xì)胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，通常是絲狀真菌宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌”指真菌亞門的所有絲狀形式(參見(jiàn)Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌學(xué)概論》(Introductory Mycology),威利出版社，紐約(Wiley, New York))。這些真菌的特征是其營(yíng)養(yǎng)菌絲體的細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)合多糖組成。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳學(xué)上與酵母不同。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行，并且碳分解代謝是專性好氧的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，絲狀真菌親本細(xì)胞可以是以下各屬(但不限于以下各屬)的物種的細(xì)胞木霉屬(Trichoderma)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei)(其為之前歸類為長(zhǎng)梗木霉(T.1ongibrachiatum)的紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無(wú)性形式)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs 等人，1984年，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App1. Microbiol. Biotechnol)，第20卷，第46-53頁(yè)；ATCCNo. 56765 和 ATCC No. 26921);青霉屬(Penicillium sp.);腐質(zhì)霉屬(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(H. lanuginosa)和灰腐質(zhì)霉(H. grisea);金孢子菌屬(Chrysosporium sp.)(例如 C.1ucknowense);粘帚霉屬(Gliocladium sp.);曲霉屬(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A. oryzae)、黑曲霉(A. niger)、醬油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A. japonicus)、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)和泡盛曲霉(A. awamori) (Ward等人,1993年，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App1. Microbiol. Biotechnol.)，第39卷，第738-743頁(yè)；以及Goedegebuur等人,2002年，《遺傳學(xué)》(Genet),第41卷,第89-98頁(yè));鐮刀菌屬(Fusarium sp.)(例如粉紅色鐮刀菌(F. roseum)、禾谷鐮刀菌(F. graminum)、F. cerealis、尖孢鐮刀菌(F. oxysporuim)和F. venenatum);脈胞菌屬(Neurospora sp.)(粗糙脈胞菌(N. crassa));肉座菌屬(Hypocrea sp.);毛霉屬(Mucor sp.)(米黑毛霉(M. miehei));根霉屬物種(Rhizopus sp.)和裸孢殼屬(Emericella sp.)(另參見(jiàn)Innis等人，1985年,《科學(xué)》(Sc1.),第 228 卷,第 21-26 頁(yè))。術(shù)語(yǔ)木霉屬(“Trichoderma”或“Trichoderma sp. ”或“Trichoderma spp. ”)指之前或目前被歸類為木霉的任何真菌屬。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞將是經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，其中天然基因已例如通過(guò)在真菌細(xì)胞中進(jìn)行缺失而被失活。在期望獲得具有一個(gè)或多個(gè)失活的基因的真菌宿主細(xì)胞的情況中，可使用已知的方法(例如美國(guó)專利第5，246，853號(hào)和第5，475，101號(hào)以及WO 92/06209中公開(kāi)的方法)?？赏ㄟ^(guò)完全或部分缺失、通過(guò)插入失活或者通過(guò)任何其他能使基因?qū)ζ漕A(yù)定目的而言無(wú)功能的手段(使得防止該基因表達(dá)功能蛋白)，來(lái)實(shí)現(xiàn)基因失活。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞尤其是里氏木霉宿主細(xì)胞時(shí)，cbhl基因、cbh2基因、egll基因和egl2基因?qū)⒈皇Щ詈?或通常被缺失。代表性地，具有quad缺失蛋白的里氏木霉宿主細(xì)胞在美國(guó)專利第5，847，276號(hào)和WO 05/001036中給出并描述。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株。為用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的實(shí)施方案的葡糖淀粉酶，可構(gòu)建包含編碼該指定葡糖淀粉酶的氨基酸序列的核酸的DNA構(gòu)建體，并例如轉(zhuǎn)移到里氏木霉宿主細(xì)胞中。載體可以是任何當(dāng)被引入到里氏木霉宿主細(xì)胞中時(shí)能整合到宿主細(xì)胞基因組中并能被復(fù)制的載體。有關(guān)載體名單可參見(jiàn)真菌遺傳學(xué)原種中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC，〈WWW.fgsc.net>)菌株目錄。合適的表達(dá)和/或整合載體的另外的例子在以下文獻(xiàn)和專利中提供Sambrook等人，1989年，出處同上；Ausubel, 1987年，出處同上；和van denHondel等人，1991年，載于Bennett和Lasure編輯,“真菌中的更多基因操縱”(More GeneManipulations In Fungi),學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),第 396-428 頁(yè)；以及美國(guó)專利第5，874，276號(hào)?？蓪⒕幋a葡糖淀粉酶的核酸有效連接到在里氏木霉宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的合適啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可衍自編碼該宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。啟動(dòng)子的合適的非限制性例子包括cbhl、cbh2、egll、egl2。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可以是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。通常，啟動(dòng)子可以是里氏木霉cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并已寄存在GenBank中，登記號(hào)為D86235。“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”可指在環(huán)境調(diào)節(jié)或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可以是里氏木霉宿主細(xì)胞的異源啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其他例子包括來(lái)自泡 盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如Nunberg等人，1984年，《分子與細(xì)胞生物學(xué)》(Mol. Cell Biol.)，第4卷，第2306-2315頁(yè)；和Boel等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，第3卷，第1581-1585頁(yè))。另外，里氏木霉xlnl基因和纖維二糖水解酶I基因的啟動(dòng)子也是有用的(EPA 13f280Al)。在一些實(shí)施方案中，可將葡糖淀粉酶編碼序列有效連接到信號(hào)序列。信號(hào)序列可以是葡糖淀粉酶的天然信號(hào)肽(例如，對(duì)于HgGA而言為SEQ ID NO 2的殘基1_20 ;對(duì)于TrGA而言為SEQ ID NO :5的殘基1_33)?；蛘撸盘?hào)序列可與天然信號(hào)序列具有至少90%或至少95 %序列同一性。在另外的實(shí)施方案中，構(gòu)成待引入到里氏木霉宿主細(xì)胞中的DNA構(gòu)建體或載體的信號(hào)序列和啟動(dòng)子序列衍自相同的來(lái)源。例如，在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列可以是有效連接到cdhl啟動(dòng)子的cdhl信號(hào)序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體也可包括終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，終止序列和啟動(dòng)子序列可衍自相同來(lái)源。在另一個(gè)實(shí)施方案中，終止序列可以對(duì)宿主細(xì)胞而言是同源的。特別合適的終止子序列可以是衍自里氏木霉的cbh7。其他示例性的真菌終止子包括來(lái)自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體可包括選擇性標(biāo)記。代表性的選擇性標(biāo)記的例子包括賦予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的選擇性標(biāo)記。營(yíng)養(yǎng)選擇性標(biāo)記也可用于本發(fā)明，包括本領(lǐng)域已知的amdS、argB和pyr4標(biāo)記。在用于木霉屬的轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Finkelstein，《絲狀真菌的生物技術(shù)》(Biotechnology Of Filamentous Fungi)第 6 章，F(xiàn)inkelstein 等人編輯，馬薩諸塞州波士頓 Butterworth-Heinemann 出版社(Butterworth-Heinemann, Boston, Mass.), 1992 年，第6章；和Kinghorn等人，1992年，《絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)》(APPLIED MOLE⑶LARGENETIC S OF FILAMENTOUS FUNGI)，倫敦 Chapman and Hall 出版社(Blackie Academicand Professional)。在一個(gè)代表性的實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記可以是編碼乙酰胺酶的amdS基因，從而使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能以乙酰胺作為氮源生長(zhǎng)。使用構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇性標(biāo)記在例如以下文獻(xiàn)中有描述=Kelley等人，1985年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，第4卷，第475-479頁(yè)；和Penttila等人，1987年，《基因》(Gene)，第61卷，第155-164頁(yè)。包含具有編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，可以是任何能夠在給定的真菌宿主生物中自主復(fù)制或能夠整合到宿主的DNA中的載體。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以是質(zhì)粒。在典型的實(shí)施方案中，設(shè)想到兩種類型的用于獲得基因的表達(dá)的表達(dá)載體。第一個(gè)表達(dá)載體可包含這樣的DNA序列，其中啟動(dòng)子、葡糖淀粉酶編碼區(qū)和終止子均來(lái)源于待表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)缺失掉不需要的DNA序列(例如編碼不想要的結(jié)構(gòu)域的DNA)以留下待在其自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)域，來(lái)獲得基因截短。第二種類型的表達(dá)載體可以是預(yù)先裝配的，含有高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列并含有選擇性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，可將葡糖淀粉酶基因的編碼區(qū)或其部分插入到這個(gè)通用表達(dá)載體中，使得它處于表達(dá)構(gòu)建體啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實(shí)施方案中，可將基因或其部分插入在強(qiáng)啟動(dòng)子如強(qiáng)cbhl啟動(dòng)子的下游。用于連接包含編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸、啟動(dòng)子、終止子和其他序列的DNA構(gòu)建體并將它們插入到合適的載體中的方法是本領(lǐng)域公知的。連接通?？赏ㄟ^(guò)在便利的限制位點(diǎn)處的連接來(lái)完成。如果不存在此類位點(diǎn)，那么根據(jù)常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸接頭。(參見(jiàn)Sambrook, 1989年，出處同上 ；以及Bennett和Lasure,《真菌中的更多基因操縱》(More Gene Manipulations In Fungi),學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(Academic Press, SanDiego), 1991年，第70-76頁(yè))。另外，可用已知的重組技術(shù)構(gòu)建載體(例如InvitrogenLife Technologies, Gateway Technology)。將DNA構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中包括諸如以下的技術(shù)轉(zhuǎn)化；電穿孔；核顯微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鈣DNA沉淀一起溫育；用包被DNA的微粒高速轟擊；及原生質(zhì)體融合。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域知道的(參見(jiàn)例如Ausubel等人，1987年，出處同上,第9章；Sambrook, 1989年出處同上；以及Campbell等人，1989年，《當(dāng)代遺傳學(xué)》(Curr. Genet.),第16卷，第53-56頁(yè))。異源蛋白在木霉屬中的表達(dá)在以下專利和文獻(xiàn)中有描述美國(guó)專利第6，022，725號(hào)；第6, 268, 328 號(hào)；Harkki 等人，1991 年，《酶微生物技術(shù)》(Enzyme Microb. Technol.)，第 13 卷，第227-233頁(yè)；Harkki等人，1989年，《生物技術(shù)》(Bio Technol.)，第7卷，第596-603頁(yè)；EP244, 234 ；EP215, 594 ;以及Nevalainen等人，“木霉屬的分子生物學(xué)及其在表達(dá)同源和異源基因中的應(yīng)用” (“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application tothe Expression of Both Homologous and Heterologous Genes”)，載于《分子工業(yè)真菌學(xué)》(Molecular Industrial Mycology), Leong和Berka編輯，馬塞爾 德克爾公司，紐約(Marcel Dekker Inc.，NY)，1992 年，第 129-148 頁(yè))。在一些實(shí)施方案中，可用可據(jù)以將編碼葡糖淀粉酶的核酸穩(wěn)定整合到宿主菌株染色體中的載體系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株。然后可通過(guò)已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化株。在一個(gè)非限制性例子中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株的區(qū)別在于它們生長(zhǎng)速度較快，并且在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上形成光滑輪廓而不是粗糙輪廓的圓形菌落。此外，在一些情況下，通過(guò)以下方式進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性測(cè)試使轉(zhuǎn)化株在固體非選擇性培養(yǎng)基(即缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，從這個(gè)培養(yǎng)基收獲孢子，并測(cè)定隨后在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長(zhǎng)的這些孢子的百分比?；蛘?，可使用本領(lǐng)域知道的其他方法來(lái)選擇轉(zhuǎn)化株。DNA向里氏木霉屬菌株宿主中的攝取取決于鈣離子濃度。通常，在攝取溶液中可使用約IOmM CaCl2至50禮CaCl20攝取溶液中除了需要鈣離子外，其他通常包括的化合物是緩沖系統(tǒng)如TE緩沖液(IOmM Tris, pH7. 4 ；lmM EDTA)或IOmM MOPS, pH6. 0緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認(rèn)為，聚乙二醇的作用是融化細(xì)胞膜，從而讓該介質(zhì)的內(nèi)容物得以遞送到里氏木霉屬菌株的細(xì)胞質(zhì)中，并且質(zhì)粒DNA得以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。這種融化在很多情況下使質(zhì)粒DNA的多個(gè)拷貝整合到宿主染色體中。通常，在轉(zhuǎn)化中使用含有密度為IO5至107/mL、通常2X IO6AiL的經(jīng)歷過(guò)滲透性處理的里氏木霉屬原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液。將這些原生質(zhì)體或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)娜芤?例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100 y L體積與所需DNA混合。通常，可將高濃度的PEG加入到攝取溶液?？上蛟|(zhì)體懸浮液加入0. 1-1體積的25% PEG4000。還通常向原生質(zhì)體懸浮液加入約0. 25體積。也可向攝取溶液加入添加劑例如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等，幫助轉(zhuǎn)化。有類似的程序可用于其他的真菌宿主細(xì)胞。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利第6，022，725 號(hào)和第 6，268，328 號(hào)。通常，然后可將混合物在大約(TC下溫育10-30分鐘的時(shí)間。然后可向混合物加入另外的PEG以進(jìn)一步增強(qiáng)所需 的基因或DNA序列的攝取。25% PEG4000的加入體積通?？蔀檗D(zhuǎn)化混合物的體積的5-15倍；但是，更大和更小的體積都可以是適合的。25% PEG4000通?？蔀檗D(zhuǎn)化混合物的體積的約10倍。在加入PEG后，接著可將轉(zhuǎn)化混合物在室溫下或在冰上進(jìn)行溫育，然后再加入山梨糖醇/CaCl2溶液。然后可將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基的熔化等分試樣。該生長(zhǎng)培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)。通常，在含有生理鹽和營(yíng)養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(參見(jiàn)例如，Pourquie,J.等人，《纖維素降解的生物化學(xué)和遺傳學(xué)》(Biochemistry And Genetics Of CelluloseDegradation), Aubert, J. P.等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),第 71-86 頁(yè)，1988年；以及Ilmen, M.等人，1997,《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》(App1. Environ. Microbiol.),第63卷，第1298-1306頁(yè))。常見(jiàn)的商業(yè)制備的培養(yǎng)基(例如酵母麥芽浸膏(YM)肉湯、LuriaBertani (LB)肉湯和Sabouraud右旋糖(SD)肉湯也可用于本發(fā)明的實(shí)施方案。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的(例如，培養(yǎng)物在搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐中在適當(dāng)培養(yǎng)基中于大約28°C下進(jìn)行溫育，直到達(dá)到所需的葡糖淀粉酶表達(dá)水平)。在真菌生長(zhǎng)建立后，使細(xì)胞暴露于能有效促使或允許葡糖淀粉酶的表達(dá)的條件。在葡糖淀粉酶編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下的情況中，可將誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以能有效誘導(dǎo)葡糖淀粉酶表達(dá)的濃度加到培養(yǎng)基。通常，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的葡糖淀粉酶可分泌到培養(yǎng)基中，并可例如通過(guò)將不想要的組分從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除來(lái)進(jìn)行純化或分離。在一些情況中，葡糖淀粉酶可以細(xì)胞形式產(chǎn)生，這就需要從細(xì)胞切割物中回收在此類情況下，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常采用的技術(shù)從產(chǎn)生該酶的細(xì)胞純化該酶。這些技術(shù)的例子包括但不限于親和層析(Tilbeurgh等人，1984年，F(xiàn)EBS Lett.，第16卷，第215頁(yè))、離子交換色譜方法(Goyal等人，1991年，《生物資源技術(shù)》(Biores. Technol.),第36卷,第37頁(yè)；Fliess等人，1983年，《歐洲應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》(Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.),第17卷,第314頁(yè);Bhikhabhai等人，1984年，《應(yīng)用生物化學(xué)雜志》(J. Appl. Biochem.),第6卷,第336頁(yè)；和Ellouz等人，1987年,《色譜》(Ch`romatography),第396卷,第307頁(yè))，包括使用具有高拆分能力的材料進(jìn)行的離子交換(Medve等人，1998年,《色譜雜志A》(J. Chromatography A),第808卷,第153頁(yè))、疏水相互作用色譜(參見(jiàn)Tomaz和Queiroz, 1999年，《色譜雜志A》(J. Chromatography A)，第 865 卷，第 I23 頁(yè))、兩相分配(參見(jiàn) Brumbauer 等人，1999 年，《生物分離》(Bioseparation),第7卷，第287頁(yè))、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化娃上或在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如DEAE上進(jìn)行的色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀和凝膠過(guò)濾(例如Sephadex G-75)。2. 2. Q-淀粉酶a -淀粉酶構(gòu)成一組存在于微生物和來(lái)自動(dòng)植物的組織中的酶。它們能夠水解糖原、淀粉、相關(guān)多糖和一些寡糖的a-l，4-糖苷鍵。盡管所有a-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它們的氨基酸序列有很大差異。不同的淀粉酶之間的序列同一性可能實(shí)質(zhì)上是不存在的，例如低于25 %。盡管存在相當(dāng)大的氨基酸序列變異，但是a -淀粉酶具有共同的整體拓?fù)鋵W(xué)模式，該拓?fù)淠Ｊ绞窃跍y(cè)定了來(lái)自不同物種的a -淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)后得到確定的。該共同的三維結(jié)構(gòu)揭示了三個(gè)結(jié)構(gòu)域(I)稱為結(jié)構(gòu)域A的“ TIM”桶，(2)稱為結(jié)構(gòu)域B的長(zhǎng)環(huán)區(qū)域，其插入于結(jié)構(gòu)域A中，和(3)稱為結(jié)構(gòu)域C的接近C端的區(qū)域，其含有具有Greek-key基序的特征性P _結(jié)構(gòu)。
“Termamyl樣” a-淀粉酶是指一組廣泛用于淀粉加工行業(yè)的a -淀粉酶。具有美國(guó)專利第6，440，716號(hào)的SEQ ID NO :2氨基酸序列的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) a -淀粉酶以商品名Termamyl 市售。Termamyl樣a -淀粉酶通常指
芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)產(chǎn)生的一組高度同源的a-淀粉酶。該組的其他成員包括來(lái)自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophi lus)(之前稱為脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus);這兩個(gè)名稱在本說(shuō)明書中可互用)和解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的a -淀粉酶以及衍自芽抱桿菌屬NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513和DSM9375的a -淀粉酶，所有這些在美國(guó)專利第6，440，716號(hào)和W095/26397中有詳細(xì)描述。盡管a-淀粉酶普遍含有上述的三個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是一些a-淀粉酶(如來(lái)自枯草芽孢桿菌的AmyE)的三維結(jié)構(gòu)不同于Termamyl樣a -淀粉酶。這些酶統(tǒng)稱為非Termamyl樣a-淀粉酶。出于本發(fā)明的目的，“AmyE”意指來(lái)自枯草芽孢桿菌的天然a -淀粉酶(EC3. 2.1.1 ;1，4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性的AmyE酶及其變體在2009年6月4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)12/478，266和12/478，368以及2009年6月5日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)12/479,427中公開(kāi)?？墒褂闷渌惺鄣牡矸勖?，例如TERMAMYL# 120-L、LC和SCSAN SUPER 、 SUPRA 及LIQUEZYME SC (可獲自諾和諾德公司(Novo NordiskA/s))，F(xiàn)UELZYME FL(可獲自戴維薩公司(Diversa))，以及 CLARASE L、SPEZYME FRED,SPEZYME ETHYL、GC626 和GZYME G997 (可獲自丹尼斯克美國(guó)公司杰能科分公司(Danisco, US, Inc.，Genencor Division))。2. 3.其他酶和酶組合在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在淀粉處理中的糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中也可加入其他的酶作為補(bǔ)充。這些輔助性的酶可包括蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質(zhì)酶、木聚糖酶和/或a-葡萄糖苷酶。參見(jiàn)例如WO 2009/099783。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知使用以上所列的酶的方法。本文公開(kāi)的葡糖淀粉酶可與任何其他酶組合使用。例如，葡糖淀粉酶可與淀粉酶(例如a -淀粉酶)組合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖化和/或發(fā)酵或者同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)過(guò)程使用葡糖淀粉酶和一種或多種非淀粉多糖水解酶。這些酶能夠水解復(fù)合碳水化合物聚合物如纖維素、半纖維素和果膠。非限制性例子包括纖維素酶(例如內(nèi)切和外切葡聚糖酶、
葡萄糖苷酶)、半纖維素酶(例如木聚糖酶)和果膠酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖化和/或發(fā)酵或者SSF過(guò)程使用葡糖淀粉酶、a -淀粉酶和一種或多種非淀粉多糖水解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖化和/或發(fā)酵或者SSF過(guò)程使用葡糖淀粉酶與植酸酶、蛋白酶、異淀粉酶和支鏈淀粉酶。在一些實(shí)施方案中，糖化和/或發(fā)酵或者SSF過(guò)程可使用至少兩種非淀粉多糖水解酶。在一些實(shí)施方案中，糖化和/或發(fā)酵或者SSF過(guò)程可使用至少三種非淀粉多糖水解酶。纖維素酶是能水解纖維素(P-l，4-D-葡聚糖鍵)和/或其衍生物(如磷酸溶脹纖維素)的酶組合物。纖維素酶包括如下分類外切纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和P -葡萄糖苷酶(BG) (EC3. 2. 191、EC3. 2.1. 4和EC3. 2.1. 21)。纖維素酶的例子包括來(lái)自以下各屬微生物的纖維素酶青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀菌屬(Fusarium)、高溫單孢菌屬(Thermomonospora)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、肉座菌屬(Hypocrea)、梭菌屬(Clostridium)、高溫單孢菌屬(Thermomonospore)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)和曲霉屬(Aspergillus)。為飼料應(yīng)用而出售的市售纖維素酶的非限制性例子有ROVABIO (安迪蘇公司(Adisseo))、NATUGRAIN (巴斯夫公司(BASF))、MULTTFECT bgl(丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor))和JECONASEti (AB酶制劑公司(AB Enzymes))。一些商業(yè)纖維素酶包括AGGELERASE氣也可使用US20060193897A1中描述的纖維素酶和內(nèi)切葡聚糖酶。3 -葡萄糖苷酶(纖維二糖酶)能將纖維二糖水解為單個(gè)單糖。各種3 -葡聚糖酶可在本發(fā)明中與植酸酶組合使用。P -葡聚糖酶(內(nèi)切纖維素酶分類EC3. 2.1. 4)也稱內(nèi)切葡聚糖酶1、II和III，其能攻擊纖維素纖維以釋放較小的纖維素片段，后者進(jìn)一步被外切纖維素酶攻擊以釋放葡萄糖?？捎糜诒景l(fā)明方法的商業(yè)P -葡聚糖酶包括aPT_lM./\SH@BG和OPTIMASH TBG (丹尼斯克美國(guó)公司杰能科分公司)。半纖維素酶是能降解半纖維素的酶。半纖維素涵蓋植物細(xì)胞壁中存在的多種比糖復(fù)雜但不如纖維素復(fù)雜的多糖。在一些實(shí)施方案中，木聚糖酶可在本發(fā)明方法中用作補(bǔ)充酶。任何合適的木聚糖酶都可用于本發(fā)明。水解木聚糖主鏈的木聚糖酶(例如內(nèi)切-￠-木聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 8))可來(lái)自細(xì)菌來(lái)源(例如芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、梭菌屬(Clostridium)、熱酸菌屬(Acidothermus)、小四抱菌屬(Microtetrapsora)或高溫單孢菌屬(Thermonospora))或者來(lái)自真菌來(lái)源(曲霉屬、木霉屬、鏈孢霉屬、鏈孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、青霉屬或鐮刀菌屬(參見(jiàn)例如EP473545 ;美國(guó)專利第5，612，055號(hào)；W0 92/06209 ；和TO 97/20920))?？捎糜诒景l(fā)明的木聚糖酶包括商業(yè)制劑(例如MULT1FECT*和FEEDTREAT Y5 (丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor) )、RONOZYME WX (諾和諾德公司(Novozymes A/S))和 NATUGRAIN WTTEAT* (巴斯夫公司(BASF))。在一些實(shí)施方案中，木聚糖酶是來(lái)自里氏木霉的木聚糖酶或者是來(lái)自里氏木霉的變體木聚糖酶，或者是EP1222256B1中描述的天生熱穩(wěn)定性木聚糖酶，以及是來(lái)自以下各屬微生物的其他木聚糖酶黑曲霉(Aspergillus flavus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、Neocallimastixpatriciarum、青霉屬的物種、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)、熱紫鏈霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)、褐色高溫單抱菌(Thermomonospora fusca)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和綠色木霉(Trichodermaviridae)。

可使用的植酸酶包括那些能夠從肌醇六磷酸釋放至少一個(gè)無(wú)機(jī)磷酸的酶。植酸酶根據(jù)其對(duì)植酸分子上起始水解的磷酸酯基團(tuán)的特定位置的偏好性進(jìn)行分類(例如，分為3-植酸酶(EC3. 1.3.8)或分為6-植酸酶(EC3. 1.3. 26))。植酸酶的一個(gè)典型例子是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。植酸酶可獲自微生物如真菌和細(xì)菌(例如曲霉屬(例如黑曲霉、土曲霉(A. terreus)和煙曲霉(A. fumigatus))、毀絲霉屬(Myceliophthora)(嗜熱毀絲霉(M. thermophila))、籃狀菌屬(Talaromyces)(嗜熱籃狀菌(T. thermophilus))、木霉屬(里氏木霉)和嗜熱真菌屬(Thermomyces)(參見(jiàn)例如W099/49740))。植酸酶還可獲自青霉屬的物種(例如P. hordei (參見(jiàn)例如ATCC No. 22053)、檜狀青霉(P. piceum)(參見(jiàn)例如ATCC No. 10519)或者短密青霉(P. brev1-compactum)(參見(jiàn)例如ATCCNo. 48944)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第6，475，762號(hào))。另外的可用于本發(fā)明的植酸酶可獲自隔孢伏革菌屬(Peniophora)、大腸桿菌(E. coli)、枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterbacter)和布丘氏菌屬(Buttiauxella)(參見(jiàn)例如2005年10月17日提交的W02006/043178)。另外的可用于本發(fā)明的植酸酶可從商業(yè)來(lái)源獲得(例如NATlfPHOS (巴斯夫公司(BASF))、RONOZYME P (諾維信公司(Novozymes A/S))、PHZYME (丹尼斯克公司(Danisco A/S)、戴維薩公司(Diversa))和F1NASE (AB酶制劑公司(ABEnzymes))。各種酸性真菌蛋白酶(AFP)也可用作該組合的一部分。酸性真菌蛋白酶包括例如那些獲自曲霉屬、木霉屬、毛霉屬和根霉屬如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉的蛋白酶。AFP可衍自細(xì)菌、植物和真菌來(lái)源的異源或內(nèi)源蛋白質(zhì)表達(dá)。可使用從木霉屬的菌株分泌的IAFP。合適的AFP包括天然野生型AFP以及變體AFP和遺傳工程突變AFP。一些可用于本發(fā)明的商業(yè)AFP酶包括FERMGEN (丹尼斯克美國(guó)公司杰能科分公司(DaniscoUS, Inc.，Genencor Division))和FORMASE 200。蛋白酶也可與葡糖淀粉酶和任何其他酶的組合一起使用?？墒褂萌魏魏线m的蛋白酶。蛋白酶可衍自細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源。細(xì)菌蛋白酶的來(lái)源包括來(lái)自芽孢桿菌屬(例如解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、遲緩芽孢桿菌(B.1entus)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis))的蛋白酶。示例性的蛋白酶包括但不限于枯草桿菌蛋白酶，如可獲自解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(美國(guó)專利第4，760，025號(hào))o合適的商業(yè)蛋白酶包括MULTIFECT P3000 (丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor))和SUMIZYME FP (新日本公司(Shin Nihon))。合適的真菌蛋白酶的來(lái)源包括但不限于 例如木霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬和青霉屬。也可將脫支酶如異淀粉酶(EC3. 2.1. 68)或支鏈淀粉酶(EC3. 2.1. 41)與葡糖淀粉酶組合用于本發(fā)明的糖化和/或發(fā)酵或者SSF過(guò)程。可使用的支鏈淀粉酶的非限制性例子是 Pn)mo/:ynic. 03.淀粉加工3.1.淀粉底物和原料本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可供用于制備在本文公開(kāi)的過(guò)程中使用的淀粉底物。例如，可用的淀粉底物可獲自塊莖、根、莖、豆類、谷類或全谷。更具體而言，顆粒淀粉來(lái)自能生產(chǎn)大量淀粉的植物。例如，顆粒淀粉可獲自玉米、小麥、大麥、黑麥、買羅高梁、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高梁、大米、豌豆、豆(bean)、香蕉或馬鈴薯。玉米含有約60-68%淀粉；大麥含有約55-65%淀粉；小米含有約75-80%淀粉；小麥含有約60-65%淀粉；精白米含有約70-72%淀粉。具體設(shè)想到的淀粉底物有玉米淀粉、小麥淀粉和大麥淀粉。來(lái)自谷類的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗軸。淀粉可以是來(lái)自淀粉精制過(guò)程的高度精制的生淀粉或原料。各種淀粉也可市售獲得。例如，玉米淀粉可獲自Cerestar公司、西格瑪公司(Sigma)和日本片山化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(Katayama Chemical Industry Co.);小麥淀粉可獲自西格瑪公司(Sigma);甘薯淀粉可獲自日本的和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(Wako Pure Chemical Industry Co.);馬鈴薯淀粉可獲自日本的 Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.。3. 2.碾磨淀粉底物可以是來(lái)自經(jīng)碾磨的全谷的粗淀粉，全谷含有非淀粉級(jí)分例如殘胚和纖維。碾磨可包括濕磨或干磨。在濕磨中，可將全谷浸泡在水或稀酸中，以將谷粒分離為其組分，例如淀粉、蛋白質(zhì)、胚芽、油、籽粒纖維。濕磨能有效地分離胚芽和粗粉(即淀粉顆粒和蛋白質(zhì))，并可尤其適合于生產(chǎn)糖漿。在干磨中，將全籽粒研磨成細(xì)粉并在不將谷粒分級(jí)為其組分的情況下進(jìn)行加工。干磨谷粒因此除了包含淀粉外還將包含大量的非淀粉碳水化合物。大部分的乙醇來(lái)自干磨?；蛘撸庸さ牡矸劭梢詾楦叨染频牡矸圪|(zhì)量，例如至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99. 5%純。3. 3.糊化和液化在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可使用糊化和/或液化。本文所用的術(shù)語(yǔ)“液化”意指將淀粉轉(zhuǎn)化為粘性較小且鏈長(zhǎng)較短的可溶性糊精的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，這個(gè)過(guò)程涉及在進(jìn)行淀粉糊化的同時(shí)添加a-淀粉酶或者或隨后添加a-淀粉酶?？扇芜x添加另外的液化促進(jìn)酶，如植酸酶。在一些實(shí)施方案中，不使用糊化。在其他實(shí)施方案中，不使用單獨(dú)的液化步驟?？稍谶M(jìn)行糖化和/或發(fā)酵的同時(shí)使淀粉轉(zhuǎn)化為較短的鏈。在一些實(shí)施方案中，淀粉被直接轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在其他實(shí)施方案中，在糖化之前使用單獨(dú)的液化步驟。在一些實(shí)施方案中，可將如上所述制備的淀粉底物用水調(diào)成漿液。淀粉漿液含有的淀粉以干物質(zhì)重量百分比計(jì)可為約10-55 %、約20-45%、約30-45%、約30-40%或約30-35%。在一些實(shí)施方 案中，淀粉漿液為至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%或至少約55%。為優(yōu)化a-淀粉酶穩(wěn)定性和活性，可將漿液的pH調(diào)整至a-淀粉酶的最適pH。液化后在漿液中剩余的a -淀粉酶可通過(guò)在后一反應(yīng)步驟中降低pH或者通過(guò)從漿液移除鈣來(lái)使其失活。當(dāng)使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶時(shí)，應(yīng)將漿液的PH調(diào)整至中性pH (例如pH5. 0-8. 0及這個(gè)范圍內(nèi)的任何pH)?？蓪⒌矸奂觓 -淀粉酶的漿液連續(xù)泵送經(jīng)過(guò)噴射蒸煮器，該噴射蒸煮器可被蒸汽加熱到約85°C至最高約105°C。在這些條件下糊化發(fā)生得非常快，并且酶活性與極大的剪切力相結(jié)合開(kāi)始淀粉底物的水解。在噴射蒸煮器中的停留時(shí)間可非常短暫?？墒菇?jīng)部分糊化的淀粉穿過(guò)維持在約85-105°C下的一系列保溫管并保溫約5分鐘以完成糊化過(guò)程。這些罐可具有擋板以阻止回流混合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“第二液化”指跟在第一液化后面的液化步驟，此時(shí)讓漿液冷卻到室溫。這個(gè)冷卻步驟可為約30分鐘至約180分鐘，例如約90分鐘至120分鐘。經(jīng)碾磨和液化的谷粒也被稱為糊料(mash)。3.4.糖化在液化后，可將糊料通過(guò)糖化進(jìn)一步進(jìn)行水解以產(chǎn)生在下游應(yīng)用中可容易使用的可發(fā)酵糖。本發(fā)明實(shí)施方案的糖化可通過(guò)使用如上所述的葡糖淀粉酶在5. 0-8. 0,5. 5-7. 5、
6.0-7. 5、6. 5-7. 5或7. 0-7. 5范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，所用的pH可為5. 0、
5.25、5. 50、5. 75、6. 0、6. 50、7. 0、7. 50 或 8. O。在一個(gè)實(shí)施方案中，在pH6. 0或6. 0以上，葡糖淀粉酶相對(duì)于其在最適pH下的最大活性具有至少約50%、約51%、約52%、約53%、約54%或約55%活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于6. 0-7. 5的pH范圍，HgGA相對(duì)于其最大活性可具有至少53%活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在pH6. 0下，TrGA相對(duì)于其最大活性可具有至少50%活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)在pH7.0下具有最大活性的67%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)在pH5. 25下具有最大活性的66%。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶的用量可在約0. 2-2. OGAU/g dss (干物質(zhì)淀粉)、約0. 5-1.5GAU/g dss或1.0-1.5GAU/g dss的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)可以按約l-5GAU/g dss的用量使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)可以按約 lGAU/gdss、 2GAU/g dss、3GAU/g dss、4GAU/g dss 或 5GAU/g dss 的用量使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)可以按約0. 25-lGAU/g dss的用量使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)可以按約0. 25GAU/g dss、0. 5GAU/g dss、0. 75GAU/g dss或IGAU/g dss的用量使用。糖化可在約30至約60°C或約40至約60°C下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，糖化在32°C、pH7.0下進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，糖化在58°C、pH6. 5下進(jìn)行。完整的糖化步驟通常可在24-96小時(shí)、24-72小時(shí)或24-48小時(shí)的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，糖化在約 2、4、6、7. 7、8、110、14、16、18、20、22、23. 5、24、26、28、30、31. 5、34、36、38、40、42、44、46或48小時(shí)后進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，糖化步驟和發(fā)酵步驟組合在一起，這個(gè)過(guò)程被稱為同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)。認(rèn)識(shí)到，通常隨著時(shí)間的推移，酶(葡糖淀粉酶加上或不加上其他其他酶如a -淀粉酶或非淀粉多糖水解酶)將高級(jí)糖還原為低聚合度(DP)糖(如DPI)。可通過(guò)使用不同的參數(shù)來(lái)改變糖譜(sugar profile),所述參數(shù)例如但不限于起始淀粉底物、溫度、葡糖淀粉酶的量、葡糖淀粉酶的類型和pH。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于HgGA，在32攝氏度和pH7. 0下，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約0. 36%至約96. 50% DP1、約3. 59%至約11.80%DP2J4 0. 12%至約7.75%、和/或約2. 26%至約88. 30%高級(jí)糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于TrGA，在32攝氏度和pH7. 0下，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖分布可為約0. 36%至約 79. 19% DP1、約 3. 59%至約 9. 92% DP2、約 0. 17%至約 9. 10% DP3 和 / 或約 17. 15%至約88. 30%高級(jí)糖。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用HgGA，在24小時(shí)后DPl含量可達(dá)到超過(guò)90%。在45小時(shí)后，DPl含量可達(dá)到超過(guò)96%，而高級(jí)糖的含量可降低到低于3%。使用TrGA，可在24小時(shí)后獲得超過(guò)70% DPI。在45小時(shí)后，DPl含量可達(dá)到約80%，而高級(jí)糖的含量可下降到低于20%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于HgGA，在58攝氏度和pH6. 5下，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖分布可為約 60. 66%至約 93. 67% DP1、約1. 49%至約 8. 87% DP2、約 0. 33%至約1. 93%DP3和/或約4. 51%至約28. 17%高級(jí)糖。在其他實(shí)施方案中，對(duì)于TrGA，在58攝氏度和PH6. 5下，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約37. 08%至約75. 25% DP1、約5. 48%至約10. 19% DP2、約0. 46%至約5. 06%、和/或約18. 37%至約47. 47%高級(jí)糖。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用HgGA，在24小時(shí)后DPl含量可達(dá)到超過(guò)90%。在48小時(shí)后，DPl含量可達(dá)到超過(guò)93%，而高級(jí)糖的含量可降低到低于5 %。使用TrGA，可在24小時(shí)后獲得超過(guò)70% DPl0在45小時(shí)后，DPl含量可達(dá)到約75%，而高級(jí)糖的含量可下降至約18%。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，在58攝氏度和pH6. 5下，本文公開(kāi)的葡糖淀粉酶可用來(lái)糖化其中高級(jí)糖(例如DP4+)減少的淀粉底物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于TrGA，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約81. 10%至約90. 36% DP1、約1. 99%至約3. 96% DP2、約0. 49%至約0.61% DP3、約4. 48%至約16. 13% DP4+。在其他實(shí)施方案中，對(duì)于HgGA，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約93. 15%至約95. 33% DP1、約2. 10%至約3. 94% DP2,約 0. 53%至約1. 00% DP3、約 0. 94%至約 3. 76% DP4+。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于HgGA,在58攝氏度和pH6. 4下,糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約93. 79%至約96. 9% DP1、約1. 55%至約3. 02% DP2、約0. 2%至約0. 49% DP3和約0%至約3. 98% DP4+。在一些情況中，在24小時(shí)內(nèi)可達(dá)到約93%溶解度和約96. 9%葡萄糖產(chǎn)量。繼續(xù)糖化可在約48小時(shí)后達(dá)到99%溶解度和約96. 8%葡萄糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在58攝氏度和pH6. 4下，糖化過(guò)程過(guò)程中的糖或寡糖分布可為約 75. 08%至約 96. 5% DP1U. 57%至約 9. 16% DP2、0. 67%至約 15. 76% DP3+。在一些情況中，HgGA在pH6. 4下可維持大量的葡糖淀粉酶活性長(zhǎng)達(dá)約52小時(shí)，以持續(xù)地產(chǎn)生DPl產(chǎn)物、DP2產(chǎn)物和提高可溶性固形物的百分比。增加HgGA的量可導(dǎo)致溶解百分比和DPl生成的速率提聞。3.5.發(fā)酵在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中`，可使可發(fā)酵糖經(jīng)歷分批或連續(xù)發(fā)酵條件。傳統(tǒng)的分批發(fā)酵是在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)設(shè)定，并且在發(fā)酵過(guò)程中不進(jìn)行人為改變。因此，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，可用所需的生物體接種培養(yǎng)基。在這個(gè)方法中，可在不向系統(tǒng)中添加任何組分的情況下讓發(fā)酵進(jìn)行。通常，分批發(fā)酵是就添加碳源而言謂之“分批”，而常常會(huì)嘗試對(duì)諸如PH和氧濃度的因素進(jìn)行控制。直到發(fā)酵停止之時(shí)，分批系統(tǒng)的代謝物和生物量組成都不斷地變化。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞經(jīng)靜息遲滯期進(jìn)入高速對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最終到達(dá)生長(zhǎng)速率降低或停止的穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細(xì)胞如果不加以處理就會(huì)最終死亡。一般而言，是對(duì)數(shù)期的細(xì)胞導(dǎo)致終產(chǎn)品的大量產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一種變型是“補(bǔ)料分批發(fā)酵”系統(tǒng)，其可在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中使用。在典型的分批系統(tǒng)的這個(gè)變型中，可隨著發(fā)酵的進(jìn)行以增量的形式(inincrements)添加底物。在分解代謝物阻遏傾向于抑制細(xì)胞的代謝時(shí)和在需要在培養(yǎng)基中具有有限量的底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)特別有用。補(bǔ)料分批系統(tǒng)中實(shí)際底物濃度的測(cè)量可能是困難的，因此根據(jù)諸如pH、溶氧、廢氣(如CO2)分壓的可測(cè)量因素的變化進(jìn)行估計(jì)。分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵都是本領(lǐng)域普通且公知的。另一方面，連續(xù)發(fā)酵是開(kāi)放系統(tǒng)，其中限定的發(fā)酵培養(yǎng)基可連續(xù)添加到生物反應(yīng)器，并可同時(shí)移取等量的經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基進(jìn)行加工。連續(xù)發(fā)酵通常以恒定的高密度維持培養(yǎng)物，其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。連續(xù)發(fā)酵使得可以調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和/或終產(chǎn)品濃度的一個(gè)因素或多個(gè)因素。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以固定的速率維持限制性營(yíng)養(yǎng)物如碳源或氮源，同時(shí)讓所有其他參數(shù)調(diào)節(jié)。在其他系統(tǒng)中，可連續(xù)地改變多個(gè)影響生長(zhǎng)的因素，同時(shí)可保持細(xì)胞濃度(通過(guò)培養(yǎng)基濁度測(cè)量)恒定。連續(xù)系統(tǒng)旨在維持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件。因此，必須使由于移取培養(yǎng)基導(dǎo)致的細(xì)胞損失與發(fā)酵中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率保持平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子的方法以及使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域公知的。在另外的實(shí)施方案中，通過(guò)使用本領(lǐng)域知道的適當(dāng)發(fā)酵微生物，發(fā)酵終產(chǎn)品可包括但不限于酒精、1，3-丙二醇、琥珀酸、乳酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、功能寡糖以及它們的衍生物。參見(jiàn)例如WO 2008/086811(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇發(fā)酵)；W0 2003/066816、美國(guó)專利第5，254，467號(hào)和第6，303，352號(hào)(1，3_丙二醇發(fā)酵)；美國(guó)專利第RE37，393號(hào)、第6，265，190號(hào)和第6，596，521號(hào)(琥珀酸發(fā)酵);美國(guó)專利第5，464，760號(hào)、W02003/095659、Mercier等人，《化工技術(shù)與生物技術(shù)雜志》(J. Chem. Tech. Biotechnol.)，第55卷，第111-121 頁(yè)、Zhang 和 Cheryan,《生物技術(shù)通訊》(Biotechnol. Lett.),第 13 卷，第 733-738頁(yè)，1991 年、Linko 和 Javanainen,《酶微生物技術(shù)》(Enzyme Microb. Technol.),第 19 卷，第118-123頁(yè)，1996年、以及Tsai和Moon，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》(Appl. Biochem.Biotechnol.,第70-72卷,第417-428頁(yè)，1998年(乳酸發(fā)酵);美國(guó)專利第7，320, 882號(hào)、第7，332，309號(hào)、第7，666，634號(hào)、以及Zhang等人，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》(Appl.Microbiol. Biotechnol.)，第77卷，第355-366頁(yè)，2007年(各種氨基酸的發(fā)酵)。以上列舉的名單僅為例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道多種可適當(dāng)?shù)赜糜讷@得所需的終產(chǎn)品的發(fā)酵微生物。3.6.同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)在SSF過(guò)程中，將水 解酶隨同終產(chǎn)品生產(chǎn)者(通常為微生物)一起加入。酶從淀粉底物釋放可發(fā)酵的較低分子量糖類，即可發(fā)酵糖DP1-3，同時(shí)微生物利用可發(fā)酵糖進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)生終產(chǎn)品。通常，選定發(fā)酵條件，所述條件能提供用于促進(jìn)生產(chǎn)者即宿主細(xì)胞株的最佳生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的最適pH和溫度，并提供針對(duì)培養(yǎng)物所產(chǎn)生的酶的催化條件。參見(jiàn)例如Doran等人,《生物技術(shù)進(jìn)展》(Biotechnol. Progress)，第9卷，第533-538頁(yè)，1993年。表I顯示了示例性的發(fā)酵微生物和它們的最適發(fā)酵pH。由于本文公開(kāi)的葡糖淀粉酶在中性pH和高溫下具有顯著的活性，它們將可在SSF中用于那些具有在5. 5-7. 5范圍內(nèi)的最適發(fā)酵pH的微生物。
_6] 表1.示例性的發(fā)酵微生物及其最適pH。
權(quán)利要求
1.一種加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶存在下在PH5. 0-8. 0下將淀粉底物糖化成可發(fā)酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性,其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO :3的灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO :6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉屬物種(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述變體與所述親本葡糖淀粉酶相比具有一個(gè)氨基酸修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HgGA為SEQID NO :3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述HgGA從里氏木霉宿主細(xì)胞產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述TrGA為SEQID No :6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RhGA為SEQID NO :9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖化在6.0-7. 5范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖化在7.0-7. 5范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括將所述可發(fā)酵糖發(fā)酵成終產(chǎn)品，且其中糖化和發(fā)酵在相同的PH下進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中糖化和發(fā)酵作為同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)過(guò)程進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述SSF過(guò)程在7.0-7. 5之間的pH下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖化在約30°C至約60°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中糖化在約40°C至約60°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物為約15%-50%干物質(zhì)(DS)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物為約15%-30%干物質(zhì)(DS)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物為約15%-25%干物質(zhì)(DS)。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述終產(chǎn)品選自甲醇、乙醇、丁醇、谷氨酸一鈉、琥珀酸、1，3_丙二醇、維生素、氨基酸和乳酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述終產(chǎn)品為乙醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述終產(chǎn)品為1，3_丙二醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述終產(chǎn)品為琥珀酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物為顆粒淀粉或液化淀粉。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在約0.1至約2. OGAU/克干物質(zhì)淀粉的范圍內(nèi)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在約0.2至約1. OGAU/克干物質(zhì)淀粉的范圍內(nèi)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在約0.5至1. OGAU/克干物質(zhì)淀粉的范圍內(nèi)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括加入a-淀粉酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述a-淀粉酶為來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)的物種，或?yàn)槠渥凅w。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述a-淀粉酶為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) a -淀粉酶(AmyE)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) a _ 淀粉酶、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus) a -淀粉酶或其變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物來(lái)自玉米、小麥、黑麥、大麥、高粱、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、馬鈴薯以及它們的任何組合。
29.—種加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一種其他酶存在下在PH5. 0-8. 0下將淀粉底物糖化成可發(fā)酵糖， 其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO 3的灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉屬物種葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，且 其中所述其他酶選自蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質(zhì)酶、木聚糖酶和a -葡萄糖苷酶。
30.一種加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一種其他非淀粉多糖水解酶存在下在PH5. 0-8. 0下將淀粉底物糖化成可發(fā)酵糖， 其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相對(duì)于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO :3的灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉屬物種葡糖淀粉酶(RhGA)以及它們的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，且 其中所述非淀粉多糖水解酶選自纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施例涉及通過(guò)糖化和/或發(fā)酵從淀粉底物生產(chǎn)下游產(chǎn)品如可發(fā)酵糖和終產(chǎn)品的過(guò)程。糖化由葡糖淀粉酶在5.0-8.0范圍內(nèi)的pH下有效催化。在pH6.0或6.0以上，葡糖淀粉酶相對(duì)于其最大活性具有至少50％活性。糖化和發(fā)酵可作為同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)過(guò)程進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12P7/06GK103068997SQ201180039681
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者M·H·貝里斯瑪, G·K·肖塔尼, W·A·奎瓦斯, 段鋼, S·H·李, 錢瑩, V·夏爾馬, J·K·謝蒂, B·A·斯托姆, P·J·M·特伊尼森, H·徐 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司