專利名稱：包含磷酸酮醇酶的重組宿主細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及エ業(yè)微生物領域。本發(fā)明涉及重組宿主細胞，其包含(i)編碼多肽的內源性基因中的修飾，所述多肽將丙酮酸轉化為こ酰_CoA、こ醛或こ酰-磷酸，和(ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明也涉及重組宿主細胞，其包含
(i)編碼具有丙酮酸脫羧酶(PDC)·活性的多肽的內源性基因中的修飾或具有PDC活性的內源性多肽中的修飾，和(ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明也涉及重組宿主細胞，其還包含(iii)編碼具有磷酸轉こ酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。此外，本發(fā)明涉及制備和使用此類重組宿主細胞的方法，包括例如增加細胞生長的方法、降低或消除細胞生長對外源碳底物的需求的方法、増加葡萄糖消耗的方法、以及增加產生利用丙酮酸的途徑的產物的方法。
背景技術：
全球對液態(tài)運輸燃料的需求預計將對實現某些環(huán)境方面驅動的目標的能力造成壓力，例如石油儲量的保持和溫室氣體排放的限制。此類需求驅動了科技的發(fā)展，其允許利用可再生資源以減少石油儲量的消耗和并盡量減少溫室氣體的排放。丁醇是ー種重要的エ業(yè)化學品，其可用作燃料添加剤、塑料エ業(yè)中的化學原料以及食品和香料エ業(yè)中的食品級提取劑。毎年，通過石油化學手段生產100至120億磅的丁醇，并且對該日用化學品的需求將來很可能還會增加?；瘜W合成的異丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氫化(Ullmann’ sEncyclopedia of Industrial 01611118廿7,第6版，2003,￥;[167~\01 Verlag GmbH and C0.,ffeinheim, Germany,第5卷,第716-719頁)和甲醇與正丙醇的格爾伯特縮合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A:Chem.220:215-220，2004)。這些エ藝利用衍生自石油化學產品的起始材料并通常昂貴，并且對環(huán)境不友好。用衍生自植物的原材料生產異丁醇將會使溫室氣體排放達到最低程度并將代表本領域的進步。2- 丁酮，也被稱為甲基こ基酮(MEK)，是被廣泛使用的溶剤，并且是繼丙酮之后最重要的商品化生產的酮。它被用作用于漆料、樹脂和粘合劑的溶剤、以及選擇性提取劑、氧化反應的活化劑，并且它可在催化劑的存在下通過與氫反應而化學地轉化為2- 丁醇(Nystrom, R.F.和 Brown,ff.G.(J.Am.Chem.Soc.(1947)69:1198)。2, 3- 丁ニ醇可被用于丁烯和丁ニ烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油獲得)的化學合成中，并且2，3-丁ニ醇的酯可被用作增塑劑(Voloch等人,“Fermentation Derived2, 3-Butanediol, ”Comprehensive Biotechnology,Pergamon Press Ltd.,England,第 2 卷，第 3 節(jié):933-947(1986))。微生物可被工程化以表達生物合成途徑，其起始利用細胞的丙酮酸來產生，例如2，3- 丁二醇、2- 丁酮、2- 丁醇和異丁醇。美國專利公開7，851，188公開了用于生產異丁醇的工程化重組微生物。美國專利申請公布US200702594IOAl和US20070292927A1公開了用于產生2-丁酮或2-丁醇的重組微生物的工程化。公開了多個用于異丁醇和2-丁醇的生物合成的途徑，它們全部從細胞的丙酮酸開始。丁二醇是美國專利申請公布US20070292927A1公開的2- 丁醇途徑中的中間體。在工程化表達利用丙酮酸的生物合成途徑的重組宿主細胞中，對丙酮酸脫羧酶(PDC)的破壞可用于提高丙酮酸的可用性，其用于經由生物合成途徑的產物形成。例如，美國專利申請公布US20070031950A1公開了帶有一種或多種丙酮酸脫羧酶基因的破壞(PDC敲出或HXH(O)并且表達D-乳酸脫氫酶基因的酵母菌株，其被用于生產D-乳酸。美國專利申請公布US20050059136A1公開了沒有丙酮酸脫水酶活性的葡萄糖耐受的不依賴二碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脫氫酶基因。Nevoigt和Stahl(Yeastl2:1331-1337 (1996))描述了在啤酒糖酵母中降低的丙酮酸脫羧酶和提高的NAD-依賴的甘油-3-磷酸脫氫酶對甘油產量的影響。美國專利申請20090305363A1公開了通過工程化酵母以表達定位于胞質的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脫羧酶活性而提高的丙酮酸至乙酰乳酸的轉化。盡管roc-KO重組宿主細胞可用于生產利用丙酮酸生物合成途徑的產物，PDC-KO重組宿主細胞需要外源的碳底物補充(例如，乙醇或乙酸)用于它們的生長(Flikweert 等人，1999, FEMS Microbiol.Lett.174 (I):73-79 “Growth requirementsof pyruvate-decarboxylase-negative Saccharomyces cerevisiae，，)。在帶有一個或多個編碼丙酮酸脫氫酶基因突變的大腸桿菌菌株中觀察到了類似的營養(yǎng)缺陷型(Langley和Guest, 1977, J.Gen.Microbiol.99:263-276)。 在商業(yè)應用中，在轉化為所需產物的底物中額外加入外源碳底物可能會導致成本增加。本領域仍存在對于重組宿主細胞的需求，其降低了或消除了對外源碳底物補充的需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個方面涉及重組宿主細胞，其包含(i)編碼多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換，所述多肽將丙酮酸轉化為乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA ;和編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及此類重組宿主細胞，其還包含(iii)編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。在多個實施方案中，所述將丙酮酸轉化為乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脫羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶。本發(fā)明的一個方面涉及重組宿主細胞，其包含(i )編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中或具有丙酮酸脫羧酶活性的內源性多肽中的修飾jP(ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及此類重組宿主細胞，其還包含(iii)編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明的一個方面涉及重組宿主細胞，其包含(i )編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換jP(ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及重組宿主細胞，其還包含:(iii)編碼具有磷酸轉こ酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及與包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重組真核宿主細胞相比，所述宿主細胞在培養(yǎng)物中的生長對外源ニ碳底物具有降低或消除的需求。本發(fā)明的另一方面涉及在不補充外源ニ碳底物的培養(yǎng)基中此類宿主細胞的生長情況與在補充外源ニ碳底物的培養(yǎng)基中包含(i)且不包含(ii)或(iii)的宿主細胞的生長速率基本上相等的或更高。本發(fā)明的ー個方面，所述重組宿主細胞是下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、志賀氏菌屬(Shigella)、紅球菌屬(Rhodococcus )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產喊菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、紐桿菌屬(Brevibacterium)、裂通酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、畢赤 酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)或糖酵母屬(Saccharomyces)。在本發(fā)明的另一方面，所述重組宿主細胞是啤酒糖酵母(b.cerevisiaeノ。在本發(fā)明的另一方面中，所述重組宿主細胞表達利用丙酮酸的生物合成途徑，其包括例如用于生成如2，3-丁ニ醇、異丁醇、2-丁醇、2-丁酮、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸或異戊醇產物的生物合成途徑。本發(fā)明的另一方面涉及在所述重組宿主細胞中表達異丁醇生物合成途徑，所述重組宿主細胞包含編碼多肽的至少ー種DNA分子，所述多肽催化選自下列的底物至產物的轉化:(i )丙酮酸至こ酰乳酸的轉化；(i i )こ酰乳酸至2，3- ニ羥基異戊酸的轉化；(iii) 2，3- ニ羥基異戊酸至2-酮異戊酸的轉化；(iv)2-酮異戊酸至異丁醛的轉化；以及(V)異丁醛至異丁醇的轉化。本發(fā)明的另一方面涉及在所述重組宿主細胞中表達2- 丁酮生物合成途徑，所述重組宿主細胞包含編碼多肽的至少ー種DNA分子，所述多肽催化選自下列的底物至產物的轉化:(i)丙酮酸至こ酰乳酸的轉化的轉化；(ii)こ酰乳酸至こ偶姻的轉化；(iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的轉化；以及(1パ2，3-丁ニ醇至2-丁酮的轉化。本發(fā)明的另一方面涉及在所述重組宿主細胞中表達2-丁醇生物合成途徑，所述重組宿主細胞包含編碼多肽的至少ー種DNA分子，所述多肽催化選自下列的底物至產物的轉化:(i)丙酮酸至こ酰乳酸的轉化；(ii)こ酰乳酸至こ偶姻的轉化；(iii)こ偶姻至2，3- 丁ニ醇的轉化；(iv) 2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的轉化；以及(V) 2- 丁酮至2- 丁醇的轉化。本發(fā)明的ー個方面涉及生產產物的方法，所述產物選自2，3-丁ニ醇、異丁醇、2_ 丁醇、2-丁酮、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸和異戊醇，所述方法包括使本文所述的重組宿主細胞在產生所述產物的條件下生長且任選地回收所述產物。本發(fā)明的另一方面涉及制備重組宿主細胞的方法，所述方法包括用(i )編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸；以及任選地(ii)編碼具有磷酸轉こ酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少ー個缺失、突變和/或替換。
本發(fā)明的另一方面涉及改善重組宿主細胞的生長的方法，所述重組宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換，所述方法包括(i )用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞；以及任選地(ii)用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。在多個實施方案中，所述方法還包括使所述重組宿主細胞在包含限制的碳底物的培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明的另一方面涉及降低重組宿主細胞的生長對外源二碳底物的需求的方法，所述重組宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換，所述方法包括(i)用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞；以及任選地(ii)用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。 本發(fā)明的另一方面涉及消除重組宿主細胞的生長對外源二碳底物的需求的方法，所述重組宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換，所述方法包括(i)用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞；以及任選地(ii)用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述宿主細胞。本發(fā)明的另一方面涉及增加所述重組宿主細胞中磷酸酮醇酶途徑的活性的方法，所述方法包括(i )提供本發(fā)明的重組宿主細胞；以及(i i )使所述重組宿主細胞在增加所述重組宿主細胞中磷酸酮醇酶途徑的活性的條件下生長。在另一方面，所述重組宿主細胞包含磷酸酮醇酶，所述磷酸酮醇酶以小于
7.5E-242的E值匹配表6中給出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸酮醇酶與SEQ IDN0:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一個具有至少約40%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶與SEQID N0:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一個具有至少約90%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242U.1E-124、
2.1E_49、7.8E-37的E值分別匹配表6、7、8和9中給出的序型HMM。在另一方面，所述重組宿主細胞還包含磷酸轉乙酰酶，所述磷酸轉乙酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中給出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸轉乙酰酶與SEQ ID N0:1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159或1129具有至少約40%的同一性。在另一方面，所述磷酸轉乙酰酶與SEQID NO: 1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159 或 1129 具有至少約 90% 的同一性。


以及提供的序列表和表格本發(fā)明的各種實施方案可通過詳細的描述、附圖和并入的序列描述更充分的理解，這也是本專利申請的一部分。圖1描繪了磷酸酮醇酶途徑的示意圖，其包括磷酸酮醇酶和磷酸轉乙酰酶。圖2描繪了沒有外源碳底物補充的表達磷酸酮醇酶和磷酸轉乙酰酶的I3DC-KO酵母菌株的生長情況。圖3描繪了沒有外源碳底物補充的表達磷酸酮醇酶和/或磷酸轉乙酰酶的I3DC-KO酵母菌株的生長情況。圖4描繪了磷酸乙酰轉移酶(PTA)和磷酸丁酰轉移酶(PTB)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。采用默認參數用Clustal X進行多重序列比對。采用鄰接法推導系統(tǒng)發(fā)育樹并用Mega4軟件繪制。標記的序列如下:(編號，菌種，GI號)1，腸道沙門氏菌(S.enterica)，56412650 ；2，大腸桿菌(E.coli)K12,88192043 ;3，小韋榮菌(V.parvula), 227371784 ;4，克魯氏梭狀芽抱桿菌(C.kluyveri), 153954015 ；5,丙麗丁醇梭菌(C.Acetobutylicum), 15895019 ;6，熱纖梭菌(C.thermocellum), 196254011 ;7，甲燒八疊球菌(M.thermophila),88192043 ;8，化膿性鏈球菌(S.pyogenes), 48425286 ;9，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，58176784 ;10，發(fā)酵乳酸桿菌(L.fermentum), 227514417 ;11，植物乳桿菌(L.plantarum)，28377658 ;12，舊金山乳桿菌(L.sanfranciscensis), 11862872。圖5是本文所述的pRS426::GPD_xpkl+ADH_eutD質粒圖譜。圖6描繪的是BP913整合了磷酸酮醇酶途徑載體(本文所述)后的Apdcl::1lvD(Sm)基因座。圖7A顯示了在不存在こ醇和存在こ醇以及不存在和存在所述磷酸酮醇酶途徑(xpk)條件下產異丁醇菌株的生長情況。IS01、IS02和IS03是指平行測定。圖7B顯示了來自圖7A的菌株第二次傳代培養(yǎng)的生長情況。表6、7、8、9和14為本文所述序型HMM的表格。表6、7、8、9和14為隨同文件電子提交的，并以引用方式并入本文。根據下面的詳細描述和附帯的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細描述和所附的序列描述形成了本申請的一部分。隨同文件提供的序列表以引用方式并入本文并符合37C.F.R.1.821-1.825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則(Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide bequencesand/or Amino Acia sequenceDisclosures-the Sequence Rules)”)，并且與世界知識產權組織(WIPO)標準ST.25(2009)以及EPO和PCT的序列列表要求(規(guī)則5.2和49.5 (a-bis),以及行政指導的208節(jié)和附錄C)相一致。核苷酸的符號和格式以及氨基酸序列數據符合如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)則。電子提交的序列表的內容名稱:20110615_CL4871USNA_SeqList.txt ;大小:6.67MB ；和創(chuàng)建/修改日期:2011年6月9日/2011年6月15日全文以引用方式并入本文。SEQ ID NO: 1-20為PDC靶基因編碼區(qū)和蛋白質的序列。SEQ ID N0:21_638為磷酸酮醇酶靶基因編碼區(qū)和蛋白質的序列。SEQ ID N0:762_1885為磷酸轉こ酰酶靶基因編碼區(qū)和蛋白質的序列。SEQ ID NO: 1893-1897為雜合啟動子序列。SEQ ID N0:639-642、644-654、656-660、662-701-714、725-726、729-740、742-748和750-761為引物。SEQ ID NO:643 為載體 pRS426::GPD-xpkl+ADHl_eutD。SEQ ID NO:655 為 TEFlp-kan-TEFlt 基因。SEQ ID N0:661 為載體 pLA54。SEQ ID N0:715 為載體 pRS423::pGALl-cre。SEQ ID NO = 7I6 為載體 pLH468_sadB。

SEQ ID NO:717 和 718 為來自木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)sadB的氨基酸和核酸序列。
SEQ ID N0:719為來自乳酸乳球菌(L.lactis)的kivD編碼區(qū)。SEQ ID NO:720 為質粒 pRS425::GPM_sadB。SEQ ID NO: 721 為 GPM 啟動子。SEQ ID NO:722 為 ADHl 終止子。SEQ ID NO:723 為 GPM-sadB-ADHt 片段。SEQ ID N0:724 為 pUC19-URA3 質粒。SEQ ID NO:741 為 iIvD-FBAIt 片段。SEQ ID NO: 749 為 URA:3r2 模板 DNA。SEQ ID NO: 1886為來自變異鏈球菌(S.mutans)的iIvD編碼區(qū)。SEQ ID N0:1888 為載體 pLH468。SEQ ID NO:1898 為 pUC19_URA3::pdcl::GPD_xpkl+ADHl_eutD。SEQ ID NO: 1899-1906為經修飾的啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因座的序列。SEQ ID NO: 1907 是 pLH702 的序列。SEQ ID NO: 1908 是 pYZ067DkivDDhADH 的序列。SEQ ID NO: 1909 是 ALD6 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1910 是 K9D3 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1911 是 K9G9 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1912 是 YMR226c 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1913和1914是AFTl的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1915和1916是AFT2的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1917和1918是FRA2的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1919和1920是GRX3的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1921和1922是CCCl的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1923是來自Bei jerinkia indica的乙醇脫氫酶的氨基酸序列。
具體實施方式
申請人已通過降低或消除對于提供兩種底物的需求解決了所述問題，兩種底物中的一種底物被轉化為所需的產物，另一種底物被重組宿主細胞全部或部分地轉化為乙酰-CoA，所述重組宿主細胞需要此類用于生長的補充，在此類細胞中包含所述磷酸酮醇酶途徑多個酶的表達。一種此類酶，磷酸酮醇酶(酶學委員會編號EC4.1.2.9)，催化木酮糖-5-磷酸轉化為甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸(Heath等人，J.Biol.Chem.231:1009-29 ；1958)。另一種此類酶為磷酸轉乙酰酶(酶學委員會編號EC2.3.1.8)，其將乙酰-磷酸轉化為乙酸-CoA。申請人:已提供了 PDC-KO重組宿主細胞，其包含編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸和任選地編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。與PDC-KO細胞相比，對用于其生長的外源二碳底物此類細胞表現出降低的或消除了的需求。申請人還提供了制備和使用此類重組宿主細胞的方法，其包括例如增加細胞生長的方法、降低或消除細胞生長對外源碳底物的需求的方法、增加葡萄糖消耗的方法、以及增加產生利用丙酮酸的途徑的產物的方法。
除非另行定義，否則本文所用的所有科技術語的含義與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的一祥。如發(fā)生矛盾，以本專利申請(包括其定義)為準。除非上下文另有要求，単數術語應包括復數，并且復數術語應包括単數。本文提及的所有公布、專利和其它參考文獻出于各種目的全文以引用方式并入本文，如同每ー單獨的公布或專利申請均特定且個別地以引用方式并入一祥，除非僅專利或專利申請的特定部分被提及以引用方式并入本文。下文描述了合適的方法和材料，雖然在本發(fā)明的實施或試驗過程中也可以使用與本文所述的那些類似或等同的方法和材料。材料、方法和實施例僅是例示性的并且不旨在進行限制。根據具體實施方式
和權利要求，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將顯而易見。為了進一歩明確本發(fā)明，提供下列術語、縮寫和定義。如本文所用，術語“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其它變型g在是非排它的或可廣泛解釋的。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、エ藝、方法、制品或設備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、エ藝、方法、制品或設備固有的元素。此外，除非另外特別說明，否則“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何ー個均表示滿足條件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同樣，涉及元素或組分實例(即次數)的數目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞“ー個”或“ー種” g在是非限制性的。因此，應將“ー個”或“ー種”理解為包括一個或至少ー個，并且元素或組分的詞語單數形式也包括復數指代，除非有數字明顯表示単數。如本文所用，術語“發(fā)明 ”或“本發(fā)明”為非限制性術語，并且不g在意指本發(fā)明的任何單獨實施方案，而是涵蓋如專利申請所述的所有可能的實施方案。如本文所用，修飾本發(fā)明的成分或反應物的量使用的術語“約”是指可以通過例如以下方式而發(fā)生的用數字表示的量的變化:在真實世界中用于制備濃縮物或使用溶液的一般測量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異等等。術語“約”還包括由于產生自特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語“約”來修飾，權利要求包括量的等同量。在一個實施方案中，術語“約”指在報告數值10%范圍內，優(yōu)選地在報告數值5%范圍內。本文所用術語“丁醇”是指2- 丁醇、1- 丁醇、異丁醇或它們的混合物。術語“利用丙酮酸的生物合成途徑”是指從丙酮酸產生生物合成產物的酶途徑。術語“異丁醇生物合成途徑”是指從丙酮酸產生異丁醇的酶途徑。術語“2- 丁醇生物合成途徑”是指從丙酮酸產生2- 丁醇的酶途徑。術語“2- 丁酮生物合成途徑”是指從丙酮酸產生2- 丁酮的酶途徑。如本文所用，術語“pdc_”、“PDC敲除”或“PDC-K0”是指具有滅活或降低編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)的基因的表達的基因修飾，從而使該細胞基本上沒有或完全沒有丙酮酸脫羧酶酶活性。如果所述細胞具有多于ー種的表達的(活性的)PDC基因，則每個活性PDC基因可以被滅活或具有最小的表達從而產生Pdc-細胞。術語“碳底物”是指可被本文所公開的重組宿主細胞代謝的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的實例，包括但不限于單糖、寡糖、多糖、こ醇、乳酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、ニ氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖或它們的混合物。術語“外源二碳底物”是指提供的由缺乏將丙酮酸轉化為乙酰-CoA的能力的宿主細胞代謝為乙酰-CoA的碳源。這個術語用于區(qū)分碳底物，其通過利用丙酮酸的生物合成途徑轉化為丙酮酸衍生的產物，本文也指“途徑底物”，其包括例如葡萄糖。術語“多核苷酸”旨在包括單數的核酸以及復數的核酸，并且是指核酸分子或構建體例如信使RNA (mRNA)或質粒DNA (pDNA)。多核苷酸可包含全長cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻譯的5’和3’序列和編碼序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脫氧核糖核酸組成，其可為非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由單鏈和雙鏈DNA構成，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；單鏈和雙鏈RNA，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；包含DNA和RNA的雜合分子，其可為單鏈或，更典型地雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。“多核苷酸”包含了化學地、酶學地或代謝地改性的形式。多核苷酸序列可意為“分離的”，其中它從天然的環(huán)境中移除出來。例如，包含在載體中的編碼具有二羥酸脫水酶活性多肽或多肽片段的異源性多核苷酸，出于本發(fā)明的目的可被認為是分離的。分離的多核苷酸的另一個實例包括異源宿主細胞擁有的重組多核苷酸或溶液中的純化的(部分地或基本上)多核苷酸。根據本發(fā)明分離的多核苷酸或核酸還包括此類人工合成生產的分子。DNA聚合物形式的分離的 多核苷酸片段可由一個或多個cDNA、基因組DNA或合成DNA片段構成。術語“基因”指可被表達為特定蛋白質的核酸片段，其任選包括編碼序列前的調節(jié)序列(5’非編碼序列)和編碼序列后的調節(jié)序列(3’非編碼序列)?！疤烊换颉笔侵柑烊淮嬖诘木哂衅渥约旱恼{控序列的基因?！皟仍葱曰颉敝肝挥谏锏幕蚪M內它的天然位置的天然基因。“異源性基因”是指非天然存在于宿主生物中的但通過基因轉移導入所述宿主生物中的基因。“異源性基因”也包括原生的編碼區(qū)或它們的一部分，即以不同于對應的原生基因的形式重新導入源生物體。例如，異源性基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一個部分的天然編碼區(qū)，其中所述嵌合基因包括非天然的調控區(qū)。外來基因可以包含插入到非天然生物體內的天然基因或嵌合基因。如本文所用，術語“編碼區(qū)”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調控序列”指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、中間或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其可影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調控序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖環(huán)結構。如本文所用，術語“多肽”旨在涵蓋單數的“多肽”以及復數的“多肽”，并指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也被稱為肽鍵)線性連接組成的分子。術語“多肽”是指任何兩個或更多個氨基酸的鏈，并且不涉及產物的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“氨基酸鏈”或其它任何用于指由兩個或更多個氨基酸組成的一條鏈或多條鏈的術語，都包括在“多肽”的定義內，并且術語“多肽”可用于取代或與這些術語中任一項互換使用。多肽可來源于天然生物源或由重組技術產生，但不一定是由指定的核酸序列翻譯的。它可由任何方式生成，包括通過化學合成。以“分離的”多肽或片段形式的變體和其衍生物擬為不在其自然環(huán)境下的多肽。不需要特別的純化水平。例如，分離的多肽可從它原生的或天然的環(huán)境中去除。在宿主細胞中重組產生的多種多肽和蛋白質考慮以所述發(fā)明目的進行分離，即為原生的或重組的多肽，其已通過任何適宜的技術分離、分餾或部分或大幅純化。如本文所用，術語“變體”是指利用例如重組DNA技術(例如誘變)產生的，通過氨基酸的插入、缺失、突變和取代而不同于特異性地列舉的本發(fā)明的多肽的多肽。通過將特定多肽的序列與同源的多肽(例如酵母或細菌的)的序列進行比較，并使高度同源區(qū)域(保守區(qū)域)中進行的氨基酸序列改變的數量最小化，或通過用共有序列代替氨基酸，可發(fā)現用以確定哪些氨基酸殘基可以被取代、添加或缺失而不會破壞所關注的活性的指導。作為另外一種選擇，編碼這些相同或相似多肽的重組多核苷酸變體可以合成或通過利用遺傳密碼子的冗余而選出。各種密碼子取代，如產生各種限制性位點的沉默變化，可引入以優(yōu)化克隆到質粒表達載體或病毒表達載體。多核苷酸序列的多種突變可體現在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的結構域中以改變多肽中任意部分的性質。氨基酸“取代”可以是用具有相似的結構和/或化學特性的另ー種氨基酸取代一種氨基酸的結果，即保守的氨基酸取代，或它們可以是用具有不同的結構和/或化學特性的另ー種氨基酸取代一種氨基酸的結果，即非保守的氨基酸取代?！氨Ｊ氐摹卑被崛〈稍趨⑴c殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或兩親性本質相似性的基礎上進行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；并且?guī)ж撾姷?酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作為另外ー種選擇，“非保守”氨基酸取代可通過選擇這些氨基酸中任一項在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或兩親性本質的差異而進行?！安迦搿被颉叭笔А笨稍谥亟M蛋白質結構上或功能上耐受的變型范圍之內。通過系統(tǒng)地利用重組DNA技術產生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失或取代，并檢測所得重組變體的活性，可以以實驗方法確定所允許的變型。

術語“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般來講，編碼序列位于啟動子序列的3’端。啟動子可整個源于天然基因，或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領域的技術人員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或在不同的發(fā)育階段，或響應不同的環(huán)境條件或生理條件而指導基因的表達。通常將在大多數細胞類型中、在大多數情況下引起基因表達的啟動子稱為“組成型啟動子”。還應認識到因為在大多數情況下還不能完全確定調控序列的確切范圍，不同長度的DNA片段可可具有相同的啟動子活性。例如，應當理解，“ FBAl啟動子”可用于指來源于FBAl基因啟動子區(qū)的片段。如本文所用的術語“終止子”是指位于編碼序列下游的DNA序列。這包括多腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節(jié)信號的其它序列。多腺苷酸化信號通常表征為影響多腺苷酸片添加到mRNA前體的3’端。3'區(qū)可影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。應認識到，因為在大多數情況下還不能完全確定調控序列的確切范圍，因此不同長度的DNA片段可可具有相同的終止子活性。例如，應當理解，“CYCl終止子”可用于指來源于CYCl基因終止子區(qū)的片段。術語“可操作地連接”指單個核酸片段上的核酸序列的關聯，使得其中ー種核酸序列的功能受到另ー種核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即該編碼序列受到該啟動子的轉錄控制)吋，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以按有義或反義的取向可操作地連接至調控序列。如本文所用，術語“表達”指源于本發(fā)明核酸片段的有義RNA (mRNA)或反義RNA的轉錄和穩(wěn)定積聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。如本文所用，術語“過表達”是指比相同的或相關的基因的內源性表達更高的表達。如果異源性基因的表達比可比較的內源性基因的表達更高，則所述異源性基因是過表達的。如本文所用，術語“轉化”指將核酸片段轉移至宿主生物體內，導致基因穩(wěn)定遺傳。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為“轉基因”或“重組”或“轉化”生物體。如本文所用，術語“質粒”和“載體”是指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構建體中，該獨特構建體能夠將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列與相應的3’端非翻譯序列一起引入細胞中。如本文所用，術語“密碼子簡并性”指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的性質。技術人員非常了解具體宿主細胞在使用核苷酸密碼子以確定給定氨基酸時所表現出的“密碼子偏倚性”。因此，當合成基因用以改善在宿主細胞中的表達時
，希望對基因進行設計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細胞優(yōu)選的密碼子使用頻率。如它是指用于轉化各種宿主的基因或編碼區(qū)的核酸分子，術語“密碼子優(yōu)化的”是指在基因或編碼區(qū)的核酸分子中的密碼子改變，反映了在沒有改變DNA編碼的多肽情況下宿主生物典型的密碼子使用情況。此類優(yōu)化包括將至少一個或多于一個或顯著的數目的密碼子替換為在那種生物體中使用頻率更高的一個或多個密碼子。包含編碼任何多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的偏差，允許編碼該基因的序列中的變型。由于每一密碼子由三個核苷酸組成，而組成DNA的核苷酸限于四種特異性堿基，存在64種可能的核苷酸組合，其中的61種編碼氨基酸(其余三種密碼子編碼結束翻譯的信號)。本文將顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的“遺傳密碼”重制為表I。因此，許多氨基酸被分配了多于一種的密碼子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四種三聯體編碼，絲氨酸和精氨酸由六種，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一種三聯體編碼。這種簡并性允許DNA堿基組成在寬范圍內變化而不會改變由該DNA編碼的蛋白質的氨基酸序列。表1:標準遺傳密碼
權利要求
1.重組宿主細胞，包含: (i)編碼多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變或替換或它們的組合，所述多肽將丙酮酸轉化為乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-Cok ;和 (ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。
2.根據權利要求1所述的重組宿主細胞，其中所述將丙酮酸轉化為乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脫羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶。
3.根據權利要求1所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含: (iii)編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。
4.根據權利要求1所述的重組宿主細胞，其中與包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重組真核宿主細胞相比，所述宿主細胞在培養(yǎng)物中的生長對外源二碳底物具有降低的需求。
5.重組宿主細胞，包含: (i)編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換；和 (ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。
6.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含: (iii)編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。
7.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中與包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重組真核宿主細胞相比，所述宿主細胞在培養(yǎng)物中的生長對外源二碳底物具有降低的需求。
8.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中與包含(i)且不包含(ii)或(iii)的宿主細胞相比時，所述宿主細胞在不補充外源碳底物的培養(yǎng)基中具有改善的生長。
9.根據權利要求8所述的重組宿主細胞，其中所述外源二碳底物是乙醇或乙酸。
10.根據權利要求3所述的重組宿主細胞，包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換，其中所述至少一個缺失、突變和/或替換引起丙酮酸脫羧酶活性的降低或消除。
11.根據權利要求10中任一項所述的重組宿主細胞，其中所述編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因是roc1、PDC5、PDC6或它們的組合；并且所述宿主細胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)。
12.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸是來自植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的xpkl、來自戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) MD363 的 xpkA 或來自乳酸雙歧桿菌(B.1actis)的 6_ 憐酸磷酸酮醇酶。
13.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述具有磷酸酮醇酶活性的多肽與SEQID N0:481或其活性片段包含至少85%的同一性。
14.根據權利要求6所述的重組宿主細胞，其中所述編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸是來自植物乳桿菌的EutD或來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的磷酸轉乙酰酶。
15.根據權利要求6所述的重組宿主細胞，其中所述多肽與SEQID NO: 1472或其活性片段包含至少85%的同一性。
16.根據權利要求5中任一項所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞是下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serrat ia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、志賀氏菌屬(Shigella)、紅球菌屬(Rhodococcus )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產喊菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter )、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、裂通酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)或糖酵母屬(Saccharomyces)。
17.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞是啤酒糖酵母。
18.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，還包含利用丙酮酸的生物合成途徑，其中所述利用丙酮酸的生物合成途徑形成選自下列的產物:2，3- 丁ニ醇、2- 丁醇、2- 丁酮、纈氨酸、亮氨酸、乳酸、蘋果酸和異戊醇。
19.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，還包含利用丙酮酸的生物合成途徑，其中所述利用丙酮酸的生物合成途徑是異丁醇生物合成途徑，所述異丁醇生物合成途徑包括下列底物至產物的轉化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的轉化； (ii)こ酰乳酸至2，3-ニ羥基異戊酸的轉化； (iii)2，3- ニ羥基異戊酸至2-酮異戊酸的轉化； (iv)2-酮異戊酸至異丁醛的轉化；以及 (v)異丁醛至異丁醇的轉化；并且 其中所述重組宿主細胞產生異丁醇。
20.根據權利要求18所述的重組宿主細胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途徑是2- 丁酮生物合成途徑，所述2- 丁酮生物合成途徑包括下列底物至產物的轉化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的轉化； (ii)こ酰乳酸至こ偶姻的轉化； (iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的轉化；以及 (iv)2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的轉化；并且 其中所述重組宿主細胞產生2- 丁酮。
21.根據權利要求18所述的重組宿主細胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途徑是2- 丁醇生物合成途徑，所述2- 丁醇生物合成途徑包括下列底物至產物的轉化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的轉化； (ii)こ酰乳酸至こ偶姻的轉化； (iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的轉化； (iv)2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的轉化；以及 (v)2- 丁酮至2- 丁醇的轉化；并且 其中所述重組宿主細胞產生2- 丁醇。
22.生產2，3-丁ニ醇、2-丁醇、2-丁酮、纈氨酸、亮氨酸、乳酸、蘋果酸、丙氨酸、富馬酸、琥珀酸或異戊醇的方法，包括使權利要求18的重組宿主細胞在產生所述產物的條件下生長且任選地回收所述產物。
23.生產異丁醇的方法，包括使權利要求19的重組宿主細胞在產生所述產物的條件下生長且任選地回收所述產物。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述重組宿主細胞包含2-丁酮生物合成途徑，所述2- 丁酮生物合成途徑包含編碼多肽的至少一種DNA分子，所述多肽催化選自下列的底物至產物的轉化: (i)丙酮酸至乙酰乳酸的轉化； (ii)乙酰乳酸至乙偶姻的轉化； (iii)乙偶姻至2，3-丁二醇的轉化；以及 (iv)2，3- 丁二醇至2- 丁酮的轉化； 并且其中所述產物是2-丁酮。
25.根據權利要求22所述的方法，其中所述重組宿主細胞包含2-丁醇生物合成途徑，所述2- 丁醇生物合成途徑包含編碼多肽的至少一種DNA分子，所述多肽催化選自下列的底物至產物的轉化: (i)丙酮酸至乙酰乳酸的轉化； (ii)乙酰乳酸至乙偶姻的轉化； (iii)乙偶姻至2，3-丁二醇的轉化；(iv)2，3- 丁二醇至2- 丁酮的轉化；以及 (v)2-丁酮至2-丁醇的轉化； 并且其中所述產物是2- 丁醇。
26.制備重組宿主細胞的方法，包括: 用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變和/或替換。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述方法還包括: 用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。
28.改善重組宿主細胞的生長的方法，所述重組宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變或替換，所述方法包括: 用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述方法還包括: 用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。
30.根據權利要求28所述的方法，還包括使所述重組宿主細胞在包含限制的碳底物的培養(yǎng)基中生長。
31.降低重組宿主細胞的生長對外源二碳底物的需求的方法，所述重組宿主細胞包含編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變或替換，所述方法包括: 用編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述方法還包括: 用編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸轉化所述重組宿主細胞。
33.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242的E值匹配表6中給出的序型HMM。
34.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242、 1.1E-124、2.1E_49、7.8E-37的E值分別匹配表6、7、8和9中給出的序型HMM。
35.根據權利要求5所述的重組宿主細胞，還包含磷酸轉こ酰酶，所述磷酸轉こ酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中給出的序型HMM。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組宿主細胞，其包含(i)編碼多肽的內源性基因中的至少一個缺失、突變或替換，所述多肽將丙酮酸轉化為乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA；和(ii)編碼具有磷酸酮醇酶活性的多肽的異源性多核苷酸。本發(fā)明也涉及重組宿主細胞，其還包含(iii)編碼具有磷酸轉乙酰酶活性的多肽的異源性多核苷酸。
文檔編號C12P13/08GK103140584SQ201180039718
公開日2013年6月5日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2010年6月18日
發(fā)明者M.道納, L.A.馬吉奧-霍爾, J-F.湯布 申請人:布特馬斯先進生物燃料有限責任公司