專利名稱：通過adr-1基因增加轉(zhuǎn)基因植物對大豆銹菌抗性的方法
通過ADR-1基因增加轉(zhuǎn)基因植物對大豆銹菌抗性的方法本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細胞中增加對大豆銹菌抗性的方法。與不包括重組ADR-1基因的野生型植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物中ADR-1蛋白的含量和/或活性增加。此外，本發(fā)明涉及具有增加的對大豆銹菌抗性的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細胞，以及包含與編碼功能性ADR-1基因的序列或其片段相同或同源的序列的重組表達載體。農(nóng)作物的耕種主要用于生產(chǎn)人和動物的食品。特別是當今慣例的單種作物栽培對疾病的流行性傳播高度易感。結果是明顯減少的產(chǎn)量。到目前為止，主要通過用殺蟲劑控制病原生物。目前，直接修飾植物或病原體的遺傳傾向的可能性也對人類開放。抗性一般表示植物防止，或至少減少有害病原體的侵擾和建群的能力。在植物用于防止植物病原性生物的建群的天然存在的抗性中可以識別出不同的機制。這類病原體和宿主之間的特異相互作用確定了感染的過程(Schopfer和Brennicke (1999)Pflanzenphysiologie, Spri nger Verlag,柏林-海德堡，德國)。關于宗族特異性抗性，又稱為宿主抗性，在相容和不相容相互作用之間有差異。在相容相互作用中，在病毒性病原體和易感植物之間發(fā)生相互作用。病原體存活，并可建立繁殖結構，而宿主大部分先后死去。另一方面，當病原體感染植物但在癥狀的弱發(fā)展之前或之后其生長被抑制時，發(fā)生不相容相互作用。在后一種情況下，植物對相應的病原體具有抗性(Schopfer和Brennick,見上)。然而,此類抗性是對于某些株或病原體特異性的。在相容和不相容相互作用中，都發(fā)生宿主對病原體的防御性和特異性反應。然而，事實上由于病原體的新病毒性宗族的快速進化發(fā)展，此抗性通常被克服(Neu等人，(2003)American Cytopathol. Society, MPMI 16No. 7 :626-633)。大部分病原體是植物物種特異性的。這表示病原體可在某些植物物種中誘導疾病，但不在其他植物物種中誘導疾病(Heath(2002)Can. J. Plant Pathol. 24 :259-264)。某些植物物種中對病原體的抗性稱為非宿主抗性。非宿主抗性提供對植物病原體的強力、廣泛和永久的防護。提供非宿主抗性的基因在非宿主植物中提供對某些疾病的強力、廣泛和永久的防護的機會。特別地，此類抗性對病原體的不同株系起作用。真菌分布于全世界。到目前為止，已知約100000種不同的真菌種類。銹菌非常重要。它們可具有復雜的發(fā)育周期，具有多達5個不同孢子階段(不動精子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔孢子)。在病原真菌感染植物的過程中，通常觀察到不同的階段。在植物病原性真菌和其潛在宿主植物之間的相互作用的第一階段對于真菌的植物建群是決定性的。在感染的第一階段，孢子附著于植物表面，發(fā)芽，真菌穿透植物。真菌可通過已有的入口例如氣孔、皮孔、排水器和傷口穿透植物，或者它們由于機械力的作用以及在細胞壁消化酶的幫助下，直接穿透植物表皮。為了穿透植物，發(fā)育了特異性的感染結構。大豆銹菌豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在穿過表皮細胞后,真菌到達葉肉的細胞內(nèi)空間，在此真菌開始在葉中擴散。為獲得營養(yǎng)物，真菌穿透葉肉細胞并在葉肉細胞內(nèi)發(fā)育出吸器。在穿透過程中，被穿透的葉肉細胞的質(zhì)膜保持完整。因此大豆銹菌與大豆建立活體營養(yǎng)型相互作用?；铙w營養(yǎng)性植物病原性真菌，例如許多銹菌，其營養(yǎng)依賴于植物活細胞的新陳代謝。壞死營養(yǎng)型植物病原性真菌的營養(yǎng)依賴于植物的死細胞。大豆銹菌占據(jù)了中間位置，因為它直接穿透表皮，而被穿透的細胞變得壞死。在穿透后，真菌改為專性活體營養(yǎng)生活方式。為本發(fā)明的目的，基本遵循此種感染策略的活體營養(yǎng)型真菌病原體的亞群將被稱為“半壞死營養(yǎng)型的”。大豆銹病最近已變得日益重要。此疾病可由致病性銹菌豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi (Sydow))和山馬幢層鎊菌(Phakopsora meibomiae (Arthur)導致。它們屬于擔子菌綱，銹菌目，層銹菌科。兩種銹菌都感染多種豆類宿主植物。豆薯層銹菌也稱為亞洲銹菌，是對大豆(Glycine max)更具有侵略性的病原體，因此，至少目前，它對農(nóng)業(yè)很重要。豆薯層銹菌可見于世界上幾乎全部熱帶和亞熱帶大豆種植區(qū)域。豆薯層銹菌能在自然條件下感染來自17個科的31種豆類植物，還能在受控制的條件下在另外60種上生長(Sinclair 等人(編)，Proceedings of the rust workshop (1995), NationalSoyaResearch Laboratory, Publication No.1 (1996) ；Rytter J. L.等人，Plant Dis. 87,818(1984))。山馬蝗層銹菌(P. meibomiae)已見于加勒比海盆地區(qū)和波多黎各，尚未造成實質(zhì)性破壞。豆薯層銹菌目前只能用殺真菌劑的方法在田地中控制。沒有對隔離群的全部譜有抗性的大豆植物。在尋找抗性植物時，發(fā)現(xiàn)了 4個介導大豆對豆薯層銹菌抗性的顯性基因Rppl-4?？剐匝杆賮G失，因為豆薯層銹菌發(fā)展出新的病毒性宗族。最近幾年中，真菌病例如大豆銹病作為病害在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要性增加了。因此現(xiàn)有技術中存在開發(fā)控制真菌和提供真菌抗性植物的方法的需求。對感染植物表皮層的白粉菌和霜霉菌進行了大量研究。然而，對付感染葉肉的大豆銹菌的問題仍未解決。
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出乎意料地,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)過表達來自擬南芥的ADR-1基因增加對大豆銹菌的抗性。本發(fā)明的目的是提供在轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因植物細胞中增加對大豆銹菌抗性的方法。另一個目的是提供抗大豆銹菌的轉(zhuǎn)基因植物、生產(chǎn)此類植物的方法以及用于上述方法的載體構建體。此目的由主要權利要求的主體對象實現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式由從屬權利要求的特征限定。參考以下的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的詳細說明以及其中包括的實例，可更方便地理解本發(fā)明。除非另有注明，本文使用的術語應根據(jù)相關領域普通技術人員的慣常使用理解。除了本文提供的術語的限定，分子生物學中的常用術語的定義也可參見Rieger 等人，1991Glossary of genetics !classical and molecular,第 5 版，Berlin Springer-VerlagjPCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人編，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc. andJohn Wiley & Sons, Inc. , (1998Supplement)。應當理解,如說明書和權利要求書所用，單數(shù)形式“a”或“an”可表示一個或多個，取決于其使用的上下文。因此，例如，“細胞”可表示至少一個細胞可被利用。應當理解，本文所用的術語只用于說明具體實施方式
的目的，并不旨在進行限制。
在本申請中參考了多個出版物。這些出版物和其中引用的參考文獻的公開內(nèi)容在此以整體并入本申請，以更完整地說明本發(fā)明所屬的現(xiàn)有技術。用于克隆、DNA分離、擴增和純化的、用于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制內(nèi)切酶等的酶促反應的標準技術以及多種分離技術是本領域技術人員熟知并常用的。在Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y. ；Maniatis 等人，1982MolecularCloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y. ；ffu (編)1993Meth.Enzymo1. 218,Part I ;Wu(編)1979Meth Enzymo1. 68 ;Wu等人，(編)1983Meth. Enzymo1. 100和 101 ；Grossman 和 Moldave(編)1980Meth. Enzymol. 65 ；Miller 編)1972Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. ；01d and Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University ofCalifornia Press,Berkeley ;Schleif和Wensink, 1982Practical Methods in MolecularBiology ；Glover(編)1985DNA Cloning Vol.1 and II, IRL Press, Oxford, UK ；Hames和 Higgins (編)1985Nucleic Acid Hybridization, IRLPress, Oxford, UK;和 Setlow和 Hollaenderl979Genetic Engineering Principles and Methods,第 1-4 卷，PlenumPress,New York中說明了多種標準技術。在使用時，縮寫和命名法被視為本領域標準并廣泛用于專業(yè)雜志例如本文引用的那些中。

蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和/或酶，所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和/或酶相對于未修飾的目標蛋白質(zhì)具有氨基酸替換、缺失和/或插入，并與其來源的未修飾的蛋白質(zhì)具有相似的功能活性。核酸的“同源物”涵蓋這樣的核苷酸和/或多核苷酸，所述核苷酸和/或多核苷酸相對于未修飾的目標核酸具有核酸替換、缺失和/或插入，其中由此類核酸編碼的蛋白質(zhì)與由未修飾的核酸編碼的未修飾的蛋白質(zhì)相比具有類似或更高的功能活性，其中此類核酸源自所述未修飾的核酸。特別地，核酸的同源物涵蓋基于簡并氨基酸編碼的替換?！叭笔А敝笍牡鞍踪|(zhì)除去一個或多個氨基酸，或從DNA、ssRNA和/或dsRNA除去一個或多個核酸?！安迦搿敝敢粋€或多個氨基酸殘基或核酸殘基被引入蛋白質(zhì)或核酸中預定的位點?！疤鎿Q”指用具有相似性質(zhì)(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結構或β-片層結構的傾向)的其他氨基酸取代蛋白質(zhì)的氨基酸。在核酸水平，替換指用其他核酸取代核酸，其中由修飾的核酸編碼的蛋白質(zhì)具有相似的功能。特別地，核酸的同源物涵蓋基于簡并氨基酸編碼的替換。氨基酸替換通常是單個殘基的替換，但取決于對蛋白質(zhì)的功能性約束可為聚集的殘基，并可在I至10個氨基酸范圍內(nèi)變化；插入或缺失通常是約I至10個氨基酸殘基的數(shù)量級。氨基酸替換優(yōu)選地是保守氨基酸替換。本領域熟知保守替換表(參見例如Creighton (1984) Proteins, ff. H. Freeman and Company(編)和下表 I)。表1:保守氨基酸替換的實例
權利要求
1.增加植物和/或植物細胞中大豆銹菌抗性的方法，其中與野生型植物和/或野生型植物細胞相比，至少一種ADR-ι蛋白的含量和/或活性增加。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中ADR-1蛋白質(zhì)由以下編碼 (i)與SEQ ID No.1、其功能片段和/或能與其此類核酸雜交的重組核酸具有至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %或100 %同一性的重組核酸，和/或由 ( )與SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權利要求1或2中任一項的方法，所述方法包括 (a)用表達盒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細胞，表達盒包含與啟動子功能性連接的 (i)與SEQID No.1和/或其功能片段和/或能與此類核酸雜交的重組核酸具有至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %或100 %同一性的重組核酸，和/或 ( )編碼與SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白質(zhì)的重組核酸； (b)從植物細胞再生植物；和 (c)以足以生成或增加所述植物中大豆銹菌抗性的量和時間表達編碼ADR-1蛋白的所述重組核酸。
4.重組載體構建體，包含 (a)(i)與SEQ ID No.1、其功能片段和/或能與此類核酸雜交的核酸具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的重組核酸，和/或 (ii)編碼與SEQID No.2、其功能片段，其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白質(zhì)的重組核酸 有效連接于 (b)啟動子和 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
5.根據(jù)權利要求3的方法或根據(jù)權利要求4的載體構建體，其中啟動子是組成型、病原體誘導型啟動子和/或葉肉特異性啟動子。
6.用根據(jù)權利要求4或5的載體構建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因大豆植物、轉(zhuǎn)基因植物部分或轉(zhuǎn)基因植物細胞。
7.生產(chǎn)對大豆銹菌具有增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (a)將根據(jù)權利要求4或5的載體構建體引入植物和/或植物細胞， (b)從植物細胞再生植物，和 (C)表達蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì) (i)與SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性和/或( )由與SEQ ID No.1、其功能片段和/或能與此類核酸雜交的核酸具有至少60%，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %同一性或100 %同一性的核酸編碼。
8.根據(jù)權利要求6的植物的可收獲部分，其中可收獲部分優(yōu)選地是種子。
9.源自根據(jù)權利要求6的植物的產(chǎn)品、可根據(jù)權利要求7的方法生產(chǎn)的植物的產(chǎn)品和/或來自根據(jù)權利要求8的植物的可收獲部分的產(chǎn)品，其中產(chǎn)品優(yōu)選地是大豆粉和/或大豆油。
10.生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，所述方法包括 a)種植權利要求6的植物或可通過權利要求7的方法獲得的植物，和 b)從本發(fā)明的植物和/或這些植物的部分例如種子,或由本發(fā)明的植物和/或這些植物的部分例如種子，生產(chǎn)所述產(chǎn)品。
11.權利要求1至3、5、7的方法或根據(jù)權利要求6的植物，其中大豆銹菌是豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi)和 / 或山馬蟲皇層鎊菌(Phakopsora meibomiae)。
12.權利要求1至3、5、7或11的方法或根據(jù)權利要求6或11的植物，其中植物是大豆。
全文摘要
本發(fā)明涉及增加轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細胞中對大豆銹菌抗性的方法。與不包括重組ADR-1基因的野生型植物相比，這些植物中ADR-1蛋白的含量和/或活性增加。
文檔編號C12N5/14GK103068991SQ201180040127
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者H·舒爾塞斯 申請人:巴斯夫植物科學有限公司