專利名稱：糖苷水解酶61家族蛋白在纖維素加工中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及糖酵解酶及其用途的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)的GH61蛋白、和所述蛋白在從纖維素生物質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類和乙醇中的用途。直量纖維素生物質(zhì)是用于生成可發(fā)酵糖類的重要的可再生資源。這些糖類可用作發(fā)酵和其他代謝工藝的基質(zhì)以產(chǎn)生生物燃料、化學(xué)化合物和其他有商業(yè)價(jià)值的終產(chǎn)物。雖然將糖類諸如單糖發(fā)酵為乙醇相對直接，但將纖維素生物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類是有挑戰(zhàn)的。Ladisch 等人，1983, Enzyme Microb.Technol.5:82。纖維素生物質(zhì)向可發(fā)酵糖類的轉(zhuǎn)化可以開始于化學(xué)、機(jī)械、酶促或其他預(yù)處理以提高纖維素對水解的敏感性。這種預(yù)處理之后可以是使用分解纖維素的酶進(jìn)行的纖維素向纖維二糖、纖維寡糖、葡萄糖和其他糖類與糖聚合物的酶促轉(zhuǎn)化。這些酶總稱為“纖維素酶”，并包括內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纖維二糖水解酶。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供從嗜熱毀絲霉獲得的重組糖苷水解酶61家族(GH61)蛋白和編碼所述蛋白的核酸。本發(fā)明`還提供來自嗜熱毀絲霉培養(yǎng)物肉湯的分離和純化的GH61蛋白。這些蛋白可用于增加含纖維素的基質(zhì)經(jīng)歷被纖維素酶諸如內(nèi)切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶和纖維二糖水解酶之一或其組合糖化的反應(yīng)的產(chǎn)物的產(chǎn)量。重組或分離的GH61蛋白的加入或存在可增加纖維素酶的產(chǎn)物的產(chǎn)量，例如，至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是包含分離的或重組的GH61蛋白的組合物和用于制備這樣的組合物的方法。蛋白可從嗜熱毀絲霉分離，或可通過重組產(chǎn)生來獲得。提供了二十四種全長嗜熱毀絲霉GH61蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明的GH61蛋白包括包含與所列的蛋白(SEQID NO:1-30)的任一種或其生物活性片段至少約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的氨基酸序列的蛋白。示例性的GH61蛋白是GH61a(SEQ ID NO:2)。其他示例性GH61蛋白包括GH61o、GH61v、GH61x、GH61b 和 GH61e(SEQ IDNO:6、13、15、16、19、30)。其他示例性的 GH61 蛋白包括 GH61f、GH61v、GH61p、GH61g 和 GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)。在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的組合物包括分離的或重組的GH61蛋白和本公開文件中列出的一種或多種纖維素酶，包括但不限于選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的纖維素酶。GH61蛋白和纖維素酶可從相同或不同的宿主細(xì)胞類型獲得。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是從纖維素基質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類的方法。將包含基質(zhì)的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從基質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類諸如葡萄糖和木糖。組合物還可包含選自纖維素酶蛋白(內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶、I型纖維二糖水解酶和2型纖維二糖水解酶)、酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶的一種或多種酶。基質(zhì)可獲取自，例如，小麥、麥桿、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合，以預(yù)處理的麥桿示例?？砂l(fā)酵糖類可被回收并用于產(chǎn)生終產(chǎn)物諸如醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機(jī)酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、谷氨酸、檸檬酸或丙酸)、氨基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機(jī)酸、烷、烯、二醇或甘油。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是在用一種或多種纖維素酶的糖化反應(yīng)中，通過在上述GH61蛋白的存在下進(jìn)行反應(yīng)來增加可發(fā)酵糖類的產(chǎn)量的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供水解纖維素基質(zhì)的方法。將基質(zhì)與包含一種或多種重組GH61蛋白、一種或多種β-葡糖苷酶(BGL)以及一種或多種纖維二糖水解酶(CBH)的組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，酶組合物基本上無內(nèi)切葡聚糖酶(EG)。水解可導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量比在所述GH61蛋白不存在時進(jìn)行的相同反應(yīng)的產(chǎn)量多至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是從纖維素基質(zhì)產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法。在藉以產(chǎn)生可發(fā)酵糖類的條件下將基質(zhì)與包含上述GH61蛋白的組合物接觸。然后在發(fā)酵中將可發(fā)酵糖類與微生物接觸以產(chǎn)生終產(chǎn)物，諸如以上列出的那些。該方法適于制備醇，尤其是乙醇，其中微生物是酵母。 本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括:a)上述重組GH61蛋白，任選地被產(chǎn)生為帶有異源信號肽山)編碼GH61蛋白的核酸序列，其可以可操作地連接于異源啟動子；c)產(chǎn)生所述重組GH61蛋白的宿主細(xì)胞，以嗜熱毀絲霉、酵母、毛殼屬(Chaetomium)、梭孢殼屬(Thielavia)、支頂抱屬(Acremonium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)宿主細(xì)胞示例。本發(fā)明還包括重組產(chǎn)生的GH61蛋白在產(chǎn)生乙醇中的用途。GH61蛋白包括與所列的蛋白的任一種、或其具有GH61活性的片段至少60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92 %、約93 %、約94 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %相同的氨基酸序列。在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供編碼GH61蛋白的核酸。本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明的蛋白序列(SEQ ID NO:1至30)、可操作地連接于異源啟動子的重組核酸序列的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是(例如)嗜熱毀絲霉細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，重組核酸序列包括SEQ ID NO:31 ;或SEQID NO:32至59的任一種。該細(xì)胞還可表達(dá)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)的至少一種重組纖維素酶蛋白。在一個實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)GH61蛋白和選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGLl)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)、和/或所述纖維素酶蛋白的變體的至少一種、至少兩種、或至少三種重組纖維素酶蛋白。在一個方面，本發(fā)明提供包含GH61蛋白(例如，SEQ ID Ν0:2)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的組合物，其中GH61蛋白、EG、BGL、CBH1和CBH2的組合質(zhì)量是組合物中總的無細(xì)胞的蛋白的至少約20%、40%、60%、70%、80%、90%、95%、或基本上全部。組合物中可存在的CBH1、CBH2、EG和BGL酶的一種、兩種、三種、或所有四種可以是衍生自天然存在的纖維素酶蛋白的變體。組合物還可以是包含纖維素酶蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物肉湯。在一個方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:3至30的任一種的GH61蛋白或其分泌片段。任選地，該蛋白包含分泌片段和相應(yīng)的信號肽序列，如果存在信號肽序列的話。在一個相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供與本文提供的多肽或生物片段具有至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %序列同一性的GH61蛋白變體。在一個方面，本發(fā)明提供編碼上述蛋白的重組核酸序列，其可具有天然存在的基因或其片段的序列。在一個實(shí)施方案中，核酸的蛋白編碼序列可操作地連接于異源信號序列。通常，該重組核酸序列可操作地連接于異源啟動子。在一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的重組核酸的宿主細(xì)胞。該細(xì)胞可 表達(dá)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)U型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)的至少一種、兩種、三種或四種重組纖維素酶蛋白。在一個方面，本發(fā)明提供包含包括選自SEQ ID NO:1至30、和或其至少一種生物活性片段的分泌部分的序列的至少一種分離的蛋白的組合物。在一個實(shí)施方案中，該組合物還包含至少一種內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)，其中GH61蛋白、EG、BGL、CBHl和/或CBH2的組合質(zhì)量是組合物中總的無細(xì)胞的蛋白的至少約70%。在一個方面，本發(fā)明提供用于糖化的方法:(a)在至少一種GH61蛋白被分泌進(jìn)入培養(yǎng)物肉湯的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，和(b)在發(fā)生糖化的條件下混合所述肉湯與纖維素生物質(zhì)，其中(a)可在(b)之前發(fā)生或與(b)同時發(fā)生。在一個方面，本發(fā)明提供水解淀粉的方法，包括將淀粉與包含一種或多種重組GH61蛋白和一種或多種淀粉酶的組合物接觸。本發(fā)明的其他實(shí)施方案將由以下說明變得明顯。


圖1取自使用來自嗜熱毀絲霉的重組產(chǎn)生的GH61a蛋白的實(shí)驗(yàn)。使用來自嗜熱毀絲霉的培養(yǎng)物肉湯的纖維素酶試驗(yàn)了該蛋白的纖維素酶增強(qiáng)活性。圖1(A)顯示與在GH61a不存在時的糖化反應(yīng)相比，在GH61a存在下進(jìn)行的相同反應(yīng)的產(chǎn)量改進(jìn)的百分比。在圖1(B)中，將數(shù)據(jù)繪圖來顯示總的葡萄糖產(chǎn)量。圖2取自使用從嗜熱毀絲霉的培養(yǎng)物肉湯分離的包含GH61的級分(斤action)的實(shí)驗(yàn)。將GH61蛋白GH61f、GH61p、和/或GH61a與CBHla和CBH2b混合。這些結(jié)果證明，包含這些組分的酶混合物具有將纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的足夠的酶活性。圖3顯示GH61a蛋白對纖維素生物質(zhì)的粘度的影響。詳沭1.引言
已確定，絲狀真菌嗜熱毀絲霉產(chǎn)生GH61蛋白。當(dāng)含纖維素的基質(zhì)經(jīng)歷被一種或多種纖維素酶糖化時，GH61蛋白增加可發(fā)酵糖類的產(chǎn)量。除了其他用途以外，由糖化產(chǎn)生的可發(fā)酵糖類可用在發(fā)酵反應(yīng)中以產(chǎn)生終產(chǎn)物，諸如但不限于乙醇。GH61蛋白可從嗜熱毀絲霉細(xì)胞分離。GH61蛋白還可通過表達(dá)編碼本公開文件中提供的GH61蛋白序列的任一種的核酸來重組地產(chǎn)生，本公開文件中提供的GH61蛋白序列包括野生型序列以及野生型序列的變體和片段。本發(fā)明的GH61蛋白和組合物的制備和用途在以下部分更詳細(xì)地描述。II定義本文提到的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列均通過引用明確地并入本文。除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施涉及在分子生物學(xué)領(lǐng)域、發(fā)酵領(lǐng)域、微生物學(xué)領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域中通常使用的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。除非在本文中另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)中可使用與本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但描述了一些優(yōu)選的方法和材料。實(shí)際上，意圖在于本發(fā)明不限于本文所述的特定方法學(xué)、方案和試劑，因?yàn)檫@些可隨使用它們的背景而改變。本文提供的標(biāo)題不是對本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗啤１M管如此，為了促進(jìn)對本發(fā)明的理解，以下定義了若干術(shù)語。數(shù)值范圍包括限定范圍的數(shù)字。這樣，本文公開的每個數(shù)值范圍旨在包括落在這種較寬的數(shù)值范圍內(nèi)的每個較窄的數(shù)值范圍，如同這種較窄的數(shù)值范圍全部被明確寫在本文一樣。意圖還在于本文公開的每個最大(或最小)的數(shù)值限制(numerical limitation)包括每個較低(或較高)的數(shù)值限制，如同這種較低(或較高)的數(shù)值限制被明確地寫在本文一樣。如本文所用，術(shù)語“包括”及其同源詞以其包含的意義使用(即，等同于術(shù)語“包含”及其對應(yīng)的同源詞)。如在此處和在所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另外清楚地表示，否則單數(shù)“一(a)”、“一(an)”和“該(the) ”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，提到“宿主細(xì)胞”包括多個此類
宿主細(xì)胞。除非另外指明，否則分別以5'至3'方向從左到右書寫核酸；以氨基到羧基方向從左到右書寫氨基酸序列。本文提供的標(biāo)題不是對可通過參照作為整體的說明書而具有的本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗啤?jù)此，通過參照作為整體的說明書更完全地定義以下所定義的術(shù)語。如本文所用，“GH61蛋白”是具有GH61(或“纖維素酶增強(qiáng)”)活性的蛋白。“GH61蛋白”或GH61多肽可具有天然存在的(野生型)蛋白的序列，或可包括相對于野生型蛋白的變異。如本文所用，表I和表2所示的GH61蛋白序列(SEQ ID NO:1_30)被認(rèn)為是野生型序列。如果當(dāng)?shù)鞍妆话ㄔ谔腔磻?yīng)(例如，使用內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶、以及I型和2型纖維二糖水解酶進(jìn)行)中時比在GH61蛋白不存在時在相同條件下進(jìn)行的糖化反應(yīng)導(dǎo)致更大量(即，更大產(chǎn)量)的一種或多種可溶性糖類(例如，葡萄糖)，則該蛋白具有“GH61活性”或“纖維素酶增強(qiáng)活性”或是“生物活性”的?！吧锘钚宰凅w”是保留野生型蛋白的GH61活性的至少一些(例如，至少10% )的變體或片段。如本文所用，“變體”GH61蛋白(或編碼GH61蛋白的多核苷酸)是包含相對于野生型GH61 (或編碼GH61的野生型多核苷酸)的一種或多種修飾的GH61蛋白。修飾包括一個或多個氨基酸殘基(或多核苷酸中的一個或多個核苷酸或密碼子)的取代、插入、缺失、和/或氨基或羧基截短。包含相對于野生型蛋白的缺失的變體可稱為“片段”。如本文所用，GH61蛋白的“片段”是(a)具有野生型序列但包含相對于SEQ ID NO:1-30的缺失的多肽或(b)包含相對于多肽SEQ ID NO:1_30的缺失的GH61變體。蛋白序列中的氨基酸“取代”是該序列中的單個氨基酸被另一種氨基酸代替。氨基酸取代可以是“保守的”取代，在這種情況中取代氨基酸與其代替的氨基酸共有一種或多種化學(xué)特性。共有的特性包括以下:堿性氨基酸:精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性氨基酸:谷氨酸(E)和天冬氨酸(D);不帶電荷的極性氨基酸:谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N);疏水氨基酸:亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V);芳族氨基酸:苯丙氨酸
(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y);含硫氨基酸:半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M);小氨基酸:甘氨酸
(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)。術(shù)語“前蛋白”具有其在本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)含義，是指包括附加的氨基末端信號肽(或前導(dǎo)序列)區(qū)域的多肽。隨著蛋白的分泌，信號肽酶將信號肽從前蛋白上切割。蛋白的分泌部分可稱為“成熟的”或“分泌的”蛋白。因此，前蛋白的氨基酸序列，該序列包括信號肽部分和分泌的(成熟)部分。 如本文所用，術(shù)語“信號肽”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義，是指與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑?！疤腔笔侵该复呋姆磻?yīng)，導(dǎo)致復(fù)雜碳水化合物水解為可發(fā)酵糖類(例如，單糖類諸如葡萄糖或木糖)。該酶可以是纖維素酶，諸如內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、I型和/或2型纖維二糖水解酶、和這些纖維素酶的組合。該纖維素酶可來自產(chǎn)生纖維素酶的野生型或纖維素酶-工程化的生物體(例如，真菌諸如嗜熱毀絲霉或酵母)的培養(yǎng)物肉湯。當(dāng)相鄰單糖的至少一些之間的糖苷鍵被水解，從而將此前鍵合的單體對彼此分開時，“水解”纖維素或另一種多糖(例如，淀粉)發(fā)生。當(dāng)在反應(yīng)期間存在的特定組分(諸如GH61蛋白)導(dǎo)致與在相同條件下以相同的基質(zhì)和其他代用品、但不存在目標(biāo)組分時進(jìn)行的反應(yīng)相比產(chǎn)生更多產(chǎn)物時，出現(xiàn)“增加”反應(yīng)產(chǎn)物(諸如可發(fā)酵糖類)的產(chǎn)量。術(shù)語“改進(jìn)的”或“改進(jìn)的特性”在描述GH61變體的特性的語境中使用時，是指與野生型GH61(例如，SEQ ID NO:2)或指定參考多肽相比表現(xiàn)出一種或多種特性的改進(jìn)的GH61變體多肽。改進(jìn)的特性可包括但不限于，增加的蛋白表達(dá)、增加的熱活性、增加的熱穩(wěn)定性、增加的PH活性、增加的穩(wěn)定性(例如，增加的pH穩(wěn)定性)、增加的產(chǎn)物特異性、增加的比活性、增加的底物特異性、增加的對底物或終產(chǎn)物抑制的抗性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性、減少的被葡萄糖抑制、增加的對抑制劑(例如，乙酸、凝集素、鞣酸和苯酚化合物)的抗性、和改變的PH/溫度曲線。術(shù)語“纖維素酶(cellulase) ”(或“纖維素酶(cellulose enzyme)，，)寬泛地是指催化纖維素β_1，4-糖苷鍵水解為更短的纖維素鏈、寡糖、纖維二糖和/或葡萄糖的酶，例如，內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纖維二糖水解酶。
如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物、及其互補(bǔ)物。如本文所用，“基因”是編碼蛋白的核酸序列。該核酸可具有或不具有任何內(nèi)含子，可以是或不是重組的，并可還包括或不包括影響轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件。為了本說明書的目的，編碼蛋白的cDNA序列有時可稱為“基因”。術(shù)語“重組核酸”具有其常規(guī)含義。重組核酸或等義地“多核苷酸”，是被插入到異源位置，以使其不與自然界發(fā)現(xiàn)的正常情況下在該核酸兩側(cè)的核苷酸序列締合的核酸(例如，被插入到載體中或異源生物體的基因組中的核酸)。同樣，不在自然界出現(xiàn)的核酸序列例如天然存在的基因的變體是重組的。包含重組核酸或從重組核酸體外或體內(nèi)表達(dá)的蛋白的細(xì)胞也是“重組的”。重組核酸的實(shí)例包括(i)可操作地連接于異源啟動子和/或(ii)編碼帶有蛋白序列和異源信號肽序列的融合多肽的編碼蛋白的DNA序列:。當(dāng)核酸締合，通常在溶液中締合時，它們“雜交”。核酸雜交是由于各種被很好表征的物理-化學(xué)力，諸如氫鍵鍵合、溶劑排斥(solvent exclusion)、堿基堆積等。如本文所用，在核酸雜交實(shí)驗(yàn)諸如Southern雜交或Northern雜交的背景下術(shù)語“嚴(yán)格的雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。有關(guān)核酸雜交的深入指導(dǎo)見于 Ti jssen, 1993, “Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,，，Part I, Chapter2(Elsevier, NewYork)，其通過引用并入本文。對于至少100個核苷酸長度的多核苷酸而言，對低嚴(yán)格條件到極高嚴(yán)格條件限定如下:在標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡程序后，在42°C在5XSSPE，0.3% SDS,200 μ g/ml剪切和變性的鮭魚精DNA，以及對于低嚴(yán)格性的25%甲酰胺，對于中等和中-高嚴(yán)格性的35%甲酰胺，或?qū)τ诟邍?yán)格性和極高嚴(yán)格性的50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交。對于至少100個核苷酸長度的多核苷酸，使用2XSSC，0.2% SDS在50°C (低嚴(yán)格性)、在550C (中等嚴(yán)格性)、在60°C (中-高嚴(yán)格性)、在65°C (高嚴(yán)格性)或在70°C (極高嚴(yán)格性)將載體材料(carrier material)最終洗漆三次,每次15分鐘。術(shù)語“表達(dá)載體”是指包括編碼本發(fā)明的多肽的區(qū)段，并且所述區(qū)段可操作地連接于提供其轉(zhuǎn)錄的另外區(qū)段(例如，啟`動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、增強(qiáng)子)和任選地選擇性標(biāo)記的線性或環(huán)狀的DNA分子。為了本公開的目的，如果啟動子在自然界不與基因序列締合時，該啟動子對該基因是“異源的”。當(dāng)信號肽序列在自然界不與蛋白序列締合時，該信號肽對該蛋白是“異源的”。關(guān)于調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子)，術(shù)語“可操作地連接”是指如下配置:在該配置中調(diào)節(jié)序列被安放在相對于多肽編碼序列的位置以使得該調(diào)節(jié)序列影響多肽的表達(dá)。關(guān)于信號序列，術(shù)語“可操作地連接”是指如下配置:在該配置中信號序列編碼與多肽融合的氨基末端信號肽，以使該基因的表達(dá)產(chǎn)生前蛋白。 如本文所用，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互換地使用，是指氨基酸殘基的聚合物。如本文所用，術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及氨基酸類似物。術(shù)語“生物質(zhì)”、“生物質(zhì)基質(zhì)”、“纖維素生物質(zhì)”、“纖維素原料”、“木質(zhì)纖維素原料”和“纖維素基質(zhì)”都是指包含纖維素的材料。為了簡化，本文使用的術(shù)語“纖維素基質(zhì)”是指通常在預(yù)處理后，能夠被纖維素酶(任選地存在GH61蛋白)作用來產(chǎn)生可發(fā)酵糖類的包含纖維素的材料。纖維素基質(zhì)的實(shí)例包括但不限于，生物質(zhì)諸如木頭、木紙漿、紙漿、玉米纖維、玉米粒、玉米芯、谷物殘?jiān)T如玉米皮、玉米秸桿、草、小麥、麥桿、大麥、大麥桿、干草、稻草、柳枝稷、廢紙、紙和紙漿加工廢料、木質(zhì)或草本植物、果漿或蔬菜漿、酒糟、稻殼、棉、大麻、亞麻、劍麻、甘鹿S、高粱、大豆、碾磨谷物、樹、樹枝、根、葉、木片、鋸末、灌木叢、蔬菜、果實(shí)、和花獲得的組分、及其混合物。在一些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法“預(yù)處理”或處理纖維素材料，諸如化學(xué)預(yù)處理(例如，氨預(yù)處理、稀酸預(yù)處理、稀堿預(yù)處理、或溶劑暴露)、物理預(yù)處理(例如，蒸汽爆破或輻照)、機(jī)械預(yù)處理(例如，研磨或碾磨)和生物預(yù)處理(例如，施加增溶木質(zhì)素的微生物)和其組合，以增加纖維素對水解的敏感性。纖維素基質(zhì)及其加工在以下更詳細(xì)地描述。纖維素基質(zhì)通過包括以下的方法“獲取自”特定來源(諸如玉米或小麥):獲得該來源或該來源的實(shí)體部分(諸如玉米芯或麥桿)，然后任選地預(yù)處理該來源或部分。纖維素酶蛋白序列(即，纖維素變體)當(dāng)通過使用體外誘變或分子進(jìn)化方法向野生型序列引入變異來產(chǎn)生時，“衍生自”野生型纖維素酶序列。通常蛋白序列將與野生型序列至少 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%相同。纖維素基質(zhì)已經(jīng)通過一些物理和/或化學(xué)手段加工來幫助糖化時，被稱為是“預(yù)處理的”?！翱砂l(fā)酵糖類”意為簡單糖類(simple sugars)(單糖、二糖和短寡糖)，諸如但不限于葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖?？砂l(fā)酵糖類是微生物能夠利用或發(fā)酵的任何糖。術(shù)語“轉(zhuǎn)化(transform) ”或“轉(zhuǎn)化(transformation) ”在提到細(xì)胞使用時，表示細(xì)胞具有整合入其基因組或作為經(jīng)過多代被維持的附加體(例如，質(zhì)粒)的非天然核酸序列。

術(shù)語“引入”在將核酸序列插入細(xì)胞的語境中使用時表示被接合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化(統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)化”)或以其他方式并入到細(xì)胞的基因組中或作為附加體被保持在細(xì)胞內(nèi)?！袄w維素酶工程化的”細(xì)胞是包含編碼纖維素酶或纖維素酶變體的至少一種、至少兩種、至少三種、或至少四種重組序列且其中纖維素酶或纖維素酶變體的表達(dá)相對于野生型形式已被修飾的細(xì)胞。當(dāng)非天然存在的纖維素酶變體被表達(dá)或當(dāng)天然存在的纖維素酶被過表達(dá)時，纖維素酶的表達(dá)是“被修飾的”。過表達(dá)纖維素酶的一種方式是可操作地連接強(qiáng)(任選地組成型)啟動子于纖維素酶編碼序列。過表達(dá)纖維素酶的另一種方式是增加異源的、變異的、或內(nèi)源的纖維素酶基因的拷貝數(shù)。纖維素酶工程化的細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞(例如，解纖維素?zé)崴峋?Acidothermus cellulolyticus)、Thermobifida fusca、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、嗜熱毀絲霉、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)、枝頂孢屬、梭孢殼屬、里氏木霉(Trichoderma reesei)、曲霉屬)。在一些實(shí)施方案中，纖維素酶工程化的細(xì)胞是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。術(shù)語“培養(yǎng)”是指在液體或固體培養(yǎng)基中使微生物(例如真菌)細(xì)胞的群體生長。一些培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)和分泌蛋白，諸如例如，GH61蛋白或纖維素酶蛋白。當(dāng)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中生長時，蛋白可能被分泌到培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基被稱為多種術(shù)語，包括細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞肉湯。如本文所用，術(shù)語“回收”是指從細(xì)胞肉湯或可選地從固體培養(yǎng)基收獲、分離、收集或離析蛋白、糖、細(xì)胞或終產(chǎn)物(例如，醇)。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指從與之在自然界中通常締合的組分(諸如其他蛋白、核酸或細(xì)胞)中部分地或完全地分開的核酸、多肽、或其他組分。已經(jīng)被“純化”的產(chǎn)物是已經(jīng)從獲得其的來源富集至少10倍、任選地至少100倍、或至少1000倍的產(chǎn)物。例如，從其占總蛋白0.1%的培養(yǎng)物肉湯獲得的蛋白可被純化，使得其為制品中蛋白的 1%、2.5%、10%、25%、50%、80%、95%或 100% (wt/wt)?！安糠旨兓摹碑a(chǎn)物已經(jīng)從產(chǎn)生其的來源富集至少2倍、或至少5倍，但仍包含至少50%、有時至少90% (wt/wt)的溶劑以外的不相關(guān)組分?！胺旨?fractionating) ”液體產(chǎn)物諸如培養(yǎng)物肉湯表示施加分離工藝(諸如鹽沉淀、柱色譜、尺寸排阻、和過濾)或所述工藝的組合，從而獲得一種溶液，其中期望蛋白(諸如GH61蛋白、纖維素酶、或其組合)在該溶液中為比在最初液體產(chǎn)物中占總蛋白的百分比更大的百分比?！皾{料”是其中分散一種或多種固體組分諸如纖維素基質(zhì)的水溶液。如本文所用，包含一種或多種蛋白的“組合物”可以是，例如，包含蛋白的無細(xì)胞組合物、細(xì)胞溶解產(chǎn)物、包含例如以分泌形式的蛋白的細(xì)胞肉湯；包含蛋白的細(xì)胞，諸如表達(dá)蛋白的重組細(xì)胞；表達(dá)不同蛋白的兩種或多種細(xì)胞群體的混合物(例如，表達(dá)重組GH61蛋白的一種細(xì)胞和表達(dá)纖維素酶蛋白的第二細(xì)胞)。術(shù)語“無細(xì)胞組合物”是指其中已經(jīng)去除了細(xì)胞和細(xì)胞碎片的包含蛋白的組合物，諸如純化的纖維素酶混合物或包含分泌的蛋白的、已經(jīng)從其去除了細(xì)胞和不溶性物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物肉湯。術(shù)語“同一性百分比”、同一性”、“百分比相同”和相同”在本文可互換地使用，是指兩條最佳地對齊的序列跨比較窗的比較。為了優(yōu)化比較，比較窗可在任一條序列中包括添加或缺失。同一性百分比是序列之間相同的位置數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)(包括其中一條序列具有缺口的位置)。例如，具有在310個位置與序列GH61a(其分泌形式具有323個氨基酸)匹配的氨基酸序列的蛋白，將與該參考序列具有310/323 = 95.9%同一性。類似地，具有300個殘基(S卩，小于全長)并在280個位置與參考序列匹配的蛋白變體將具有280/300 = 93.3%同一性。盡管最佳比對和評分可手動完成，但通過使用計(jì)算機(jī)執(zhí)行的比對算法可促進(jìn)該過程。實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，描述在Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等，1977，NucleicAcids Res.3389-3402 中?？蛇x地，兩條氨基酸序列之間的同一性程度可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-53)確定，該算法已經(jīng)在EMBOSS軟件包的Needle程序中實(shí)現(xiàn)(EMBOS S:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等，2000,Trendsin Geneticsl6:276-77)，優(yōu)選地以3.0.0或后來的版本。使用的任選參數(shù)是:缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。Needle的標(biāo)為“最長同一性”的輸出值(使用nobrief選項(xiàng)獲得的)用作同一性百分比，并如下計(jì)算:(相同殘基X 100) + (比對的 長度-比對中的缺口總數(shù))。HI:GH61某閔的鑒定
如實(shí)施例1所述，鑒定了對嗜熱毀絲霉內(nèi)源的二十四種GH61蛋白。參見下表I和表2。如實(shí)施例2和3所示，名稱為GH61a的特定嗜熱毀絲霉GH61蛋白(SEQ ID NO:2)顯示為在纖維素酶存在時增強(qiáng)糖化反應(yīng)。類似地，本發(fā)明的其他GH61蛋白(SEQ ID NO:3至
30)可用于增強(qiáng)纖維素酶活性。表I提供GH61前蛋白的序列(SEQ ID NO:1),以加下劃線顯示預(yù)測的天然信號肽，和預(yù)測的分泌的(成熟)形式(SEQ ID NO:2)。序列ID NO: 2的長度是323個氨基酸。預(yù)期本發(fā)明的某些GH61a蛋白變體包括SEQ IDNO:2的殘基11-323 (包括但不限于，氨基末端截短的片段)，或與SEQ IDNO:2的殘基11-323具有至少:約70%、約75%、約80%、約85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、或約99%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，GH61s蛋白變體與SEQ IDNO:2的殘基11-323具有至少90%的同一性并長至少315個殘基。表2提供28種GH61前蛋白序列，預(yù)測的天然信號肽加下劃線。預(yù)測GH61t和GH61n不具有信號肽。除了另外指明或從上下文清楚的情況以外，提及表2中所列的一種或多種序列意為涵蓋前蛋白形式和分泌形式(即，包含完整序列的蛋白、和不包括加下劃線的序列的蛋白)的一種或兩種。還預(yù)期本發(fā)明的某些GH61蛋白包括表2所示的序列的殘基11至C末端(包括但不限于，氨基末端截短的片段)，或與這些序列的殘基11至C末端具有至少:約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約96%、約97%、約98%、或約99%的序列同一性。在表2中可使用以下名稱:B =全長蛋白(包括信號肽)的SEQ ID N0.;C=信號肽(加下劃線的)；D=成熟蛋白(不加下劃線的)；E = D的開始于分泌部分的殘基11的部分(即，在最后一個缺口與C末端之間，亦即氨基末端截短部分)。表I和表2中的信號肽邊界是基于對基本序列的分析來預(yù)測的。實(shí)際的裂解位點(diǎn)與預(yù)測的位點(diǎn)差達(dá)數(shù)個殘基(例如，1-10個，例如，達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)是有可能的。異源信號肽的存在也可以影響裂解位點(diǎn)。信號肽裂解位點(diǎn)可通過表達(dá)全長序列，并鑒定分泌的GH61蛋白的氨基末端殘基來確定。預(yù)計(jì)在成熟蛋白氨基末端添加或缺失數(shù)個殘基可以對分泌的蛋白的活性影響很小或無影響。M I
糖苷水解酶61蛋白GH61a
權(quán)利要求
1.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。
2.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲霉的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶； 其中在纖維素經(jīng)歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應(yīng)中，與所述GH61蛋白不存在時的相同糖化反應(yīng)相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產(chǎn)量至少20%。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白是重組的。
4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白通過從嗜熱毀絲霉培養(yǎng)物分離GH61蛋白活性而獲得。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GH61蛋白增加所述反應(yīng)中的葡萄糖的產(chǎn)量至少約50%。
6.如權(quán)利要求5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GH61蛋白增加葡萄糖的產(chǎn)量至少約2 倍。
7.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)包含與SEQID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約99%相同的氨基酸序列的重組產(chǎn)生的GH61蛋白；和 b)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。
8.一種組合物，包含: a)包含與選自由SEQID NO:1至30和SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段組成的組的序列至少約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約97 %或約99%相同的氨基酸序列的重組產(chǎn)生的GH61蛋白；和 b)選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶， 其中在纖維素經(jīng)歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應(yīng)中，與所述GH61蛋白不存在時的相同反應(yīng)相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產(chǎn)量至少20%。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包含與SEQID NO:2、或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括SEQID NO:1至30的任一種；或其具有GH61活性的片段。
13.如權(quán)利要求8至12任一項(xiàng)所述的組合物，包含兩種、三種、或多于三種纖維素酶。
14.如權(quán)利要求8至13任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述纖維素酶是重組的。
15.如權(quán)利要求8至14任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述纖維素酶是真菌酶類。
16.如權(quán)利要求8至15任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述纖維素酶來自嗜熱毀絲霉。
17.如權(quán)利要求8至16任一項(xiàng)所述的組合物，包括在一種宿主細(xì)胞群體中表達(dá)編碼所述GH61蛋白的基因，和在另一種宿主細(xì)胞群體中表達(dá)編碼纖維素酶的至少一種基因。
18.如權(quán)利要求8至16任一項(xiàng)所述的組合物，包括在相同宿主細(xì)胞類型中表達(dá)編碼所述GH61蛋白的基因和編碼纖維素酶的至少一種基因。
19.如權(quán)利要求17或18所述的組合物，其中所述基因編碼包含異源信號肽的GH61蛋白。
20.一種從纖維素基質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類的方法，包括將包含所述基質(zhì)的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從所述基質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類， 其中所述GH61蛋白包括與SEQ ID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約93 %、約95 %、約97 %或約99 %相同的氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:1至30的任一種的分泌部分100%相同的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中在所述接觸之前，將所述基質(zhì)預(yù)處理。
23.如權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GH61蛋白與SEQID NO:2至少95%相同。
24.如權(quán)利要求20至23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含選自酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和其組合的一種或多種酶。
25.如權(quán)利要求20至24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含選自EG、BGL、CBHl和CBH2的一種或多種纖維素酶。
26.如權(quán)利要求20至25任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基質(zhì)獲取自小麥、麥桿、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合。
27.如權(quán)利要求20至26任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基質(zhì)獲取自麥桿。
28.如權(quán)利要求20至27任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可發(fā)酵糖類包括葡萄糖。
29.如權(quán)利要求20至28任一項(xiàng)所述的方法，還包括回收所述可發(fā)酵糖類。
30.如權(quán)利要求20至29任一項(xiàng)所述的方法，還包括從所述可發(fā)酵糖類產(chǎn)生終產(chǎn)物， 其中所述終產(chǎn)物包括醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機(jī)酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、谷氨酸、檸檬酸或丙酸)、氨基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機(jī)酸、烷、烯、二醇或甘油。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述醇是乙醇。
32.—種用于在含纖維素的基質(zhì)經(jīng)歷被一種或多種纖維素酶糖化的反應(yīng)中增加可發(fā)酵糖類的產(chǎn)量的方法，包括在包括與SEQ ID NO:1至30的任一種；或SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段至少80%相同的氨基酸序列的GH61蛋白存在下進(jìn)行所述反應(yīng)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:2、或其片段至少95%相同的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種;或所述序列的任一種的片段至少95%相同的氨基酸序列。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種;或所述序列的任一種的片段至少95%相同的氨基酸序列。
36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括SEQID N0:1至30的任一種；或其片段。
37.如權(quán)利要求32至36任一項(xiàng)所述的方法，其中所述纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的組合。
38.一種水解纖維素基質(zhì)的方法，包括將所述基質(zhì)與包含一種或多種重組GH61蛋白、一種或多種葡糖苷酶(BGL)、和一種或多種纖維二糖水解酶(CBH)的組合物接觸，其中所述酶組合物基本上無內(nèi)切葡聚糖酶(EG)。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述組合物包含I型纖維二糖水解酶和2型纖維二糖水解酶二者。
40.如權(quán)利要求38或39任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GH61蛋白是來自嗜熱毀絲霉的分離或重組的GH61蛋白。
41.如權(quán)利要求38至40任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GH61蛋白與SEQID NO:2或其具有GH61活性的片段至少80%相同。
42.如權(quán)利要求38至41任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水解導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量是在所述GH61蛋白不存在時以BGL酶和CBH酶水解所述纖維素基質(zhì)獲得的葡萄糖產(chǎn)量的約1.5倍聞。
43.一種從纖維素基質(zhì)產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法，包括: a)將所述纖維素基質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求8至16任一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法獲得的組合物接觸，藉以從所述基質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖類；和 b)在發(fā)酵中將所述可發(fā)酵糖類 與微生物接觸以產(chǎn)生終產(chǎn)物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，所述方法是同時糖化和發(fā)酵的工藝。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述纖維素基質(zhì)的糖化與所述發(fā)酵連續(xù)地發(fā)生。
46.一種從纖維素基質(zhì)產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法，包括: a)獲得根據(jù)權(quán)利要求20至42任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的可發(fā)酵糖類；和 b)在發(fā)酵中將所述可發(fā)酵糖類與微生物接觸以產(chǎn)生終產(chǎn)物。
47.如權(quán)利要求43至46任一項(xiàng)所述的方法，其中所述終產(chǎn)物是醇。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述醇是乙醇。
49.如權(quán)利要求43至48任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物是酵母。
50.一種重組GH61蛋白，包括與SEQ ID NO:1至30的任一種、或其具有GH61活性的片段至少約80%相同的氨基酸序列。
51.如權(quán)利要求50所述的重組GH61蛋白，其中在纖維素經(jīng)歷被來自絲狀真菌的培養(yǎng)物肉湯中包含的纖維素酶糖化的反應(yīng)中，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產(chǎn)量。
52.如權(quán)利要求51所述的重組GH61蛋白，其中所述細(xì)胞是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求51或52所述的GH61蛋白，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:6、16、19和23的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。
54.如權(quán)利要求51或52所述的GH61蛋白，包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少約95%相同的氨基酸序列。
55.如權(quán)利要求51至54任一項(xiàng)所述的GH61蛋白，包括SEQID NO:1至30的任一種；或其具有GH61活性的片段。
56.—種重組多核苷酸,包括編碼權(quán)利要求51至55任一項(xiàng)的GH61蛋白的核酸序列。
57.如權(quán)利要求56所述的重組多核苷酸，包括SEQID NO:31、或其編碼具有GH61活性的多肽的片段。
58.如權(quán)利要求56所述的重組多核苷酸，包括SEQID NO:32至59的任一種、或其編碼具有GH61活性的多肽的片段。
59.如權(quán)利要求56至58任一項(xiàng)所述的重組多核苷酸，其中所述GH61蛋白具有異源信號肽。
60.如權(quán)利要求56至59 任一項(xiàng)所述的重組多核苷酸,其是表達(dá)載體。
61.如權(quán)利要求60所述的表達(dá)載體，其中編碼所述GH61蛋白的所述核酸序列可操作地連接于異源啟動子。
62.—種宿主細(xì)胞,包含權(quán)利要求56至61任一項(xiàng)的重組多核苷酸。
63.如權(quán)利要求62所述的宿主細(xì)胞，還包含各編碼一種纖維素酶的一種或多種基因。
64.如權(quán)利要求63所述的宿主細(xì)胞，其中所述纖維素酶選自內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)。
65.如權(quán)利要求63或64所述的宿主細(xì)胞，其中所述纖維素酶編碼基因的至少一種是重組多核苷酸。
66.如權(quán)利要求62至65任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所述GH61蛋白的所述核酸序列可操作地連接于異源啟動子。
67.如權(quán)利要求62至66任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其是絲狀真菌細(xì)胞。
68.如權(quán)利要求62至66任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其是毛殼屬(Chaetomium)、梭抱殼屬(Thielavia)、支頂抱屬(Acremonium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)宿主細(xì)胞。
69.如權(quán)利要求68所述的宿主細(xì)胞，其是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。
70.如權(quán)利要求62至66任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其是酵母細(xì)胞。
71.—種組合物，所述組合物由包括以下的方法制備:培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求62至70任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，從所述培養(yǎng)獲得肉湯，和任選地分級所述肉湯。
72.重組產(chǎn)生的GH61蛋白在產(chǎn)生乙醇中的用途， 其中所述GH61蛋白包括與選自SEQ ID NO:1至30的序列；或所述選擇的序列的具有GH61活性的片段至少約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約97 %或約99 %相同的氨基酸序列；其中在纖維素經(jīng)歷被來自嗜熱毀絲霉細(xì)胞的培養(yǎng)物肉湯中包含的纖維素酶糖化的反應(yīng)中，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產(chǎn)量。
73.如權(quán)利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:2 ;或其片段至少約95 %相同的氨基酸序列。
74.如權(quán)利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種；或其片段至少95%相同的氨基酸序列。
75.如權(quán)利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其片段至少95%相同的氨基酸序列。
76.如權(quán)利要 求72至75任一項(xiàng)所述的用途，其中所述GH61蛋白包括SEQID NO:1至30的任一種；或其片段。
77.一種重組核酸，編碼如以上描述的GH61蛋白。
78.—種分離的或重組產(chǎn)生的如以上描述的GH61蛋白。
79.—種組合物，包含如以上描述的GH61蛋白和纖維素酶。
80.GH61蛋白在如 以上描述的水解纖維素基質(zhì)或產(chǎn)生乙醇中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供從嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)獲得的重組GH61蛋白、和編碼所述蛋白的核酸。本發(fā)明還提供從嗜熱毀絲霉上清液分離的、具有GH61蛋白活性的蛋白級分。這些制品可用于增加含纖維素的基質(zhì)經(jīng)歷被一種或多種纖維素酶諸如內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或纖維二糖水解酶糖化的反應(yīng)中產(chǎn)物的產(chǎn)量。在乙醇生產(chǎn)中GH61蛋白與纖維素酶的組合可用于分解纖維素生物質(zhì)為可發(fā)酵糖類。
文檔編號C12N9/24GK103080306SQ201180040308
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者蒂普納斯·貝德亞洛伊, 路易斯·克拉克, 奧諾拉托·坎波皮亞諾, 克麗帕·拉奧, 洛蘭·紹博, 亞諾什·托羅克, 楊劼 申請人:科德克希思公司