專利名稱：Hspc117分子作為rna連接酶的用途的制作方法
HSPC117分子作為RNA連接酶的用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞和分子生物學(xué)工具領(lǐng)域，尤其是涉及RNA連接酶，及用于分析和治療的使用及抑制RNA連接酶的方法。
背景技術(shù)：
天然的連接RNA或DNA的酶通常將具有磷酰基的核酸分子在5’位置接合到具有羥基的第2核酸分子在3’位置。在能量轉(zhuǎn)移步驟中5’端的磷酸通常由ATP提供。轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)是對于信使RNA (mRNA)翻譯成蛋白必要的銜接子分子。類似于其他RNA分子，使前體tRNA轉(zhuǎn)錄物(前-tRNA)在它們實(shí)現(xiàn)它們的生物學(xué)功能之前經(jīng)歷擴(kuò)展的翻譯后加工。除了移出5’ -前導(dǎo)序列和3’ -尾隨序列，擴(kuò)展的堿基和糖修飾和核苷酸的模板-獨(dú)立添加之外，一些tRNA不得不經(jīng)歷干擾序列的切除。tRNA內(nèi)含子的移出由不同于mRNA的規(guī)范剪接體-依賴性加工的剪接過程實(shí)現(xiàn)。tRNA剪接還需要切下內(nèi)含子的特化的內(nèi)切核酸酶和用于接合外顯子半的連接酶(圖W。W02004/087884A2描述用于篩選涉及tRNA加工的小有機(jī)分子的方法。Pascal etal., Current Opinion in Structural Biologyl8 (I) (2008): 96-105 涉及 PNA 和 RNA 連接酶中的差異。Kato et al., Journal of Molecular Biology239 (5) (2003):903-911 描述嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的 RNA 連接酶的晶體結(jié)構(gòu)。Wang et al., RNAll (6)
(2005):966-975 實(shí)施了酵母 tRNA連接酶的結(jié)構(gòu)-功能分析。Okada et al., PR0TEINS63 (4)
(2006): 1119-1122提供來自超嗜熱火球菌(Pyrococcus horikoshii )的RtcB同源蛋白，一種RNA環(huán)化酶的晶體結(jié)構(gòu)。

盡管tRNA基因中內(nèi)含子的存在似乎是在全部生命域中共通的，剪接機(jī)理的進(jìn)化在連接步驟明顯分歧。已描述可歸因于不同生命界的2種主要的連接通路(Abelson等人，1998)。真菌及植物分化體使用由與噬菌體T4RNA連接酶I同源的單多功能多肽催化的共同的連接機(jī)理。此通路需要環(huán)狀磷酸二酯酶和多核苷酸激酶活性的作用，以制備用于隨后連接的外顯子末端。結(jié)果，來源于三磷酸核苷(NTP)供體的外源磷酸合入成熟tRNA (圖1A,上枝)。相反，動物和古細(xì)菌分化體可通過在內(nèi)切核酸酶反應(yīng)后直接接合2’，3’-環(huán)磷酸和5’-羥基(5’-0H)左末端來連接tRNA外顯子(Laski等人，1983)。此連接酶反應(yīng)(圖1A，降低枝)依賴于2’，3’-環(huán)狀-磷酸酯終結(jié)的RNA (RNA>p)，且導(dǎo)致源于前體的2’，3’-環(huán)磷酸并合到作為3’，5’ -磷酸二酯的成熟tRNA的剪接連接部(Fi Iipowicz和Shatkin，1983)。已闡明此RNA>p連接酶反應(yīng)的關(guān)鍵生物化學(xué)方面。但是，盡管許多生物化學(xué),生物信息學(xué)和遺傳努力，自從起初假定tRNA剪接通路，還未鑒定適合的RNA連接酶。

發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供至少也能使用2’，3’ -環(huán)磷酸終結(jié)的RNA作為底物的RNA連接酶(〃RNA>p連接酶〃)。此目標(biāo)由權(quán)利要求的主題達(dá)到。尤其是，本發(fā)明涉及HSPC117分子作為RNA連接酶作為分子生物學(xué)工具及在治療中的用途。HSPCl 17已被測序(例如.Genbank ACC NO:NP_055121或CAG33456)，及位于第22染色體orf28 (〃C220RF28〃)。HSPC117是由未知的功能的高度保守的結(jié)構(gòu)域(UPR)027)和獨(dú)特蛋白折疊表征的細(xì)菌/古細(xì)菌RtcB基因家族的人同源物。UPR)027蛋白形成在植物或真菌模型生物中無可檢測的代表的直系同源基因(K0G3833)簇。此種系分布高度暗示動物和古細(xì)菌中RNA>p連接酶活性的排他性的發(fā)生。HSPC117在本文也被稱為HSPC117/C220RF28或RtcB/HSPC117。如本文所用，表述"HSPC117分子〃指稱此簇中任何同源或直系同源分子，其現(xiàn)在已鑒定為催化RNA連接酶反應(yīng)。該"HSPC117分子〃的例序列在圖6中作為SEQ IDN0:1 SEQ ID NO: 11給出。全部HSPCl 17分子已發(fā)現(xiàn)含有對應(yīng)于SEQ ID NO:1的C122的催化性半胱氨酸殘基。HSPCl 17分子和序列已進(jìn)一步描述于，例如US2007/0204352A1 (尤其SEQID NO: 15，16，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78)，但是之前無創(chuàng)造性用途的認(rèn)識。US2007/0204352A1涉及潛在地涉及α -突觸核蛋白的聚集的基因的篩選。在段落[50]，US2007/0204352A1提供顯著的程度的HSPC117基因的進(jìn)化保守的背景，其蛋白可在本發(fā)明的方法中，在這些HSPCl 17分子的新功能的知識中使用。本發(fā)明的RNA連接酶可用于催化第IRNA轉(zhuǎn)移到第2RNA。兩個RNA末端可由連接酶連接。此連接通常是兩個RNA之間的磷酸二酯鍵的共價連接。尤其是，一個RNA可包含3’磷酸，尤其是以2’，3’ -環(huán)磷酸形式，及另一 RNA可包含5’ -OH末端。該端之間尤其是通過使用5’ -OH末端形成連接的能力是本發(fā)明的HSPC117分子的獨(dú)特特征。一般而言，RNA連接可為鏈間或鏈內(nèi)連接。2個分離RNA鏈可分別在3’和5’端連接。此外，在鏈內(nèi)連接中 ，連接一個RNA分子的5’和3’端。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，RNA是雙鏈。尤其是，由本發(fā)明的RNA連接酶連接的第I和/或第2RNA分子可包含雙鏈部分或是完全雙鏈或替代性地是單鏈。尤其優(yōu)選的是，由RNA連接酶反應(yīng)連接的其他RNA端的上述3’端以及5’末端可為雙鏈。RNA的，尤其是RNA剪接的其他部分也可為單鏈，通常有前-tRNA的單鏈3’懸伸。而且，由RNA連接酶反應(yīng)連接的5’和/或3’端可為單鏈，如在前-tRNA加工中的通常情況。雙-鏈可為第I和第2RNA分子之間的堿基配對，或替代性地可為與其他RNA鏈的堿基配對。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的HSPC117分子用于RNA剪接。在RNA剪接反應(yīng)中，將由本發(fā)明的RNA連接酶連接的2外顯子之間的內(nèi)含子部分移出。典型剪接反應(yīng)是外顯子1-內(nèi)含子-外顯子2序列到外顯子1-外顯子2的反應(yīng)。其他剪接反應(yīng)可移出幾個內(nèi)含子，且任選地也移出這些內(nèi)含子部分之間的外顯子。由HSPC117分子作為RNA連接酶的創(chuàng)造性使用連接的RNA可具有任何長度。例RNA長度是2 3000個核苷酸或堿基對長。在特定實(shí)施方式中，第IRNA或第2RNA可為多于 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50，60，70，80，90 或多于 100 個核苷酸或堿基對長。替代性地或此外，RNA，第IRNA或第2RNA或二者，可為達(dá)3000,2000，1500,1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100，80，70，60 或達(dá) 50 個核苷酸或堿基對長。本發(fā)明的HSPC117分子可具有下列之任一個:SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:1l0 序列提供分別智人(H.sapiens),小家鼠(Μ.musculus),光滑爪蟾(X.1aevis),紫色球海膽(S.purpuratus),黑腹果蜆(D.melanogaster),秀麗隱桿線蟲(C.elegans),萊哈衣滴蟲(C.reinhardtii),詹氏甲燒球菌(M.jannaschii),超嗜熱火球菌(P.horikoshii),嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)或大腸埃希氏菌(E.coli)的例HSPC117分子。其他HSPCl 17序列或序列變體公開于SEQ ID NO: 12 23，還提供來自智人(Homo sapiens),秀麗隱桿線蟲(C.elegans),果蜆屬(Drosophila),始(Danio rerio),牛，小鼠和大鼠的核酸和氨基酸序列。本發(fā)明的HSPC117分子可從任何這些生物得到。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的HSPC117分子是動物或古細(xì)菌的，尤其是哺乳動物，諸如靈長類動物，包括人，或嚙齒動物，尤其是小鼠或大鼠的。本發(fā)明的HSPC117分子可還由一個或更多氨基酸取代或缺失修飾。此外，本發(fā)明的HSPC117分子可作為融合蛋白的部分表達(dá)，且可還包含另外的氨基酸或多肽序列。尤其優(yōu)選的是，本發(fā)明的HSPCl 17分子與下列之任何一個具有至少45%，50%, 55%，60%, 65%，70%，75%，80%，85%，90%或至少 95% 的序列同一性:SEQID NO:1SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID N0:23。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，序列同一性是與SEQ ID NO:1相關(guān)的。序列同一性通常在 SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6,SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23 的全長序列上計算。當(dāng)然該HSPC117分子變體維持上述RNA連接酶活性，如可由標(biāo)準(zhǔn)測定容易測定，如在本文實(shí)施例部分中顯示。尤其重要性的是，HSPCl 17分子維持催化性地重要?dú)埢?，諸如SEQID N0:1的半胱氨酸122。本發(fā)明的HSPC117分子的變體例如描述于US2007/0204352A1(尤其是其 SEQ ID N0:15，16，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78)，在本文通過引用作為 SEQ IDNO: 12 23合并，且可用于本發(fā)明的目的。在氨基酸取代的情況中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的取代是保守的氨基酸取代。保守的取代是氨基酸基之內(nèi)的突變。氨基酸通常根據(jù) 它們的極性，電荷和/或尺寸分組。以下組是值得注意的:堿性氨基酸:精氨酸，組氨酸，賴氨酸；酸性氨基酸:天冬氨酸，谷氨酸；極性氨基酸:天冬酰胺，谷氨酰胺；小氨基酸:丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸；芳族氨基酸:苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸，組氨酸；疏水氨基酸:亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸。半胱氨酸是特殊情況，由于其可通常用絲氨酸和任何其他極性不帶電的側(cè)鏈保守地取代和反之亦然。甘氨酸可用作任何氨基酸的取代基。甘氨酸可通常由小側(cè)鏈諸如由丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸取代。脯氨酸可通常取代，或用作甘氨酸的取代基。在再一方面，本發(fā)明涉及連接至少2個RNA分子的方法-例如以上描述-包括使用上述HSPC117分子。在本文中，表述〃使用..作為RNA連接酶〃和〃連接RNA分子的方法〃互換使用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的用途或方法可包括使至少2個RNA分子與HSPCl 17分子在細(xì)胞內(nèi)接觸。本發(fā)明也涉及重組HSPC117的用途。上述重組HSPC117 (包括任何同源物或直系同原物)可通過包含與調(diào)控DNA序列(其可為異源調(diào)控序列)，諸如啟動子或增強(qiáng)子可操作的連接的一個或更多HSPC117DNA序列的遺傳構(gòu)建體在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來容易獲得。例宿主細(xì)胞是細(xì)菌，古細(xì)菌，真菌(包括酵母)，植物或動物(包括昆蟲或哺乳動物)細(xì)胞。在該構(gòu)建體中，其設(shè)計在常見的實(shí)驗(yàn)室手冊中描述且對于熟練的技工常規(guī)，調(diào)控序列可可操作地連接到編碼HSPC117分子的多核苷酸或其具有RNA連接酶活性的有活性的變體。本發(fā)明的HSPC117分子可諸如在細(xì)胞中體內(nèi)使用，例如人工提供到其中或在細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)。2個RNA分子可在所述細(xì)胞內(nèi)根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式連接。細(xì)胞可為上述任何細(xì)胞，優(yōu)選非-人細(xì)胞或分離的人細(xì)胞。在進(jìn)一步實(shí)施方式中RNA分子可與HSPCl 17分子體外或原位諸如例如包括在細(xì)胞之外或在無細(xì)胞的溶液中接觸。用本發(fā)明的HSPC117分子，以分離的樣式，離體連接RNA分子是可能的。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)HSPC117是可天然地在體內(nèi)在復(fù)合物中也含有的催化性地有活性的蛋白。因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式，本發(fā)明的HSPC117分子也在該復(fù)合物中提供。復(fù)合物可為例如剪接體粒子，諸如可從核HeLa細(xì)胞提取物分離的SF3B粒子。其他復(fù)合成員，尤其是關(guān)于其他生物的其他HSPCl 17分子或其變體可從相應(yīng)生物的細(xì)胞提取物分離。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物可包含DEAD盒解螺旋酶DDX1，F(xiàn)AM98B分子，CG1-99分子，ASW或其任何組合，尤其優(yōu)選的是，DDXl和FAM98B分子的組合?？砂贖SPCl 17分子的復(fù)合物中的其他復(fù)合成員可為在實(shí)施例5中顯示的表I和2中的任何一種。根據(jù)本發(fā)明，HSPC117分子可本身提供?；蛘?，HSPCl 17分子可作為試劑盒的組分使用或提供。由此，在再一方面，本發(fā)明涉及含有HSPC117分子的試劑盒。試劑盒可還包含用于RNA連接酶的反應(yīng)緩沖劑，其包含緩沖劑組分或選自下列的一種或更多金屬離子:Mg2+，Mn2+, Ni2+或其混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，金屬離子以用于ca0.1 20mM,優(yōu)選I IOmM,尤其優(yōu)選的是2 5mM的終濃度范圍使用的量包括。除了以上-提及的金屬離子之外，試劑盒的緩沖劑可含有為本領(lǐng)域所熟知的通常的緩沖劑組分。該緩沖劑可例如包括磷酸鹽，Hepes, Tris-HCl組分。優(yōu)選緩沖劑在例如。PH6 pH9，優(yōu)選pH7 8，尤其優(yōu)選約pH7.4的生理學(xué)pH值的范圍。緩沖劑可包含強(qiáng)直物質(zhì)或約10 200mM KCl或NaCl的鹽。此外，緩沖劑可含有非-離子張度物質(zhì)諸如甘油。以測試試劑盒的形式，試劑盒可還包含是本發(fā)明的HSPC117分子的底物的RNA分子，尤其具有2’，3’環(huán)磷酸的RNA分子。此RNA分子可例如還包含標(biāo)記物諸如放射性標(biāo)記物，以在RNA連接酶反應(yīng)之前或之后檢測RNA分子。該試劑盒對于全部類型的反應(yīng)有用及以監(jiān)測RNA加工或雜交。本發(fā)明的HSPC117分子或試劑盒可尤其用于RNA連接或剪接研究。本發(fā)明在再一方面涉及包含外源地表達(dá)的HSPC117分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。細(xì)胞可為細(xì)胞系或包含在動物模型，尤其是非-人動物模型中。細(xì)胞系也可為穩(wěn)定地表達(dá)HSPC117分子的人細(xì)胞系。外源地表達(dá)的HSPC117分子的穩(wěn)定的表達(dá)通過在細(xì)胞內(nèi)插入HSPC117DNA在啟動子，優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動子控制下來達(dá)到。在特定實(shí)施方式中，可將此DNA插入細(xì)胞的基因組，其可由常規(guī)方法諸如可商購的系統(tǒng)如四環(huán)素-誘導(dǎo)性系統(tǒng)諸如t-REx系統(tǒng)(invitiOgen)達(dá)到。該細(xì)胞在與可連接的 RNA，尤其具有用于連接RNA分子的2’，3’環(huán)磷酸或5’ -OH的RNA組合是有用的。
本發(fā)明還涉及減少細(xì)胞內(nèi)的RNA連接酶活性，尤其是RNA>p連接酶活性的方法，其包括抑制細(xì)胞內(nèi)的HSPC117分子，優(yōu)選由敲除或RNAi。RNA>p連接酶活性，如上所述，涉及使用2’，3’ -環(huán)磷酸終結(jié)的RNA作為底物的RNA連接酶反應(yīng)。該方法可用于在所述細(xì)胞中減少tRNA產(chǎn)生或加工。HSPC117的減小可通過將結(jié)合，分開或通常滅活HSPC117的HSPC117的配體施用到所述細(xì)胞中或通過抑制HSPC117表達(dá)來達(dá)到。該結(jié)合抑制物是例如HSPC117抗體，其是例如可商購的。"HSPC117-抗體〃包括任何功能相當(dāng)體和其衍生物，包括結(jié)合HSPCl 17的抗體片段諸如Fab，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)v或單鏈抗體(scAb)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制通過減少所述細(xì)胞中HSPCl 17分子，優(yōu)選內(nèi)源性HSPCl 17分子的表達(dá)來達(dá)到。減少HSPCl 17表達(dá)的適合的抑制物是誘導(dǎo)RNAi的HSPC siRNA分子。優(yōu)選的抑制HSPCl 17表達(dá)的方法是敲除或RNAi。為敲除，將基因組HSPCl 17修飾為呈遞功能性HSPC117分子的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄或翻譯。該修飾可包括例如達(dá)200或更多核苷酸的大延伸缺失或催化性中心中的選擇性修飾(缺失或取代)。例如根據(jù)SEQ ID NO:1的人HSPCl 17序列的催化性C122的修飾足以防止功能分子的表達(dá)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易選擇替代性的修飾，其在分子細(xì)胞生物學(xué)家的常規(guī)能力之內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選的方法是RNAi(RNA干涉)。為拮抗細(xì)胞HSPCl 17表達(dá)，優(yōu)選施用siRNA分子，以減少表達(dá)和功能。RNA干涉是以序列特異性方式抑制基因表達(dá)的機(jī)理。RNA干涉是用于真核生物細(xì)胞中的特定基因功能的阻遏的高度有效方法。當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞和生物時，RNAi使短干擾RNA (siRNA)寡聚體或短-發(fā)卡RNA (shRNA)編碼載體的轉(zhuǎn)染后靶mRNA的降解。已描述各種RNAi的方法及通常知道改變植物細(xì)胞，果蠅和人黑色素瘤細(xì)胞中基因表達(dá)，如描述于例如US2002/0162126和US2002/0173478。選擇用于在本發(fā)明的方法和組合物中使用的siRNA以靶向HSPC117分子。以此方式，它們靶向?qū)?yīng)于HSPC117基因的各種RNA或其部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，在本文描述的siRNA也可包括是雜交體DNA/RNA構(gòu)建體或其任何相當(dāng)體，雙鏈RNA，微RNA (miRNA),以及siRNA形式諸如siRNA復(fù)制，病毒和非-病毒載體中的小發(fā)卡RNA (shRNA)和載體中的siRNA或shRNA的改變的siRNA。
在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及HSPC117敲除細(xì)胞或具有減少的或抑制的內(nèi)源性HSPCl 17表達(dá)的細(xì)胞。該細(xì)胞系可還用于RNA連接或剪接研究，即以研究RNA連接的功能。內(nèi)源性HSPC117表達(dá)的減小也具有無介導(dǎo)2’，3’環(huán)磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?’-0H RNA分子的本發(fā)明的HSPC117連接酶的背景活性的益處。與HSPC117在誘導(dǎo)型啟動子控制下的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組合，此允許RNA連接酶的特定開/關(guān)研究，且是控制連接酶活性的有用的工具，其僅用于剪接研究或作為細(xì)胞生物化學(xué)加工工具。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及不表達(dá)內(nèi)源性HSPC117、但用在誘導(dǎo)型啟動子控制下的HSPCl 17分子另外外源地轉(zhuǎn)染的HSPCl 17敲除細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，尤其優(yōu)選靈長類動物的細(xì)胞，尤其是人或嚙齒動物細(xì)胞諸如小鼠細(xì)胞。這些細(xì)胞，包括具有增加的或降低的上述HSPCl 17表達(dá)的細(xì)胞，可用于RNA連接或剪接研究。在再一方面，本發(fā)明中涉及具有異常tRNA加工的疾病或依賴于(增加的)tRNA加工的疾病的治療。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供HSPC117分子作為RNA連接酶的用途或抑制HSPC117分子的方法，前提是，排除由療法治療人或動物身體的方法，或HSPC117分子或HSPC117抑制物用作藥物的用途。HSPC117抑制物是減少上述HSPC117活性或表達(dá)的任何分子，優(yōu)選HSPCl 17抗體或HSPC117siRNA。HSPC117分子抑制可在幾種疾病中具有治療效果。該疾病包括增殖疾病，尤其是癌。通過減少tRNA加工，增殖活性可為大大降低，導(dǎo)致減少的細(xì)胞生長。因此，本發(fā)明提供減少腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括給所述細(xì)胞施用HSPC117分子抑制物。已知，腫瘤細(xì)胞具有異常地高的聚合酶(Pol)III轉(zhuǎn)錄速率(Marshall&White, 2008)。由于Pol III合成tRNA，靶向tRNA連接酶會在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)(高)tRNA生產(chǎn)率-限制。用于增殖的tRNA剪接組分的重要性例如公開于W02004/087884A2 (在本文通過引用合并)。在再一方面，本發(fā)明中提供治療依賴于宿主聚合酶的疾病或感染，諸如丁型肝炎病毒感染的方法，其包括給所述細(xì)胞施用HSPC117分子抑制物。人丁型肝炎病毒是僅動物病毒，已知使用宿主聚合酶復(fù)制其RNA基因組。病毒復(fù)制中涉及的宿主因子是難以捉摸的。牽涉在復(fù)制期間環(huán)化病毒基因組中的連接酶-宿主因子(Reid&Lazinski，2000)。在組合的蛋白質(zhì)組學(xué)-RNAi篩選中鑒定了多于100種與丁型肝炎抗原關(guān)聯(lián)的蛋白。部分鑒定的蛋白在RNA代謝中具有作用，且那些之一是HSPC117。組合的此顯示，HSPC117是用于治療丁型肝炎病毒感染的決定性靶。此外，本發(fā)明涉及治療與功能異常性tRNA剪接關(guān)聯(lián)的受試者中的疾病，尤其是由RNA>p而在tRNA連接中有缺陷，優(yōu)選腦橋小腦發(fā)育不全的方法，包括給所述受試者施用HSPC117分子。tRNA剪接通路和腦橋小腦發(fā)育不全之間的關(guān)聯(lián)已建立。此疾病屬于一組退行性常染色體隱性病癥，其具有出生前發(fā)作，小腦萎縮或發(fā)育不全和其他運(yùn)動損傷。機(jī)理上，這些疾病相關(guān)于在tRNA剪 接期間的內(nèi)含子的異常移出和外顯子的連接。因此功能HSPC117分子的施用可恢復(fù)正常剪接及內(nèi)含子移出及治療疾病，盡管其也是良好知道的，但在分子水平不明白tRNA代謝對腦功能具有特定影響。細(xì)胞通過分泌血管生成素(除了在血管發(fā)生中的知道的作用，顯示核糖核酸酶活性的因子)來應(yīng)答氧化應(yīng)激。血管生成素在反密碼子環(huán)切割成熟tRNA，由此產(chǎn)生被稱為tiRNA的tRNA塊，用于源于tRNA的應(yīng)激-誘導(dǎo)的RNA。tiRNA蓄積損傷蛋白合成，及因此有害于細(xì)胞健康和功能。滅活人tRNA連接酶HSPCl 17導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞中tiRNA增加。增加的HSPCl 17回復(fù)血管生成素切割及減少tiRNA水平。HSPCl 17因此可在再連接血管生成素-切割的tRNA中具有不同作用。此血管生成素反應(yīng)不可在HSPC117分子抑制后回復(fù)。由此，本發(fā)明也涉及諸如通過增加或降低細(xì)胞中的HSPC117活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞中tiRNA量的方法。在再一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含表達(dá)HSPC117分子的核酸，優(yōu)選表達(dá)載體形式的，或HSPC117分子抑制物，優(yōu)選上述抗體或其siRNA或變體。該組合物可為即用組合物，例如用于治療上述任何疾病。用于治療或預(yù)防性使用的藥物組合物或制劑可包含藥學(xué)可接受的稀釋劑，載體，增溶劑，乳化劑和/或防腐劑。本發(fā)明也提供用于藥物組合物，其包含治療有效量的HSPCl 17抑制物或表達(dá)核酸。術(shù)語〃治療有效量〃是指提供用于特定的條件和施用途徑的治療效果的量。組合物可為液體或冷凍干燥的形式，且包含具有各種pH值和離子強(qiáng)度的稀釋劑(Tris，乙酸鹽或磷酸鹽緩沖劑)，增溶劑諸如吐溫或聚山梨酯，載體諸如人血清白蛋白或明膠，防腐劑諸如硫柳汞或芐基醇，及抗氧化劑諸如抗壞血酸或偏亞硫酸氫鈉。特定組合物的選擇會依賴于許多因素，包括待治療的病情，施用途徑和期望的藥代動力學(xué)參數(shù)。核酸和siRNA制劑優(yōu)選在脂質(zhì)體制劑中施用。本發(fā)明的組合物可通過注射，皮下，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用，或由口腔，鼻，肺部或直腸施用。最終選擇的施用途徑會依賴于許多因素和可由本領(lǐng)域技術(shù)人員查明。以下會參照圖和實(shí)施例更詳細(xì)解釋本發(fā)明，不旨在限制。

圖1.RNA連接機(jī)理和RNA>p連接酶HSPCl 17的鑒定。(A)例證在描述的RNA連接通路中的機(jī)理差異的方案(B)將[5’ -32P]-pCp-放射性標(biāo)記的5’ -0H，3’ -P RNA寡核苷酸(以灰色描繪，星號標(biāo)記放射性標(biāo)記物的位置)與或不與AP溫育，及退火到RNA鏈(以黑色描繪)，在ATP的存在下與或不與T4Pnk溫育。將獲得的RNA雙聯(lián)體用作HeLa細(xì)胞提取物中鏈間連接的底物。在指示的時間點(diǎn)抽出連接反應(yīng)的等份，及通過變性凝膠電泳分析。
(C)為自HeLa提取物部分純化RNA>p連接酶建立的分級分離方案。在整個純化過程中，[5’ -32P]-pCp放射性標(biāo)記的5’ -0H，3’ -P dsRNA的鏈間連接用于監(jiān)測RNA>p連接酶活性。
(D)檢定來自HSPCl17-siRNA-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和對照-siRNA-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備的蛋白提取物的稀釋系列的鏈間連接。以上泳道的數(shù)指示提取物稀釋。(E)檢定相同的提取物在時程實(shí)驗(yàn)中的[a -32Pl-GTP-放射性標(biāo)記的前-tRNA的加工。(F)由蛋白印跡確認(rèn)提取物中HSPC117水平的減小。圖2.自穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞系的c-myc-HSPC117的親和純化產(chǎn)生RNA>p連接酶復(fù)合物。(A)將WT或C122A c-myc-HSPC117的IP與[a-32P]-GTP-放射性標(biāo)記的tRNA外顯子半溫育。將自非表達(dá)克隆制備的IP用作陰性對照。(B)由蛋白印跡確認(rèn)親和純化的特異性和在比較的IP中等同量的WT和突變體c-myc-HSPC117的存在。(C)將tRNA外顯子半在ATP的存在或缺失下與Clpl或T4Pnk溫育?；厥誖NA，并在與免疫純化的c-myc-HSPC117溫育中用作底物。(D)例證用于在成熟tRNA和環(huán)狀內(nèi)含子中剪接連接的最近鄰分析的過程的方案(Np，核苷3’ - 一磷酸酯；pN，核苷5’ - 一磷酸酯)。(E)通過變性凝膠電泳解析源于由T4Pnk/Rnll或親和性純化的c-myc-HSPC117產(chǎn)生的[a -32P]-UTP-放射性標(biāo)記的成熟tRNA的RNA酶Tl片段。從凝膠分離6聚體，7聚體和8聚體，由RNA酶T2消化，及在溶劑D中由TLC分析。(F)從凝膠分離由T4Pnk/Rnll或親和性純化的c-myc-HSPC117產(chǎn)生的環(huán)狀，[a -32P] -ATP-放射性標(biāo)記的內(nèi)含子，用RNA酶Pl消化，及在溶劑C中由TLC分析。圖3.有活性的RNA>p連接酶復(fù)合物用SF3B復(fù)合物共純化。(A)為自HeLa核提取物純化SF3B-復(fù)合物建立的親和性流程。在由固定的識別三甲基鳥苷(m32’2’7G)mRNA帽結(jié)構(gòu)的單克隆抗體H20耗盡U2之后，HSPCl 17-及SF3B-復(fù)合物被固定的單克隆SF3B155-導(dǎo)向的抗體13E12結(jié)合。(B)在自抗-SF3B15513E12柱洗脫后，在Superose6上由尺寸排阻分離SF3B和RNA>p連接酶復(fù)合物。由SDS-PAGE分析級分，且蛋白用考馬斯藍(lán)色染色。(C)使用tRNA外顯子半作為底物檢定從Superose6柱洗脫的級分的RNA>p連接酶活性。通過變性凝膠電泳分析從反應(yīng)回收的RNA。(D)RNA>p連接酶峰級分由SDS-PAGE分析，蛋白條帶通過用考馬斯藍(lán)色染色來可視化。由質(zhì)量光譜法鑒定標(biāo)記的條帶。(E)HSPC117而非RNA>p連接酶復(fù)合物的其他組分沉默后鏈間連接和tRNA成熟活性的喪失。用靶向C220RF28/HSPC117, DDXl, C140RF166/CG1-99，F(xiàn)AM98B, C20RF49/ASW 和 EGFP 的 siRNA 作為對照處理細(xì)胞。從這些細(xì)胞制備提取物及檢定[5’ -32P]-pCp-放射性標(biāo)記的dsRNA的鏈間連接，或(F) [a -32P]-GTP -放射性標(biāo)記的前-tRNA的加工。(G)由定量PCR確認(rèn)C220RF28/HSPC117，DDXl, C140RF166/CG1-99, FAM98B 和 C20RF49/ASW mRNA 的有效耗盡。結(jié)果表示三重 PCR 反應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(H) HSPC117，DDXl, FAM98B和β -肌動蛋白作為裝載對照的蛋白印跡確認(rèn)個體RNA>p復(fù)合成員的有效耗盡。圖4.HSPCl 17的沉默消除活HeLa細(xì)胞中的鏈間連接，且部分損傷體內(nèi)tRNA加工。(A)將[5’ -32P]-pCp-放射性標(biāo)記的dsRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)用靶向EGFP作為對照基因，HSPC117或RT⑶I的siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。在指定的時間點(diǎn)停止轉(zhuǎn)染。分離RNA及通過變性凝膠電泳分析。(B)用于siRNA和報告子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染和標(biāo)記的tRNA轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)的處理方案。(C)存在于標(biāo)記的tRNA報告子構(gòu)建體的元件的示意表示。(D)將表達(dá)Tet-阻遏物的HeLa細(xì)胞用靶向?qū)φ栈駿GFP，HSPCl 17或TSEN2的siRNA及用表達(dá)標(biāo)記的前-tRNA Ile的報告子構(gòu)建體pSTet-1le共轉(zhuǎn)染。在誘導(dǎo)之后，在指定的時間點(diǎn)分離RNA，及由RNA印跡分析。(E)多RNA印跡實(shí)驗(yàn)的定量。一式三份進(jìn)行siRNA和報告子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染。自細(xì)胞回收RNA,由RNA印跡檢測成熟tRNA,及由Phosphorimaging使用ImageQuant定量。誤差條表不標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5.由RNAi耗竭HSPC117的提取物中體外RNA連接缺陷的遺傳拯救。(A)將穩(wěn)定的小鼠-BAC轉(zhuǎn) 基因HeLa細(xì)胞庫或野生型HeLa細(xì)胞用靶向人HSPCl 17的非-保守的3’-UTR的siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染。檢定從這些細(xì)胞制備的提取物的與[5’-32P]-pCp-放射性標(biāo)記的dsRNA的鏈間連接。以上泳道的數(shù)指示連接產(chǎn)物的相對量。泳道I中的信號任意設(shè)置為1.0。(B)從相同的實(shí)驗(yàn)平行分離RNA，及由定量PCR分析小鼠和人HSPCl 17的水平。HeLa細(xì)胞中的人HSPCl 17和小鼠-BAC轉(zhuǎn)基因HeLa細(xì)胞庫中的人和鼠HSPCl 17的表達(dá)水平任意設(shè)置為100%。圖6.HSPC117/RtcB蛋白的序列比對。HSPC117/RtcB蛋白在古細(xì)菌，細(xì)菌和動物中廣泛分布，但不在植物和真菌中。星號指示在人/鼠HSPC117的假定的活性位點(diǎn)中特征性的C122A突變的位置。使用以下序列標(biāo)識符:智人(H.sapiens):SEQ ID NO:1,小家鼠(M.musculus):SEQ ID N0:2，光滑爪蟾(X.laevis):SEQ ID N0:3，紫色球海膽(S.purpuratus):SEQ ID NO:4,黑腹果蜆(D.melanogaster):SEQ ID N0:5,秀麗隱桿線蟲(C.elegans):SEQ ID NO:6，萊哈衣滴蟲(C.reinhardtii):SEQ ID N0:7，詹氏甲烷球菌(M.jannaschii):SEQ ID NO:8,超嗜熱火球菌(P.horikoshii):SEQ ID N0:9,嗜熱棲熱菌(T.thermophilus):SEQ ID NO: 10,大腸埃希氏菌(E.coli):SEQ ID NO: 11。圖7.用于剪接連接磷酸酯的最近鄰分析的流程詳細(xì)解釋。(A)描繪的前-tRNA是用[a -32P]-UTP身體-標(biāo)記的。為簡便起見，僅顯示放射性標(biāo)記的磷酸酯。用詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的重組體剪接內(nèi)切核酸酶(MjTSEN)的這前-tRNA的切割產(chǎn)生具有放射性標(biāo)記的末端2’，3’-環(huán)磷酸的5’-外顯子半。外顯子半與c-myc-HSPC117的連接導(dǎo)致含有源于前體的剪接連接磷酸酯的成熟tRNA分子的形成。在相同的外顯子半與T4Pnk和T4Rnll的混合物連接期間，剪接連接磷酸酯被由三磷酸核苷提供的外源磷酸酯取代。結(jié)果，放射性剪接連接標(biāo)記物失。從二個連接反應(yīng)分離成熟tRNA，及用RNA酶Tl消化。剪接連接現(xiàn)在含在RNA酶T17聚體中，其可由制備性變性凝膠電泳分離。RNA酶T17聚體用RNA酶T2的完全消化釋放剪接連接磷酸酯，如鳥苷3’ - 一磷酸酯(Gp)。因此，放射性標(biāo)記的Gp的檢測指示源于前體的，放射性標(biāo)記的末端2’，3’ -環(huán)磷酸并合進(jìn)剪接連接體，如3’，5’-磷酸二酯。(B)描繪的前-tRNA是用[a-32P]-ATP身體-標(biāo)記的。此前體的切割產(chǎn)生具有放射性標(biāo)記的末端2’，3’ -環(huán)磷酸的線性內(nèi)含子。此線性內(nèi)含子與c-myc-HSPC117的連接產(chǎn)生含有放射性標(biāo)記的末端磷酸酯的環(huán)化的內(nèi)含子。在線性內(nèi)含子與T4Pnk和Rnl I連接期間，此磷酸酯被移出，及由三磷酸核苷提供的外源磷酸酯落在線性內(nèi)含子的第I尿嘧啶核苷核苷酸的5’-0H。由制備性變性凝膠電泳分離環(huán)化的內(nèi)含子。在與c-myc-HSPC117連接期間，放射性標(biāo)記的2’，3’-環(huán)磷酸成為線性內(nèi)含子的第I尿嘧啶核苷核苷酸的5’-磷酸酯。因此，環(huán)化的內(nèi)含子用RNA酶Pl的消化釋放連接磷酸酯作為尿嘧啶核苷5’-一磷酸酯(PU)。因此，放射性標(biāo)記的pU的檢測指示線性內(nèi)含子的放射性標(biāo)記的末端2’，3’ -環(huán)磷酸作為3’，5’ -磷酸二酯并合進(jìn)環(huán)狀內(nèi)含子。圖8.由RNAi耗竭HSPC117的提取物中體外RNA連接缺陷的生物化學(xué)拯救。由RNAi耗竭HSPCl 17的細(xì)胞的提取物由用SF3B粒子共純化的HSPCl 17-復(fù)合物的Superose6級分補(bǔ)充。就[a-32P ]-GTP-放射性標(biāo)記的前-tRNA的加工來檢定級分。圖9.用RNA>p連接酶通過用十字形DNA特異性抑制來干擾。(A)將[5’ -32P]-pCp-放射性標(biāo)記的dsRNA與HeLa細(xì)胞提取物在相比dsRNA底物2000倍摩爾過量的十字形(ScraPal)或?qū)φ誅NA (ScraPal Λ )雙聯(lián)體存在下溫育。在指定的時間點(diǎn)抽出等份的反應(yīng)，及通過變性凝膠電泳分析。(B)在相比RNA底物2000倍摩爾過量的十字形或?qū)φ誅NA雙聯(lián)體的存在下檢定HeLa提取物的[a -32P]-GTP-放射性標(biāo)記的前-tRNA的加工。在指定的時間點(diǎn)抽出等份的反應(yīng)，及通過變性凝膠電泳分析。圖10.用于體內(nèi)tRNA加工實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記的tRNA Ile的設(shè)計和HSPC117和TSEN2的RNA1-介導(dǎo)的耗盡的驗(yàn)證。編碼標(biāo)記的前-tRNA IleTAT的pSTet插入子與源于標(biāo)注的人基因組tRNA Ile座位的外顯子序列的比對(Chan和Lowe, 2009)。底行的大寫字母指示普遍地保守的殘基，星號指示關(guān)于Chrl9/trnalO-1leTAT的突變的位置。
實(shí)施例實(shí)施例1:由新生物化學(xué)策略鑒定哺乳動物RNA>p連接酶檢測RNA>p連接酶的新策略，如應(yīng)用潛在地導(dǎo)致tRNA連接酶的鑒定。偶然發(fā)現(xiàn)3’ -磷酸化的(3’ -P)，5’ -OH雙鏈RNA分子(dsRNA)在與人細(xì)胞提取物溫育后共價連接。在這些提取物中，3’ -P dsRNA由人RNA末端環(huán)化酶RT⑶I轉(zhuǎn)變?yōu)?’，3’ -環(huán)磷酸終結(jié)的dsRNA。因此，我們決定使用3’-P dsRNA作為穩(wěn)定的替代品底物用于難以捉摸的tRNA連接酶。鏈間連接需要與5’-0H互補(bǔ)鏈退火的3’-P單鏈RNA。通過與堿性磷酸酶(AP)溫育的3’_P的移出或通過與噬菌體T4多核苷酸激酶(T4Pnk)在ATP的存在下溫育的5’-OH的磷酸化或二者的組合抑制鏈間連接(圖1B)。此結(jié)果導(dǎo)致由典型活性引導(dǎo)的蛋白層析鑒定RNA>p連接酶。監(jiān)測鏈間連接，我們能通過4個純化步驟跟蹤RNA>p連接酶活性(圖1C)。不能進(jìn)一步分級分離鏈間連接活性，我們由在溶液胰蛋白酶消化中之后是串聯(lián)質(zhì)量光譜測量分析(MS)鑒定了最富集的MonoQ級分中含有的蛋白。91種(表SI)鑒定的多肽之一，HSPC117/C220RF28，由于以下原因呈現(xiàn)出具有特定興趣。第1，HSPC117是由未知的功能的高度保守的結(jié)構(gòu)域(UPR)027)和帶有推定的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)特蛋白折疊表征的細(xì)菌/古細(xì)菌RtcB基因家族的人同源物。有趣的是，在大腸埃希氏菌(E.coli)中，RtcB與RtcA，RNA3’ -P末端環(huán)化酶一起在σ 54-調(diào)控的操縱子之內(nèi)(Genschik等人，1998)。結(jié)果，RtcB/HSPC117蛋白已之前預(yù)測在RNA加工或修飾中具有功能(Galperin和Koonin, 2004)。第2，UPR)027蛋白形成直系同源基因(K0G3833)簇，在植物和真菌模型生物，擬南芥(Arabidopsis thaliana)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中無可檢測的代表。此種系分布在動物和古細(xì)菌中高度暗示RNA>p連接酶活性的排他的發(fā)生(Abelson 等人,1998)。實(shí)施例2:鏈間連接和tRNA成熟需要HSPCl 17因此，測試是否HSPC117的確涉及鏈間連接和tRNA加工。用靶向HSPC117或EGFP作為對照的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。從這些細(xì)胞制備提取物，及檢定鏈間連接。顯著地，HSPCl 17由RNA干涉(RNAi)的耗盡影響了鏈間連接(圖1D，比較泳道2_4與泳道5-7)。3’-P dsRNA僅用作替代底物，且RNA>p連接推定為tRNA剪接所需要。接下來，體外檢查沉默HSPCl 17對tRNA成熟的影響。適合的tRNA前體(前-tRNA)轉(zhuǎn)錄物在HeLa細(xì)胞質(zhì)提取物中加工為成熟tRNA (Laski等人，1983)。因此，與由RNAi耗竭HSPCl 17的提取物包括[a -32Pl-GTP-放射性標(biāo)記的前-tRNA轉(zhuǎn)錄物(圖1E)。減少的HSPC117水平損傷成熟tRNA的形成，且導(dǎo)致外顯子半的相伴的蓄積,與tRNA外顯子的連接中的生物化學(xué)功能一致。由蛋白印跡分析確證提取物中HSPC117水平的有效減小(圖1F)。用不同組的siRNA及由RNAi表型的拯救(圖5)通過自源于小鼠基因組DNA的細(xì)菌人工染色體(BAC)的耐RNAi的形式的HSPC117的表達(dá) 確認(rèn)HSPC117的siRNA-介導(dǎo)的耗盡的特異性。實(shí)施例3=HSPCl 17是哺乳動物RNA>p連接酶的催化性組分接下來研究是否HSPC117相關(guān)于RNA>p連接酶活性。因此，建立表達(dá)c-myc-標(biāo)記的鼠HSPC117的穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的克隆HeLa細(xì)胞系。基于UPR)027蛋白的多序列比對(圖6)及由出版的自超嗜熱火球菌(Pyrococcus horikoshii)的RtcB的晶體結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)(Okada等人，2006)，產(chǎn)生表達(dá)點(diǎn)突變c-myc-HSPC117C122A的穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的克隆細(xì)胞系。為了檢測獨(dú)立于RT⑶I和tRNA內(nèi)切核酸酶的tRNA連接酶活性，通過用自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的重組體剪接內(nèi)切核酸酶(MjTSEN)切割適合的[a -32P] -GTP放射性標(biāo)記的雜交體前-tRNA來制備tRNA外顯子半(Englert, 2005)。c-myc-HSPC117的親和純化產(chǎn)生了能連接tRNA外顯子半的免疫沉淀(IP)。相反，點(diǎn)突變體c-myc-HSPC117C122A作為RNA連接酶無活性(圖2A，比較泳道6和7與泳道8)。由蛋白印跡確認(rèn)等同量的野生型(WT)和C122A突變體c-myc-HSPC117的比較(圖2B，比較泳道2和3)。因此總結(jié)，HSPCl 17是tRNA連接酶的催化性組分。實(shí)施例4=HSPCl 17催化2’，3’ -環(huán)磷酸和5’ -OH RNA末端的直接連接RNA>p連接酶被預(yù)測需要其底物末端的5’ -0H。一貫地，當(dāng)tRNA外顯子半與重組5’ -OH RNA激酶CLPl在將3’ -外顯子的5’ -OH轉(zhuǎn)變?yōu)?’ -P的ATP的存在下預(yù)溫育時，在c-myc-HSPC117IP中無連接酶活性可檢測(圖2C,比較泳道2和3)。除了其5’ -OH RNA激酶活性之外，T4Pnk已知包含2’，3’ -環(huán)狀磷酸二酯酶和3’ -磷酸酶活性。如對于RNA>p連接酶預(yù)期，當(dāng)我們使用與T4Pnk在ATP (為了移出2’，3’ -環(huán)磷酸及為了另外地將5’ -OH轉(zhuǎn)變?yōu)?’ -P)缺失(為了移出2’，3’ -環(huán)磷酸)或存在下預(yù)溫育的tRNA外顯子半作為用于與c-myc-HSPC117IP連接的底物時，我們無法檢測任何連接酶活性(圖2C,泳道4和5)。由此，由描述的RNA>p連接酶的連接是對于5’ -OH (見也圖1B)和2’，3’ -環(huán)磷酸有利的。由RNA>p連接酶的tRNA外顯子半的連接的最特征性特征是在規(guī)范5’，3’ -磷酸二酯鍵中含有源于前體的剪接連接磷酸酯的成熟tRNA的產(chǎn)生(圖1A，更下游)。為了測試是否此對于由c-myc-HSPC117IP催化的RNA連接是真的，實(shí)施剪接連接磷酸酯的最近鄰分析(圖2D)。通過用重組體剪接內(nèi)切核酸酶切割[a-32P]-UTP-放射性標(biāo)記的前-tRNA來制備在5’ -外顯子半的末端具有放射性標(biāo)記的2’，3’ -環(huán)磷酸的tRNA外顯子半(圖7)。通過與c-myc-HSPC117IP或與T4Pnk和噬菌體T4RNA連接酶l(T4Rnll)的混合物作為陰性對照溫育來連接這些外顯子半。從這些反應(yīng)分離成熟tRNA，及由切割每鳥苷核苷酸的RNA3’和將其底物加工成由鳥苷3’- 一磷酸酯(Gp)終結(jié)的片段的RNA酶Tl消化。分離6 8個核苷酸長的片段，由RNA酶T2消化，及由薄層層析解析得到的核苷酸3’ - 一磷酸酯。通過此過程，僅在源于由c-myc-HSPC117產(chǎn)生的成熟tRNA的RNA7聚體中檢測到放射性標(biāo)記的Gp，指示源于前體的剪接連接磷酸酯的保留(圖2E，泳道3)。如所預(yù)期，剪接連接磷酸酯在用T4Pnk和T4Rnll實(shí)施的對照連接中交換(圖2E，泳道4)。由于無放射性標(biāo)記的NTP加入任何連接反應(yīng)，無放射性標(biāo)記的Gp在源于成熟，T4Rnll-連接的tRNA的RNA酶T1-7聚體的RNA酶T2消化中可檢測(圖2E，泳道4)。在由c-myc-HSPC117IP轉(zhuǎn)變成環(huán)化的內(nèi)含子之后也用2’，3’ -環(huán)磷酸末端放射性標(biāo)記的線性內(nèi)含子實(shí)施類似最近鄰域分析。由c-myc-HSPC117而非由T4Pnk/Rnll環(huán)化的內(nèi)含子的Pl核酸酶消化中放射性標(biāo)記的尿嘧啶核苷5’ - 一磷酸酯(PU)的檢測支持了剪接連接磷酸酯的保留(圖2F，比較泳道I和2)。其得出，鑒定的RNA>p連接酶通過將源于前體的剪接連接磷酸酯合并到成熟tRNA來在規(guī)范3’，5’-磷酸二酯鍵中接合tRNA外顯子半。實(shí)施例5=HSPCl 17在穩(wěn)·定的雜聚體蛋白復(fù)合物中醒目地，與我們的純化RNA>p連接酶的努力平行，至今未知功能的穩(wěn)定的和高度同質(zhì)的含有HSPC117的復(fù)合物發(fā)現(xiàn)與自核HeLa細(xì)胞提取物制備的剪接體SF3B粒子共純化。因此，測試SF3B-關(guān)聯(lián)的和高度純化的HSPC117-復(fù)合物，以呈現(xiàn)RNA>p連接酶活性。SF3B-關(guān)聯(lián)的HSPC117-復(fù)合物通過SF3B和U2剪接體復(fù)合物的解離，之后是U2的選擇性免疫耗竭來獲得。自流通回收未結(jié)合的SF3B-及HSPC117-復(fù)合物，由抗-SF3B155-偶聯(lián)的樹脂捕獲，和用抗體表位肽特別洗脫(圖3A)。在自親和性柱洗脫之后，SF3B-(圖3B，級分12 19)和HSPCl 17-復(fù)合物(圖3B，級分23 26)由尺寸排阻層析在Superose6上分離。一致于用c-myc-HSPC117IP獲得的初始數(shù)據(jù)，含有HSPC117-復(fù)合物而非SF3B剪接體復(fù)合物的級分將tRNA外顯子半和線性內(nèi)含子分別轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靦RNA及環(huán)化的內(nèi)含子(圖3C)。此外，相同的級分可生物化學(xué)地拯救HSPC117的RNA1-耗竭的提取物的tRNA剪接缺陷(圖8)。在此含有HSPC117的復(fù)合物中鑒定的蛋白由自考馬斯藍(lán)染色的凝膠分離的單條帶的胰蛋白酶消化之后是MS分析來分析。除了 C220RF28/HSPC117之外，鑒定的蛋白包含DEAD盒解螺旋酶DDXl及ninein相互作用蛋白C140RF166/CG1-99 (除了 FAM98B之外)和亞化學(xué)計量的ASW/C20RF49 (圖3D)。此組蛋白與來自穩(wěn)定的細(xì)胞克隆的c-myc_HSPC117 (表2)和MonoQ RNA>p連接酶級分中鑒定的蛋白(圖1C和表I)的免疫沉淀的MS分析的結(jié)果重疊。
權(quán)利要求
1.HSPCl 17分子作為RNA連接酶的用途，優(yōu)選用于將第IRNA端轉(zhuǎn)移到第2RNA端，尤其優(yōu)選的是其中第I端包含3’磷酸，優(yōu)選2’，3’ -環(huán)磷酸，和/或其中第2端包含5’ -OH末端。
2.權(quán)利要求1的用途，用于鏈間或鏈內(nèi)連接。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中RNA是雙鏈。
4.權(quán)利要求1 3之任一項(xiàng)的用途，用于RNA剪接。
5.權(quán)利要求1 4之任一項(xiàng)的用途，其中RNA是mRNA或tRNA。
6.權(quán)利要求1 5之任一項(xiàng)的用途，其中RNA是2 3000個核苷酸或堿基對長。
7.權(quán)利要求1 6之任一項(xiàng)的用途，其中HSPCl17分子具有下列之任何一個:SEQ IDNO:1SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9，SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23。
8.連接至少2個RNA分子的方法， 包括使用根據(jù)權(quán)利要求1 7之任一項(xiàng)的HSPC117分子， 優(yōu)選包括使至少2個RNA分子與所述HSPCl 17分子在細(xì)胞內(nèi)接觸，或 優(yōu)選包括使至少2個RNA分子與所述HSPCl 17分子體外接觸， 尤其優(yōu)選的是還包括給復(fù)合物中的HSPC117分子提供，優(yōu)選剪接體粒子，優(yōu)選其中復(fù)合物包括DEAD盒解螺 旋酶DDXl分子，F(xiàn)AM98B分子，CG1-99分子，ASff或其任何組合。
9.適合于實(shí)施RNA連接的試劑盒，包含HSPCl 17 分子， RNA連接酶反應(yīng)緩沖劑，其包含:緩沖劑組分及選自下列的一種或更多金屬離子:Mg2+，Mn2+，Ni2+或其混合物，用于以ca0.1 20mM，優(yōu)選I 10mM，尤其優(yōu)選的是2 5mM的終濃度范圍使用，任選地還包含具有2’，3’ -環(huán)磷酸，優(yōu)選還具有標(biāo)記物的RNA分子。
10.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包含優(yōu)選用誘導(dǎo)型啟動子外源地表達(dá)的HSPC117分子。
11.HSPC117敲除細(xì)胞或具有減少的抑制的內(nèi)源性HSPC117表達(dá)的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10或11的細(xì)胞，其為哺乳動物細(xì)胞。
13.減少細(xì)胞內(nèi)的RNA連接酶活性，尤其是RNA>p連接酶活性的方法包括抑制細(xì)胞內(nèi)的HSPCl 17分子，優(yōu)選由敲除或RNAi。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于抑制是通過減少所述細(xì)胞內(nèi)的HSPC117分子，優(yōu)選內(nèi)源性HSPCl 17分子的表達(dá)。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其用于減少所述細(xì)胞內(nèi)的tRNA產(chǎn)生或加工。
16.權(quán)利要求10 12之任一項(xiàng)的細(xì)胞用于RNA連接或剪接研究的用途，優(yōu)選以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的tiRNA量。
17.減少腫瘤細(xì)胞生長或依賴于宿主聚合酶的疾病或感染，諸如丁型肝炎病毒感染的方法，包括給所述細(xì)胞施用HSPCl 17分子抑制物，或治療與功能異常性tRNA剪接關(guān)聯(lián)的受試者中的疾病，優(yōu)選腦橋小腦發(fā)育不全的方法，包含給所述受試者施用HSPC117分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及HSPC117分子作為RNA連接酶的用途，連接RNA分子的方法，用于這些方法和用途的試劑盒和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
文檔編號C12N9/00GK103228783SQ201180041769
公開日2013年7月31日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者J·波寶, S·威澤爾, J·馬蒂內(nèi), K·美希特勒, A·施勒費(fèi)爾 申請人:分子生物技術(shù)院有限公司