專利名稱：顯性突變基因表達(dá)抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含可選擇性且有效地抑制顯性突變基因的表達(dá)的RNAi分子的顯性突變基因的表達(dá)抑制劑、包含該表達(dá)抑制劑的藥物組合物及所述RNAi分子的設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
近年來，作為與化合物及抗體并列的新型醫(yī)藥或診斷藥，在生物體內(nèi)控制特定的基因的表達(dá)的功能性核酸備受關(guān)注，在世界各國(guó)中正進(jìn)行面向其醫(yī)療應(yīng)用的各種研究及開發(fā)。對(duì)功能性核酸而言，已知有利用經(jīng)由RNAi (RNA interference:RNA干擾)的基因沉默在轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)的siRNA (small interfering RNA，小干擾RNA)、shRNA (short hairpin RNA,短發(fā)夾 RNA)及 miRNA (micro RNA,微小 RNA),或與轉(zhuǎn)錄因子等靶物質(zhì)特異性結(jié)合來抑制其功能的核酸適體，與靶mRNA結(jié)合而抑制其翻譯的反義核酸，含有作為陷阱序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域等調(diào)節(jié)區(qū)域，并通過捕捉靶物質(zhì)來抑制其轉(zhuǎn)錄因子引起的基因表達(dá)的陷阱DNA，特異性地阻礙靶基因的mRNA前體中的多聚腺苷酸化而使其不穩(wěn)定化后，將其引入分解的Ul接頭等。這些均被期待作為下一代的醫(yī)藥或診斷藥，其中，從其目標(biāo)特異性、應(yīng)用性的廣度及作用效果的可靠性的方面考慮，利用siRNA或shRNA的RNAi作為可抑制期望的基因表達(dá)的強(qiáng)力的基因表達(dá)控制工具引人注目。

作為RNAi的應(yīng)用，可以特異性地抑制期望的等位基因的表達(dá)的等位基因特異的基因沉默(allele-specific RNA1:ASP-RNAi)不會(huì)對(duì)野生型基因的表達(dá)造成影響，可特異性地抑制引起疾病的靶顯性突變基因的表達(dá)，因此，一般認(rèn)為是疾病治療法上極其有用的方法。例如，作為常染色體顯性遺傳疾病之一已知的難治性的進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:F0P)是由作為原因基因的ALK2 (Activin-like kinase2:激活素樣激酶2)基因上的第617位的G(鳥嘌呤)取代為A(腺嘌呤)的點(diǎn)突變或第1067位的G取代為A的點(diǎn)突變引起的。具有這些點(diǎn)突變的任一種的突變基因?yàn)轱@性，因此，即使為具有野生型ALK2基因的雜合體也會(huì)引發(fā)FOP (非專利文獻(xiàn)I 3)。但是，現(xiàn)在還未知抑制FOP的發(fā)病及發(fā)展的有效方法。在此，若可利用ASP-RNAi僅抑制顯性突變基因的表達(dá)且容許野生型基因的表達(dá)，則可以抑制以FOP為代表的常染色體顯性遺傳疾病的發(fā)病，另外，若為已發(fā)病的患者，則可以阻止其發(fā)展。這樣，ASP-RNAi在RNAi中特別是作為藥物或診斷用藥的實(shí)用性極高。但是，在如上所述的通過點(diǎn)突變的堿基置換的突變基因和野生型基因中，其基因間的堿基序列僅I 數(shù)個(gè)堿基不同，因此，基于現(xiàn)有的一般的設(shè)計(jì)方法的RNAi分子對(duì)于突變基因的特異性低，甚至抑制野生型基因的表達(dá)。另外，即使如產(chǎn)生含有不連續(xù)接合點(diǎn)(接合點(diǎn)，connection point)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的顯性突變基因那樣，在突變基因和野生型基因的堿基序列之間存在明顯的不同的情況下，也未必能說利用現(xiàn)有方法設(shè)計(jì)的RNAi分子對(duì)于突變基因的特異性高，但卻常常抑制野生型基因的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)這樣的ASP-RNAi，對(duì)于突變基因特異性極高的siRNA或shRNA的開發(fā)不可或缺。另一方面，在siRNA等的設(shè)計(jì)中，必須將含有突變位點(diǎn)(置換位點(diǎn)、缺失位點(diǎn)、插入位點(diǎn)等)周圍的堿基序列作為靶區(qū)域，因此，設(shè)計(jì)區(qū)域必然受到限制。因此，即使應(yīng)用公知的有效的siRNA的靶序列選擇方法，也存在未必能夠設(shè)計(jì)特異性高且有效的siRNA等的問題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I:Shore EM.，et al., 2006, Nature Genetics, Vol.38:525-527非專利文獻(xiàn)2:Nakajima M., et al., 2007, Journal of Human Genetics, Vol.52:473-475非專利文獻(xiàn)3:Furuya H., et al., 2008, American Journal of Medical GeneticsPart A, Vol.146A:459-46
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明開發(fā)了容許野生型基因或期望的顯性突變基因的表達(dá)、可僅選擇性且有效地抑制在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)的特定的靶顯性突變基因的表達(dá)的RNAi分子，其目的在于提供一種含有將該RNAi分子作為有效成分的顯性突變基因的表達(dá)抑制劑及該RNAi分子的設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明的目的在于提供一種治療由于顯性突變基因的表達(dá)而發(fā)病的遺傳性疾病的治療劑。用于解決課題的手段本發(fā)明人等為了解決所述課題重復(fù)進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可選擇性且有效地抑制在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)的特定的靶顯性突變基因的表達(dá)的siRNA等的RNAi分子結(jié)構(gòu)的一般規(guī)則。即，明確從與不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的有義鏈區(qū)域的3’端的堿基至其3’末端的堿基長(zhǎng)度設(shè)定為規(guī) 定的長(zhǎng)度的RNAi分子選擇性且有效地抑制顯性突變基因的表達(dá)，另一方面，對(duì)于野生型基因的表達(dá)，幾乎不顯示抑制效果或降低其表達(dá)。本發(fā)明是基于上述見解而完成的，提供以下發(fā)明。(I) 一種顯性突變基因的表達(dá)抑制劑，含有將ASP得分值為0.4以上的RNAi分子作為有效成分，其中，所述ASP得分由以下公式算出，ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)_(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)，(式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)；所述RNAi分子包含含有在作為靶的顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生至少一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)及與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的連續(xù)的16 30個(gè)堿基序列一致的堿基序列的RNAi有義鏈區(qū)域，以及含有與所述RNAi有義鏈區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域，且從與所述RNAi有義鏈區(qū)域上的任一不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的3’端的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的任一堿基構(gòu)成該RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基。(2) 一種顯性突變基因的表達(dá)抑制劑，含有將編碼ASP得分值為0.4以上的RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為有效成分，其中，所述ASP得分由以下公式算出，ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)_(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)，(式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)；所述RNAi分子包含含有在作為靶的顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生至少一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)及與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的連續(xù)的16 30個(gè)堿基序列一致的堿基序列的RNAi有義鏈區(qū)域，以及含有與所述RNAi有義鏈區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域，且從與所述RNAi有義鏈區(qū)域上的任一不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的3’端的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的任一堿基構(gòu)成該RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基。(3)如⑴或⑵所述的 抑制劑，其中，在RNAi有義鏈區(qū)域和RNAi反義鏈區(qū)域上進(jìn)一步附加TT或UU。(4)如(I) (3)中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，RNAi分子為siRNA。(5)如(I) (3)中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，RNAi分子為shRNA。(6)如⑴ (5)中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因中的突變從由堿基缺失、堿基插入、破壞剪接位點(diǎn)得到的堿基置換、基因重復(fù)、基因易位、以及染色體倒位構(gòu)成的組中選出。(7)如⑴ (6)中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因?yàn)楣δ塬@得型。(8)如(I) (7)中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因參與疾病的發(fā)病。(9)如(8)所述的抑制劑，其中，疾病為惡性新生物。(10)如(9)所述的抑制劑，其中，惡性新生物為非小細(xì)胞肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虴GFR基因；惡性新生物為大腸癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虲TNNBl基因；惡性新生物為胃癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虲DHl基因；惡性新生物為乳腺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虰RCAl基因或突變型BRCA2基因；惡性新生物為自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征I型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虯IRE基因；惡性新生物為自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃蚑NFRSF6/APT1/FAS基因；惡性新生物為慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)锽CR-ABL嵌合基因；惡性新生物為伯基特淋巴瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閏-myc-1gH-嵌合基因；惡性新生物為間變性大細(xì)胞淋巴瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镹PM-ALK-嵌合基因；惡性新生物為肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋ML4-ALK-嵌合基因；惡性新生物為隆突性皮膚纖維肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門OGFB-COLlAl嵌合基因；惡性新生物為先天性纖維肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋TV6-NTRK3嵌合基因；惡性新生物為低度惡性纖維粘液性肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镕US-CREB3L2嵌合基因；惡性新生物為骨外黏液樣軟骨肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋WS-CHN嵌合基因；惡性新生物為尤因肉瘤或促纖維增生性小細(xì)胞腫瘤(線維形成性小細(xì)胞腫瘍)，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷WSRl基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為腺泡狀橫紋肌肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷YT基因或SSX基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷LK基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為脂肪肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷HOP基因作為易位伙伴的嵌合基因；或者惡性新生物為透明細(xì)胞肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷TFl基因作為易位伙伴的嵌合基因。(11)如(10)所述的抑制劑，其中，惡性新生物為非小細(xì)胞肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虴GFR基因。(12)如(11)所述的抑制劑，其中，RNAi分子的有義鏈區(qū)域由序列號(hào)3、5、7、9、11、
13、15、17、19、21、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、59、61、63、65、67、129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的核苷酸構(gòu)成。(13)如(10)所述的抑制劑，其中，惡性新生物為慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)锽CR-ABL嵌合基因。(14)如(13)所述的抑制劑，其中，RNAi分子的有義鏈區(qū)域由序列號(hào)97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的核苷酸構(gòu)成。(15)如⑶所述的抑制劑，其中，疾病為人常染色體顯性突變疾病。(16)如(15)所述的抑制劑，其中，人常染色體顯性突變疾病為先天性夜盲癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镽HO基因；人常染色體顯性突變疾病為耳聾基因區(qū)域DFNA2，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNQ4基因或GJB基因；人常染色體顯性突變疾病為瓦登伯革氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸ITF基因；人常染色體顯性突變疾病為非綜合征耳聾，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镈IAPH1/DFNA1基因或P0U4F3基因；人常染色體顯性突變疾病為肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門NNT2基因；人常染色體顯性突變疾病為家族性肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸YBPC3基因；人常染色體顯性突變疾病為心尖肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門NNI3基因；人常染色體顯性突變疾病為腓骨肌萎縮癥IA型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镻MP22基因；人常染色體顯性突變疾病為腓骨肌萎縮癥IB型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸PZ基因；人常染色體顯性突變疾病為長(zhǎng)QT綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNQl基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNEl基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTAI基因；人常染色體顯性突變疾病為短QT綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNH2基因或KCNJ2基因；人常染色體顯性突變疾病為布魯格達(dá)氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾CN5A基因或GPDlL基因或CACNA1C基因或CACNB2B或SCNlB基因；人常染色體顯性突變疾病為兒荼酚胺敏感型多形性室速，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镽YR2基因；人常染色體顯性突變疾病為心臟傳導(dǎo)障礙， 且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾CN5A基因或SCNlB基因；人常染色體顯性突變疾病為肌萎縮側(cè)索硬化癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門DP43基因；人常染色體顯性突變疾病為奴南氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镻TPNll基因；或者人常染色體顯性突變疾病為低鈣血癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镃aR基因。(17)如⑶所述的抑制劑，其中，疾病為強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镈MPK基因；疾病為脊髓性肌萎縮癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾MNl基因；疾病為先天性肌無(wú)力綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镃HRNE基因；疾病為額顳癡呆癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸APT基因；或者疾病為單純性生長(zhǎng)激素缺乏癥II型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镚Hl基因，(18) 一種藥物組合物，至少含有一種(I) (17)中任一項(xiàng)所述的抑制劑作為有效成分。(19)如從屬于(11)或(12)的(18)所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有有義鏈區(qū)域由序列號(hào)83或85所不的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體，以及/或者有義鏈區(qū)域由序列號(hào)89所示的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為有效成分。(20) 一種點(diǎn)突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑，含有有義鏈區(qū)域由序列號(hào)89所示的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。(21) 一種選擇性地抑制在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上具有不連續(xù)接合點(diǎn)的顯性突變基因的表達(dá)的RNAi分子的設(shè)計(jì)方法，其中，包括:(a)將與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 上的不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端和3’端的堿基分別作為第I和第2基準(zhǔn)堿基進(jìn)行設(shè)定的工序；(b)在所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，從對(duì)應(yīng)所述第2基準(zhǔn)堿基的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的堿基設(shè)定為對(duì)應(yīng)RNAi有義鏈的3’末端的堿基的工序；(c)在所述顯性突變基因中，將含有包括該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第I和第2基準(zhǔn)堿基的連續(xù)的16 30個(gè)堿基的堿基序列作為RNAi有義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序；(d)將含有與設(shè)定的有義鏈區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列作為RNAi反義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序。(22) 一種如(21)所述的設(shè)計(jì)方法，其中，進(jìn)一步含有(e)將ASP得分值為0.4以上的RNAi分子進(jìn)行篩選的工序，所述ASP得分由以下公式算出，ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)_(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)，(式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)。
(23)如(21)或(22)所述的抑制劑，其中，在RNAi有義鏈區(qū)域和RNAi反義鏈區(qū)域上進(jìn)一步附加TT或UU。本說明書含有作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2010-222847號(hào)、2011-044347號(hào)的說明書及/或附圖中所記載的內(nèi)容。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的顯性突變基因表達(dá)抑制劑，不會(huì)對(duì)野生型基因或除靶之外的顯性突變基因的表達(dá)造成大的影響，可選擇性且有效地抑制靶顯性突變基因的表達(dá)。根據(jù)作為本發(fā)明的顯性突變基因表達(dá)抑制劑的有效成分的RNAi分子的設(shè)計(jì)方法，可以針對(duì)成為疾病的原因的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上具有不連續(xù)接合點(diǎn)的顯性突變基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，且可提供一種應(yīng)用性高的設(shè)計(jì)方法。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，可以通過在遺傳性疾病中維持野生型基因的表達(dá)，同時(shí)選擇性地抑制成為疾病原因的靶顯性突變基因的表達(dá)，而治愈該疾病。


圖1為說明缺失突變的種類的概念圖，實(shí)線空白方塊(0102、0103)表示基因
(0101)的外顯子內(nèi)編碼區(qū)域(0102)或外顯子的全部或一部分(0103)，實(shí)線斜線方塊(0104,0105)表示基因的非編碼區(qū)域(5，非編碼區(qū)域:0104 ;3，非編碼區(qū)域:0105)，插到方塊上的實(shí)線(0106、0107)表示內(nèi)含子的全部(0106)或一部分(0107)，虛線所表示的區(qū)域?yàn)樵谌笔^(qū)域(0108、0109、0110、0111)中，虛線空白方塊表示基因的外顯子內(nèi)編碼區(qū)域的缺失區(qū)域(0108)或缺失外顯子(0112)，方塊間的虛線(0113、0114)表示缺失內(nèi)含子的全部(0113)或一部分(0114),箭頭(0115)表示轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；圖2為說明缺失 突變中的不連續(xù)接合點(diǎn)的概念圖(I)，分別A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，B表示突變基因，B’表示其突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，另外，C中用虛線表示的為突變基因B與野生型基因A對(duì)比時(shí)的缺失區(qū)域(b區(qū)域)，在該圖中，B’上的a區(qū)域和c區(qū)域的接合點(diǎn)(J)形成不連續(xù)接合點(diǎn)；圖3為說明缺失突變中的不連續(xù)接合點(diǎn)的概念圖(2)，分別A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，B表示突變基因，B’表示其突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，實(shí)線空白方塊(0301、0302)表示外顯子，方塊間的實(shí)線(0303、0304)表示內(nèi)含子的全部(0303)或一部分(0304)，星符號(hào)(0305)表示5’剪接位點(diǎn)，虛線所表示的區(qū)域(0306)為在突變基因中的缺失區(qū)域，在該圖中，突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’上，來自第一外顯子(0301)的一部分(0307)的區(qū)域與來自內(nèi)含子的一部分(0304)的區(qū)域的接合點(diǎn)(Jl)，以及來自內(nèi)含子的一部分(0304)的區(qū)域和來自第二外顯子(0302)的區(qū)域的接合點(diǎn)(J2)的兩個(gè)位置形成不連續(xù)接合點(diǎn)；圖4為說明缺失突變中的不連續(xù)接合點(diǎn)的概念圖(3)，分別A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，B表示突變基因，B’表示其突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，另外，C中用虛線表示的為突變基因B與野生型基因A對(duì)比時(shí)的缺失區(qū)域(0406)，在該圖中，突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’中，第一外顯子(0401)和第三外顯子(0403)的接合點(diǎn)(J)形成不連續(xù)接合
占.
圖5為說明插入突變中的不連續(xù)接合點(diǎn)的概念圖，分別A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，B表示突變基因，B’表示其突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，圖中的a區(qū)域和b區(qū)域中，分別空白方塊表示外顯子內(nèi)的編碼區(qū)域，斜線方塊表示外顯子內(nèi)的非編碼區(qū)域，c區(qū)域(網(wǎng)狀方塊)表示突變基因中的插入部分，在該圖中，突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’上，來自野生型外顯子a區(qū)域的區(qū)域和來自c區(qū)域的插入部分的區(qū)域的兩處接合點(diǎn)(J1、J2)形成不連續(xù)接合點(diǎn)；圖6表示RNAi分子結(jié)構(gòu)的概念圖，分別(A)表示雙鏈RNAi分子(siRNA)的情況及⑵表示單鏈RNAi分子(shRNA)的情況；圖7表示實(shí)施方式I中RNAi分子的設(shè)計(jì)方法的流程；圖8-1的A表示野生型EGFR基因和缺失突變型EGFR基因del (E764-A750)中的缺失位點(diǎn)周圍的堿基序列及氨基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型EGFR基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)樵撏蛔冃虴GFR基因的缺失區(qū)域，用箭頭表示相當(dāng)于該突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，B為將EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失突變型EGFR基因del (E764-A750)的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的^-半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖8-2的C表示EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失突變型EGFR基因del (E764-A750)的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖9-1的A表示野生型EGFR 基因和缺失突變型EGFR基因del (L747-T751)-L747S中的缺失位點(diǎn)周圍的堿基序列及氨基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型EGFR基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)樵撏蛔冃虴GFR基因的缺失區(qū)域，用箭頭表示相當(dāng)于該突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，B為將EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失突變型EGFR基因del(L747-T751)-L747S的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，各樣品的螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的P-半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖9-2的C表示EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失突變型EGFR基因del (L747-T751) -L747S的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖10-1的A表示野生型EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del (L747-E749) -A750P (G)中的缺失位點(diǎn)周圍的堿基序列及氨基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型EGFR基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)樵撏蛔冃虴GFR基因的缺失區(qū)域，另夕卜，在突變型EGFR基因中黑體字所表示的堿基為插入堿基，用箭頭表示相當(dāng)于該突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，在該缺失/插入突變型中存在兩處不連續(xù)接合點(diǎn)，B為將EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(G)的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，各樣品的螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的P-半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖10-2的C表示EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(G)的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖11-1的A表示野生型EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del (L747-E749) -A750P (A)中的缺失位點(diǎn)周圍的堿基序列及氨基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型EGFR基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)樵撏蛔冃虴GFR基因的缺失區(qū)域，另夕卜，在突變型EGFR基因中黑體字所表示的堿基為插入堿基，用箭頭表示相當(dāng)于該突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，在該缺失/插入突變型中存在兩處不連續(xù)接合點(diǎn)，B為將EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(A)的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，各樣品的螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的P-半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖11-2的C表示EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突變型EGFR基因del (L747-E749) -A750P (A)的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖12-1的A表示由費(fèi)城染色體(位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)上的ABL基因與位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂(22qll)上的BCR基因互相易位)表現(xiàn)的BCR-ABL嵌合基因和野生型ABL基因中易位位點(diǎn)周圍序列的喊基序列及氣基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型ABL基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)橐孜坏膮^(qū)域，在BCR-ABL嵌合基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)橥ㄟ^易位與BCR基因連接的ABL基因的區(qū)域，用箭頭表示相當(dāng)于該嵌合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，B為將BCR-ABL-siRNA針對(duì)野生型的非靶ABL基因和BCR-ABL嵌合基因的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的0 -半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖12-2的C表示BCR-ABL-siRNA針對(duì)野生型的非靶ABL基因和BCR-ABL嵌合基因的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖13-1的A表示由費(fèi)城染色體(位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)上的ABL基因與位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂(22qll)上的BCR基因互相易位)產(chǎn)生的BCR-ABL嵌合基因和野生型BCR基因中易位位點(diǎn)周圍序列的喊基序列及氣基酸序列的對(duì)比的圖，在野生型BCR基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域 為易位的區(qū)域，在BCR-ABL嵌合基因的堿基序列中，黑框圈出的區(qū)域?yàn)橥ㄟ^易位與ABL基因連接的BCR基因的區(qū)域，用箭頭表示相當(dāng)于該嵌合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)的位置，B為將BCR-ABL-siRNA針對(duì)野生型的非靶BCR基因和BCR-ABL嵌合基因的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的0 -半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖13-2的C表示BCR-ABL-siRNA針對(duì)野生型的非靶BCR基因和BCR-ABL嵌合基因的ASP得分值，用虛線表示ASP得分值0.4的邊界線；圖14表示在導(dǎo)入時(shí)，EGFR-siRNA(si747/49-3D19)針對(duì)源自人非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞系(PC3細(xì)胞)的EGFR del(L747-E749)-A750P突變的突變基因特異的RNAi效果的電泳圖；圖15表示在導(dǎo)入時(shí)，EGFR-siRNA (si747/49 (A)-8D19)針對(duì)PC3細(xì)胞的突變基因特異的RNAi效果的電泳圖；圖16為利用PC3細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)表示將EGFR-siRNA (si747/49-3D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的其細(xì)胞增殖抑制作用的圖；圖17表示將EGFR-siRNA (si747/49-3D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的siRNA的細(xì)胞毒性作用的圖；圖18表示將EGFR-siRNA(si747/49-3D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的PC3細(xì)胞的細(xì)胞增殖及生存活性的圖(I);圖19為利用PC3細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)表示將EGFR-siRNA (si747/49 (A)-8D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的其細(xì)胞增殖抑制作用的圖；圖20表示將EGFR-siRNA(si747/49-3D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的PC3細(xì)胞的細(xì)胞增殖及生存活性的圖(2);圖21表示將EGFR-siRNA(si747/49-3D19)導(dǎo)入到PC3細(xì)胞時(shí)的PC3細(xì)胞的細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的圖；圖22的A表示野生型EGFR基因和針對(duì)點(diǎn)突變型(置換突變型)EGFR基因I790M突變?cè)O(shè)計(jì)的siRNA的有義鏈區(qū)域中的置換位點(diǎn)周圍的堿基序列和氨基酸序列的對(duì)比的圖，在突變型EGFR基因的堿基序列中，黑體字所示的堿基為該突變型EGFR基因的置換位點(diǎn)，B為將EGFR-siRNA針對(duì)野生型的非靶EGFR基因和置換突變型EGFR基因I790M的表達(dá)抑制效果作為在各自的siControl的螢光素酶活性為1.0時(shí)的相對(duì)值算出，螢光素酶活性通過未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的作為外來對(duì)照的P -半乳糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)行校正；圖23表示將具有突變型EGFR del (L747-E749) -A750P的源自人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的PC3細(xì)胞、具有突變型EGFR del (E746-A750)的源自人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的PC9細(xì)胞、以及具有野生型EGFR的源自人子宮頸癌細(xì)胞系的HeLa細(xì)胞在各種濃度的抗癌試劑吉非替尼中暴露時(shí)的各細(xì)胞的細(xì)胞增殖及生存活性的圖，A表示PC3細(xì)胞，B表示PC9細(xì)胞，C表示HeLa細(xì)胞，各圖的值分別利用在未處理的細(xì)胞的細(xì)胞生存活性為100%時(shí)的相對(duì)值進(jìn)行表示；圖24表示向PC3細(xì)胞、PC9細(xì)胞、以及HeLa細(xì)胞給藥各種濃度的EGFR-siRNA時(shí)的各細(xì)胞的細(xì)胞增殖和生存活性的圖，A表示利用siRNA對(duì)PC3細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)的結(jié)果，B表示利用siRNA對(duì)PC9細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)的結(jié)果，C表示利用siRNA對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)的結(jié)果，各圖的值分別利用在未處理的細(xì)胞的細(xì)胞生存活性為100%時(shí)的相對(duì)值進(jìn)行表示；圖25的A表示向皮下移植的源自PC3細(xì)胞的腫瘤(箭頭)給藥siRNA等后第三周(9周齡)的裸鼠，a表示未給藥siRNA的個(gè)體，b表示給藥siControl的個(gè)體，c表示給藥EGFR-siRNA(si747/49-3D19)的個(gè)體，B表示在給藥siRNA等后第三周(9周齡)時(shí)，從未給藥siRNA的個(gè)體組(al a3)、給藥siControl的個(gè)體組(bl b3)以及給藥EGFR-siRNA(si747/49-3D19)的個(gè)體組(cl c3)中取出的源自PC3細(xì)胞的腫瘤；圖26表示向裸鼠給藥針對(duì)皮下移植的PC3細(xì)胞的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)時(shí)的腫瘤體積的時(shí)間變化圖，★符號(hào)表示與未給藥siRNA個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p<0.05)，另外，#符號(hào)表示與給藥siControl的個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p
<0.05)；圖27表示向裸鼠給藥針對(duì)皮下移植的PC3細(xì)胞的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)時(shí)的腫瘤濕重的圖，★符號(hào)表示與未給藥siRNA個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p
<0.05)，另外，#符號(hào)表示與給藥siControl的個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p
<0.05)；圖28的A表示向皮下 移植的源自PC3細(xì)胞的腫瘤(箭頭)給藥siRNA等后第三周(9周齡)的裸鼠，B表示在給藥siRNA等后第三周(9周齡)時(shí)，從各個(gè)體組(I組5只)中取出的源自PC3細(xì)胞的腫瘤；圖29表示向裸鼠給藥針對(duì)皮下移植的PC3細(xì)胞的EGFR-siRNA (si747/49 (A)-8D19)時(shí)的腫瘤體積的時(shí)間變化圖，★符號(hào)表示與未給藥siRNA個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(P < 0.05)，另外，#符號(hào)表示與給藥siControl的個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(P < 0.05)；圖30表示向裸鼠給藥針對(duì)皮下移植的PC3細(xì)胞的EGFR-siRNA(si747/49-8D19)時(shí)的腫瘤濕重的圖，★符號(hào)表示與未給藥siRNA個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p
<0.05)，另外，#符號(hào)表示與給藥siControl的個(gè)體的腫瘤體積相比有顯著性差異(p
<0.05)；圖31表示EGFR-siRNA的針對(duì)小鼠個(gè)體的副作用影響，A表示血漿中膽紅素總量，B表示血漿中直接膽紅素量，C表示血漿 中間接膽紅素量，以及D表示血漿中堿性磷酸酶的量，siEgfr為具有現(xiàn)有siRNA結(jié)構(gòu)的EGFR-siRNA。
具體實(shí)施例方式1.顯性突變基因表達(dá)抑制劑1-1.概要本發(fā)明的第I實(shí)施方式為顯性突變基因表達(dá)抑制劑。本發(fā)明的抑制劑的特征在于，含有RNAi分子和/或編碼其的表達(dá)載體作為有效成分，并選擇性地抑制顯性突變基因的表達(dá)。1-2.RNAi分子的構(gòu)成和定義在本說明書中，“RNAi分子”是指在生物體內(nèi)誘導(dǎo)RNA干擾(RNA interference)，可以經(jīng)由作為目標(biāo)顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分解在轉(zhuǎn)錄后翻譯前抑制(沉默)其基因的表達(dá)的分子。若為可經(jīng)由RNAi機(jī)制抑制基因的表達(dá)的分子，則可以為單鏈分子或雙鏈分子中的任一種。例如可以舉出如siRNA (small interfering RNA)之類的雙鏈分子、如shRNA (short hairpin RNA)或miRNA (micro RNA)之類的單鏈分子。關(guān)于RNA干擾,例如希望參照 Bass B.L.,2000, Cell, 101,235-238 ；Sharp P.A.，2001，Genes Dev.，15，485-490 ;Zamore P.D., 2002, Science, 296,1265-1269 ；Dernburg, A.F.&Karpen, G.H., 2002, Cell,111，159-162。予以說明，在本說明書中，以下，將經(jīng)由RNAi機(jī)制的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默作為“基因的表達(dá)抑制”表不。在本說明書中，RNAi分子由核酸構(gòu)成。在此所謂的“核酸”是指天然型核酸、非天然型核酸及/或核酸類似物。在本說明書中，“天然型核酸”是指以核苷酸作為構(gòu)成單元，它們通過磷酸二酯鍵連接而成的存在于自然界的生物體高分子。通常，具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶中任一堿基的核糖核苷酸連接而成的RNA及/或具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶中的任一堿基的脫氧核糖核苷酸連接而成的DNA符合。在本發(fā)明的RNAi分子中，特別優(yōu)選RNA為主要的構(gòu)成成分。在本說明書中，“非天然型核酸”是指含有非天然型核苷酸的或由其構(gòu)成的核酸。在此，“非天然型核苷酸”是指人工構(gòu)建或人工化學(xué)修飾的在自然界不存在的核苷酸，即包含具有與上述天然存在的核苷酸類似的性質(zhì)及/或結(jié)構(gòu)的核苷酸或具有與天然存在的核苷或堿基類似的性質(zhì)及/或結(jié)構(gòu)的核苷或堿基的核苷酸。例如可以舉出:脫堿基核苷酸、阿拉伯核苷酸、2’ -脫氧尿核苷、α-脫氧核糖核苷酸、β-L-脫氧核糖核苷酸、具有其它的糖修飾的核苷酸。進(jìn)而，含有取代戊糖(2’-O-甲基核糖、2’-脫氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖、1’，2’ -脫氧核糖)、阿拉伯糖、取代阿拉伯糖；取代己糖及具有α-端基異構(gòu)體的糖修飾的核苷酸。另外，非天然型核苷酸也含有包含人工構(gòu)建的堿基類似物或人工化學(xué)修飾的堿基(修飾堿基)的核苷酸。在對(duì)“堿基類似物”而言，例如可以舉出:2_氧代(IH)-吡啶-3-基、5位取代-2-氧代(IH)-吡啶-3-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6- (2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6- (2-噁唑基)嘌呤-9-基等。對(duì)“修飾堿基”而言，例如可以舉出:修飾的嘧啶(例如，5-羥基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶)、修飾的嘌呤(例如，6-甲基腺嘌呤、6-硫代鳥嘌呤)及其它的雜環(huán)堿基等。也可以含有甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸酯型DNA/RNA、磷酰胺酯型DNA/RNA、2’ -O-甲基型DNA/RNA等化學(xué)修飾核酸及核酸類似物。在本說明書中，“核酸類似物”是指具有與天然型核酸類似的結(jié)構(gòu)及/或性質(zhì)的人工構(gòu)建的化合物。例如可以舉出:肽核酸(PNA:P印tide Nucleic Acid)、具有磷酸酯基的妝核酸(PHONA)、交聯(lián)化核酸(BNA/LNA:Bridged Nucleic Acid,橋接核酸/Locked NucleicAcid，鎖核酸)、嗎啉代核酸等。另外，構(gòu)成本發(fā)明的RNAi分子的核酸可以根據(jù)需要用核酸用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記磷酸基、糖及/或堿基。核酸用標(biāo)記物質(zhì)可以利用該領(lǐng)域中公知的所有物質(zhì)。例如可以舉出:放射性同位元素(例如，3\、咕、140、016、生物素、熒光色素(例如，F(xiàn)ITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、J0E、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)或發(fā)光物質(zhì)(例如。吖啶酯(了
夕D夕二々厶工叉夕一))。在本說明書中，“突變”是指在基因上或染色體上產(chǎn)生的堿基序列的物理的或結(jié)構(gòu)的突變。雖然有在基因上產(chǎn)生的基因突變和在染色體上產(chǎn)生的染色體突變，但在本說明書中，若為在靶顯性突變 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生后述的不連續(xù)接合點(diǎn)的突變，則可以為任一種。另外，突變不僅為在自然界中產(chǎn)生的突變，也包含使用甲磺酸乙酯(EMS)或1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍的突變誘變劑等所人為誘發(fā)的突變和使用分子遺傳學(xué)的方法所導(dǎo)入的突變。突變的種類，可舉例基于基因中的堿基缺失、插入或置換、基因重復(fù)或易位、或者染色體倒位的突變?！叭笔А笔侵敢吧突虻膲A基序列的一部分缺失的突變。在此，“野生型基因”是指在同種基因的等位基因集合(集団)內(nèi)，在自然界存在較多，且其編碼的蛋白質(zhì)或功能性核酸具有該原本功能的基因。所謂“功能性核酸”也稱為非編碼RNA，即不編碼蛋白質(zhì)且其自身具有各種功能的RNA。例如，符合的有轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、以及微小RNA (miRNA)。在本發(fā)明中，一個(gè)基因中的缺失位點(diǎn)只要為在其缺失基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上引起不連續(xù)接合點(diǎn)的位點(diǎn)，則不特別限定其缺失堿基的數(shù)量或位置。一般有I 50個(gè)堿基、I 40個(gè)堿基、I 30個(gè)堿基、或I 20個(gè)堿基左右的缺失，但只要為利用缺失產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)果在具有其突變基因的個(gè)體上引起顯性突變的范圍，例如野生型基因的堿基序列的70 %以上、80 %以上、或90 %以上的缺失也是可以的。作為一個(gè)基因中的缺失位點(diǎn)的例子，可以舉出，如圖1A所示，在一個(gè)外顯子(OlOl)的編碼區(qū)域(0102)中，不含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(0115)的虛線所表示的一部分區(qū)域(0108)缺失的情況，如圖1B所示，在含有一個(gè)以上內(nèi)含子的基因中，不含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(0115)的含有一個(gè)以上的外顯子的完整區(qū)域(全領(lǐng)域)(0112)的區(qū)域(0109)缺失的情況(可以含有一個(gè)以上內(nèi)含子的完整區(qū)域和/或一部分區(qū)域；在圖1B中，缺失位點(diǎn)除一個(gè)外顯子的完整區(qū)域(0112)之外，還含有位于其兩側(cè)的兩個(gè)內(nèi)含子的一部分(0114))，如圖1C所示，在含有一個(gè)以上的內(nèi)含子的基因中，含有至少一個(gè)內(nèi)含子的完整區(qū)域(0113)的兩個(gè)外顯子的一部分(即，上游外顯子的3’端的一部分和下游外顯子的5’端的一部分)之間的區(qū)域(0110)缺失的情況，如圖1D所示，含有上游外顯子的3’端的一部分和位于其外顯子下游的內(nèi)含子的5’端的一部分的區(qū)域缺失的情況(可包含位于其間的一個(gè)以上的其他外顯子和內(nèi)含子的完整區(qū)域，在圖1D中，包含一個(gè)外顯子的完整區(qū)域(0112)、以及位于其兩端的一端的內(nèi)含子的完整區(qū)域(0113)和另一端的內(nèi)含子的一部分區(qū)域(0114))。另一方面，不含剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子的一部分區(qū)域的缺失或一個(gè)以上的完整區(qū)域的缺失由于在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上不產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)，因此不符合本發(fā)明的缺失?！安迦搿笔侵冈谝吧突虻膲A基序列中插入有一個(gè)以上的堿基的突變。在本發(fā)明中，基因內(nèi)的堿基插入的位置只要在外顯子內(nèi)就沒有特別限定。另一方面，插入到內(nèi)含子內(nèi)的情況下，通常，在基因表達(dá)后，其內(nèi)含子通過剪接除去，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上不產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)。因此，原則上內(nèi)含子內(nèi)的堿基插入并不包含于本發(fā)明的插入。但是，即使是內(nèi)含子內(nèi)的插入，通過插入而使后述的剪接位點(diǎn)被破壞時(shí)，由插入使得堿基的數(shù)量增加、其內(nèi)含子不能通過剪接正常被除去時(shí)，或在插入的堿基中含有相當(dāng)于外顯子的序列的結(jié)果、在剪接后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上插入新的外顯子時(shí)，如上情況在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)時(shí)，包含于本發(fā)明的插入。插入的堿基的數(shù)量沒有特別的限定。例如，可以如上述插入一個(gè)堿基，也可如轉(zhuǎn)座子插入數(shù)百個(gè)堿基以上?！爸脫Q”是指野生型基因的堿基與其他堿基置換的突變。通常，在置換突變中，對(duì)比野生型基因和突變基因的情況下，在兩者的基因以及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列中不產(chǎn)生缺口。因此，通常除了破壞剪 接位點(diǎn)的置換之外，在其基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上不產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)。另一方面，如果是破壞剪接位點(diǎn)的置換，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上，妨礙利用處于其剪接位點(diǎn)支配下的內(nèi)含子的剪接的除去的結(jié)果，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)，即如后述，在野生型基因和突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列之間產(chǎn)生缺口。因此，本發(fā)明中的置換僅以破壞剪接位點(diǎn)的置換為對(duì)象。在此，剪接位點(diǎn)是指在基因序列中進(jìn)行正常的剪接所必要的位點(diǎn)。例如，前mRNA剪接的情況，位于內(nèi)含子的5’末端周圍的5’剪接位點(diǎn)(供體位點(diǎn))、位于內(nèi)含子的3’末端周圍的3’剪接位點(diǎn)(受體位點(diǎn))，以及位于內(nèi)含子內(nèi)的分支點(diǎn)等的內(nèi)含子內(nèi)所定位置的一般位點(diǎn)符合。此外，也包含剪接所必要的內(nèi)含子內(nèi)的其他堿基或位于外顯子內(nèi)的堿基。另外，tRNA剪接或自剪接的情況下，對(duì)剪接需要的RNA序列內(nèi)的高次結(jié)構(gòu)的形成所必要的堿基符合。置換的堿基數(shù)量只要能夠破壞剪接位點(diǎn)，就沒有特別限定。例如，如剪接位點(diǎn)上的G(鳥嘌呤)，如果是前mRNA剪接所必要的堿基，也可以為一個(gè)堿基置換的點(diǎn)突變?！爸貜?fù)”是指染色體中存在多個(gè)相同的基因的突變。通常，基因重復(fù)伴隨含有其基因的染色體的一部分區(qū)域的重復(fù)發(fā)生。在本發(fā)明中，僅是基因的一部分重復(fù)，基于此，使在其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)的基因產(chǎn)生的重復(fù)成為對(duì)象?！耙孜弧笔侵富蚧蛉旧w的一部分在相同或不同染色體上改變其位置的突變。在本發(fā)明中，利用易位基因一部分移動(dòng)至不同位置的結(jié)果，在包含其易位基因一部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)成為對(duì)象。例如，易位結(jié)果產(chǎn)生的嵌合基因，即為不同的兩個(gè)以上的基因部分地融合的基因的情況下，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與成為其融合的基礎(chǔ)的各基因的任意的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)比具有不連續(xù)接合點(diǎn)的?！暗刮弧笔侵溉旧w的一部分的方向形成逆向的突變。在本發(fā)明中，利用倒位基因的一部分的方向形成逆向的結(jié)果，在含有其形成逆向基因的一部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)的成為對(duì)象?！巴蛔兓颉笔侵负信c野生型基因的堿基序列不同的堿基的基因。在本發(fā)明中，突變基因除了包括在染色體上先天性存在的突變基因以外，也包括后天性獲得的突變基因。突變基因不需要存在于構(gòu)成個(gè)體的全部的細(xì)胞中，也可以僅存在于一部分細(xì)胞、組織或器官中。例如可以舉出在一個(gè)體中，未存在于正常細(xì)胞中，僅存在于癌細(xì)胞中的突變基因。 在本說明書中，“顯性突變基因”是指在個(gè)體中基于其突變的性狀作為表型而顯現(xiàn)的突變基因。如果為在其個(gè)體上作為結(jié)果以顯性帶來異常表型的突變基因，則不論該突變基因是否具有編碼的蛋白質(zhì)或功能性RNA的活性。例如，可以為功能獲得型突變(gain of function mutation)或功能喪失型突變(loss of function mutation)中的任一種。功能獲得型突變含有引起蛋白質(zhì)表達(dá)量的上升(過表達(dá):overexpression)或活性上升(組成型活化！constitutive active或功能允進(jìn)型:hyper active)的性狀的超效等位基因突變(hypermorph mutation)、引起顯示新型功能活性的性狀的新效等位基因突變(neomorph mutation)及與源自野生型基因的蛋白質(zhì)拮抗或?qū)ζ湟种?、抑制野生型突變基因的性狀表達(dá)的反效等位基因突變(antimorph mutation:dominant negative)。另夕卜，對(duì)功能喪失型突變而言，可以舉出基因完全喪失了性狀表達(dá)能力的無(wú)效等位基因突變(amorph mutation)及引起基因的性狀表達(dá)能力的降低的亞效等位基因突變(hypomorphmutation)。在功能喪失型突變的情況，通常形成隱性的突變較多，但在本說明書中，僅限于其效果為顯性的突變?yōu)閷?duì)象。優(yōu)選為功能獲得型的顯性突變。在本說明書中，“不連續(xù)接合點(diǎn)”是指在將突變基因中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列與野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列對(duì)比時(shí)，通過至少一個(gè)堿基以上的缺口(該缺口可以位于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列端部)的存在，使突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間對(duì)應(yīng)的堿基的連續(xù)性中斷的在突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的堿基的接合部。不連續(xù)接合點(diǎn)可以在一個(gè)突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中有一個(gè)位置以上。該不連續(xù)性為基于突變基因的突變的不連續(xù)性。例如，如圖2所示，突變?yōu)橐粋€(gè)外顯子內(nèi)的堿基缺失的情況，野生型基因A中用b表示的區(qū)域所缺失的突變基因B的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’中，與野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物A’的堿基序列進(jìn)行對(duì)比時(shí)，用a和c表示的區(qū)域的堿基序列對(duì)應(yīng)，但在野生型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中a區(qū)域的3’末端的堿基與c區(qū)域的5’末端的堿基之間，其連續(xù)性中斷。此時(shí)，突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’中a區(qū)域的3’末端的堿基與c區(qū)域的5’末端的堿基的接合部(J)成為不連續(xù)接合點(diǎn)。另外，如圖3所示，突變基因B中的缺失(參照用虛線表示缺失位點(diǎn)的C)為由第I外顯子(0301)的3’末端的一部分堿基和第I內(nèi)含子(0303)的5’末端的一部分堿基構(gòu)成的區(qū)域(0306)的情況下，通過突變基因B的5’剪接位點(diǎn)(0305)的缺失，妨礙了由前mRNA剪接的第I內(nèi)含子的除去，結(jié)果生成含有第I內(nèi)含子(0303)的3’末端的一部分堿基的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’。在將該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’與野生型基因A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物A’的堿基序列對(duì)比時(shí)，5’端的第I外顯子(0301)的3’缺失末端的堿基，和3’端的第2外顯子(0302)的5’末端的堿基，其連續(xù)性中斷。因此，該情況下，第I外顯子(0301)的3’缺失末端的堿基和5’末端的一部分截?cái)嗟牡贗內(nèi)含子(0304)的5’缺失末端的堿基的接合部(Jl)，以及第I內(nèi)含子(0304)的3’末端的堿基和第2外顯子(0302)的5’末端的堿基的接合部(J2)的兩個(gè)位置成為不連續(xù)接合點(diǎn)。進(jìn)而，如圖4所示，突變基因B中的缺失(參照用虛線表示缺失位點(diǎn)的C)為由第I內(nèi)含子(0404)的3’末端的一部分堿基和第2外顯子(0402)的5’末端的一部分堿基構(gòu)成的區(qū)域(0406)的缺失的情況下，通過突變基因B的第I內(nèi)含子的3’剪接位點(diǎn)(0407)的缺失，第2外顯子(0402)的3’末端的一部分區(qū)域(0408)由剪接除去，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’可能為第I外顯子(0401)和第3外顯子(0403)成為連接狀態(tài)的情況。在該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’和野生型基因A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物A’的堿基序列進(jìn)行對(duì)比時(shí)，第I外顯子(0401)的3’末端的堿基和第3外顯子(0403)的5’末端的堿基之間，其連續(xù)性中斷。因此，該情況下，其第I外顯子(0401)的3’末端的堿基和第3外顯子(0403)的5’末端的堿基的接合部(J)成為不連續(xù)接合點(diǎn)。另外，例如，如圖5所示，突變基因B中的突變?yōu)橄蛞粋€(gè)外顯子內(nèi)的堿基的插入的情況下，對(duì)比含有插入的c區(qū)域的突變基因B的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’和野生型基因A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物A’的堿基序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’中的a區(qū)域的3’末端和c區(qū)域的5’末端，以及c區(qū)域的3’末端和b區(qū)域的5’末端，其連續(xù)性中斷。該情況下，突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物B’中的a區(qū)域的3’末端的堿基和c區(qū)域的5’末端的堿基的接合部(Jl)，以及c區(qū)域的3’末端的堿基和b區(qū)域的5’末端的堿基的接合部(J2)的兩個(gè)位置成為不連續(xù)接合點(diǎn)。在本實(shí)施方式中，靶基因的種類及該基因所源自的生物種沒有特別限定。所有編碼蛋白質(zhì)或功能性核酸的基因可以成為本實(shí)施方式的抑制劑的靶。另外，生物種可以為動(dòng)物、植物中的任一種，包括它們的所有種類。若是動(dòng)物，則優(yōu)選為脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選為魚類、鳥類或哺乳動(dòng)物。在魚類中，進(jìn)一步優(yōu)選為水產(chǎn)資源用魚種(例如，鮭魚科、鱸魚科、鱈魚科、鯡魚科、比目魚科、鰈魚科、竹莢魚科、玉筋魚科、真鯛科及平鈾科(★ 科)的魚種)。在鳥類中，進(jìn)一步優(yōu)選為食用種(例如，雞、鵝、鴨、野鴨、雜種鴨、火雞、鵪鶉、駝鳥等)。在哺乳動(dòng)物中，進(jìn)一步優(yōu)選為家畜(豬、公牛、綿羊、山羊、馬)、實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物(嚙齒類、兔、狗、猴子)、比賽用的馬、寵物(狗、貓、兔、猴子、嚙齒類)或人。進(jìn)一步優(yōu)選的生物種為人。另一方面，若為植物，則優(yōu)選為種子植物，更優(yōu)選為被子植物，進(jìn)一步優(yōu)選為食用植物種(例如屬于禾本科(例如，水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、高粱、小米)、豆科(例如，大豆、小豆、綠豆)、茄科(例如，番茄、茄子、馬鈴薯、辣椒、青椒)、旋花科(例如，紅薯)、薔薇科(例如，草莓、杏、桃、李子、梅、薔薇、櫻花)、十字花科(例如，蘿卜、蕪菁、油菜)、藜科(例如，菠菜、甜菜)、傘形科、寥科、葫蘆科、菊科、百合科、天南星科、葡萄科、蕓香科、殼斗科、棕櫚科等的食用的植物種)、纖維資源用植物種(例如，棉花、麻等)、木材資源用植物種(例如，杉、扁柏、冷杉、鐵衫、松、紫杉 樹、櫻花樹、楓樹、橡樹、櫟、山毛櫸、榆樹、櫸、核桃樹、*々、桂樹、柚木樹、柳安木、黑檀樹、桃花心木、白楊、桉樹等)。
上述突變所參與的性狀也沒有特別限定，優(yōu)選為欲抑制其表達(dá)的性狀。例如可以舉出參與疾病的發(fā)病的突變、參與異常形態(tài)的突變等。在此所謂的疾病包含例如后天性地在特定的細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA中產(chǎn)生的突變引起的疾病或常染色體顯性突變疾病。對(duì)后天性地在特定的細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA中產(chǎn)生的突變引起的疾病而言，可以舉出:新生物(腫瘤)、特別是惡性新生物(惡性腫瘤，所謂的癌，包含白血病)。作為對(duì)后天性地在特定的細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA中產(chǎn)生的堿基序列的插入或缺失引起的惡性新生物的具體實(shí)例，可以舉出:以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的突變作為原因的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，以CTNNBl基因的突變作為原因的大腸癌，以CDHl基因的突變作為原因的胃癌，以BRCAl基因或BRCA2基因的突變作為原因的乳腺癌，以AIRE基因的突變作為原因的自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征I型，以TNFRSF6/APT1/FAS基因的突變作為原因的自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征。另外，作為對(duì)后天性地在特定的細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA中產(chǎn)生的伴有易位的基因的突變引起的產(chǎn)生惡性新生物的更具體的例子，可以舉出:以BCR基因和ABL基因的嵌合基因作為原因的慢性骨髓性白血病(CML)或急性淋巴性白血病(ALL)，以c-myc基因和IgH基因的嵌合基因作為原因的伯基特淋巴瘤，以NPM基因和ALK基因的嵌合基因作為原因的間變性大細(xì)胞淋巴瘤，以EML4基因和ALK基因的嵌合基因作為原因的肺癌，以TOGFB基因和COLlAl基因的嵌合基因作為原因的隆突性皮膚纖維肉瘤，以ETV6基因和NTRK3基因的嵌合基因作為原因的先天性纖維肉瘤，以FUS基因和CREB3L2基因的嵌合基因作為原因的低度惡性纖維粘液性肉瘤，以EWS基因 和CHN基因的嵌合基因作為原因的骨外黏液樣軟骨肉瘤，以將EWSl基因作為易位伙伴的嵌合基因作為原因的尤因肉瘤，以將SYT基因或SSX基因作為易位伙伴的嵌合基因作為原因的腺泡狀橫紋肌肉瘤，以將ALK基因作為易位伙伴的嵌合基因作為原因的炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤，以將CHOP基因作為易位伙伴的嵌合基因作為原因的脂肪肉瘤，以將ATFl基因作為易位伙伴的嵌合基因作為原因的透明細(xì)胞肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤。另外，伴隨剪接異常的疾病，可以舉出:以DMPK基因的突變作為原因的強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良，以SMNl基因的突變作為原因的脊髓性肌萎縮癥，以CHRNE基因的突變作為原因的先天性肌無(wú)力綜合征，以MAPT基因的突變作為原因的額顳癡呆癥，以GHl基因的突變作為原因的單純性生長(zhǎng)激素缺乏癥II型。另外，人常染色體顯性突變疾病，可以舉出:以RHO基因作為原因的先天性夜盲癥，以KCNQ4基因或GJB基因的突變作為原因的耳聾基因區(qū)域DFNA2，以MITF基因的突變作為原因的瓦登伯革氏綜合征，以DIAPH1/DFNA1基因或P0U4F3基因的突變作為原因的非綜合征耳聾，以TNNT2基因的突變作為原因的肥厚型心肌病，以MYBPC3基因的突變作為原因的家族性肥厚型心肌病，以TNNI3基因的突變作為原因的心尖肥厚型心肌病，以MPZ基因的突變作為原因的腓骨肌萎縮癥IB型，以PMP22基因的突變作為原因的腓骨肌萎縮癥IA型，以KCNQl基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNEl基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTAl基因的突變作為原因的長(zhǎng)QT綜合征，以KCNH2基因或KCNJ2基因的突變作為原因的短QT綜合征，以SCN5A基因或GPDlL基因或CACNAIC基因或CACNB2B或SCNlB基因的突變作為原因的布魯格達(dá)氏綜合征，以RYR2基因的突變作為原因的兒荼酚胺敏感型多形性室速，以SCN5A基因或SCNlB基因的突變作為原因的心臟傳導(dǎo)障礙，以TDP43基因的突變作為原因的肌萎縮側(cè)索硬化癥，以PTPNll基因的突變作為原因的奴南氏綜合征，以CaR基因的突變作為原因的低鈣血癥。1-3.RNAi分子的結(jié)構(gòu)本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子，包含在作為靶的顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生至少一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)的RNAi有義鏈區(qū)域，以及含有與所述RNAi有義鏈區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域。作為一個(gè)例子，本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子的結(jié)構(gòu)中的概念圖示于圖6。如該圖所示，RNAi分子包含雙鏈分子(圖6A)或單鏈分子(圖6B)。此外，也可包含含有所述RNAi有義鏈區(qū)域以及含有與之互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域的環(huán)狀分子(例如，啞鈴型核酸)。(RNAi分子的共同構(gòu)成要素)在本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子為任一種的情況下，也含有RNAi有義鏈區(qū)域(0601)、RNAi反義鏈區(qū)域(0602)及不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)作為必需的構(gòu)成要素。以下，對(duì)RNAi分子的共同的構(gòu)成要素進(jìn)行說明?！癛NAi有義鏈區(qū)域”(0601)由與靶顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列一致的堿基序列構(gòu)成，包含至少一個(gè)在其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生的不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)(在圖6中，作為有義鏈區(qū)域(0061)中斜線區(qū)域和空白區(qū)域的接合部而表示)。另外，有義鏈區(qū)域(0601)的堿基長(zhǎng)度為其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的連續(xù)的16 30個(gè)堿基、18 25個(gè)堿基或19 23個(gè)堿基。進(jìn)而，將與所述不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)鄰接的3’端的堿基(0604)作為基準(zhǔn)(相當(dāng)于后述的第2基準(zhǔn)堿基)，從其基準(zhǔn)堿基開始數(shù)朝向下游側(cè)的第3 16位的堿基，優(yōu)選第4 15位的堿基(0605)，更優(yōu)選第4 13位的堿基構(gòu)成該RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基。不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)在一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中以多個(gè)存在的情況下，將與任一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的3’端的喊基作為基準(zhǔn)喊基即可。

“RNAi反義鏈區(qū)域”(0602)由與所述RNAi有義鏈區(qū)域(0601)完全互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。因此，在其堿基序列中，包含與所述基準(zhǔn)堿基、即不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)鄰接的3’端的堿基互補(bǔ)的堿基(0607)。對(duì)RNAi反義鏈區(qū)域而言，在本實(shí)施方式的RNAi分子為雙鏈分子(圖6A)的情況下，含有在與含有RNAi有義鏈區(qū)域的多核苷酸鏈不同的其它多核苷酸鏈中，但在單鏈分子(圖6B)的情況下，以反方向含有在與RNAi有義鏈區(qū)域相同的多核苷酸鏈中。關(guān)于“不連續(xù)接合點(diǎn)”(0603)已詳細(xì)說明，此處省略該說明。本實(shí)施方式的RNAi分子的特征在于ASP得分值為0.4以上?！癆SP得分”(Allele-SPecificity score)為在ASP-RNAi中將作為重要因素的等位基因識(shí)別能力進(jìn)行數(shù)字化的值，進(jìn)而，也可視為將RNAi分子針對(duì)正常型基因的非特異的表達(dá)抑制的影響，BP, RNAi分子帶給正常型基因的副作用進(jìn)行數(shù)字化的值。ASP得分值由下式導(dǎo)出。ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)_(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)，式中，對(duì)照RNAi分子為作為本實(shí)施方式的有效成分的SiRNA分子的陰性對(duì)照的RNAi分子，為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子，因此，上式中，將對(duì)照RNAi分子處理的標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量當(dāng)作100%。例如，不存在成為靶的基因的含有任意的堿基序列的RNAi分子符合。在上式中，標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量的相對(duì)比超過“1.0”時(shí)，視作其是無(wú)表達(dá)抑制效果的，將該相對(duì)比作為“1.0”計(jì)算。根據(jù)ASP得分，可以反映對(duì)于突變基因的“特異性”和“抑制效果”這兩方面。例如，某個(gè)RNAi分子的ASP得分值低時(shí)，該RNAi分子即使可較強(qiáng)地抑制突變基因的表達(dá)的情況下，但也意味著特異性低，所以也同時(shí)強(qiáng)烈抑制野生型基因的表達(dá)，即，這意味著對(duì)于野生型基因的副作用較強(qiáng)。ASP得分值為0.4以上時(shí)，該RNAi分子具有抑制突變基因的表達(dá)，且具有針對(duì)野生型基因的沒有副作用或較弱的副作用的效果，因此，可獲得ASP-RNAi的功能。關(guān)于用于ASP得分的計(jì)算的正常型基因和突變基因的表達(dá)量的測(cè)定，如果利用相同的方法測(cè)定各表達(dá)量，則可以使用在該領(lǐng)域公知的任意的方法，沒有特別限定。另外，標(biāo)準(zhǔn)化可以基于未受到RNAi分子引起的表達(dá)抑制的內(nèi)部或外來對(duì)照基因的表達(dá)量進(jìn)行。優(yōu)選使用通過 Ohnishi Y.等(2006, Journal ofRNAi and Gene Silencing, Vol.2:154-160)所開發(fā)的報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，在后述的實(shí)施例1所記載的條件下，基于螢火蟲和海腎螢光素酶等報(bào)告基因的表達(dá)，以及作為對(duì)照的未受到RNAi引起的表達(dá)抑制的β -半乳糖苷酶基因的表達(dá)，測(cè)定野生型基因和突變基因的表達(dá)量。(雙鏈RNAi分子的構(gòu)成要素)在本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子為SiRNA那樣的雙鏈分子的情況下，如上述圖6Α所示，除作為上述RNAi分子共同構(gòu)成要素的RNAi有義鏈區(qū)域(0601)、RNAi反義鏈區(qū)域(0602)及不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)之外，可以進(jìn)一步在各自的多肽鏈的3’末端含有3’末端附加堿基(0606)?！?’末端附加堿基”(0606)由TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU (尿嘧啶-尿嘧啶)的2 個(gè)堿基構(gòu)成。附加了該堿基的RNAi分子可以提高RNAi抑制效率(Tuschl T et al.,1999, Genes Dev,13(24):3191-7)。(單鏈RNAi分子的構(gòu)成要素)在本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子為shRNA那樣的單鏈分子的情況下，如上述圖6B所示，除作為上述RNAi分子共同構(gòu)成要素的RNAi有義鏈區(qū)域(0601)、RNAi反義鏈區(qū)域(0602)及不連續(xù)接合點(diǎn)(0603)之外，進(jìn)一步含有連接RNAi有義鏈區(qū)域(0601)和與此反方向的RNAi反義鏈區(qū)域(0602)的短的間隔序列(0608)。間隔序列可以設(shè)為由通常3 24個(gè)堿基、優(yōu)選4 15個(gè)堿基構(gòu)成的任意的堿基序列。因此，在RNAi分子為單鏈的情況下，作為分子整體，由35個(gè)堿基(16X2+3) 84個(gè)堿基(30X2+24)構(gòu)成。在RNAi分子內(nèi)，RNAi有義鏈區(qū)域和RNAi反義鏈區(qū)域互相進(jìn)行堿基配對(duì)，位于其間的間隔序列形成環(huán)結(jié)構(gòu)，由此，分子整體形成發(fā)夾型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。具有上述結(jié)構(gòu)的單鏈RNAi分子被導(dǎo)入于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過被稱為Dicer的內(nèi)切核酸酶的作用加工成雙鏈siRNA，其中RNAi反義鏈區(qū)域被并入RISC(RNA_induced silencing complex, RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)復(fù)合體之后，可以利用與上述的雙鏈RNAi分子同樣的RNAi機(jī)制抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯前表達(dá)。單鏈分子中的RNAi有義鏈區(qū)域(0601)和RNAi反義鏈區(qū)域(0602)與所述雙鏈RNAi分子相同，可以在各自區(qū)域的3’末端上包含3’末端附加堿基。在單鏈分子中的5’末端，和/或3’末端上，可以附加任意的序列。例如，在5’末端和/或3’末端上可以附加能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基序列。1-4.表達(dá)載體的構(gòu)成在本說明書中，“表達(dá)載體”是指本實(shí)施方式的抑制劑中所含的有效成分，即將編碼上述RNAi分子的DNA以可以表達(dá)的方式插入表達(dá)用載體內(nèi)的載體。在RNAi分子為SiRNA那樣的雙鏈分子的情況下，本實(shí)施方式的表達(dá)載體可以將編碼各個(gè)RNAi有義鏈區(qū)域及RNAi反義鏈區(qū)域的DNA片段插入不同的兩個(gè)表達(dá)用載體，另外，也可以獨(dú)立地作為表達(dá)控制的DNA片段插入一個(gè)表達(dá)用載體內(nèi)。另一方面，在RNAi分子為shRNA那樣的單鏈分子的情況下，編碼該單鏈RNA分子的DNA片段插入表達(dá)用載體內(nèi)的規(guī)定的位置即可。在本說明書中，“表達(dá)用載體”是指本實(shí)施方式的表達(dá)載體中的骨架部分，即在本實(shí)施方式的表達(dá)載體中實(shí)施方式I的編碼RNAi分子的DNA片段以外的部分。表達(dá)用載體的種類沒有特別限定，優(yōu)選質(zhì)?；虿《?。它們根據(jù)導(dǎo)入的宿主適宜選擇即可。例如在導(dǎo)入的宿主為人的情況下，可以使用以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、仙臺(tái)病毒、腺伴隨病毒等病毒或者非病毒載體為基礎(chǔ)的載體那樣的公知的表達(dá)載體。另外，在導(dǎo)入的宿主為植物的情況下，可以利用PBI系或者pRI系的雙元載體等質(zhì)粒或花椰菜花葉病毒(CaMV)、菜豆金色花葉病毒(BGMV)、煙草花葉病毒(TMV)等病毒。進(jìn)而，在導(dǎo)入的宿主為大腸桿菌的情況下，例如可以利用 pBI 系、pPZP 系、pSMA 系、pUC 系、pBR 系、pBluescript 系(stratagene 公司)等的質(zhì)粒。此外，也可以利用從各生命科學(xué)制造商市售的各種各樣的各種宿主用表達(dá)載體。上述表達(dá)用載體可以含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者終止子那樣的調(diào)節(jié)區(qū)域、或選擇標(biāo)記基因那樣的標(biāo)記區(qū)域。各自的種類沒有特別限定。根據(jù)導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主適宜選擇該領(lǐng)域中公知的載體即可。作為在大腸桿菌中 可操作的啟動(dòng)子，例如可以舉出:lac、trp或者tac啟動(dòng)子或源自噬菌體的T7、T3、SP6、PR或者PL啟動(dòng)子等。作為在酵母中可操作的啟動(dòng)子，例如可以舉出:源自酵母糖酵解基因的啟動(dòng)子、醇脫氫酶基因啟動(dòng)子、TPIl、ADH2-4c啟動(dòng)子等。作為在植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子，例如可以舉出:花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子、月因脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子(Pnos)、源自玉米的泛素蛋白啟動(dòng)子、源自水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、源自煙草的PR蛋白質(zhì)啟動(dòng)子等。作為在昆蟲細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子，例如可以舉出:多角體蛋白啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子、苜蓿銀紋夜蛾多角體堿性蛋白啟動(dòng)子、桿狀病毒極早期基因I啟動(dòng)子、桿狀病毒39K晚早期(遅延型初期)基因啟動(dòng)子等。而且，作為在以人為代表的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可操作的啟動(dòng)子，可優(yōu)選使用RNA聚合酶II(PoIII)系的啟動(dòng)子或RNA聚合酶IIKPol III)系的啟動(dòng)子。優(yōu)選為Pol III系的啟動(dòng)子，特別優(yōu)選為U6及Hl等啟動(dòng)子。另外，在任一宿主的情況下，也可以使用僅在生物體內(nèi)的特定的位點(diǎn)上誘導(dǎo)表達(dá)的位點(diǎn)特異的啟動(dòng)子。予以說明，在不同的兩個(gè)表達(dá)用載體中分別插入編碼RNAi有義鏈區(qū)域及RNAi反義鏈區(qū)域的DNA片段的情況下，為了各RNA鏈以同程度的量表達(dá)，啟動(dòng)子優(yōu)選使用相同的啟動(dòng)子或具有同程度的表達(dá)活性的不同的啟動(dòng)子。1-5.RNAi分子的設(shè)計(jì)和制造對(duì)本實(shí)施方式的抑制劑中所含的RNAi分子的設(shè)計(jì)方法進(jìn)行說明。如圖7所示，本設(shè)計(jì)方法含有基準(zhǔn)堿基設(shè)定工序(0701)、3’末端堿基設(shè)定工序(0702)、RNAi有義鏈區(qū)域設(shè)定工序(0703)、及RNAi反義鏈區(qū)域設(shè)定工序(0704)。以下，對(duì)各個(gè)工序進(jìn)行說明。
“基準(zhǔn)堿基設(shè)定工序”(0701)為在作為靶的顯性突變基因中，將與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端以及3’端的堿基分別作為第I和第2基準(zhǔn)堿基進(jìn)行設(shè)定的工序。在顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在兩處以上不連續(xù)接合點(diǎn)的情況下，選擇任一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)即可。此時(shí)，與選擇的不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端以及3’端的堿基成為第I和第2基準(zhǔn)堿基?！?’末端堿基設(shè)定工序”(0702)將對(duì)應(yīng)于所述第2基準(zhǔn)堿基的堿基為起點(diǎn)朝向下游側(cè)第4 15位，優(yōu)選第4 14位或第4 13位的堿基設(shè)定為與RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端喊基對(duì)應(yīng)的工序?！癛NAi有義鏈區(qū)域設(shè)定工序”(0703)，是在顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列中，將含有第I和第2基準(zhǔn)堿基的連續(xù)的16 30個(gè)堿基作為RNAi有義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序。通過所述3’末端喊基設(shè)定工序決定3’末端喊基，因此，在轉(zhuǎn)錄廣物的喊基序列上，從其3’末端堿基對(duì)應(yīng)的堿基開始數(shù)，朝向上游包含第I和第2基準(zhǔn)堿基，將16 30個(gè)堿基作為RNAi有義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定即可。通過本工序決定針對(duì)RNAi分子的顯性突變基因的靶區(qū)域?！癛NAi反義鏈區(qū)域設(shè)定工序”(0704)為將含有與經(jīng)設(shè)定的RNAi有義鏈區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列作為RNAi反義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序。不論本實(shí)施方式的抑制劑中含有的RNAi分子的形態(tài)(例如，單鏈RNAi分子、雙鏈RNAi分子或環(huán)狀RNAi分子等)，以上的工序也為共同的工序。接著，對(duì)3’末端附加工序及間隔連接工序、ASP得分篩選工序進(jìn)行說明。“3’末端附加工序”的特征在于，在上述設(shè)計(jì)的RNAi有義鏈區(qū)域及RNAi反義鏈區(qū)域的各個(gè)3’末端上附加TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU(尿嘧啶-尿嘧啶)。本工序?yàn)槿芜x工序，因此根據(jù)需要進(jìn)行添加即可?！伴g隔連接工序”為對(duì)于單鏈RNAi分子或環(huán)狀RNAi分子特有的且必需的工序。本工序?yàn)閷⑸鲜鲋性O(shè)計(jì)的RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端(在本工序前，如RNAi有義鏈區(qū)域經(jīng)過3’末端附加工序時(shí)，在RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端附加的TT或UU的3’末端)和RNAi反義鏈區(qū)域的5’末端(S卩，與RNAi有義鏈區(qū)域相反方向)分別與間隔序列的3’末端和5’末端連接而制成單鏈分子或環(huán)狀RNAi分子的工序。間隔序列可以為由3 24個(gè)堿基、優(yōu)選4 15個(gè)堿基構(gòu)成的任意的堿基序列。優(yōu)選為在間隔序列內(nèi)不會(huì)形成堿基配對(duì)的堿基序列?！癆SP得分篩選工序”為由上述工序制備的RNAi分子中，僅對(duì)ASP得分值為0.4以上的RNAi分子進(jìn)行篩選的工序。ASP得分值由上述式計(jì)算即可。本實(shí)施方式的RNAi分子可以基于通過上述的方法設(shè)計(jì)的堿基序列通過化學(xué)的合成法來合成。對(duì)RNAi分子的化學(xué)合成而言，各生命科學(xué)制造商(例如，西格瑪奧德里奇公司、BEX公司、寶生物公司、英杰公司等)進(jìn)行有受托制造服務(wù)，也可以利用這些服務(wù)。另外，對(duì)本實(shí)施方式的RNAi分子而言，將通過上述的方法設(shè)計(jì)的堿基序列暫時(shí)轉(zhuǎn)換為DNA序列，基于該序列將化學(xué)合成DNA而成的物質(zhì)進(jìn)行克隆后，利用該領(lǐng)域中公知的體外RNA轉(zhuǎn)錄法對(duì)RNA進(jìn)行制備。體外RNA轉(zhuǎn)錄法例如參照SambrooK, J.et.al.， (1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York 即可。另外，可以以 U1-Tei 等的方法(Nucleic Acids Res.,32:936-948,2004)、Reynolds 等的方法(Nat.Biotechnol.,22:326-330, 2004)、Amarzguioui等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.,316:1050-1058，2004)作為參考。1-6.表達(dá)載體的制備本實(shí)施方式的抑制劑中所含的表達(dá)載體的制備方法基本上可以依據(jù)該領(lǐng)域中公知的方法，例如 Sambrook, J.et.al., (1989)Molecular Cloning:a Laboratory ManualSecond Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 中記載的方法進(jìn)行制備。若舉出具體的例子，則首先，依據(jù)上述的“ 1-5.RNAi分子的設(shè)計(jì)和制造”的項(xiàng)目中說明的方法，確定RNAi分子的堿基序列。接下來，基于與其對(duì)應(yīng)的DNA序列，通過化學(xué)合成法等分別合成有義鏈DNA及反義鏈DNA。此時(shí)，優(yōu)選在各鏈的兩末端附加適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)或在各鏈退火后形成適當(dāng)?shù)恼承阅┒恕?duì)DNA合成而言，生命科學(xué)相關(guān)制造商各公司進(jìn)行有受托合成服務(wù)，也可以利用該服務(wù)。將合成后的兩鏈進(jìn)行混合并退火，制備雙鏈DNA片段后，在末端附加限制位點(diǎn)的情況下，根據(jù)需要用限制酶切斷。進(jìn)而，根據(jù)需要用T4多核苷酸激酶等將各鏈的5’末端進(jìn)行磷酸化。接下來，將上述制備的雙鏈DNA片段與表達(dá)用載體的啟動(dòng)子下游的對(duì)應(yīng)的限制位點(diǎn)連接。對(duì)DNA片段而言，暫時(shí)與適當(dāng)?shù)目寺≥d體連接而進(jìn)行克隆化后，可以將從其中切出的DNA片段與表達(dá)用載體連接。另外，為了使具有3’末端附加堿基的RNAi分子表達(dá)，注意預(yù)先將TT插入到RNAi有義鏈區(qū)域以及RNAi反義鏈區(qū)域中各自的3’末端。本工序?yàn)槿芜x工序，因此根據(jù)需要進(jìn)行添加即可。1-7.突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑作為本實(shí)施方式的顯性突變基因表達(dá)抑制劑的一個(gè)例子，可以舉出:將特異性地抑制突變型EGFR (表皮生長(zhǎng)因子受體)基因的表達(dá)的RNAi分子(EGFR-RNAi分子)作為有效成分的突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑。此處的突變型EGFR基因?yàn)楹筇煨援a(chǎn)生的顯性突變基因，是成為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer ；NSCLC)的原因的基因。表皮生長(zhǎng)因子等的配體一旦在EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上結(jié)合，則通常被細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活化，自體磷酸化作用運(yùn)轉(zhuǎn)。認(rèn)為在突變型EGFR基因中，EGFR基因的特定的堿基上產(chǎn)生置換、缺失、插入，下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路通過成為處于組成型活化狀態(tài)的功能獲得型而產(chǎn)生(Paez G..J.et al.，Science, 2004, 304 ;1497_1500)。本實(shí)施方式的突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑，在這樣的突變型EGFR基因中，可以特異性地抑制基于除置換以外的缺失和插入等的突變的基因的表達(dá)。作為本實(shí)施方式的突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑的具體實(shí)例，如圖8-1、9_1、10-1和11-1的各A所示，可以例舉為:將分別針對(duì)人EGFR基因的部分堿基缺失的del (E746-A750)突變以及del (L747-T751) -L747S突變、以及部分堿基的缺失和插入產(chǎn)生的del (L747-E749)-A750P突變的EGFR-RNAi分子作為有效成分的突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑。予以說明，關(guān)于del(L747-E749)-A750P突變，如后述，即使編碼的氨基酸序列相同，通過堿基序列的缺失和插入的差異，存在具有G和A的一個(gè)堿基的不同的兩種突變。在本說明書中，deI (L747-E749) -A750P突變中，在有必要區(qū)別這些突變的不同時(shí)，以后適當(dāng)?shù)貙⒕哂蠫的突變作為del(L747-E749)-A750P(G)突變(圖10-1A)，而將具有A的突變作為del(L747-E749)-A750P(A)突變 (圖11-1A)。作為更具體的突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑，例如，作為del (E746-A750)的表達(dá)抑制劑，可以舉出:有義鏈區(qū)域由序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的單鏈或雙鏈RNAi分子、或?qū)⒕幋aRNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。另外，作為del(L747-T751)-L747S的表達(dá)抑制劑，可以舉出:例如，有義鏈區(qū)域由序列號(hào)29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49所示的單鏈或雙鏈RNAi分子、或?qū)⒕幋aRNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。進(jìn)而，作為del (L747-E749) -A750P (G)的表達(dá)抑制劑，可以舉出:例如，有義鏈區(qū)域由序列號(hào)53、55、59、61、63、65或67所示的單鏈或雙鏈RNAi分子、或?qū)⒕幋aRNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體?；蛘?，作為del(L747-E749)-A750P(A)的表達(dá)抑制劑，可以舉出:例如，有義鏈區(qū)域由序列號(hào)129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的單鏈或雙鏈RNAi分子、或?qū)⒕幋aRNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。1-8.BCR-ABL嵌合基因表達(dá)抑制劑作為本實(shí)施方式的顯性突變基因表達(dá)抑制劑的一個(gè)例子，可以舉出:將特異性地抑制通過費(fèi)城染色體中的易位突變產(chǎn)生的BCR-ABL嵌合基因的表達(dá)的RNAi分子(BCR-ABL-RNAi分子)作為有效成分的BCR-ABL嵌合基因表達(dá)抑制劑。此處的BCR-ABL嵌合基因?yàn)楹筇煨援a(chǎn)生的顯性突變基因，是成為慢性骨髓性白血病(CML)或急性淋巴性白血病(ALL)的原因基因。費(fèi)城染色體(Ph染色體)以慢性骨髓性白血病(CML)的90%以上，以及急性淋巴性白血病(ALL)的約20%的病例被發(fā)現(xiàn)，是具有9號(hào)染色體的一部分易位到22號(hào)染色的結(jié)構(gòu)的腫瘤特異的染色體。根據(jù)該易位，產(chǎn)生了位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)上的ABL基因與位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂(22qll)上的BCR基因互相易位形成BCR-ABL嵌合基因的結(jié)果，產(chǎn)生有酪氨酸激酶活性促進(jìn)的P210或pl90蛋白質(zhì)。本實(shí)施方式的BCR-ABL嵌合基因表達(dá)抑制劑可以特異性地抑制這樣的BCR-ABL嵌合基因的表達(dá)。作為本實(shí)施方式的BCR-ABL嵌合基因表達(dá)抑制劑的具體實(shí)例，可以舉出:如圖12-1以及13-1的A所示，將針 對(duì)BCR-ABL嵌合基因的BCR-ABL-RNAi分子作為有效成分的BCR-ABL嵌合基因表達(dá)抑制劑。更具體地，例如，有義鏈區(qū)域由序列號(hào)97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的單鏈或雙鏈RNAi分子、或?qū)⒕幋aRNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。1-9.效果根據(jù)本實(shí)施方式的基因表達(dá)抑制劑，有效成分的RNAi分子幾乎或不太會(huì)對(duì)非靶基因的表達(dá)造成影響，可以選擇性且有效地抑制靶基因的表達(dá)。根據(jù)本實(shí)施方式的抑制劑，在導(dǎo)入于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，在以RNAi分子作為有效成分的情況下，該RNAi分子可以直接與靶顯性突變基因作用并利用RNAi沉默機(jī)制抑制其表達(dá)，另夕卜，在以表達(dá)載體為有效成分的情況下，在該表達(dá)載體中所含的DNA中所編碼的RNAi分子進(jìn)行表達(dá)后，可以與靶顯性突變基因作用并利用RNAi沉默機(jī)制抑制其表達(dá)。因此，在抑制劑含有RNAi分子的情況下，可以在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)給藥后的細(xì)胞等賦予該RNAi產(chǎn)生的抑制效果。另一方面，在抑制劑含有表達(dá)載體的情況下，只要在給藥后的細(xì)胞內(nèi)維持表達(dá)載體，則可以繼續(xù)賦予所述效果。因此，通過將這些組合使用，可以有效地抑制顯性突變基因的表達(dá)。若使用本實(shí)施方式的抑制劑，則通過加入于后述的藥物組合物，可以治療或減輕各種疾病。2.藥物組合物本發(fā)明的第2實(shí)施方式為藥物組合物。2-1.構(gòu)成本發(fā)明的藥物組合物含有作為有效成分的所述實(shí)施方式I的顯性突變基因表達(dá)抑制劑。顯性突變基因表達(dá)抑制劑可單獨(dú)含有針對(duì)作為靶的顯性突變基因的RNAi分子或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體，也可含有將相同基因作為靶的一個(gè)以上不同的RNAi分子和/或?qū)⒕幋a一個(gè)以上不同的RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。例如，本實(shí)施方式的藥物組合物的有效成分為突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑，在該抑制劑含有兩個(gè)以上不同的EGFR-RNAi分子的情況下，可以含有選自由以所述del (E746-A750)突變基因作為靶的EGFR-RNAi分子(例如，有義鏈區(qū)域含有由序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的堿基序列)、以del (L747-T751)-L747S突變基因作為革巴的EGFR-RNAi分子(例如，有義鏈區(qū)域含有由序列號(hào)29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49所示的堿基序列)、以del (L747-E749)-A750P(G)突變基因作為靶的EGFR-RNAi分子(例如，有義鏈區(qū)域含有由序列號(hào)53、55、59、61、63、65或67所示的堿基序列)以及以del (L747-E749)-A750P(A)突變基因作為靶的EGFR-RNAi分子(例如，有義鏈區(qū)域含有由序列號(hào)129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的堿基序列)構(gòu)成的組中的兩個(gè)以上RNAi分子。另外，突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑也可含有EGFR-RNAi分子和EGFR-RNAi分子表達(dá)載體(例如，將編碼該EGFR-RNAi分子和/或不同EGFR-RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體)。

進(jìn)而，實(shí)施方式的醫(yī)藥組合物可以在制藥上可容許的范圍內(nèi)，且在不使實(shí)施方式I的顯性突變基因表達(dá)抑制劑中的RNAi分子及/或表達(dá)載體失活的范圍內(nèi)含有其它有效成分，可以為所謂的復(fù)合制劑。此處所謂的其他有效成分，將與所述實(shí)施方式I的顯性突變基因表達(dá)抑制劑的相同基因作為靶，但可含有具有和所述實(shí)施方式I的有效成分不同的結(jié)構(gòu)的RNAi分子和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為表達(dá)抑制劑。作為一個(gè)例子，將突變型EGFR基因作為靶基因的情況下，除了含有具有所述實(shí)施方式I所記載的結(jié)構(gòu)的EGFR-RNAi分子和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體的顯性突變基因表達(dá)抑制劑以外，可以舉出:含有有義鏈區(qū)域含有由序列號(hào)83或85所示的RNAi分子，以及/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體的顯性等位基因表達(dá)抑制劑。此外，也可含有與所述的顯性等位基因表達(dá)抑制劑不同的顯性突變基因表達(dá)抑制劑，含有以后述的實(shí)施例4說明的有義鏈區(qū)域由序列號(hào)89所示的RNAi分子，及/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為有效成分的抑制劑。如此，以相同基因的不同突變位點(diǎn)作為靶，將抑制基于每個(gè)突變的基因表達(dá)的抑制劑作為有效成分的復(fù)合制劑在靶基因的突變位點(diǎn)不清楚的時(shí)候是有用的。作為所述抑制劑的有效成分的RNAi分子對(duì)于靶突變基因的特異性高，因此具有下面的優(yōu)點(diǎn)，即使混合也幾乎沒有抑制其他基因表達(dá)的副作用，或使RNAi分子及/或表達(dá)載體失活的可能性。
另外，其他有效成分，也可為具有與所述實(shí)施方式I的顯性突變基因表達(dá)抑制劑不同藥理作用的藥劑。例如，可以例舉為抗生素。本發(fā)明的藥物組合物含有作為有效成分的RNAi分子及/或表達(dá)載體的介質(zhì)。對(duì)介質(zhì)而言，例如可以舉出:水、乙醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類那樣的溶劑。這樣的介質(zhì)優(yōu)選進(jìn)行殺菌，優(yōu)選根據(jù)需要與血液等張地調(diào)整。在本發(fā)明的藥物組合物中，作為藥物組合物中的有效成分的RNAi分子及/或表達(dá)載體的含量根據(jù)作為治療對(duì)象的疾病的原因基因的種類、其基因的發(fā)病作用機(jī)制、RNAi分子的作用效果及穩(wěn)定性、表達(dá)載體的表達(dá)量、藥物組合物的劑型、使用的載體的種類及給藥方法、給藥的受治療者的狀態(tài)等各種條件而不同。這些基于該領(lǐng)域的公知技術(shù)適宜選擇即可。對(duì)本發(fā)明的RNAi分子或表達(dá)載體的含量的具體實(shí)例而言，在利用注射液對(duì)不需要其它的醫(yī)藥的并用的人成人男子(體重60kg)給藥的情況下，每給藥單位的注射液含有約0.01 % (w/v) 約20% (w/v)、優(yōu)選約0.1 % (w/v) 約10% (w/v)即可。具體而言，例如在I次Iml的注射劑中通常含有siRNAl μ g 200 μ g即可。另外，在得到本發(fā)明的藥物組合物的藥理效果的基礎(chǔ)上，在需要本發(fā)明的核酸的大量給藥的情況下，為了減輕對(duì)于受治療者的負(fù)擔(dān)，也可以分成數(shù)次進(jìn)行給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要進(jìn)一步含有制藥上可容許的載體?！爸扑幧峡扇菰S的載體”是指在制劑技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的添加劑。例如可以舉出:賦形劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動(dòng)添加調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)滑劑等。作為賦形劑，作為例子可以舉出:如單糖、二糖類、環(huán)糊精及多糖類之類的糖(更具體而言，沒有限定，含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麥芽糊精、淀粉及纖維素)、金屬鹽(例如，氯化鈉、磷酸鈉或者磷酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、碳酸鈣)、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、高嶺土、硅酸或它們的組合。作為粘合劑，作為例子可以舉出:使用了玉米、小麥、稻米或者馬鈴薯的淀粉的淀粉糊、單糖漿、葡萄糖液、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、蟲膠及/或聚乙烯基吡咯烷酮等。作為崩解劑，作為例子可以舉出:上述淀粉及乳糖、羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、昆布糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、海藻酸或者海藻酸鈉、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯或它們的鹽。作為填充劑，作為例子可以舉出:上述糖及/或磷酸鈣(例如，磷酸三鈣或者磷酸氫鈣)。作為乳化劑，作為例子可以舉出:山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪
酸酯、丙二醇脂肪酸酯。作為流動(dòng)添加調(diào)節(jié)劑及潤(rùn)滑劑，作為例子可以舉出:硅酸鹽、滑石、硬脂酸鹽或聚
乙二醇。這樣的載體是主 要容易形成上述劑型，另外，用于維持劑型及藥劑效果之外，還用于使得作為顯性突變基因表達(dá)抑制劑的有效成分的RNAi分子難以被體內(nèi)的核酸酶分解，根據(jù)需要適宜使用即可。除上述添加劑以外，也可以根據(jù)需要含有矯味矯臭劑、助溶劑、懸浮劑、稀釋劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、吸收促進(jìn)劑、增量劑、加濕劑、保濕劑、吸附劑、崩解抑制劑、包衣劑、著色劑、防腐劑、抗氧化劑、香料、風(fēng)味劑、甜味劑、緩沖劑等。本發(fā)明的藥物組合物也可以在不喪失上述RNAi分子所具有的藥理效果的范圍內(nèi)含有其它的藥劑。例如若在注射劑的情況下，則可以含有規(guī)定量的抗生素。本實(shí)施方式的藥物組合物的劑型只要為不使作為抑制劑中的有效成分的RNAi分子或表達(dá)載體以及其它的附加的有效成分失活的形態(tài)就沒有特別限定。RNA—般不穩(wěn)定，因此在給藥RNAi分子情況下，優(yōu)選在體內(nèi)難以分解的劑型。例如可以為液體、固體或半固體中的任一種。作為具體的劑型，例如可以舉出:注射劑、懸浮劑、乳劑、洗眼劑、滴鼻劑、乳膏齊U、軟膏劑、硬膏劑、貼敷劑及栓劑等非口服劑型或液劑、散劑、顆粒劑、藥片、膠囊劑、舌下齊U、片劑等經(jīng)口劑型。在含有以RNAi分子或表達(dá)載體作為有效成分的抑制劑的本實(shí)施方式的藥物組合物的情況下，優(yōu)選劑型為注射劑。另外，可以將本實(shí)施方式的藥物組合物或所述實(shí)施方式I的顯性突變基因表達(dá)抑制劑制備為納米顆粒(例如，包含Davis ME, et al.，Nature，2010，464:1067-1070中所記載的靶納米顆粒遞送系統(tǒng))、脂質(zhì)體(例如，包含膜滲透肽結(jié)合脂質(zhì)體、SNALP)、膽固醇結(jié)合體的形態(tài)。也可以利用 Castanotto D.&Rossi JJ, Nature, 2009,457,426-433 中所記載的RNAi遞送系統(tǒng)。2-2.給藥方法本實(shí)施方式的藥物組合物為了治療目標(biāo)疾病，可以對(duì)生物體給藥制藥上有效的量。作為給藥的對(duì)象的生物體為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。在本說明書中，“制藥上有效的量”是指作為本發(fā)明的藥物組合物中所含的抑制劑的有效成分的RNAi分子及/或表達(dá)載體在治療作為對(duì)象的疾病或減輕癥狀方面需要的用量(具體而言，可以抑制作 為疾病原因的顯性突變基因的性狀表達(dá)的用量)，且對(duì)于給藥的生物體幾乎或完全沒有有害的副作用(例如，野生型基因等的表達(dá)抑制等)的用量。其具體的量根據(jù)靶基因的種類、顯性突變基因的性狀表達(dá)效果、使用的劑型、受治療者(在人的情況下為受試者)的信息及給藥路徑而不同。在對(duì)人進(jìn)行給藥的情況下，制藥上有效的量的范圍及優(yōu)選的給藥路徑一般基于由細(xì)胞培養(yǎng)分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)而策劃制定。最終的給藥量根據(jù)各個(gè)受試者通過醫(yī)師的判斷來確定并進(jìn)行調(diào)整。此時(shí)，在所考慮的受試者的信息中含有疾病的進(jìn)行度或重癥度、全身的健康狀態(tài)、年齡、體重、性別、飲食生活、對(duì)藥物敏感性及治療的耐性等。本發(fā)明的RNAi分子可以為全身給藥或局部給藥中的任一種。可以根據(jù)疾病的種類、發(fā)病場(chǎng)所或進(jìn)行度等而適宜選擇。若發(fā)病場(chǎng)所為局部的疾病，則優(yōu)選利用注射等在發(fā)病場(chǎng)所及其周邊直接給藥的局部給藥。這是因?yàn)?，可以?duì)應(yīng)治療的場(chǎng)所(組織或器官)給藥充分量的本發(fā)明的RNAi分子，另外，對(duì)其它的組織不易產(chǎn)生影響。另一方面，如在轉(zhuǎn)移性癌那樣無(wú)法確定治療場(chǎng)所的情況或發(fā)病為全身性的疾病的情況下，沒有限定，優(yōu)選利用靜脈注射等的全身給藥。這是因?yàn)橥ㄟ^經(jīng)由血流使本發(fā)明的RNAi分子遍布于全身，對(duì)在診斷中無(wú)法發(fā)現(xiàn)的病變部也可以給藥。本發(fā)明的RNAi分子可以用所含有的有效成分不會(huì)失活的所有的適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行給藥。例如可以為非口服(例如，注射、氣霧劑、涂布、洗眼、滴鼻)或口服中的任一種。優(yōu)選為注射。
在利用注射給藥的情況下，注入部位沒有特別限定。只要由本發(fā)明的RNAi分子或表達(dá)載體生產(chǎn)的RNAi分子對(duì)于靶分子發(fā)揮其功能且可以實(shí)現(xiàn)藥物組合物的目的，就可以為任一部位。例如可以舉出:靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肝臟內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻腔內(nèi)、腸內(nèi)或舌下等。優(yōu)選靜脈內(nèi)注射或動(dòng)脈內(nèi)注射等向血管內(nèi)的注射。這是因?yàn)榭扇缟鲜瞿菢咏?jīng)由血流使本發(fā)明的藥物組合物遍布于全身，另外，侵襲性也較低。例如，可以使用上述Davis等的靶納米粒子遞送系統(tǒng)等，利用血管內(nèi)注射向全身給藥RNAi分子。2-3.用法本發(fā)明的藥物組合物可用于治療疾病。例如，通過在以常染色體顯性遺傳疾病那樣的顯性突變基因的表達(dá)作為原因的疾病中進(jìn)行應(yīng)用，可以選擇性地抑制突變基因的表達(dá)，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)編碼具有正常功能的基因蛋白質(zhì)的野生型基因的性狀，因此，除目前其治療困難的遺傳病或癌等的治療以外，可以用于動(dòng)植物的品種改良等。因此，作為本實(shí)施方式的藥物組合物的對(duì)象的疾病為抑制劑中所含的RNAi分子或表達(dá)載體表達(dá)的RNAi分子所基于的目標(biāo)的顯性突變基因的顯性性狀的疾 病。作為這樣的疾病的具體實(shí)例包含例如后天性地在特定的細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA中產(chǎn)生的突變引起的疾病或常染色體顯性突變疾病。關(guān)于這些疾病的具體實(shí)例如上所述。因此，本實(shí)施方式的藥物組合物根據(jù)作為治療對(duì)象的疾病，通過將針對(duì)作為其原因基因的顯性突變基因的RNAi分子或含有編碼其的DNA的表達(dá)載體用作有效成分，可以對(duì)各種各樣的疾病進(jìn)行應(yīng)用。實(shí)施例<實(shí)施例1:siRNA針對(duì)EGFR基因的ASP-RNAi效果的研究>對(duì)特異性地抑制突變型EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)基因的表達(dá)的siRNA (EGFR-siRNA)進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)針對(duì)突變基因(致癌基因)的表達(dá)抑制效果，即ASP-RNAi (等位基因特異的基因沉默)效果進(jìn)行驗(yàn)證。功能獲得型的突變型EGFR基因?yàn)榉切〖?xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer ；NSCLC)的原因基因。因此，本發(fā)明的EGFR-siRNA只要具有僅特異性地抑制功能獲得型的突變型EGFR基因的表達(dá)的ASP-RNAi效果，則可成為對(duì)非小細(xì)胞肺癌的有效的治療劑。(I)突變型EGFR基因的種類在非小細(xì)胞肺癌患者中，在EGFR基因(登記號(hào)NM_005228)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與疾病相關(guān)的各種突變(功能獲得型突變)。例如，具有如下:如圖8-1A所示從第2235位到第2249位(將起始密碼子的A作為第I位，以下相同)的堿基序列缺失的“del(E746-A750)突變”(伴隨所述基因的缺失突變，將起始甲硫氨酸作為第I位時(shí)，產(chǎn)生從第746位的谷氨酸到第750位的丙氨酸缺失的突變蛋白質(zhì))，如圖9-1A所示從第2240位到第2251位的堿基序列缺失的“del (L747-T751)-L747S突變”(伴隨所述基因的缺失突變，產(chǎn)生從第747位的亮氨酸到第751位的蘇氨酸缺失以及將第747位的亮氨酸置換為絲氨酸的突變蛋白質(zhì))，如圖10-1A所示從第2238位到第2248位的堿基序列缺失，向其缺失位點(diǎn)插入新的兩個(gè)堿基的“del(L747-E749)-A750P(G)突變”(伴隨所述基因的缺失/插入突變，產(chǎn)生從第747位的亮氨酸到第749位的谷氨酸缺失并將第750位的丙氨酸置換為脯氨酸的突變蛋白質(zhì))，進(jìn)而如圖11-1A所示從起始密碼子的A開始相當(dāng)于第2238位的堿基，即編碼E746的密碼子(GAG)的第三位的堿基不是“G”(Pao et al.，2005，Plos Medicine, vol.2,Issue3:e73)而是 “A”(Paez et al.，2004，Science, vol，304，1497-1500)的 “del (L747-E749)-A750P (A)突變”等。另外，其它也可以舉出:點(diǎn)突變。于是，對(duì)于基于實(shí)施方式I所記載的RNAi分子的設(shè)計(jì)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)、制備的EGFR-siRNA是否可特異性地抑制這些突變基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。(2) EGFR-siRNA 的設(shè)計(jì)和制備關(guān)于上述del (E746-A750)突變、del (L747-T751)-L747S 突變以及del(L747-E749)-A750P突變，在其突變基因產(chǎn)物(突變mRNA)上，分別對(duì)應(yīng)在圖8-1A、9-1AU0-1A以及11-1A中用箭頭所示的位置之處相當(dāng)于本說明書所記載的不連續(xù)接合點(diǎn)。BP, del (E746-A750)突變基因以及del (L747-T751)-L747S突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上分別有一處不連續(xù)接合點(diǎn)，另外在del (L747-E749)-A750P突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上存在兩處。于是，分別將與該不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端以及3’端的堿基作為第I和第2基準(zhǔn)堿基(基準(zhǔn)堿基設(shè)定工序)。del (L747-E749)-A750P突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有兩個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)，且僅相隔 I 個(gè)堿基((L747-E749)-A750P (A)的情況下)或 2 個(gè)堿基((L747-E749)-A750P (G)的情況下)而彼此接近。因此，在此，將在形式上位于3’端的與不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端以及3’端的堿基分別作為第I和第2基準(zhǔn)堿基。接著，逐一移動(dòng)從第2基準(zhǔn)堿基對(duì)應(yīng)的堿基到3’末端的堿基數(shù)，設(shè)定RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基(3’末端堿基設(shè)定工序)。接著，在各突變基因中，將包含含有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第I和第2基準(zhǔn)堿基的連續(xù)的19個(gè)堿基的堿基序列作為RNAi有義鏈區(qū) 域進(jìn)行設(shè)定(RNAi有義鏈區(qū)域設(shè)定工序)。另外，將含有與設(shè)定的RNAi有義鏈區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列作為RNAi反義鏈區(qū)域(RNAi反義鏈區(qū)域設(shè)定工序)。利用本實(shí)施例進(jìn)行設(shè)計(jì)，在表I 4中表示使用的EGFR-siRNA的具體堿基序列。[表I]
權(quán)利要求
1.一種顯性突變基因的表達(dá)抑制劑，含有將ASP得分值為0.4以上的RNAi分子作為有效成分，其中， 所述ASP得分由以下公式算出， ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)-(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)， (式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)； 所述RNAi分子包含含有在作為靶的顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生至少一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)及與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的連續(xù)的16 30個(gè)堿基序列一致的堿基序列的RNAi有義鏈區(qū)域，以及含有與所述RNAi有義鏈區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域，且 從與所述RNAi有義鏈區(qū)域上的任一不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的3’端的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的任一堿基構(gòu)成該RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基。
2.一種顯性突變基因的表達(dá)抑制劑，含有將編碼ASP得分值為0.4以上的RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為有效成分，其中， 所述ASP得分由以下公式算出， ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)_(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNA i分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)， (式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)； 所述RNAi分子包含含有在作為靶的顯性突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生至少一個(gè)不連續(xù)接合點(diǎn)及與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的連續(xù)的16 30個(gè)堿基序列一致的堿基序列的RNAi有義鏈區(qū)域，以及含有與所述RNAi有義鏈區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的RNAi反義鏈區(qū)域，且 從與所述RNAi有義鏈區(qū)域上的任一不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的3’端的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的任一堿基構(gòu)成該RNAi有義鏈區(qū)域的3’末端堿基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抑制劑，其中，在RNAi有義鏈區(qū)域和RNAi反義鏈區(qū)域上進(jìn)一步附加TT或UU。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，RNAi分子為siRNA。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，RNAi分子為shRNA。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因中的突變從由堿基缺失、堿基插入、破壞剪接位點(diǎn)得到的堿基置換、基因重復(fù)、基因易位、以及染色體倒位構(gòu)成的組中選出。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因?yàn)楣δ塬@得型。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，顯性突變基因參與疾病的發(fā)病。
9.如權(quán)利要求8所述的抑制劑，其中，疾病為惡性新生物。
10.如權(quán)利要求9所述的抑制劑，其中，惡性新生物為非小細(xì)胞肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虴GFR基因；惡性新生物為大腸癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虲TNNBl基因；惡性新生物為胃癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虲DHl基因；惡性新生物為乳腺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虰RCAl基因或突變型BRCA2基因；惡性新生物為自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征I型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虯IRE基因；惡性新生物為自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃蚑NFRSF6/APT1/FAS基因；惡性新生物為慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)锽CR-ABL嵌合基因；惡性新生物為伯基特淋巴瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閏-myc-1gH-嵌合基因；惡性新生物為間變性大細(xì)胞淋巴瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镹PM-ALK-嵌合基因；惡性新生物為肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋ML4-ALK-嵌合基因；惡性新生物為隆突性皮膚纖維肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門OGFB-COLlAl嵌合基因；惡性新生物為先天性纖維肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋TV6-NTRK3嵌合基因；惡性新生物為低度惡性纖維粘液性肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镕US-CREB3L2嵌合基因；惡性新生物為骨外黏液樣軟骨肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镋WS-CHN嵌合基因；惡性新生物為尤因肉瘤或促纖維增生性小細(xì)胞腫瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷WSRl基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為腺泡狀橫紋肌肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷YT基因或SSX基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷LK基因作為易位伙伴的嵌合基因；惡性新生物為脂肪肉瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷HOP基因作為易位伙伴的嵌合基因；或者惡性新生物為透明細(xì)胞肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)閷TFl基因作為易位伙伴的嵌合基因。
11.如權(quán)利要求10所述的抑制劑，其中，惡性新生物為非小細(xì)胞肺癌，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)橥蛔冃虴GFR基因。
12.如權(quán)利要求11所述的抑制劑，其中，RNAi分子的有義鏈區(qū)域由序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、59、61、63、65、67、129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的核苷酸構(gòu)成。
13.如權(quán)利要求10所述的抑制劑，其中，惡性新生物為慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)锽CR-ABL嵌合基因。
14.如權(quán)利要求13所述的抑制劑，其中，RNAi分子的有義鏈區(qū)域由序列號(hào)97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的核苷酸構(gòu)成。
15.如權(quán)利要求8所述的抑制劑，其中，疾病為人常染色體顯性突變疾病。
16.如權(quán)利要求15所述的抑制劑，其中，人常染色體顯性突變疾病為先天性夜盲癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镽HO基因；人常染色體顯性突變疾病為耳聾基因區(qū)域DFNA2，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNQ4基因或GJB基因；人常染色體顯性突變疾病為瓦登伯革氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸ITF基因；人常染色體顯性突變疾病為非綜合征耳聾，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镈IAPH1/DFNA1基因或P0U4F3基因；人常染色體顯性突變疾病為肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門NNT2基因；人常染色體顯性 突變疾病為家族性肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸YBPC3基因；人常染色體顯性突變疾病為心尖肥厚型心肌病，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門NNI3基因；人常染色體顯性突變疾病為腓骨肌萎縮癥IA型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镻MP22基因；人常染色體顯性突變疾病為腓骨肌萎縮癥IB型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸PZ基因；人常染色體顯性突變疾病為長(zhǎng)QT綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNQI基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNEI基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTAI基因；人常染色體顯性突變疾病為短QT綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镵CNH2基因或KCNJ2基因；人常染色體顯性突變疾病為布魯格達(dá)氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾CN5A基因或GPDlL基因或CACNA1C基因或CACNB2B或SCNlB基因；人常染色體顯性突變疾病為兒荼酚胺敏感型多形性室速，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镽YR2基因；人常染色體顯性突變疾病為心臟傳導(dǎo)障礙，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾CN5A基因或SCNlB基因；人常染色體顯性突變疾病為肌萎縮側(cè)索硬化癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)門DP43基因；人常染色體顯性突變疾病為奴南氏綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镻TPNll基因；或者人常染色體顯性突變疾病為低鈣血癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镃aR基因。
17.如權(quán)利要求8所述的抑制劑，其中，疾病為強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镈MPK基因；疾病為脊髓性肌萎縮癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镾MNl基因；疾病為先天性肌無(wú)力綜合征，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镃HRNE基因；疾病為額顳癡呆癥，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镸APT基因；或者疾病為單純性生長(zhǎng)激素缺乏癥II型，且成為其靶的所述顯性突變基因?yàn)镚Hl基因。
18.—種藥物組合物，至少含有一種權(quán)利要求1 17中任一項(xiàng)所述的抑制劑作為有效成分。
19.如從屬于權(quán)利要求11或12的權(quán)利要求18所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有有義鏈區(qū)域由序列號(hào)83或85所示的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a其核苷酸的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體，以及/或者有義鏈區(qū)域由序列號(hào)89所示的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a 該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體作為有效成分。
20.一種點(diǎn)突變型EGFR基因表達(dá)抑制劑，含有有義鏈區(qū)域由序列號(hào)89所示的核苷酸構(gòu)成的RNAi分子、和/或?qū)⒕幋a該RNAi分子的DNA以可工作的方式連接而成的表達(dá)載體。
21.一種選擇性地抑制在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上具有不連續(xù)接合點(diǎn)的顯性突變基因的表達(dá)的RNAi分子的設(shè)計(jì)方法,其中,包括: (a)將與該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的5’端和3’端的堿基分別作為第I和第2基準(zhǔn)堿基進(jìn)行設(shè)定的工序； (b)在所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，從對(duì)應(yīng)所述第2基準(zhǔn)堿基的堿基朝向下游側(cè)第4 15位中的堿基設(shè)定為對(duì)應(yīng)RNAi有義鏈的3’末端的堿基的工序； (c)在所述顯性突變基因中，將含有包括其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第I和第2基準(zhǔn)堿基的連續(xù)的16 30個(gè)堿基的堿基序列作為RNAi有義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序； (d)將含有與設(shè)定的有義鏈區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列作為RNAi反義鏈區(qū)域進(jìn)行設(shè)定的工序。
22.—種如權(quán)利要求21所述的設(shè)計(jì)方法，其中，進(jìn)一步含有(e)將ASP得分值為0.4以上的RNAi分子進(jìn)行篩選的工序， 所述ASP得分由以下公式算出， ASP得分=[(由所述RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的正常型基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)-(由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)]X (1-由所述RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量相對(duì)于由對(duì)照RNAi分子處理的突變基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量的相對(duì)比)， (式中，對(duì)照RNAi分子為不影響所述正常型基因和突變基因的表達(dá)的RNAi分子)。
23.如權(quán)利要求21或22所述的抑制劑，其中，在RNAi有義鏈區(qū)域和RNAi反義鏈區(qū)域上進(jìn)一步附加T T或UU。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)了容許野生型或期望的突變基因的表達(dá)、可僅選擇性且有效地抑制特定的顯性突變基因的表達(dá)的RNAi分子，其目的在于提供一種含有將該RNAi分子作為有效成分的顯性突變基因表達(dá)抑制劑及該RNAi分子的設(shè)計(jì)指南。該顯性突變基因表達(dá)抑制劑包含設(shè)定的RNAi分子，該RNAi分子為在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上產(chǎn)生不連續(xù)接合點(diǎn)(接合點(diǎn)，connection point)的顯性突變基因中，從與不連續(xù)接合點(diǎn)鄰接的有義鏈區(qū)域的3’端的堿基至3’末端的堿基長(zhǎng)度設(shè)定為規(guī)定的長(zhǎng)度的RNAi分子。
文檔編號(hào)C12N15/113GK103080314SQ20118004188
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者北條浩彥, 高橋理貴 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人國(guó)立精神·神經(jīng)醫(yī)療研究中心