專利名稱：產(chǎn)生IL-13的Tr1-樣細(xì)胞及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞，用于鑒定/分離/富集它們的方法以及使用分離的產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞用于診斷或者治療炎癥性疾病、自身免疫病、過敏疾病和器官移植病的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)依賴于對侵入病原體的免疫反應(yīng)與對自身抗原的免疫耐受之間的平衡。中心和外周耐受是誘導(dǎo)和維持T細(xì)胞耐受的重要機(jī)制。在近十年內(nèi)，許多注意力集中于在維持外周免疫耐受中起重要作用 的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)?，F(xiàn)在已經(jīng)堅定地確定Treg可以分成兩個不同的亞型:天然Treg(nTreg)和可誘導(dǎo)Treg群體,例如TGF-β誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞、Trl細(xì)胞或者Th3細(xì)胞。nTreg主要作為FoxP3+T細(xì)胞描述而Trl細(xì)胞描述為產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Allan 等，2008, Immunological reviews, 223:391-421)。FoxP3+nTregs 抑制 / 調(diào)節(jié)廣泛多種的不同免疫細(xì)胞，包括初始⑶4+和⑶8+T效應(yīng)細(xì)胞和記憶⑶4+和⑶8+T效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞。Trl細(xì)胞通過分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并具有抑制初始T細(xì)胞反應(yīng)和記憶T細(xì)胞反應(yīng)兩者的能力。已經(jīng)證明Trl細(xì)胞在細(xì)胞治療中是有用的，因為向具有克隆病的患者注射Trl細(xì)胞改善了他們的病癥。然而，持續(xù)需要改善使用Trl細(xì)胞的這種細(xì)胞治療的有效性。令人驚奇地是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞亞群。發(fā)明人證明，這些細(xì)胞除了具有Trl細(xì)胞標(biāo)志性的IL-10抑制性作用之外，還具有通過IL-13誘導(dǎo)的抑制性效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目標(biāo)是能夠產(chǎn)生IL-13的分離的Trl-樣細(xì)胞群體，優(yōu)選地，分離的人Trl-樣細(xì)胞群體。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離的Trl-樣細(xì)胞群體能夠在本發(fā)明所述測試A的條件下產(chǎn)生IL-13。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體產(chǎn)生低數(shù)量的IL-4。在本發(fā)明的另一個實施方案中,所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體表達(dá):-CD4 和-低水平CD127和-低水平CD62L。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞是靜息細(xì)胞并表達(dá)低水平CD25和低水平FoxP3。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體是活化的并表達(dá)⑶25和中等水平的FoxP3。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞是抗原特異性的，優(yōu)選地抗原是II型膠原、卵清蛋白、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白或HSP。在本發(fā)明的一個實施方案中，分離的Trl-樣細(xì)胞群體是能夠產(chǎn)生IL-13的Trl-細(xì)胞群體，優(yōu)選地人Trl細(xì)胞群體，優(yōu)選在測試A條件下能夠產(chǎn)生IL-13的Trl-細(xì)胞群體，優(yōu)選地人Trl細(xì)胞群體。在本發(fā)明的一個實施方案中,本發(fā)明的Trl-樣細(xì)胞群體，優(yōu)選本發(fā)明的Trl細(xì)胞群體，產(chǎn)生IL-10，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生IL-10。本發(fā)明的另一目標(biāo)是能夠產(chǎn)生IL-13的分離的Trl-樣克隆，優(yōu)選人分離的Trl-樣克隆。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離的Trl-樣克隆能夠在本發(fā)明所述的測試A的條件下產(chǎn)生IL-13。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣克隆產(chǎn)生少量的IL-4。在另一個實施方案中，所述Trl-樣克隆表達(dá):-CD4 和-低水平CD127和-低水平CD62L。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣克隆是抗原特異性的，優(yōu)選地抗原是II型膠原、卵清蛋白、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白或HSP。在本發(fā)明的一個實施方案中，分離的Trl-樣克隆是在測試A的條件下能夠產(chǎn)生IL-13的Trl克隆，優(yōu)選人Trl克隆。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的Trl-樣克隆，優(yōu)選本發(fā)明的Trl克隆在測試A的條件下產(chǎn)生IL-10。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是鑒定產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體的方法，包括:-檢測⑶127和⑶62L標(biāo) 志物中的至少一個和⑶4在細(xì)胞群體上的細(xì)胞表面表達(dá)，-檢測IL-13的產(chǎn)生，其中表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或低水平⑶62L并產(chǎn)生IL-13的細(xì)胞是產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于鑒定分離的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體，其中方法還包括檢測IL-10的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于使細(xì)胞群體中富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的方法，包括:-鑒定表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或低水平⑶62L并產(chǎn)生IL-13的細(xì)胞，-選擇所述細(xì)胞，由此得到富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的細(xì)胞群體，其中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是富集前產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少兩倍。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于使細(xì)胞群體富集產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體，其中方法還包括檢測IL-10的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)本文上述方法得到的富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體。在本發(fā)明的一個實施方案中，群體富含產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于鑒定或者分離產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體，優(yōu)選產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體的試劑盒，包括用于檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L細(xì)胞表面表達(dá)的工具和用于檢測IL-13的產(chǎn)生或IL-10和IL-13的產(chǎn)生的工具。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是分離的和/或富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體，優(yōu)選分離的和/或富集的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體，或者產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆，優(yōu)選產(chǎn)生IL-13的人Trl克隆，用于預(yù)防或者治療免疫反應(yīng)、移植物抗宿主疾病和器官排斥、過敏疾病、炎癥性疾病或者自身免疫病。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是去除細(xì)胞群體中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的方法，包括:-如上所述鑒定產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，-去除所述細(xì)胞，由此得到產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體，其中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是去除前產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的0.5倍。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于去除細(xì)胞群體中的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)上述方法得到的去除產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的細(xì)胞群體。在本發(fā)明的一個實施方案中，被去除處理的細(xì)胞群體是產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞被去除了。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是去除產(chǎn)生IL-1 3的Trl-樣細(xì)胞的細(xì)胞群體用于增強(qiáng)需要其的受試者中的免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于增強(qiáng)需要其的受試者中免疫反應(yīng)的被去除處理的細(xì)胞群體是產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞被去除了。
具體實施例方式本發(fā)明提供具有免疫抑制能力的，新的分離的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體，以及用途。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞是Trl-樣細(xì)胞，因為它們表達(dá)與Trl細(xì)胞相同的表面標(biāo)志物并且這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-13和低水平的IL-4。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，它們的免疫抑制能力部分地通過IL-13介導(dǎo)。此外，這些Trl-樣細(xì)胞中的一些細(xì)胞還能夠產(chǎn)生IL-10。因此，發(fā)明人認(rèn)為能夠產(chǎn)生IL-10和IL-13的這些細(xì)胞是Trl細(xì)胞的亞群。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該Trl細(xì)胞亞群具有增強(qiáng)的免疫抑制效應(yīng)，這在細(xì)胞治療中具有極大的興趣。不希望被理論所束縛，發(fā)明人提出所述增強(qiáng)的免疫抑制效應(yīng)可能是因為IL-10和IL-13對祀細(xì)胞具有不同且互補(bǔ)的效應(yīng)。例如,Minty等(Eur Cytokine Netw.1997 ；8 (2):189-201)證明，IL-13和IL-10誘導(dǎo)活化單核細(xì)胞中不同的細(xì)胞因子分泌譜。本發(fā)明的一個目標(biāo)是能夠產(chǎn)生IL-13的分離的Trl-樣細(xì)胞群體，優(yōu)選在測試A的條件下能夠產(chǎn)生IL-13的分離的Trl-樣細(xì)胞群體。優(yōu)選地，分離的Trl-樣細(xì)胞群體是人細(xì)胞群體。如本文所使用，術(shù)語“IL-13”指白細(xì)胞介素13。如本文所使用，術(shù)語“產(chǎn)生IL-13”指在培養(yǎng)基中IL-13的分泌量大于50pg/ml，優(yōu)選大于100pg/ml,更優(yōu)選大于200pg/ml,甚至更優(yōu)選大于500pg/ml,甚至更優(yōu)選大于大約1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或 20000pg/ml 或更高。以另一種方式表述，該術(shù)語指IL-13的分泌量大于250pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，優(yōu)選大于500pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞和更優(yōu)選大于1000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞。如本文所使用，數(shù)值之前的術(shù)語“大約”指加或減所述數(shù)值的10%。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的Trl-樣細(xì)胞是Trl細(xì)胞，因為它們產(chǎn)生IL-10，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生IL-10。如本文所使用，術(shù)語“IL-10”指白細(xì)胞介素10。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的人Trl細(xì)胞產(chǎn)生高水平IL-10。
如本文所使用，術(shù)語“產(chǎn)生IL-10”指在培養(yǎng)基中IL-10的分泌量為至少50pg/ml，優(yōu)選至少100pg/ml,更優(yōu)選至少200pg/ml,至少大約500pg/ml,有代表性地大于大約1000,2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或 20000pg/ml 或更高。以另一種方式表述，該術(shù)語指IL-10的分泌量大于250pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞，優(yōu)選大于500pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞和更優(yōu)選大于1000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體產(chǎn)生少量的IL-4，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生少量的IL-4。如本文所使用，術(shù)語“IL-4”指白細(xì)胞介素4。如本文所使用，術(shù)語“少量的IL-4”指小于500pg/ml,優(yōu)選小于250pg/ml,更優(yōu)選小于100pg/ml的量。以另一種方式，該術(shù)語指IL-4的量小于2000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，優(yōu)選小于1000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，更優(yōu)選小于500pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，甚至更優(yōu)選小于250pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，甚至更優(yōu)選小于100pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體產(chǎn)生中等水平的TGF-β，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生中等水平的TGF-β。如本文所使用，術(shù)語“TGF- β ”指轉(zhuǎn)化生長因子β。如本文所使用，術(shù)語“中等水平TGF-β ”指TGF-β的量至少大約100pg/ml，有代表性地大于大約 200，3 00，400，600，800，* 1000pg/ml 或更高。以另一種方式，該術(shù)語指TGF-β的量至少大約400pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，有代表性地大于大約800，1200，1600，2400，3200，或4000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或更高。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體產(chǎn)生中等水平的IFN- Y，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生中等水平的IFN- Y。如本文所使用，術(shù)語“ IFN- Y ”指干擾素Y。如本文所使用，術(shù)語“中等水平IFN-Y ”指IFN-Y的量介于0.lpg/ml和至少400pg/ml 之間，有代表性地大于大約 600，800，1000，1200，1400，1600，1800，或 2000pg/ml
或更聞。以另一種方式，該術(shù)語指IFN- Y的量介于0.4pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞和至少1600pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞之間，有代表性地大于大約2400,3200，4000，4800，5600，6400，7200，或 8000pg/106 個產(chǎn)生 IL-13 的 Trl-樣細(xì)胞或更高。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體產(chǎn)生少量的IL-2，優(yōu)選在測試A的條件下產(chǎn)生少量的IL-2。如本文所使用，術(shù)語“IL-2”指白細(xì)胞介素2。如本文所使用，術(shù)語“少量的IL-2”指量小于大約500pg/ml，優(yōu)選小于大約250，100，75，或50 8/1111，或更少。以另一種方式，該術(shù)語指IL-2的量小于大約2000pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，優(yōu)選小于大約1000，400，300，* 200pg/106個產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，或更少。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞群體是分離的產(chǎn)生IL-13的人Trl群體，并且產(chǎn)生IL-13，IL-10，中等水平IFNy和TGFP和少量的IL-4和/或IL-2。根據(jù)該實施方案，分離的Trl-樣細(xì)胞群體是人Trl細(xì)胞亞群，因為發(fā)明人證明Trl細(xì)胞在測試A的條件下會產(chǎn)生或者不產(chǎn)生IL-13 (見實施例)。用于評估細(xì)胞是否能夠產(chǎn)生IL-13，IL-10，產(chǎn)生中等水平IFNy和TGFP和產(chǎn)生少量的IL-4和/或IL-2的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。如本發(fā)明中所定義的測試A在下文被描述并且使得確定在測試A的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。測試A相當(dāng)于以一種或者多種TCR活化劑活化細(xì)胞。在一個實施方案中，TCR活化劑是T淋巴細(xì)胞的多克隆活化劑，例如抗⑶3+抗⑶28抗體或白細(xì)胞介素-2, PMA+離子霉素。在另一個實施方案中，TCR活化劑是由抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原。例如，在添加有10%胎牛血清的RPMI或DMEM培養(yǎng)基中的IX IO6個細(xì)胞在一種或更多種TCR活化劑存在下，在48h期間被活化。然后收集培養(yǎng)基并通過本領(lǐng)域眾所周知的方法測量細(xì)胞因子產(chǎn)生。這些方法中的一個實例如下:細(xì)胞在抗^3(1(^8/!111)和抗^28(148/!111)存在下在48h期間被活化并且在該點通過ELISA或者通過FACS測量細(xì)胞因子分泌。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)CD4和低水平⑶127和低水平⑶62L。在一個實施方案中，所述分離的Trl細(xì)胞亞群在它們的表面上表達(dá)⑶4和低水平CD 127和低水平CD62L。在一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞是靜息的并且在它們的表面上不表達(dá)CD25。在一個實施方案中，所述分離的Trl細(xì)胞亞群是靜息的并且在它們的表面上不表達(dá) CD25。在另一個實施方案中，所述分離的Trl-樣細(xì)胞是活化的并且在它們的表面上表達(dá)CD25。在另一個實施方案中，所述分離的Trl細(xì)胞亞群是活化的并且在它們的表面上表達(dá) CD25。如本文所使用，“分離的”指細(xì)胞或者細(xì)胞群體從其自然環(huán)境(例如外周血)被移除并且是分離的、純化的或者分開的，并且至少大約75^,80^,85%和優(yōu)選大約90%，95%,96%,97%,98%,99%不含與其天然存在的但是缺乏分離細(xì)胞所依賴的細(xì)胞表面標(biāo)志物的其它細(xì)胞。如本文所使用，術(shù)語“細(xì)胞表面標(biāo)志物”指可以用于鑒別細(xì)胞群體的細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)、糖或者脂。如本文所使用，術(shù)語“表達(dá)”可互換性地指基因表達(dá)或者基因產(chǎn)物，包括編碼的多肽或者蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物的表達(dá)可以通過例如免疫測定法使用與多肽結(jié)合的一種或多種抗體測定。備選地，基因的表達(dá)可以通過測量mRNA水平，例如通過RT-PCR、RT-qPCR測量mRNA水平測定。術(shù)語“初始的1: naive )”是本領(lǐng)域眾所周知的，指還沒有接觸任何特異抗原的免疫細(xì)胞或細(xì)胞群體。術(shù)語“靜息的”是本領(lǐng)域眾所周知的并且指沒有增殖，沒有產(chǎn)生細(xì)胞因子和沒有在表面上表達(dá)常規(guī)免疫細(xì)胞活化分子例如CD25的免疫細(xì)胞或者細(xì)胞群體。術(shù)語“活化的” 是本領(lǐng)域眾所周知的并且指增殖和/或產(chǎn)生細(xì)胞因子并且在其表面上表達(dá)常規(guī)免疫細(xì)胞活化分子例如CD25的免疫細(xì)胞或者細(xì)胞群體。
尤其對于T淋巴細(xì)胞，從靜息狀態(tài)到活化狀態(tài)的過渡由T細(xì)胞與其特異抗原相遇或者由活化細(xì)胞因子或促分裂原的活化介導(dǎo)。與CD127l0/_，CD62LW_或CD25LW_相關(guān)使用的術(shù)語“低”或“Ιο”或“Ιο/-，，是本領(lǐng)域眾所周知的并且指目的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平與作為整體分析的細(xì)胞群體中該細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平相比較低。更加具體而言，術(shù)語“Ιο”指以比一種或者更多種其他不同細(xì)胞群體更低的水平表達(dá)細(xì)胞標(biāo)志物的不同細(xì)胞群體。術(shù)語“高”或“hi”或“亮”是本領(lǐng)域眾所周知的并且指目的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平與作為整體分析的細(xì)胞群體中該細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平相比較高。
術(shù)語“ + ”和是本領(lǐng)域眾所周知的并且指目的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中對應(yīng)于“ + ”的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平高或中等并且對應(yīng)于的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平低或者無。通常，染色強(qiáng)度前或5%的細(xì)胞被稱為“hi”，落入群體前50%的那些細(xì)胞歸類為“ + ”。熒光強(qiáng)度處于后50%的那些細(xì)胞被稱為“Ιο”細(xì)胞并且熒光強(qiáng)度處于后5%的細(xì)胞被稱為細(xì)胞。如本文所使用，術(shù)語“⑶127”指細(xì)胞表面上存在的“白細(xì)胞介素-7受體”(IL_7R)。IL-7受體α鏈在文獻(xiàn)中有描述(例如Goodwin等.(1990) Cell60:941-951)。IL-7R在文獻(xiàn)中也稱作⑶127。⑶127+指當(dāng)用針對⑶127的標(biāo)記抗體處理時染色中等或者亮的細(xì)胞。CD127W_指當(dāng)接觸標(biāo)記的CD127抗體時染色弱/不清楚或者根本不染色的細(xì)胞類型。通常，基于染色強(qiáng)度上容易辨別的差別，根據(jù)它們的CD127表達(dá)水平區(qū)分細(xì)胞，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在一些實施方案中，基于對所有細(xì)胞觀察到的熒光強(qiáng)度分布，可以設(shè)定將細(xì)胞稱為⑶127w_細(xì)胞的截斷值，其中熒光強(qiáng)度處于后50 %、40 %、30 %或20 %的那些細(xì)胞被稱為⑶127w_細(xì)胞。⑶127_細(xì)胞可以被指定為熒光強(qiáng)度處于后10%的細(xì)胞。在一些實施方案中，得到所有細(xì)胞的CD127染色的頻率分布并將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，并且根據(jù)對各種群分布的統(tǒng)計學(xué)分析，將細(xì)胞歸為統(tǒng)計學(xué)最有可能屬于的群體中。在一些實施方案中，⑶127w_細(xì)胞的染色強(qiáng)度比⑶127+細(xì)胞弱2至3倍。如本文所使用，術(shù)語“CD62L”指L-選擇蛋白，它是淋巴細(xì)胞遷移的關(guān)鍵粘附分子。⑶62L+指當(dāng)用針對⑶62L的標(biāo)記抗體處理時染色中等或者亮的細(xì)胞。⑶62LW_指當(dāng)接觸標(biāo)記的CD62L抗體時染色弱/不清楚或者根本不染色的細(xì)胞類型。通常，基于染色強(qiáng)度上容易辨別的差別，根據(jù)它們的CD62L表達(dá)水平區(qū)分細(xì)胞，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在一些實施方案中，基于對所有細(xì)胞觀察到的熒光強(qiáng)度分布，可以設(shè)定將細(xì)胞稱為CD62LW_細(xì)胞的截斷值，其中熒光強(qiáng)度處于后50 %、40 %、30 %或20 %的那些細(xì)胞被稱為⑶62LW_細(xì)胞。CD62L_細(xì)胞可以被指定為熒光強(qiáng)度處于后10%的細(xì)胞。在一些實施方案中，獲得所有的細(xì)胞的CD62L染色的頻率分布并將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，并且根據(jù)對各種群分布的統(tǒng)計學(xué)分析，將細(xì)胞歸為統(tǒng)計學(xué)最有可能屬于的群體中。在一些實施方案中，⑶62LW_細(xì)胞的染色強(qiáng)度比⑶62L+細(xì)胞弱2至3倍。如本文所使用，術(shù)語“CD4”指有代表性地存在于成熟輔助T細(xì)胞和未成熟的胸腺細(xì)胞上以及單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的細(xì)胞表面糖蛋白。在T細(xì)胞上，CD4是T細(xì)胞受體(TCR)的共受體并且召募酪氨酸激酶lck。⑶4使用其Dl-部分附著至MHC II類分子的β2結(jié)構(gòu)域。CD4+指當(dāng)接觸標(biāo)記的抗CD4抗體時染色亮的細(xì)胞，并且CDf指當(dāng)接觸熒光標(biāo)記的CD4抗體時染色亮度最小，不清楚或者根本不染色的細(xì)胞類型。通常，基于染色強(qiáng)度上容易辨別的差別，根據(jù)它們的CD4表達(dá)水平區(qū)分細(xì)胞，因為CD4染色明顯雙峰。在一些實施方案中，獲得所有細(xì)胞的CD4染色的頻率分布并將群體曲線擬合至較高染色和較低染色群體，并且根據(jù)對各種群分布的統(tǒng)計學(xué)分析，將細(xì)胞歸為統(tǒng)計學(xué)最有可能屬于的群體中。在一些實施方案中，⑶4_細(xì)胞的染色強(qiáng)度比⑶4+細(xì)胞弱2至3倍。如本文所使用，術(shù)語“⑶25”指白細(xì)胞介素-2受體α亞基，它是分子量55kD的單鏈糖蛋白。當(dāng)T細(xì)胞在單核因子白細(xì)胞介素-1存在下被抗原或者促分裂原活化之后，快速合成并分泌白細(xì)胞介素2(IL-2)。作為對此的反應(yīng)，亞群T細(xì)胞表達(dá)IL-2的高親和性受體。這些細(xì)胞增殖，擴(kuò)增了能夠介導(dǎo)輔助、阻抑制因子和細(xì)胞毒性功能的T細(xì)胞群體。IL-2受體并非唯一存在于T細(xì)胞上。⑶25hi指當(dāng)與標(biāo)記的抗⑶25抗體接觸時染色亮的細(xì)胞，⑶25+指當(dāng)與標(biāo)記的抗CD25抗體接觸時染色亮度稍差的細(xì)胞，并且CD25W_指當(dāng)接觸標(biāo)記的CD25抗體時染色亮度最小、不清楚或者無染色的細(xì)胞類型。通常，基于染色強(qiáng)度差別，根據(jù)它們的CD25表達(dá)水平區(qū)分細(xì)胞， 這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在一些實施方案中，基于觀察到的所有細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布設(shè)置將細(xì)胞歸為CD25表達(dá)類別h1、+、lo、或-細(xì)胞的截斷值。通常，染色強(qiáng)度前2%、3%、4%或5%的細(xì)胞被歸為“hi ”，落入群體前50%的那些細(xì)胞歸類于“ + ”。熒光強(qiáng)度處于后50%的那些細(xì)胞被稱為⑶251°細(xì)胞并且熒光強(qiáng)度處于后5%的細(xì)胞被稱為0025_細(xì)胞。因此所述的Trl-樣細(xì)胞可以通過它們的細(xì)胞表面標(biāo)志物和它們產(chǎn)生IL-13的能力有效表征。因此所述Trl細(xì)胞亞群可以通過它們的細(xì)胞表面標(biāo)志物和它們產(chǎn)生IL-13和IL-10的能力有效表征。這些細(xì)胞表面標(biāo)志物可以由特異性結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物的試劑識別。例如，Trl細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)、糖或脂可以通過特定蛋白質(zhì)或糖特異性的抗體進(jìn)行免疫識別(對于抗體對標(biāo)志物的用途參見Harlow, Using Antibodies:A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Pres s, Cold Spring Harbor, N.Y.，1999 ;還參見實施例)。Trl-樣細(xì)胞表面上存在的和這些細(xì)胞表面上缺乏的標(biāo)志物組是Trl-樣細(xì)胞特征性的。因此，可以通過使用細(xì)胞表面標(biāo)志物的正選擇和負(fù)選擇來選擇Trl-樣細(xì)胞。結(jié)合由Trl-樣細(xì)胞所表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志物，即“陽性標(biāo)志物”的試劑可以用于Trl-樣細(xì)胞的正選擇(即，保留表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞)。相反，負(fù)選擇依賴于這樣的事實，即Trl-樣細(xì)胞不表達(dá)某些細(xì)胞表面標(biāo)志物。因此，“陰性標(biāo)志物”(即，Trl-樣細(xì)胞表面上不存在的標(biāo)志物)可用于通過去除與陰性標(biāo)志物特異性試劑結(jié)合的細(xì)胞而將群體中非Trl-樣細(xì)胞的那些細(xì)胞去除。在一個實施方案中，基于所檢測到的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)辨別細(xì)胞，通過比較細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)與對照細(xì)胞群體的平均表達(dá)進(jìn)行。例如，Trl-樣細(xì)胞上標(biāo)志物的表達(dá)可以與來自與Trl-樣細(xì)胞相同的樣品的其他細(xì)胞上相同標(biāo)志物的平均表達(dá)相比較。通過標(biāo)志物表達(dá)鑒別細(xì)胞的其他方法包括通過流式細(xì)胞術(shù)使用試劑組合選通細(xì)胞(參見GivanA,Flow Cytometry:First Principles,(ffiley-Liss,New York,1992) ；Owens M A & LokenM R., Flow Cytometry:Principles for Clinical Laboratory Practice, (ffiley-Liss,New York,1995))?！霸噭┙M合”意思是指至少兩種與Trl-樣細(xì)胞表面上存在(陽性標(biāo)志物)或不存在(陰性標(biāo)志物)的細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合的試劑，或者結(jié)合陽性標(biāo)志物與陰性標(biāo)志物組合的至少兩種試劑。例如，使用Trl-樣細(xì)胞表面標(biāo)志物特異性抗體組合可從許多種樣品/組織中分離和/或富集Trl-樣細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，“抗X抗體”或者“X抗體”是能特異性結(jié)合X的抗體。例如，抗⑶127抗體或⑶127抗體能夠結(jié)合⑶127。根據(jù)本發(fā)明使用的抗體包括，但不限于，重組抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人單克隆抗體、人源化或靈長源化單克隆抗體和抗體片段。許多淋巴細(xì)胞生物標(biāo)志物特異性的抗體可以商業(yè)上獲得。這些抗體包括抗⑶127抗體、抗⑶4抗體、抗⑶62L抗體、抗⑶25抗體、抗IL-4抗體、抗IL-10抗體和抗IL-13抗體(R&D、BDBiosciences等)?！翱贵w”指包含來自免疫球蛋白基因的框架區(qū)的多肽或其特異性結(jié)合并識別抗原的片段。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括K，λ，α，Υ，δ，ε，和μ恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為γ，μ，α，δ，或ε，反過來這定義了免疫球蛋白類別分別為IgG，IgM, IgA, IgD和IgE。有代表性地，抗體的抗原結(jié)合區(qū)對于結(jié)合特異性和親和性而言是最關(guān)鍵的。示例性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包括四聚體。每一四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每一多肽鏈對具有一個“輕鏈”(大約25kD)和一個“重鏈”(大約50-70kD)。每一鏈的N-末端定義了主要負(fù)責(zé)抗原識別的大約100至110或者更多個氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。抗 體作為例如完整的免疫球蛋白存在或者作為通過用不同肽酶消化產(chǎn)生的許多良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區(qū)內(nèi)二硫鍵以下的抗體產(chǎn)生F(ab)' 2，它是Fab的二聚體，F(xiàn)ab自身為通過二硫鍵與VH-CHl結(jié)合的輕鏈。F(ab) ' 2可以在溫和條件下被還原以破壞鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵，由此將F (ab) ' 2 二聚體轉(zhuǎn)變成Fab'單體。Fab'單體基本上是具有部分鉸鏈區(qū)的Fab (參見Fundamental Immunology (Paul編,第3版，1993))。雖然以消化完整抗體的方式定義了不同抗體片段，但是技術(shù)人員會意識到，此類片段可以通過化學(xué)方法或者通過使用重組DNA方法從頭合成。因此，術(shù)語抗體，如本文所使用，還包括通過修飾整個抗體產(chǎn)生的抗體片段，或者使用重組DNA方法學(xué)從頭合成的那些(例如單鏈Fv)或者使用曬菌體展示文庫鑒定的那些(參見例如McCafferty等,Nature348:552-554(1990))。在一些實施方案中，可以使用靶標(biāo)的高親和性配體代替抗體。短語“特異性(或者選擇性)結(jié)合”抗體或者與之“特異性(或者選擇性)免疫反應(yīng)”當(dāng)涉及到蛋白質(zhì)或肽時是指常常在蛋白質(zhì)和其它生物產(chǎn)品的異質(zhì)群體中決定著蛋白質(zhì)存在的結(jié)合反應(yīng)。在此類條件下與抗體的特異性結(jié)合需要選擇其對特定蛋白質(zhì)具有特異性的抗體。例如，可以對多克隆抗體進(jìn)行選擇以得到僅與所選擇的抗原特異性免疫反應(yīng)而不與其他蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的那些多克隆抗體。這種選擇可以通過削減掉與其他分子交叉反應(yīng)的抗體實現(xiàn)。優(yōu)選地，“標(biāo)簽”或者“可檢測部分”與抗體共價或非共價連接。標(biāo)簽可以通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理手段檢測到。特別有用的標(biāo)簽是熒光染料。將標(biāo)簽與抗體相連的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知。特別優(yōu)選的標(biāo)簽是通過連接體連接至抗體的那些，所述的連接體可以容易地切割或分離或者在生理條件下與預(yù)定酶接觸而經(jīng)受水解。抗體還可以與磁性微粒，例如順磁微珠綴合(Miltenyi Biotec,德國)。被磁性標(biāo)記抗體結(jié)合的活化T細(xì)胞可以使用技術(shù)包括，但不限于，磁性細(xì)胞分選分離。適宜標(biāo)記的⑶127抗體、⑶62L抗體、⑶4抗體和⑶25抗體，以及許多其它分化簇的適宜標(biāo)記抗體可以商業(yè)性獲得并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的?？贵w可以在與樣品接觸之前或之后或者在與CD接觸之前或之后被標(biāo)記。CD抗體可以通過與結(jié)合CD抗體的標(biāo)記抗體接觸而被標(biāo)記。如本文所使用，術(shù)語“CD”或者“分化簇”或“共同決定簇”指被抗體識別的細(xì)胞表面分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體是靜息的并且細(xì)胞表達(dá)低水平FoxP3。在一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群是靜息的并且細(xì)胞表達(dá)低水平FoxP3。在本發(fā)明的另一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體是活化的并且細(xì)胞表達(dá)中等水平的FoxP3。在一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群是活化的并且細(xì)胞表達(dá)中等水平的FoxP3。 如本文所使用，術(shù)語“Foxp3”指據(jù)認(rèn)為擔(dān)任轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白Foxp3(Hori等，2003 ；Yasayko, J.E.等，Nat.Genet.27:68-73 (2001) ；Fontenot, J.D.等，Nat.Tmmunol.4:330-336(2003) ；Khattri,R.等，Nat.1mmunol.4:337-342 (2003))。由于 Foxp3 定位在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)oxp3的表達(dá)可以通過使用標(biāo)記抗Foxp3抗體(eBioscience inc或BD biosciences)的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)評價。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含分離的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，基本上由分離的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞組成，或者由分離的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞組成。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含分離的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群，基本上由分離的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群組成，或者由分離的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群組成。在本發(fā)明的一個實施方案中，Trl細(xì)胞亞群或者Trl-樣細(xì)胞是抗原特異性的或者是多重抗原特異性的。Trl細(xì)胞亞群或者Trl-樣細(xì)胞特異性抗原實例包括,但不限于，自身抗原；來自普通人飲食的食物抗原；炎癥性抗原例如多發(fā)性硬化相關(guān)抗原或者關(guān)節(jié)相關(guān)抗原；和變應(yīng)原。術(shù)語“來自普通人飲食的食物抗原”指來自人普通糧食的免疫原性肽，例如下列非限制性列表中的食物抗原:?？乖巛d脂蛋白、Ca-結(jié)合S100、α -乳清蛋白、乳球蛋白例如β_乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鮭魚抗原例如細(xì)小清蛋白、雞抗原例如類卵粘蛋白、卵清蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或雞血清白蛋白、花生、蝦抗原例如原肌球蛋白、小麥抗原例如凝集素或麥醇溶蛋白、芹菜抗原例如芹菜肌動蛋白抑制蛋白、胡蘿卜抗原例如胡蘿卜肌動蛋白抑制蛋白、蘋果抗原例如索馬甜、蘋果脂轉(zhuǎn)移蛋白、蘋果肌動蛋白抑制蛋白、梨抗原例如梨肌動蛋白抑制蛋白、異黃酮還原酶、鱷梨抗原例如內(nèi)切殼多糖酶、杏抗原例如杏脂轉(zhuǎn)移蛋白、桃抗原例如桃脂轉(zhuǎn)移蛋白或桃肌動蛋白抑制蛋白、大豆抗原例如HPS、大豆肌動蛋白抑制蛋白或(SAM22)PR-1Oprot。術(shù)語“自身抗原”指來源于所述個體蛋白質(zhì)的免疫原性肽。它可以是例如下列非限制性列表中的自身抗原:乙酰膽堿受體、肌動蛋白、腺嘌呤核苷酸易位蛋白、腎上腺素能受體、芳香族L-氨基酸脫羧酶、去唾液酸糖蛋白受體、殺菌/通透性增加蛋白(B Pi)、鈣敏感受體、膽固醇側(cè)鏈剪切酶，膠原IV型-鏈、細(xì)胞色素P450 2D6、結(jié)蛋白、橋粒芯糖蛋白-1、橋粒芯糖蛋白-3、F-肌動蛋白、GM-神經(jīng)節(jié)苷脂、谷氨酸脫羧酶、谷氨酸受體、H/K ATP酶、17-羥化酶、21-羥化酶、IA-2(ICAS12)、胰島素、胰島素受體、內(nèi)因子類型1、白細(xì)胞功能抗原1、髓鞘相關(guān)糖蛋白、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白、肌球蛋白、P80-環(huán)形體蛋白、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2(PDC-E2)、鈉碘轉(zhuǎn)運體、S0X-10、甲狀腺和眼肌肉共享蛋白質(zhì)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、促甲狀腺素受體、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、轉(zhuǎn)錄輔激活因子P75、色氨酸羥化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羥化酶、ACTH、氨?；?tRNA-組氨酰合成酶、心磷脂、碳酸酐酶I1、著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)、DNA依賴的核小體刺激的ATP酶、纖維蛋白、纖連蛋白、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶、β 2-糖蛋白1、高爾基體蛋白(95，97，160，180)、熱休克蛋白、半橋粒蛋白180、組蛋白Η2Α，Η2Β、角蛋白、IgE受體、Ku-DNA蛋白激酶、Ku-核蛋白、La磷蛋白、髓過氧化物酶、蛋白酶3、RNA聚合酶1-111、信號識別蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶1、微管蛋白、vimenscin、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿蛋白(MOBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(0SP/Claudinl I)、環(huán)核苷酸:V磷酸二酯酶(CNP酶)、BP抗原I (BPAGl_e)、轉(zhuǎn)醛醇酶(TAL)、人線粒體自身抗原 PDC-E2 (Νονο 和 2)、0GDC-E2 (Νονο3)和 BC0ADC-E2 (Νονο4)、大皰性類天皰瘡(BP) 180、層粘連蛋白5(LN5)、DEAD-盒蛋白質(zhì)48(DDX48)或者胰島瘤相關(guān)抗原_2。 術(shù)語“多發(fā)性硬化相關(guān)抗原”指髓磷脂堿蛋白(ΜΒΡ)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白(M0G)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(0SP/Claudinl I)、熱休克蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、周圍髓磷脂蛋白22(PMP22)、2’ 3'-環(huán)核苷酸3"-磷酸二酯酶(CNP酶)、其片段、變異體和混合物。術(shù)語“關(guān)節(jié)相關(guān)抗原”指瓜氨酸取代的環(huán)狀和線性聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP B1、hnRNP D、Ro60/52、HSP60，65，70和90、BiP、角蛋白、波形蛋白、血纖蛋白原、膠原類型I，II，III，IV和V肽、膜聯(lián)蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；?鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶(PDH)、醛縮酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶1、SnRNP、PARP、Scl-70、Scl-100、磷脂抗原包括陰離子的心磷脂和磷脂酰絲氨酸、電中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、肌原纖蛋白、聚集蛋白聚糖。術(shù)語“變應(yīng)原”指吸入變應(yīng)原、攝入變應(yīng)原或接觸變應(yīng)原。變應(yīng)原的實例包括，但不限于，來源于花粉(Cup，Jun)、房屋塵螨(0虹，617，了71'，1^印)、狗、貓和嚙齒動物(Can，F(xiàn)el，Mus, Rat)的吸入變應(yīng)原。接觸變應(yīng)原的實例包括，但不限于，重金屬(例如鎳、鉻、金)、乳膠、半抗原例如氟烷、肼苯噠嗪。在本發(fā)明的一個實施方案中，Trl細(xì)胞亞群或者Trl-樣細(xì)胞群體特異性的抗原是HSP，優(yōu)選 HSP60。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于鑒定/分離/定量產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體的方法，包括:-檢測細(xì)胞群體上⑶127和⑶62L之一和⑶4在細(xì)胞表面上的表達(dá)，-檢測IL-13的產(chǎn)生，例如在測試A的條件下檢測IL-13的產(chǎn)生，其中表達(dá)⑶4(即為⑶4+)和低水平⑶127和/或低水平⑶62L(即為⑶1271^和⑶62L1。并且產(chǎn)生IL-13的細(xì)胞是產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞，和-鑒定/分離/定量所述細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于鑒定/分離/定量產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群的方法，包括:-檢測細(xì)胞群體上⑶127和⑶62L之一和⑶4在細(xì)胞表面上的表達(dá)，-檢測IL-13和IL-10的產(chǎn)生，例如在測試A的條件下檢測IL-13和IL-10的產(chǎn)生，其中表達(dá)⑶4(即為⑶4+)和低水平⑶127和/或低水平⑶62L(即為⑶1271^和⑶62L1。勹并且產(chǎn)生IL-13和IL-10的細(xì)胞是所述Trl細(xì)胞亞群，和-鑒定/分離/定量所述細(xì)胞。如上面所述，⑶4、⑶127和⑶62L的細(xì)胞表面表達(dá)可以通過使用抗⑶4、抗⑶62L和抗CD 127抗體檢測。IL-13和IL-10產(chǎn)生的檢測可以通過本領(lǐng)域眾所周知的不同手段開展。例如，用于檢測IL-13或IL-10產(chǎn)生的第一種方法依賴于使用標(biāo)記的抗IL-13或抗IL-10抗體，用于對先前透化的T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，通過FACS讀取染色。用于檢測IL-13或IL-10產(chǎn)生的方法的另一個實例依賴于用標(biāo)記的抗IL13或抗IL-10抗體開展的ELISA測定。 最后,用于檢測IL-13產(chǎn)生的方法的另一個實例依賴于使用Miltenyi Biotech商業(yè)化的IL-13分泌測定試劑盒(130-093-480)或其等效物。該方法是特別受關(guān)注的，因為它允許檢測并富集產(chǎn)生IL-13的細(xì)胞，而無需對它們進(jìn)行透化。用于檢測IL-10產(chǎn)生的方法的另一個實例依賴于使用Miltenyi Biotech商品化的IL-10分泌測定試劑盒(130_090_434)或其等效物。該方法是特別受關(guān)注的，因為它允許檢測并富集產(chǎn)生IL-10的細(xì)胞，而無需對它們進(jìn)行透化。包含T細(xì)胞的任何細(xì)胞來源可以用于分離產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群。有用的來源包括，但不限于，外周血、滑液、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、派爾斑和扁桃體。用于分開、分離或者選擇細(xì)胞的方法包括，但不限于使用抗體包被的磁珠的磁選(Schwartz,等,美國專利號5，759，793)和親和性層析或者使用連接至固體基質(zhì)(例如板)的抗體的“淘選”。提供精確分離的更多的技術(shù)包括熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)，它可以具有不同的復(fù)雜程度，例如具有多顏色通道，低角和圓頭光散射檢測通道，或者阻抗通道。死細(xì)胞可以通過用與死細(xì)胞有關(guān)的染料(碘化丙啶，LDS)選擇而去除。紅細(xì)胞可以通過例如沖洗、溶血或者Ficoll-Paque梯度去除。可以采用對所選擇細(xì)胞的活性沒有過分有害的任何技術(shù)?？贵w可以方便地與用于許多不同目的的標(biāo)簽綴合:例如與磁珠綴合以方便分離Trl細(xì)胞；與以高親和性結(jié)合抗生物素蛋白或鏈親和素的生物素綴合；與可以與熒光激活細(xì)胞分選儀一起使用的熒光染料綴合；與半抗原綴合；等等。可以使用FACS或者免疫磁性分選與流式細(xì)胞術(shù)的組合進(jìn)行多顏色分析。多顏色分析對于基于例如以下的多種表面抗原的細(xì)胞分離而言是感興趣的:例如非-⑶4+免疫細(xì)胞標(biāo)志物(⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、ra56、rai23、TCRy/S和血型糖蛋白A)、⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L。發(fā)現(xiàn)可在多顏色分析中使用的熒光染料包括，但不限于，藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素，和得克薩斯紅。
磁性分選是用于在磁場梯度中選擇性將磁性材料保留在容器例如離心管或柱內(nèi)的過程。Trl細(xì)胞可以通過特異性相互作用，包括免疫親和性相互作用而將磁性顆粒結(jié)合至細(xì)胞表面而被磁性標(biāo)記。然后將適宜容器內(nèi)的包含Trl細(xì)胞的懸液暴露于足夠強(qiáng)的磁場梯度下以將Trl細(xì)胞與懸液中的其它細(xì)胞分離。然后用適宜的流體洗滌容器以去除未標(biāo)記的細(xì)胞，產(chǎn)生純化的Trl細(xì)胞懸液。大多數(shù)的磁標(biāo)記系統(tǒng)使用超順磁顆粒和與其表面共價結(jié)合的單克隆抗體或鏈親和素。在細(xì)胞分離應(yīng)用中，這些顆?？梢杂糜谡x擇，其中目的細(xì)胞被磁性標(biāo)記并保留，或者負(fù)選擇，其中大多數(shù)不希望的細(xì)胞被磁性標(biāo)記和保留。所使用的顆粒的直徑廣泛變化，從 MACS 顆粒(Miltenyi Biotec)和 StemSep (TM)膠體(StemCell Technologies)的大約 50_100nm,至 EasySep (R) (StemCell Technologies)和 Imag 顆粒(BD Biosciences)的150_450nm,最高為Dynabeads (Dynal Biotech)的4.2 μ m。用來分離所標(biāo)記細(xì)胞的磁體技術(shù)影響所使用的顆粒類型。存在兩個重要種類的磁性分選技術(shù)，為了方便和實用的原因它們均使用永久磁體而不是電磁體。第一類是基于柱的高梯度磁場分離技術(shù)，它使用小的弱的磁性顆粒標(biāo)記目的靶標(biāo)，并且在填充有可磁化基質(zhì)的柱內(nèi)分離這些靶標(biāo)。當(dāng)向柱應(yīng)用磁場時，在接近于基質(zhì)元件的表面產(chǎn)生非常高的梯度。對于分離用這些相對弱的磁性顆粒標(biāo)記的靶標(biāo)而言使用高梯度是必需的。第二類是基于管的技術(shù)，它使用更強(qiáng)的磁性顆粒標(biāo)記目的靶標(biāo)。然后將這些目的靶標(biāo)通過管外磁體產(chǎn)生的磁場梯度在離心類型的管內(nèi)分離。該方法的優(yōu)勢在于它不依賴于可磁化基質(zhì)產(chǎn)生梯度；并且因此不需要昂貴的一次性柱或者以不便的清洗和凈化過程處理的可重復(fù)使用的柱。一旦放置在磁體內(nèi)，靶細(xì)胞向最高磁場強(qiáng)度的區(qū)域或多個區(qū)域遷移并且保留在磁場內(nèi)，而未標(biāo)記的細(xì)胞被排出掉。然后在從磁場中移出后收集靶細(xì)胞并使用。在需要負(fù)選擇的情況下，未標(biāo)記的細(xì)胞被保留并且用于多種用途。FACS允許基于當(dāng)它們經(jīng)過激光柱時的光散射特性分離細(xì)胞亞群。向前光散射(FALS)與細(xì)胞大小有關(guān)，并且右角光散射，也稱作側(cè)散射特性(SSC)與細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)容物和核質(zhì)比，即細(xì)胞 復(fù)雜性有關(guān)。由于細(xì)胞可以用熒光綴合的抗體標(biāo)記，所以它們可以通過抗體(突光)強(qiáng)度進(jìn)一步表征。在特別的實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞使用免疫磁性層析分離。例如,抗CD4抗體連接至磁性珠。這些抗體標(biāo)記的磁性珠用作親和純化的基礎(chǔ)。T細(xì)胞的抗體標(biāo)記部分應(yīng)用至磁性親和柱上。非粘附的細(xì)胞被排出并且通過除去磁場將粘附的細(xì)胞從磁性柱洗脫。在另一個實施方案中，首先將細(xì)胞用抗體(例如抗CD4)標(biāo)記，然后用攜帶磁性珠或球的次級抗體標(biāo)記。在另一個實施方案中，與Trl細(xì)胞具有免疫反應(yīng)性的次級抗體可以用于富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的群體。次級抗體的使用是本領(lǐng)域普遍已知的。有代表性地,次級抗體是與第一個抗體的恒定區(qū)具有免疫反應(yīng)的抗體。優(yōu)選的次級抗體包括抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊、抗馬免疫球蛋白并且可以商業(yè)性獲得。商業(yè)上可得到的試劑盒提供與標(biāo)記試齊U，例如但不限于磁性顆粒和熒光染料綴合的次級抗體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于使細(xì)胞群體富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的方法，包括:
-鑒定表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或⑶62L并產(chǎn)生IL-13的細(xì)胞，-選擇所述細(xì)胞，由此得到富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的細(xì)胞群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于使細(xì)胞群體富集產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群的方法，包括:-鑒定表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或⑶62L并產(chǎn)生IL-13和IL-10的細(xì)胞，-選擇所述細(xì)胞，由此得到富集產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群的細(xì)胞群體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，使群體富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的方法可以包括:
-將細(xì)胞群體與結(jié)合非-CD4+細(xì)胞的標(biāo)志物的至少一種試劑接觸，由此去除非-CD4+細(xì)胞，-如上所述鑒定產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞并選擇它們。在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于使群體富集產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群的方法可以包括:-將細(xì)胞群體與結(jié)合非-CD4+細(xì)胞的標(biāo)志物的至少一種試劑接觸，由此去除非-CD4+細(xì)胞，-如上所述鑒定產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群并選擇它們。結(jié)合非-⑶4+細(xì)胞的標(biāo)志物的實例包括，但不限于，⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、⑶56、⑶123和血型糖蛋白A。結(jié)合所述標(biāo)志物的優(yōu)選試劑是抗體。在再一實施方案中，抗體與突光染料或磁性顆粒綴合。在另一實施方案中，通過流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、磁性選擇、親和層析或者淘選或其組合開展細(xì)胞選擇。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)所述方法得到的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的富集群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)所述方法得到的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群的富集群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體，基本上由富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體組成，或者由富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體組成。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群，基本上由富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群組成，或者由富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群組成。如本文所使用，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞富集的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)高于在最初得到細(xì)胞的群體中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。盡管有可能，但是富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的群體不需要包含同質(zhì)的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的群體。在特別的實施方案中，所述組合物細(xì)胞的至少大約50 %，大約55 %，大約60 %，大約65 %，大約70 %，大約75 %，大約80 %，大約85 %，大約90 %，大約95 %，大約98 %，或大約99 %是產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞。在另一個實施方案中，富集的組合物/群體中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是富集前產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。如本文所使用，產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞富集的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)高于在最初得到細(xì)胞的群體中產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。盡管有可能，但是富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的群體不需要包含同質(zhì)的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的群體。在特別的實施方案中，所述組合物細(xì)胞的至少大約50 %，大約55 %，大約60 %，大約65 %，大約70 %，大約75%，大約80%，大約85%，大約90%，大約95%，大約98%，或大約99%是產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞。在另一個實施方案中，富集的組合物/群體中產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是富集前產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。包含T細(xì)胞的任何細(xì)胞來源可以用于分離/富集產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞。有用的來源包括，但不限于，外周血、滑液、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、派爾斑和扁桃體?；谂c富集過程每一步驟有關(guān)的富集水平，富集方法是不同的。產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的富集水平和純度百分?jǐn)?shù)會依賴于許多因素，包括，但不限于， 供體、細(xì)胞/組織來源和供體的疾病狀態(tài)。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞根據(jù)上述方法分離，然后通過本領(lǐng)域眾所周知的方法將產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞進(jìn)行克隆。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞根據(jù)上述方法分離，然后通過本領(lǐng)域眾所周知的方法將產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞進(jìn)行克隆。在另一個實施方案中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以分離表達(dá)CD4和低水平CD127和/或⑶62L的細(xì)胞，克隆所述細(xì)胞，然后當(dāng)活化時分離產(chǎn)生IL-13或者IL-10和IL-13的克隆。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆，基本上由產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆組成，或者由產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆組成。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆產(chǎn)生低水平的IL-4。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆產(chǎn)生低水平的IL-2。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆產(chǎn)生中等水平的IFNy。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣克隆或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl克隆產(chǎn)生中等水平的TGF β。通過本發(fā)明方法分離的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群可以通過W02006/108882中所述的體外方法進(jìn)一步擴(kuò)增。所述方法包括:a)在低于35°C的溫度Tl下，在培養(yǎng)基Mf中培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞例如昆蟲飼養(yǎng)細(xì)胞，所述溫度Tl允許飼養(yǎng)細(xì)胞增殖并且所述飼養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)與下列細(xì)胞表面蛋白相互作用的因子:-CD3/TCR 復(fù)合體，-CD28 蛋白，-1L-2 受體，-CD2 蛋白，-1L-4 受體，b)將在步驟a)中得到的清除或者未清除它們的培養(yǎng)基Mf的飼養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基Mp中包含的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體或產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群接觸，其中所述培養(yǎng)基Mp最初不包含步驟a)中所述的因子，以得到包含Trl細(xì)胞群體，飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基Mp的混合物，c)在溫度T2下培養(yǎng)在步驟b)中得到的混合物，溫度T2至少為35°C，選擇所述的溫度使得Trl細(xì)胞群體增殖而飼養(yǎng)細(xì)胞不增殖，d)將如此擴(kuò)增的Trl細(xì)胞群體回收。與上面提到的細(xì)胞表面蛋白相互作用的因子實例包括:-抗⑶3抗體，優(yōu)選修飾的抗⑶3抗體，其中⑶3重鏈的抗⑶3胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域被替換成跨膜結(jié)構(gòu)域，-CD80 或 CD86 蛋白，-由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-選自IL-4和IL-13的白細(xì)胞介素。Mp培養(yǎng)基用來培養(yǎng)T細(xì)胞并且可以是無血清培養(yǎng)基。Mp培養(yǎng)基的非限定性實例是商業(yè)上可以得到的無血清培養(yǎng)基例如來自BioWhittaker的XVIV015、來自Invitrogen的AIM V 培養(yǎng)基、DMEM、RPMI 等。Mf培養(yǎng)基用來培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞并且可以是無血清培養(yǎng)基。Mf培養(yǎng)基的非限定性實例是商業(yè)上可以得到的無血清培養(yǎng)基例如來自BioWhittaker的Schneider無血清培養(yǎng)基、來自Invitrogen的作為SFM的MD Gibco無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基或者來自Krackeler Scientific Inc 的 Insectagro0在本發(fā)明的實施方案中，如此得到的Trl細(xì)胞可以使用常規(guī)用于克隆T細(xì)胞的方法進(jìn)行克隆。在本發(fā)明的實施方案中，如此得到的Trl細(xì)胞或者Trl細(xì)胞克隆可以冷凍以儲存。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述的組合物包含富集并擴(kuò)增的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-1O的Trl細(xì)胞亞群，基本上由富集并擴(kuò)增的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-1O的Trl細(xì)胞亞群組成，或者由富集并擴(kuò)增的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-1O的Trl細(xì)胞亞群組成。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于去除細(xì)胞群體中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或產(chǎn)生IL-13和IL-1O的Trl細(xì)胞的方法， 包括:-鑒定表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或⑶62L并產(chǎn)生IL-13或IL-10和IL-13的細(xì)胞，
-去除所述細(xì)胞，-由此得到產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是組合物，所述組合物包含產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的群體，基本上由產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的群體組成，或者由產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的群體組成。產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的組合物/群體或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的組合物/群體是這樣的組合物/群體，即其中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)低于在最初得到細(xì)胞的群體中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)上述方法得到的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是根據(jù)上述方法得到的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。如上面所解釋，用于分離細(xì)胞的方法包括，但不限于，使用抗體包被磁珠的磁性分選、親和層析或者使用與固體基質(zhì)(例如板)相連的抗體的“淘選”和熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)。Trl細(xì)胞被去除，而不是被選擇 。在一個實施方案中，產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞在經(jīng)去除的組合物/群體中的百分?jǐn)?shù)是去除前產(chǎn)生IL-13的Tr1-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于鑒定或分離產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞群體，或者用于使細(xì)胞群體富集或去除產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測CD4、⑶25、⑶127和⑶62L細(xì)胞表面表達(dá)的試劑和用于檢測IL-13產(chǎn)生的工具。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于鑒定或分離產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞群體，或者用于使細(xì)胞群體富集或者去除產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L細(xì)胞表面表達(dá)的試劑和用于檢測IL-13和IL-10產(chǎn)生的工具。優(yōu)選地，所述試劑是抗體。更優(yōu)選地，這些抗體與熒光染料或者磁性顆粒綴合。在另一個實施方案中,所述試劑盒還包含用于檢測Foxp3表達(dá)的試劑。優(yōu)選地,所述試劑是抗體。更優(yōu)選地，所述抗體與熒光染料綴合。本發(fā)明的另一目標(biāo)是抑制需要其的受試者中免疫反應(yīng)的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明分離的或者富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞。本發(fā)明的另一目標(biāo)是抑制需要其的受試者中免疫反應(yīng)的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明分離的或者富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞。在一個實施方案中，受試者已經(jīng)經(jīng)歷或者正在經(jīng)歷移植，例如骨髓移植或者器官移植。在另一個實施方案中，受試者具有過敏癥。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于預(yù)防或者治療需要其的受試者中炎癥性疾病的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明分離或者富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者分離或富集的產(chǎn)生IL-13和IL-1O的Trl細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于預(yù)防或者治療需要其的受試者中自身免疫病的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明分離或者富集的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者分離或富集的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，細(xì)胞群體可以從隨后向其引入產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞富集的組合物或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞富集的組合物的受試者得到。在本發(fā)明的一個實施方案中，受試者可以是希望抑制其免疫反應(yīng)的受試者。在一個實施方案中，受試者是患有炎癥性病或疾病/病癥的人，例如任何疾病/病癥，包括但不限于，非自身免疫炎癥性腸病、術(shù)后粘連、冠狀動脈疾病、肝臟纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、急性炎癥性胰腺炎、內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)引起的胰腺炎、燒傷、冠狀動脈、腦動脈和外周動脈粥樣化形成、闌尾炎、膽囊炎、憩室炎、內(nèi)臟纖維變性病癥、創(chuàng)傷愈合、皮膚瘢痕病癥(疤痕疙瘩、化膿性汗腺炎)、肉芽腫病癥(結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變)、哮喘、壞疽性膿皮病、斯威特綜合征、貝赫切特病、原發(fā)性硬化性膽管炎、和膿腫。

在另一個實施方案中，受試者是患有自身免疫病或者疾病/病癥的人，包括但不限于，紅斑狼瘡、尋常天皰瘡、甲狀腺炎、血小板減少性紫癜、格雷夫斯病、糖尿病、青少年糖尿病、自發(fā)的自身免疫性糖尿病、重癥肌無力、艾迪生病、關(guān)節(jié)炎病癥例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎；多發(fā)性硬化、銀屑病、葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、硬皮病、腸炎癥性病癥例如自身免疫炎癥性腸病、克隆病、大腸炎、食物過敏有關(guān)的腸炎癥；斯耶格倫病、橋本病、重癥肌無力、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、多肌炎、和甲狀腺炎、以及以人狼瘡為代表的全身性自身免疫病?！白陨砜乖比绫疚乃褂弥覆溉閯游锾烊坏牟⑶以谒霾溉閯游锛膊≈袨槊庖咴缘目乖虮砦?。本發(fā)明的細(xì)胞還可以用于預(yù)防或者治療移植反應(yīng)，例如移植物抗宿主疾病(GVHD)和移植排斥。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法例如繼承性細(xì)胞轉(zhuǎn)移開展產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞向患者內(nèi)的引入。簡言之，從靶供體提取混合的細(xì)胞群體。取決于應(yīng)用，在疾病緩解階段或者在活動性疾病過程中提取細(xì)胞。有代表性地，這通過收集外周血和通過白細(xì)胞去除術(shù)收獲白血細(xì)胞實現(xiàn)。例如，已經(jīng)顯示大體積白細(xì)胞去除術(shù)(LVL)使血液白細(xì)胞得率最大。收集的淋巴細(xì)胞可以使用基于Trl特異性細(xì)胞標(biāo)志物，例如本文所述的那些細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞分離技術(shù)分離，然后輸入到患者，有代表性地是細(xì)胞供體中(GVHD除外，在GVHD中供體和受體是不同的)，用于過繼性免疫抑制。大約IO3至1011，優(yōu)選IO4至IO10,優(yōu)選IO5至IO9,優(yōu)選IO6至IO9,更優(yōu)選IO6至IO8個Trl細(xì)胞注射入到患者內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語“有效量”意思是指治療物質(zhì)或者組合物的量足以減輕(以任何程度)或者改善病癥或者其一個或更多個癥狀的嚴(yán)重性/持續(xù)時間，防止病癥進(jìn)展，引起病癥退化，預(yù)防一個或多個病癥相關(guān)癥狀復(fù)發(fā)、發(fā)生、發(fā)作或進(jìn)展，檢測病癥，或者增強(qiáng)或改善另一治療(例如預(yù)防劑或治療劑)的一種或多種預(yù)防性或治療性效果。有效量將隨著受試者的年齡、性別、種族、種類、一般情況等、所治療病癥嚴(yán)重性、所使用的特定試劑、治療持續(xù)時間、任何并行治療的性質(zhì)、所使用的可藥用載體、和本領(lǐng)域技術(shù)人員知識和經(jīng)驗范圍內(nèi)的類似因素而變。根據(jù)情況，任何個體案例中的“有效量”可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考有關(guān)教科書和文獻(xiàn)和/或通過使用常規(guī)實驗確定，(例如參見Gennaro等,編者，Remington' s The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，(2000), LippincottWilliams and Wilkins, Baltimore MD ;Braunwald 等，編者，Harrison' s Principles ofInternal Medicine,第 15版，(2001) ,McGraw Hill,NY ;Berkow等，編者，The Merck Manualof Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway NJ)。術(shù)語“預(yù)防”、“預(yù)防著”和“預(yù)防的”在本文中指抑制病癥的發(fā)生或發(fā)作或者防止受試者中因施用治療(例如預(yù)防劑或治療劑)或者施用治療組合(例如預(yù)防劑或治療劑的組合)導(dǎo)致的病癥的一個或更多個癥狀復(fù)發(fā)、發(fā)作或進(jìn)展。“治療”或“治療著”意思是指達(dá)到至少改善宿主病癥的有關(guān)癥狀，其中改善以廣義使用，是指至少減少參數(shù)例如與正在治療病癥相關(guān)的癥狀的強(qiáng)度。照此，治療還包括這樣的情況，即其中病理病癥或者與其有關(guān)的至少一些癥狀完全被抑制，例如被阻止發(fā)生，或者被停止，例如被終止，以致于受試者不再遭受病癥，或者至少病癥特征性的 癥狀。如本文所使用，術(shù)語“受試者”指動物，優(yōu)選哺乳動物并且最優(yōu)選人。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于增加所移植細(xì)胞群體在需要其的受試者內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法，包括向所述受試者施用有效量的如上所述產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于增加所移植細(xì)胞群體在需要其的受試者內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法，包括向所述受試者施用有效量的如上所述產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。在一個實施方案中，所述方法用于治療經(jīng)歷癌癥治療的受試者。在一個實施方案中，所移植的細(xì)胞群體是抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞群體。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞群體是腫瘤抗原特異性的，抗原為例如黑素瘤的MART-1 (Melan A)或者黑素瘤的MAGEl，2，3、甲狀腺髓樣癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸和/或支氣管鱗狀細(xì)胞癌等等。在另一個實施方案，所述方法是用于治療傳染性疾病例如EBV、HIV、HCV、CMV感染。已經(jīng)證明去除調(diào)節(jié)T細(xì)胞會增強(qiáng)癌癥患者內(nèi)的疫苗介導(dǎo)的免疫(Dannull等，2005,115(12):3623-3633)。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，建議將產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞的去除用于治療癌癥或者傳染性疾病的細(xì)胞治療中，其中所述的產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者所述的產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞對于治療是有害的。例如，在癌癥治療中，在疫苗接種/免疫療法方案之前，暫時去除產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞或者產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞是感興趣的，通過根據(jù)本發(fā)明的去除方法的裝置而在活體外方式對患者血液進(jìn)行去除處理，并且立即將其回注到患者內(nèi)，獲得所述的短暫去除。


圖1:T細(xì)胞增殖活性被IL-13的體外抑制。重組人IL_13(12.5ng/ml)加入到用抗CD3和抗CD28單克隆抗體活化的人PBMC培養(yǎng)物中。在培養(yǎng)3天后使用WST-1標(biāo)記的活細(xì)胞評價細(xì)胞的增殖。圖2:T細(xì)胞增殖活性被產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的體外抑制。圖A顯示用抗⑶3+抗⑶28單克隆抗體處理后48小時過程中的產(chǎn)生IL-13的調(diào)節(jié)細(xì)胞的體外細(xì)胞因子分泌模式。圖B顯示IL-13活化細(xì)胞上清對用抗⑶3+抗⑶28單克隆抗體在培養(yǎng)中刺激3天的人PBMC增殖的抑制性潛能。組C顯示加入抗IL13封閉抗體能夠逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生IL-13的調(diào)節(jié)細(xì)胞上清的抑制作用。圖3:產(chǎn)生IL-13的人調(diào)節(jié)細(xì)胞的表型。人IL-13調(diào)節(jié)細(xì)胞用熒光標(biāo)記的⑶25、CD127、CD62L或FoxP3特異性單克隆抗體染色進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下分析或者在使用IL-2和⑶3+⑶28刺激劑活化7天后分析。圖4:不同Trl克隆的IL-13和IL-10的產(chǎn)生。來自2個不同供體的人Trl克隆使用抗⑶3+抗⑶28單克隆抗體體外活化。48h后，通過ELISA測量上清液中IL_10、IFN_y和IL-13的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，在所測試的兩個不同供體中，數(shù)個克隆能夠產(chǎn)生IL-10和IFN-Y，但不產(chǎn)生IL-13，而其它克隆能夠產(chǎn)生三種細(xì)胞因子。對于每一供體顯示兩個亞群中的一個克隆。實施例實駘討稈產(chǎn)生IL-13的Trl樣細(xì)胞 分離和上清液產(chǎn)生對于產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞的分離，外周血細(xì)胞通過Ficoll密度離心分離并在特異性抗原存在情況下以2X IO6個細(xì)胞每ml培養(yǎng)，以使得抗原特異性Trl-樣細(xì)胞增殖。在培養(yǎng)7天后，在3周內(nèi)通過有限稀釋方法克隆細(xì)胞。然后使用CD3/CD28刺激劑和細(xì)胞因子(IL-2和IL-4)擴(kuò)增生長的克隆。通過流式細(xì)胞術(shù)評價表型來評價克隆的Trl-樣細(xì)胞身份，顯示組成型地伴有⑶62L和⑶127缺乏，以及僅在活化狀態(tài)下表達(dá)⑶25和Foxp3。通過用抗⑶3+抗⑶28包被磁珠(Dynal)在2天過程中在X_vivo培養(yǎng)基中于37°C +5% C02情況下刺激細(xì)胞得到Trl-樣細(xì)胞上清液的產(chǎn)生。流式細(xì)胞術(shù)研究對于對人細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)研究，使用下列抗體:PE-綴合的抗CD127(來自Beckman Coulter 的克隆 R34.34),來自 Becton Dickinson 的 FITC-標(biāo)記的抗 CD4Ab (克隆號RP4-T4)，PeCy5-標(biāo)記的抗CD62L(來自Becton Dickinson的克隆Dreg56)和別藻藍(lán)蛋白-綴合的抗CD25 (來自Becton Dickinson的克隆M-A251)。使用PE-綴合的抗Foxp3Ab (來自BD的克隆259D/C7)和胞質(zhì)內(nèi)染色試劑盒(BD)，根據(jù)廠商的說明書開展人Foxp3的胞質(zhì)內(nèi)染色。細(xì)胞因子測定為了測定細(xì)胞因子產(chǎn)生譜(測試A的實例)，Trl-樣細(xì)胞克隆用抗⑶3+抗⑶28包被珠以2珠/細(xì)胞的濃度刺激，并且48小時后收集上清液。使用來自Diaclone (IFN- Y，IL-1O和IL-4)和來自e-Bioscience(IL-13)的商業(yè)可得的試劑盒開展ELISA。實驗按照廠商的說明書開展。抑制研究對于抑制研究，外周血單核細(xì)胞在2天過程中用可溶性的抗⑶3單克隆抗體(I μ g/ml)在產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞上清液存在或缺乏下，抗IL13 (克隆31606，R&Dsystems)或者重組人IL-13 (6ng/ml, R&D systems)活化。使用來自Roche的可以評價每個培養(yǎng)孔內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)量的WSTl試劑盒測量所培養(yǎng)細(xì)胞的增殖。結(jié)果T細(xì)胞增殖活性被IL-13體外抑制首先，我們想證明重組人IL-13能夠體外下調(diào)T細(xì)胞增殖活性。為此目的，將IL-13加入到用抗CD3和抗CD28單克隆抗體活化的PBMC培養(yǎng)物中，并在培養(yǎng)3天后測量細(xì)胞增殖(圖1)。結(jié)果證明，IL-13能夠體外抑制T細(xì)胞增殖，顯示該細(xì)胞因子具有免疫抑制性潛倉泛。T細(xì)胞增殖活性被產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞體外抑制因此，我們想知道在使用IL-13作為抑制細(xì)胞因子的相同類型的實驗設(shè)置中產(chǎn)生IL-13的Trl-樣細(xì)胞是否能夠抑制旁觀T淋巴細(xì)胞活性。圖2A顯示被抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體活化的IL-13調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌模式，其中IL-13分泌高但沒有IL-4分泌。圖2B顯示活化的產(chǎn)生IL-13的調(diào)節(jié)細(xì)胞的上清液能夠抑制培養(yǎng)的旁觀T細(xì)胞的活化。重要的是，使用IL-13封閉抗體可以抑制這種上清液介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制(圖2C)，顯示這些細(xì)胞因子代表由這些細(xì)胞分泌的主要的可溶性抑制因子。產(chǎn)生IL-13的人調(diào)節(jié)細(xì)胞的表型最后，我們測試了 IL-13調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)種調(diào)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，顯示所述細(xì)胞不表達(dá)⑶127、⑶62L和FoxP 3分子。此外，在3種標(biāo)志物當(dāng)中，活化后FoxP3和⑶25上調(diào)(圖 3)。能夠產(chǎn)生IL-13和IL-10的Trl細(xì)胞亞群圖4顯示Trl細(xì)胞在測試A的條件下能夠分離成兩個群體:一個Trl細(xì)胞亞群能夠產(chǎn)生IL-10但不產(chǎn)生IL-13，而另一個Trl細(xì)胞亞群能夠產(chǎn)生IL-10和IL-13。
權(quán)利要求
1.分離的人Trl細(xì)胞群體，其能夠產(chǎn)生IL-13。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的人Trl細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。
3.權(quán)利要求1或2的分離的人Trl細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞表達(dá):-CD4 和 -低水平CD 127，和 -低水平CD62L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的分離的人Trl細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞是抗原特異性的，優(yōu)選地，所述抗原是II型膠原、卵清蛋白、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白或HSP。
5.分離的人Trl克隆，其能夠產(chǎn)生IL-13和IL-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的人Trl克隆，其中所述克隆表達(dá):-CD4 和 -低水平CD 127，和 -低水平CD62L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的分離的人Trl克隆，其中所述克隆是抗原特異性的，優(yōu)選地，所述抗原是II型膠原、卵清蛋 白、髓磷脂堿蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白或HSP。
8.鑒定根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的人Trl細(xì)胞群體的方法，包括: -檢測⑶127和⑶62L標(biāo)志物中的至少一個和⑶4標(biāo)志物在細(xì)胞群體上的細(xì)胞表面表達(dá)， -檢測IL-13和IL-1O的產(chǎn)生， 其中表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或低水平⑶62L并產(chǎn)生IL-13和IL-10的細(xì)胞是產(chǎn)生IL-13的Trl細(xì)胞群體。
9.使細(xì)胞群體富集根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞的方法，包括: -鑒定表達(dá)⑶4和低水平⑶127和/或低水平⑶62L并產(chǎn)生IL-13和IL-10的細(xì)胞， -選擇所述細(xì)胞， 由此得到富集了產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞的細(xì)胞群體，其中產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是富集前產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少兩倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9得到的富集的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體。
11.用于鑒定或分離產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體的試劑盒，包含用于檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L的細(xì)胞表面表達(dá)的工具和用于檢測IL-13和IL-10產(chǎn)生的工具。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的或者權(quán)利要求10的分離的和/或富集的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞群體，或者根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項的產(chǎn)生IL-13的人Trl克隆，用于預(yù)防或者治療免疫反應(yīng)、移植物抗宿主疾病和器官排斥、過敏疾病、炎癥性疾病或自身免疫病。
13.使細(xì)胞群體去除根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞的方法，包括: -根據(jù)權(quán)利要求8鑒定產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞， -去除所述細(xì)胞， 由此得到產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體，其中產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是去除前產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的至少0.5倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求13得到的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的產(chǎn)生IL-13的人Trl細(xì)胞被去除的細(xì)胞群體，用于增強(qiáng)需要其的受試者中的免疫 反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生IL-13的分離的Tr1-樣細(xì)胞群體，所述群體具有免疫抑制活性；和用于鑒定/分離/富集所述群體的方法及其用途。
文檔編號C12N5/0783GK103080303SQ201180042091
公開日2013年5月1日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者阿爾諾·福薩特, 埃爾韋·巴斯蒂安, 瓦萊麗·布魯恩, 布里吉特·夸坦尼恩斯 申請人:特克賽爾公司