專利名稱：慢病毒載體的穩(wěn)定生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基因治療的慢病毒載體(LV)的生產(chǎn)。更具體地講，本發(fā)明涉及穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系以及使用雜合桿狀-腺伴隨病毒(baculo-Adeno associated virus(AAV))載體而制備包裝細胞系的方法，用于慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白的穩(wěn)定整合。直量
自從2001年針對AIDS的首次LV I期臨床試驗之后，研究基于HIV的LV作為基因遞送載體的38個1-1I期和2個I1-1II期試驗已經(jīng)經(jīng)過當(dāng)局的審查；它們中的3個仍然處于審查中。最大數(shù)量的試驗包括單基因病，其中的一些具有高發(fā)病率，例如庫利氏貧血(Cooley’ s anemia) β -重型地中海貧血(4個試驗)。其次是癌癥和感染性疾病,主要是HIV-1感染。通常，Ι/II期試驗中招募的患者數(shù)量是有限的，但在III期中則不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的穩(wěn)定包裝細胞系，以應(yīng)付LV大規(guī)模生產(chǎn)的需要，大量用于未來有希望的III期試驗?；谒矔r方案的LV生產(chǎn)在全局應(yīng)用的安全性、成本和再現(xiàn)性的觀點來看確實是不現(xiàn)實的。越來越多的證據(jù)顯示，新近開發(fā)的用于基因治療的病毒整合載體LV具有廣泛應(yīng)用性，可轉(zhuǎn)導(dǎo)終末分化的或處于周期中的細胞，對維持長期轉(zhuǎn)基因表達是理想的并且比先前畏懼的更安全。在過去20年里對莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(YRV)積累的經(jīng)驗指導(dǎo)了 LV遞送系統(tǒng)的快速發(fā)展，其開發(fā)起源于克服逆轉(zhuǎn)錄病毒不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞(non divi ng cell)的需要。具體地講，自失活(SIN)轉(zhuǎn)移載體的產(chǎn)生使得在人類臨床試驗中大量使用LV的前景更可行[I]，只要發(fā)展和優(yōu)化同樣有效的制備方法。然而，與通過若干人和鼠的市售包裝細胞系就可制備的Y RV相反，不僅用于研究級、而且用于GMP級的目前的LV生產(chǎn)幾乎都通過瞬時轉(zhuǎn)染。該技術(shù)昂貴，難以標準化和規(guī)?；⑶倚枰罅肯掠悟炞C試驗。此外，與穩(wěn)定生產(chǎn)相比，在瞬時生產(chǎn)期間可能通過包裝和轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體中的病毒序列間的重組而產(chǎn)生的復(fù)制型慢病毒(RCL)的風(fēng)險，雖是少見的，但是可能性較高的事件。用于LV的與逆轉(zhuǎn)錄病毒等效的穩(wěn)定包裝細胞系的開發(fā)變得更緩慢和更困難，因為，與Y逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些輔助蛋白的表達對于人細胞而言是有毒的。為了克服該問題，在包裝細胞的很早期形式中存在的輔助基因，之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包裝細胞系得自猴VeiO，或人COS、HeLa和HEK293的貼壁細胞[2-5]，其經(jīng)工程化具有攜帶極少關(guān)鍵性修飾的慢病毒基因組，例如除去了包裝信號。事實上gpl20 env和大部分輔助基因都保留下來。所得LV滴度非常低[2-5]，而且更重要的是這些載體的可能應(yīng)用必定限制在⑶4+ T細胞，對于抗AIDS基因治療方法而言。隨后，gpl20 env被來源于皰疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有輔助基因，因為已經(jīng)證明對于有效LV制備而言是可有可無的。為了避免對VSV-G也描述過的毒性，通過各種不同系統(tǒng)，例如Tet、脫皮素、Rev以及Tet和cumate的組合,有條件地誘導(dǎo)其表達[20]。同樣，已經(jīng)描述了經(jīng)Tet以及強力霉素和cumate藥物組合誘導(dǎo)的gag-pol基因的有條件的表達以降低克隆選擇期間病毒蛋白酶的毒性效應(yīng)[7]。在所有這些系統(tǒng)中，通過質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因,然后藥物選擇和細胞克隆。為了實現(xiàn)真實的穩(wěn)定包裝細胞系的一個關(guān)鍵性問題就是選擇最好的病毒基因遞送載體。大部分研究人員通過質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后藥物選擇和細胞克隆[7-10]。已知該技術(shù)隨時間推移而遭受基因沉默和基因損失[11]，這二者均可危害包裝克隆的長期穩(wěn)定性。已經(jīng)公開了替代的基因遞送載體，尤其是在STAR [12]和在新近開發(fā)的GPRG-TL-20 [6]包裝細胞系中，其中通過MLV-穿梭載體將gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T細胞中。2拷貝重新編碼的gag-pol基因穩(wěn)定地整合在STAR中，而對于GPRG-TL-20則沒有這類信息[6]。與轉(zhuǎn)染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有殘留病毒基因都通過SIN-MLV而引入。存在若干系統(tǒng)，允許外源基因組穩(wěn)定整合到宿主細胞中。Palombo等，1998 [13]公開了雜合桿狀病毒-AAV載體，用于專門整合到宿主細胞中。這樣的載體看來非常有效，如果它在同一雜合桿狀病毒-AVV載體中包含r印基因的話。該文獻中未提到本發(fā)明的構(gòu)建體，更不必說提出使用這類系統(tǒng)用于LV生產(chǎn)了。在過去的大約20年里，進行了若干嘗試以產(chǎn)生穩(wěn)定的LV包裝細胞系。盡管公開了不同技術(shù)，但目前在臨床試驗中都未使用這些包裝細胞系，也沒有上市。因此需要用于大規(guī)模生產(chǎn)LV的新系統(tǒng)，其是·產(chǎn)能有效并且是安全、成本效果劃算和可重復(fù)的。發(fā)明概沭· 本發(fā)明涉及LV生產(chǎn)領(lǐng)域。若干基因治療臨床試驗正在進行中，使用LV作為基因遞送載體。在所有這些試驗中，LV的生產(chǎn)仍然基于瞬時方案。本發(fā)明提供了產(chǎn)生基于Hiv-1的包裝細胞系的新策略。這樣的策略是基于使用:雜合載體，其包含含有側(cè)翼為AAV ITR的整合盒的桿狀病毒骨架，即所謂baculo-AAV雜合系統(tǒng)；以及編碼rep蛋白的質(zhì)粒。該系統(tǒng)允許獲得HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白gag/pol和rev的穩(wěn)定整合。本發(fā)明的系統(tǒng)包括a) baculo-AAV雜合載體，其特征在于它含有2個表達盒，一個編碼慢病毒gag基因和pol基因，另一個編碼慢病毒rev基因和選擇標記,和b)編碼rep蛋白的質(zhì)粒。所提出的系統(tǒng)代表遞送HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白的一種新的有利方式，以便用這樣的慢病毒蛋白穩(wěn)定而有效地改造宿主細胞。使用該系統(tǒng)，獲得僅包含HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白gag/pol和rev的第一中間體，用于作為起點，以得到各自包含調(diào)控蛋白(tat)和目標包膜蛋白或者僅包含包膜蛋白的第2代和第3代包裝細胞系，以及也包含轉(zhuǎn)移載體的生產(chǎn)用細胞系。第一中間體攜帶以三-順反子構(gòu)型表達Hiv-1 gag-pol基因和rev基因的2拷貝重組baculo-AAV包裝構(gòu)建體。這樣的中間體被稱為PK-7并在實施例中稱為PK-7。已知是ITR-介導(dǎo)的AAV載體整合所必需的AAV rep78蛋白的瞬時表達促進了 baculo-AAV包裝載體的基因組整合[14]。這樣的第一中間體對于I年培養(yǎng)物而言顯示出具有令人吃驚的遺傳穩(wěn)定性，證明在殘留遺傳元件的瞬時轉(zhuǎn)染之后的功能性LV的連續(xù)生產(chǎn)。另外，在這類細胞中未觀察到沉默現(xiàn)象。此外，通過非編碼的基因間轉(zhuǎn)錄活性區(qū)中的2個串聯(lián)整合的包裝AAV載體的整合位點的精確作圖，我們提供了針對可能的危險基因激活的安全性理由，所述危險基因的mRNA可結(jié)合到LV中并最終結(jié)合到宿主靶細胞中。
從第一中間體，可獲得第2和第3代穩(wěn)定包裝細胞系。具體地講，依照本發(fā)明，可通過將目標包膜蛋白例如MLV 4070 env、RD114 env或GALV env逆轉(zhuǎn)錄病毒或其衍生物穩(wěn)定整合到第一中間體PK-7中而得到第3代包裝細胞系。用SIN-LV遞送可得到穩(wěn)定整合，但也可用其它基因遞送載體。我們得到相關(guān)的包裝細胞系，在實施例中稱為PK-7-RD，即通過整合嵌合包膜蛋白RD114-TR，其含有來源于貓科內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域以及MLV 4070 env的胞質(zhì)尾[15]。通過SIN-LV遞送而得到RDl 14-TR嵌合包膜蛋白整
入
口 ο為了得到第2代和第3代生產(chǎn)用細胞系，通過序貫遞送，分別整合SIN-Tat、SIN-Env和轉(zhuǎn)移載體或僅SIN-Env和轉(zhuǎn)移載體。在概念上，一次整合一個載體，盡管耗費時間，但降低了同源重組的風(fēng)險并因此減少了 RCL形成。已開發(fā)的基于使用雜合baculo-AAV載體而用于慢病毒gag-pol和rev穩(wěn)定表達的包裝系統(tǒng)被稱為“MolPack”，因此，第2代生產(chǎn)用細胞系是用該系統(tǒng)開發(fā)的，并含有RD114-TI^P tat分別作為包膜蛋白和調(diào)控蛋白，以及編碼Chim3作為治療基因的轉(zhuǎn)移載體，所述細胞系在實施例中稱為RD2-MolPack-Chim3。引人注意的是，來源于RD2-MolPack-Chim3克隆的LV滴度比產(chǎn)自HEK293T對照細胞的LV的滴度高出2-log，表明RD2-MolPack-Chim3產(chǎn)生的LV與經(jīng)瞬時方案產(chǎn)生的等量LV相比更具功能性，通過穩(wěn)定的生產(chǎn)用細胞系生產(chǎn)的更多優(yōu)勢是成本效果劃算和更安全。發(fā)明敘述
依照本發(fā)明的第一方面，提供用于慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白的穩(wěn)定表達的系統(tǒng)，其由以下組成:
1.雜合載體，其包含含有側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和
.含有處于啟動子控制之下的AAV Rep可讀框(ORF)的表達質(zhì)粒。優(yōu)選雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因，更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。優(yōu)選所述選擇標記是克隆在內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)下游。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78或rep68。更優(yōu)選rep蛋白是rep78。依照本發(fā)明另一方面,提供由穩(wěn)定表達慢病毒gag、pol和rev的細胞組成的半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其特征在于這類細胞含有穩(wěn)定整合到其基因組中的側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記。優(yōu)選所述細胞是優(yōu)選選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa的人細胞系，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動；優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78或rep68。更優(yōu)選rep蛋白是rep78。依照本發(fā)明的另一方面，提供得到穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系的方法，其包括:
1.制備雜合載體(A)，其包含含有側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和
.制備表達質(zhì)粒(B)，其含有處于啟動子控制之下的AAV rep 0RF,
ii1.用表達質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染細胞并隨后用雜合載體A感染該細胞，
iv.在抗生素存在下培養(yǎng)所述細胞，用于選擇，
V.得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的細胞，
v1.將env基因整合到這樣的細胞中， vi1.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和env蛋白的細胞
系O依照本發(fā)明的另一方面，提供得到穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系的方法，其包括:
1.制備雜合載體(A)，其包含含有側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和
.制備表達質(zhì)粒(B)，其含有處于啟動子控制之下的AAV rep 0RF,
ii1.用表達質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染細胞并隨后用雜合載體A感染該細胞，
iv.在抗生素存在下培養(yǎng)所述細胞，用于選擇，
V.得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的細胞，
v1.將慢病毒tat基因整合到這樣的細胞中，
vi1.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和tat蛋白的細胞，
vii1.將env基因整合到這樣的細胞中，
ix.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白、tat蛋白和env蛋白的細胞系。優(yōu)選所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述tat基因是HIV-1 tat。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因，更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選使用AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、穩(wěn)定質(zhì)粒整合或同源重組，將所述env基因整合到宿主細胞中。依照更優(yōu)選的方面，使用SIN慢病毒載體，整合所述env基因。優(yōu)選所述env基因選自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物；更優(yōu)選所述env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供包含表達盒的SIN慢病毒載體，所述表達盒含有從5’到3’端排列的CMV啟動子、在其序列中含有RRE元件的β -球蛋白內(nèi)含子和RD114-TR0RF，用于嵌合包膜蛋白RD114-TR的穩(wěn)定整合。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78或rep68。更優(yōu)選所述rep蛋白是rep78。依照本發(fā)明的另一方面，提供包含穩(wěn)定整合到其基因組中的以下部分的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系:
1.側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，
i1.至少一個拷貝的env。

依照本發(fā)明的同一方面，上述穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系還包含穩(wěn)定整合到其基因組中的至少一個拷貝的HIV-1-tat基因。優(yōu)選所述細胞是人細胞系，優(yōu)選所述細胞系選自HEK293、HEK293-SF、HEK29 3-T、TE671、HT1080或HeLa，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。優(yōu)選整合盒的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素，更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選使用AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、穩(wěn)定質(zhì)粒整合或同源重組，將所述env基因整合到宿主細胞中。依照更優(yōu)選的方面，使用SIN慢病毒載體來整合所述env基因。優(yōu)選所述env基因選自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更優(yōu)選所述env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。依照另一方面，提供產(chǎn)生慢病毒載體的方法，其包括:
1.培養(yǎng)穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其含有穩(wěn)定整合到其基因組中的側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記；和至少一個拷貝的env， .在所述穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉(zhuǎn)移載體。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動；優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述env基因選自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物，更優(yōu)選所述env基因是編碼RD114-TR的基因。依照本發(fā)明的另一方面，提供包含穩(wěn)定整合到其基因組中的以下部分的生產(chǎn)用細胞系:
1.側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，
i1.至少一個拷貝的env基因，
ii1.轉(zhuǎn)移載體。依照本發(fā)明的同一方面，上述生產(chǎn)用細胞系還含有穩(wěn)定整合到其基因組中的慢病毒tat基因。優(yōu)選所述細胞是優(yōu)選選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa的人細胞系，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。優(yōu)選所述整合盒的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素，更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選使用AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、穩(wěn)定質(zhì)粒整合或同源重組，將所述env基因整合到宿主細胞中。依照更優(yōu)選的方面，使用SIN慢病毒載體來整合所述env基因。優(yōu)選所述env基因選自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物,更優(yōu)選所述env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。依照另一方面，提供生產(chǎn)慢病毒載體的方法，其包括培養(yǎng)含有穩(wěn)定整合到其基因組中的以下部分的生產(chǎn)用細胞系:
1.側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記；
i1.至少一個拷貝的env;
ii1.至少一個拷貝的編碼目標基因的轉(zhuǎn)移載體。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動；優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述env基因選自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物，更優(yōu)選所述env基因是編碼RD114-TR的基因。發(fā)明詳沭
將以非限制性實施例的方式描述本發(fā)明優(yōu)選特征和實施方案的詳細描述。除非另有說明，否則本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明付諸實施。所有這些技術(shù)都是已發(fā)表的文獻中公開的和解釋過的。參見例如 J.Sambrook, E.F.Fritsct^PT.Maniatis, 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual,第二版，第 1-3 部，Cold Spring Harbor LaboratoryPress ；Ausubel, F.M.等(1995 和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology,第 9、13 和 16 章，John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ；Current Protocols inImmunology,第 12章，John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ；B.Roe, J.Crabtree和A.Kahn, 1996, DNA Isolation 和 Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &Sons ；J.M.Polak 和 James 0’D.McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principlesand Practice ；0xford University Press ；M.J.Gait (編著)，1984, OligonucleotideSynthesis: A Practical Approach, IrI Press ；and, D.M.J.Lilley 和 J.E.Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press。所有這些出版物都通過引用而結(jié)合。baculo-AAV 雜合系統(tǒng).本發(fā)明提供用于產(chǎn)生基于HIV-1的包裝細胞系的新策略。LV生產(chǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化是基于LV技術(shù)的基因治療藥物開發(fā)中需要解決的一個關(guān)鍵性問題。盡管越來越多的臨床試驗使用該技術(shù)，但是在這些試驗中LV仍然是使用瞬時轉(zhuǎn)染方案而產(chǎn)生的。按此方式，LV的生產(chǎn)仍然非常昂貴，不能令更多患者滿意。為此，進行了大量努力以開發(fā)穩(wěn)定包裝細胞系，用于LV。在穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系開發(fā)中的一個關(guān)鍵性問題就是選擇正確的載體，用于改造宿主細胞。在很多情況下，用質(zhì)粒來改造宿主細胞，但在這種情況下，還觀察到基因組不穩(wěn)定和基因沉默現(xiàn)象。在另外兩種情況下，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于穩(wěn)定整合gag/pol基因和rev基因。迄今為止所開發(fā)的穩(wěn)定包裝細胞系都未用于臨床試驗。本發(fā)明的策略是基于使用穩(wěn)定表達慢病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)由以下組成:雜合載體，其包含含有側(cè)翼為AAV ITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記；以及含有處于啟動子控制之下的AAV rep ORF的表達質(zhì)粒。桿狀病毒骨架的存在允許攜帶大而復(fù)雜的整合盒，所述整合盒包含編碼若干不同蛋白的2個表達盒。所得baculo-AAV包裝載體允許僅通過一次感染事件就用穩(wěn)定而有效產(chǎn)生LV所需的gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白來改造宿主細胞。

通過AAV rep蛋白的瞬時表達而獲得baculo-AAV包裝載體的基因組整合。該系統(tǒng)允許獲得在非編碼的基因間轉(zhuǎn)錄活性區(qū)中的AAV載體的整合，因此排除了危險基因的激活，所述危險基因的mRNA可結(jié)合到LV中并最終結(jié)合到宿主靶細胞中。所提出的系統(tǒng)代表用慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白穩(wěn)定而有效地改造宿主細胞的一種新的有利的遞送HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白的方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，baculo-AAV包裝構(gòu)建體中包含的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，AAV包裝載體中包含的選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述標記是潮霉素抗性基因，更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。通過AAV Rep蛋白的瞬時表達而獲得baculo-AAV包裝載體的基因組整合,用于ITR-介導(dǎo)的AAV載體整合。在一個優(yōu)選的實施方案中，r印蛋白選自r印78和r印68，更優(yōu)選所述蛋白是rep78。
使用該系統(tǒng),可獲得經(jīng)改造而穩(wěn)定表達HIV-1蛋白gag/pol和rev的細胞,我們將這類細胞稱為半穩(wěn)定包裝細胞系。具體地講，本發(fā)明公開并要求保護這樣的經(jīng)改造的細胞，和它們在得到包含結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白以及目標包膜蛋白的第2代和第3代包裝細胞系中的用途，以及還包含轉(zhuǎn)移載體的生產(chǎn)用細胞系，以及產(chǎn)生穩(wěn)定包裝細胞系的方法。半穩(wěn)定包裝細胞系
本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系由攜帶表達HIV-1 gag-pol基因和rev基因的至少一個拷貝的重組baculo-AAV包裝構(gòu)建體的宿主細胞組成。通過AAV rep蛋白的瞬時表達而得到baculo-AAV包裝載體的基因組整合，以獲得ITR-介導(dǎo)的AAV載體整合。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動,優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV。更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因，更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78和rep68。更優(yōu)選rep蛋白是rep78。可經(jīng)改造而得到半穩(wěn)定包裝細胞系的宿主細胞系是選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人細胞系，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。這樣的半穩(wěn)定包裝細胞系適合于利用半穩(wěn)定生產(chǎn)系統(tǒng)中的不同env和不同轉(zhuǎn)移載體來輸出可能的多種LV。因此，它代表了更有效的慢病毒載體生產(chǎn)的極大優(yōu)勢，因為它允許降低成本，它無需使用編碼gag-pol和rev的GMP級的質(zhì)粒DNA，并且降低了瞬時轉(zhuǎn)染期間質(zhì)粒間重組事件所致的RCL形成的風(fēng)險。本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系對于I年培養(yǎng)物而言顯示出具有令人吃驚的遺傳穩(wěn)定性，證明在殘留遺傳元件的瞬時轉(zhuǎn)染之后的功能性LV的連續(xù)生產(chǎn)。另外，事實上未觀察到沉默現(xiàn)象，用該中間體得到的慢病毒顆粒的滴度和感染性在I年之后仍然未受影響。在選擇壓力存在或不存在的情況下都證實了這樣的數(shù)據(jù)。值得注意的是，對于AAV-1TR介導(dǎo)的盒的整合穩(wěn)定性而言，文獻中沒有可用的類似數(shù)據(jù)。唯一相關(guān)的信息是感染了野生型AAV血清型2 (AVV-2)的人骨髓衍生的成纖維細胞樣細胞系(Ruddle’s Detroit 6細胞)以潛伏狀態(tài)保持病毒序列長達至少47和118代[16，17]。正如實施例中所示，本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系存活至少102代。穩(wěn)定包裝細胞系
本發(fā)明提供得到穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系的方法。這樣的方法是基于使用baculo-AAV包裝構(gòu)建體，其用于含有2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒的穩(wěn)定整合，所述表達盒中的一個編碼慢病毒gag基因和pol基因,第二個編碼慢病毒rev和選擇標記。通過rep蛋白的共表達而得到該盒的穩(wěn)定整合，其允許在宿主細胞中的ITR介導(dǎo)的穩(wěn)定整合。然后在抗生素存在下，培養(yǎng)經(jīng)過如此改造的宿主細胞并克隆。所得的半穩(wěn)定包裝細胞系是產(chǎn)生第2代或第3代慢病毒包裝細胞系的起點。具體地講，通過進一步整合所需的env蛋白而得到第3代穩(wěn)定包裝細胞系。通過先整合HIV-1 Tat蛋白，再整合所需的包膜而得到第2代穩(wěn)定包裝細胞系。 可使用AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、穩(wěn)定質(zhì)粒整合或同源重組，將包膜蛋白和HIV-1 tat穩(wěn)定整合到宿主細胞中。優(yōu)選使用HIV-SIN載體將包膜蛋白和HIV-1 tat整合到宿主細胞中?？墒褂萌舾煞N類的包膜蛋白，例如MLV 4070 env, RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更優(yōu)選所述env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。為了得到RD114-TR包膜蛋白的穩(wěn)定整合，最先開發(fā)SIN構(gòu)建體，其含有來源于PCMV-RD114-TR質(zhì)粒的片段并攜帶處于CMV啟動子控制之下的RD114-TR 0RF。該構(gòu)建體不產(chǎn)生RD114-TR蛋白。在SIN-RDl 14-TR LV構(gòu)建期間的一個意外發(fā)現(xiàn)是認識到β -球蛋白內(nèi)含子必須必要地包含在CMV啟動子和RDl 14-TR ORF之間。一般而言，在SIN-LV中包含的大部分細胞和病毒的基因表達盒都不含內(nèi)含子元件，因為在載體SD和內(nèi)含子SA間剪接并隨之切除表達盒中含有的啟動子的風(fēng)險。為了避免這種隱患，產(chǎn)生了新的攜帶2個RRE元件的SIN-LV，一個在SD序列和SA序列間呈典型SIN-LV構(gòu)型，一個在β -球蛋白內(nèi)含子內(nèi)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，表明為獲得RD114-TR生產(chǎn)而出乎意料地需要β -球蛋白內(nèi)含子，可能反映了在SIN-RD114-TR構(gòu)建體中存在的RD114-TR ORF中或在包含來自RD114-TR終止密碼子和3’SaMlI限制酶位點的區(qū)的328-bp片段中存在不穩(wěn)定性或負序列(negativesequence)。通過GENEART AG (Regensburg, Germany)而進行的GeneOptimizer Assisted序列分析表明，具有差的密碼子選擇的密碼子遍及整個RD114-TR基因和328-bp片段，為我們的設(shè)想給出了理由。此外，密碼子優(yōu)化分析表明，密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)從0.65提高到0.98 (其中CAI為I是最佳)。因此，原則上說，使用基于MLV或基于HIV的SIN載體將RD114-TR整合到RD-MolPack中的一個替代的和更簡單的方法可以是使用重新編碼的RDlH-TR0因此制備并測試了含有密碼子優(yōu)化序列的構(gòu)建體。相比之下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化允許甚至在缺乏球蛋白內(nèi)含子的情況下RD114-TR前體蛋白(PR)的翻譯，但是，出乎意料的是，高水平PR并未被弗林蛋白酶(furin)處理成預(yù)期的SU亞基和TM亞基。因此，已使用在構(gòu)建體中在介于CMV啟動子和RD114-TR ORF之間包含β-球蛋白內(nèi)含子的基于HIV的SIN載體，將RDl 14-TR成功整合到包裝細胞系中。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供包含表達盒的SIN-LV，所述表達盒含有從5’到3’端排列的CMV啟動子、在其序列中含有RRE元件的β-球蛋白內(nèi)含子和 RD114-TR 0RF。本發(fā)明提供生產(chǎn)LV的方法，其包括:
1.如上所述地培養(yǎng)穩(wěn)定包裝細胞系，
i1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉(zhuǎn)移載體。目前用于臨床試驗的LV生產(chǎn)仍然是基于所有所需蛋白的瞬時轉(zhuǎn)染。相比之下，本發(fā)明的方法和包裝細胞系允許穩(wěn)定生產(chǎn)。具體地講，本發(fā)明方法中所用的baculo-AAV雜合表達系統(tǒng)，有利地允許僅在一輪轉(zhuǎn)染/感染和克隆中穩(wěn)定和安全地引入HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白(gag/pol)和調(diào)控蛋白(rev)。用這樣的表達系統(tǒng)得到的中間體是穩(wěn)定的，不顯現(xiàn)出沉默現(xiàn)象并允許開發(fā)第2代和第3代包裝細胞系，這些是開發(fā)用于LV生產(chǎn)的快速有效方案的非常重要的工具。本發(fā)明的穩(wěn)定包裝細胞系可用于成果效果劃算和更安全的生產(chǎn)。事實上，完全不存在轉(zhuǎn)染，允許降低成本并降低可能導(dǎo)致形成RCL的重組事件的可能性。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明方法得到的穩(wěn)定包裝細胞系能夠產(chǎn)生的LV的滴度至少與用瞬時方案所產(chǎn)生的LV的滴度類似或甚至更高。牛產(chǎn)用細胞系可通過如上所述地將編碼目標基因(GOI)的轉(zhuǎn)移載體穩(wěn)定整合到穩(wěn)定包裝細胞系中，得到生產(chǎn)用細胞系。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生LV的方法，其包括培養(yǎng)這樣的生產(chǎn)用細胞系。引人注意的是，產(chǎn)自第2代穩(wěn)定包裝細胞系(在實施例中稱為RD2-MolPack_Chim3克隆)的LV的平均滴度和感染性比產(chǎn)自HEK293T對照細胞的LV的高出2_log，表明RD2-MolPack-Chim3產(chǎn)生的LV與經(jīng)瞬時方案產(chǎn)生的等量LV相比更具功能性。令人感興趣的是克隆RD2-MolPack-Chim3.14，其在懸液中自發(fā)生長并產(chǎn)生LV，該LV對SupTl細胞的滴度為 1.0 X 106TU/mlJ^CD34+HSCS0.5 X IO6 TU/mL.
附圖描沭


圖1.RD-MolPack的開發(fā)流程。(a)用于該研究的DNA質(zhì)粒示意圖。pPolh,多角體蛋白啟動子；attBl，連接B1;ITR，反向末端重復(fù)序列；CMV，巨細胞病毒啟動子；In，內(nèi)含子；RRE，rev效應(yīng)元件;A，多聚A序列；IRES，內(nèi)部核糖體進入位點；SD，剪接供體；SA,剪接受體；Ψ，包裝信號；WPRE，土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件；cPPT，中央聚嘌呤序列(central polypurine tract) ；hPGK,人磷酸甘油激酶啟動子。(b) AAV-GPR載體的R印78-介導(dǎo)的基因組整合的圖。AAV Rep78促進了側(cè)翼為ITR的AAV-GPR盒的切除并有利于其整合到人染色體中。(c)第2代或第3代RD-MolPack穩(wěn)定包裝細胞系的開發(fā)策略流程圖。圖2.PK克隆的表征。(a) AAV-GPR載體整合的DNA印跡分析。為了確定盒的拷貝數(shù)和完整性，將來源于PK克隆的基因組DNA (10 yg)分別用2種不同限制酶和
消化。(b)從GPR盒產(chǎn)生的病毒蛋白的蛋白印跡分析。左圖，將得自PK克隆的細胞提取物(50 μ g/道)與識別HIV-1蛋白的抗HIV-1人血清雜交。然后將膜與抗rev特異性Ab雜交。右圖，與細胞提取物相同地對產(chǎn)自PK克隆的病毒樣顆粒(VLP)的30 ng p24gag-等同物(equivalent)進行處理。(C)通過LM-PCR技術(shù)對GPR-盒整合進行示意性作圖，該技術(shù)鑒定2號染色 體長臂2q32.1位置上的DNA斷裂點。(d) AAV-GPR盒和人Hox4基因共定位到2號染色體中。進行PK-7中期染色體原位雜交，分別使用gag-特異性(紅色)探針和Hox4-特異性(綠色)探針。(e)在PK-7克隆中的2個GPR整合盒的重排和它們的尾-頭方向的示意圖。圖3.在PK-7-Tat克隆中Tat的表達。(a)對得自PK-7-Tat主體細胞(bulkcell)和5個衍生克隆的核提取物進行蛋白印跡分析(50 yg/道)。將膜與抗tat特異性Ab雜交，剝離(stripping)之后，再與抗YYl Ab雜交，其檢測組成型核轉(zhuǎn)錄因子，YYl作為內(nèi)部對照。(b)通過ELISA測量從所選克隆中生產(chǎn)的在每個細胞基礎(chǔ)上表達的p24gag ο (c)對 RD2-MolPack-Chim3.14 基因組 DNA 進行針對 SIN-LV-Tat、SIN-LV-RDl 14-TR和LTR-LV-Chim3載體的完整性的DNA印跡分析。經(jīng)TaqMan PCR計算的這3個載體的載體拷貝數(shù)在括號中標出。(d)在圖例中所示的不同％的FCS中培養(yǎng)大約2個月的RD2-MolPack-Chim3.14細胞的細胞存活率圖。圖4.RD114-TR包膜表達的分析。(a)檢測來自不同構(gòu)建體的RD114-TR表達的蛋白印跡測定。用CMV-RDl 14-TR質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染(TF) PK-7細胞(道I)，相應(yīng)的全細胞提取物用作陽性對照。將 SIN-RDl 14-TR (道 2 和道 3)、pIRES-RD114-TR-WT 和 pIRES-RDl 14-TR-密碼子優(yōu)化(CO)(道4 和 5)、SIN-RD114-TR-1N (道 6 和道 7) SIN-RDl 14-TR-1N-RRE (道8和道 9)、SIN-RDl 14-WT-TR-1N-RRE 和 SIN-RDl 14-TR-C0-1N-RRE (道 12 和道 13)轉(zhuǎn)染(TF)到PK-7細胞中或者作為轉(zhuǎn)移載體包裝到VSV-G假型LV中，后者是經(jīng)HEK293T的標準三重轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的。然后含有SIN-RD114-TR的LV用于離心接種PK-7細胞(TD)。道1-9、道12和道13對應(yīng)于細胞提取物(50 μ g/道)；道10和道11對應(yīng)于LV (30 ng p24gag-等同物/道)。濾膜用抗RD114-TR Ab探測，所述Ab識別嵌合包膜的前體(PR)亞基和跨膜(TM)亞基，但不識別表面(SU)亞基。TM*條帶對應(yīng)于經(jīng)病毒蛋白酶依賴性切割之后得到的較短的跨膜亞基。(b)在3個PK-7-Tat7-RD克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印跡分析。左圖，細胞提取物(40 Ug/道)用抗RD114-TR Ab來探測。剝離之后，將膜與抗p24gagAb雜交，以評價每p24gag水平的RD114-TR的相對比例。右圖，與細胞提取物相同地對產(chǎn)自PK-7-Tat-RD克隆的LV的30 ng p24gag-等同物進行處理。括號中的數(shù)字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE載體的拷貝。(c)在3個PK-7-RD克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印跡分析。左圖，細胞提取物(40 yg/道)用抗RD114-TR Ab來探測。剝離之后，將膜與抗p24gag Ab雜交。右圖，與細胞提取物相同地對產(chǎn)自PK-7-RD克隆的LV的30 ng p24gag-等同物進行處理。括號中的數(shù)字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE載體的拷貝。⑷在3個PK-7-RD26亞克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印跡分析。左圖，細胞提取物(40 μ g/道)用抗RD114-TR Ab來探測。剝離之后，將膜與抗p24gag Ab雜交。右圖，與細胞提取物相同地對產(chǎn)自PK-7-RD26亞克隆的LV的30 ng p24gag-等同物進行處理。在左圖中，括號中的數(shù)字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE載體的拷貝，在右圖中，在SIN-GFP轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染之后產(chǎn)自亞克隆的LV的滴度。圖5.對bacu1-AAV-GPR基因組DNA和R印78推定的殘余DNA整合的分析。(a)重組桿狀病毒-AAV DNA的DNA印跡分析。從桿狀病毒顆粒中提取DNA，用#7 Ι限制酶消化過夜，印跡之后，將11-kb GPR盒特異性探針探測。將Entry-GPR質(zhì)粒(I pg)和桿狀病毒空DNA (100 ng)上樣，分別作為陽性和陰性對照。(b)檢測整合到PK-7細胞中的推定的殘余rep78質(zhì)粒DNA。進行R印78特異性PCR，使用PK-7基因組DNA作為樣品模板和CMV-R印78(I pg)質(zhì)粒作為陽性對照。圖6.SIN-RDl 14-TR 和 SIN-RDl 14-TR-1N 載體的轉(zhuǎn)錄。在額外的 Rev 質(zhì)粒(2.5μ g)存在(道2和道4)或不存在(道I和道3)時將SIN-RD114-TR載體瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中之后，RD114-TR RNA表達的RNA印跡分析。共轉(zhuǎn)染后48小時，從HEK293T細胞中提取總RNA (5 yg)并與特異性RD114-TR探針雜交。FL，全長；Exp.FL,預(yù)期全長SIN-RDl 14-TR-1N載體，在β -球蛋白內(nèi)含子存在下預(yù)期其比SIN-RDl 14-TR長800_bp。將550-bp RDl 14-TR片段用作特異性探針。
實施例實施例1:通用方法 質(zhì)粒
通達Mlul/Narl和Mlu/Not\消化，分別從pCG719_pKLgagpol質(zhì)粒(以下簡稱CMV-GPR)(圖1a,圖例 13)和 pCG720_pKrev 質(zhì)粒(CMV-Rev)(圖1a,圖例 9)切下野生型HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因[27]。在尾-尾的方向的2個不同的表達盒中將病毒基因插入到 Gateway pENTR 4 穿梭載體(Invitrogen, C0., Carlsbad, CA),每個盒由CMV IE啟動子驅(qū)動并攜帶多聚A序列。第一盒表達gag基因和pol基因，而第二盒表達rev基因和選擇標記潮霉素抗性(hygro)基因；hygro是克隆在IRES下游以允許雙-順反子翻譯。將2個表達單元引入攜帶感染性AAV基因組的重組pSUB201質(zhì)粒的ZhI位點中[18]。再切下所得 5’ ITR-CMV-GagPol-polyA-polyA-hygro-1RES-Rev-CMV-1TR3’ 盒并插入到Gateway pENTRTM4穿梭載體中。通過含有2個盒的pENTR 4穿梭進入載體和BaculoDirect Linear DNA (BaculoDirect 桿狀病毒表達系統(tǒng)，Invitrogen, C0.)之間的噬菌體λ位點-特異性重組系統(tǒng)，獲得重組雜合baculo-AAV包裝載體(bacu1-AAV-GPR)(圖la，圖例I)。在同源重組期間，桿狀病毒DNA的多角體蛋白基因因此被GPR雙盒替代。如Recchia等，2004 [19]所述，通過克隆處于表達載體pABS.43的CMV IE啟動子之下的AAV-rep78 0RF，得到 pABCMV-r印78 表達質(zhì)粒(CMV-AAV-r印78)(圖1a,圖例 8)。pMD.G質(zhì)粒(CMV-VSV-G) [20]編碼皰疹性口炎包膜糖蛋白(VSV-G)(圖la，圖例10)。第3代轉(zhuǎn)移載體 pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP) [21]表達處在組成型啟動子 hPGK之下的eGFP基因(圖1a,圖例6)。表達抗HIV-1 Chim3轉(zhuǎn)基因的第2代P Λ N-Chim3轉(zhuǎn)移載體描述于Porcellini等，2009 &2010 [23，24](圖1a,圖例7)。按照不同策略，構(gòu)建 SIN-RDl 14-TR 載體(圖1a,圖例 3-5)，通過使用從 pCMV_RD114_TR (CMV-RD114-TR)(圖la，圖例11)質(zhì)粒中切下的RD114-TR 0RF，其編碼由貓科內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒RDl 14包膜的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域以及A-MLVenv 4070A的胞質(zhì)尾(TR)組成的嵌合RD114-TR包膜[22]。簡而言之，將 CMV-RDl 14-TR、CMV-RD114-TR-1N 和 CMV-RDl 14-TR-1N-RRE 盒各自克隆到SIN-poly#7yI載體的#7^/1位點中，所述載體是SIN-eGFP載體的修飾形式，其中hPGK_eGFP盒被除去并用 EcoR^-Mlul-Smal-Mlul-Notl-Sacl-Bglll-BamHl-Sall 多接頭取代。SIN-RDl 14-TR-1N構(gòu)建體和RDl 14-TR-1N-RRE構(gòu)建體(圖1a,圖例4和圖例5)含有存在于CMV-RDl 14-TR載體中的兔β -球蛋白內(nèi)含子(圖1a,圖例11)。在SIN-RDl 14-TR-1N-RRE中，將按照“PCR分析”部分所述進行PCR擴增的230-bp RRE元件整合到β -球蛋白內(nèi)含子元件的5bal位點中。第2代包裝pCMV- Δ R8.74 (CMV-GPRT)構(gòu)建體(圖1a,圖例12)編碼HIV-1 gag基因、pol基因、rev基因和tat基因[25]。構(gòu)建SIN-Tat載體(圖1a,圖例2)，即通過將來源于CMV-GPRT質(zhì)粒(圖1a,圖例12)的tat基因插入到pIRESpuro3(Clontech Laboratories Inc., a TakaraBio Company, Mountain View, CA) ^EcoRl點中，然后通過將雙-順反子CMV-Tat-1RES`-puro盒克隆到SIN_poly#7i/I載體的#7^/1中。
細胞
在27°C,在不存在CO2的條件下,將草地貪夜蛾{Spodoptera frugiperda, Sf9)昆蟲細胞(Invitrogen, C0.)懸浮培養(yǎng)在補充有10% FCS (EuroClone Ltd, UK)和青霉素-鏈霉素和谷氨酰胺組合(PSG)的TC-100培養(yǎng)基(Invitrogen，C0.)中。將人胚腎293T(HEK293T)細胞及其衍生克隆(PK-7和PK-7衍生物)在補充有10% FCS和PSG的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中繁殖。將CEM A3.01和SupTl T細胞在補充有10% FCS和PSG 的 RPMI 1640 中培養(yǎng)。從在 Ficoll-Hypaque 梯度(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS,Oslo, Norway)上離心的臍帶血(UCB)中純化⑶34+造血干細胞(HSC)和新生兒白細胞。經(jīng)梯度分離之后，從收集的UCB單核細胞環(huán)中通過陽性選擇，使用⑶34 MicroBeads試劑盒和MiniMACS Separator 柱(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA),分離 CD34+ HSC。通過 FACS分析(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA)和 FlowJo 軟件(Tree Star, Inc.,Ashland, OR),使用抗CD34-PE Ab (BD Pharmingen , San Diego, CA),確定 CD34+細胞純度(>92%)。在含有人干細胞因子(h-SCF) 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)、h_Flt3L 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h_IL_6 20ng/ml (R&D Systems)和人血小板生成素(h_Tpo) 20 ng/ml (Peprotech)的20%血清Iscove氏改良Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM)中，對CD34+細胞預(yù)刺激24小時，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間維持在同一培養(yǎng)基中。用可溶性抗人 CD3 (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)和重組人 IL-2 (rhIL-2)50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA)的RPMI對新生兒白細胞刺激48小時，然后將其保持在補充有10% FCS、PSG和rhIL-2的RPMI中。如下使RD2-MolPack-Chim3.14 克隆適應(yīng)在含 2.5% FCS 的 Dulbecco 氏培養(yǎng)基(DMEM)中生長:將細胞在120 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上在37°C在5% C02加濕空氣氣氛中在125-ml搖瓶中培養(yǎng)至密度為1.5 X IO6細胞/ml。生存力保持在彡70%，將細胞分為0.5X IO6細胞/ml，每天更換培養(yǎng)基。在多次傳代期間，將FCS從10%降至5%降至2.5% ;至少培養(yǎng)2代之后進行一次血清更換。HEK293T細胞的桿狀病毒生產(chǎn)和baculo_GPR感染
按照BaculoDirect方法，使用Gateway 適應(yīng)性桿狀病毒DNA系統(tǒng)(Invitrogen,C0.)，產(chǎn)生攜帶重組雜合baculo-AAV-GPR DNA基因組的桿狀病毒。通過噬斑測定評價重組桿狀病毒滴度，病毒在Sf9細胞中擴增3代之后相當(dāng)于I X IO11 pfu/ml。通過用4 μ gAAV-r印78表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染1.5 X IO6 HEK293T細胞并在24小時之后用重組baculo-AAV-GPR以1，000的MOI感染而得到PK-7克隆。在沒有潮霉素時將細胞維持4天，然后在潮霉素(100 μ g/ml)存在下，以系列稀釋濃度，將5 X IO5細胞接種在22個10_cm皿中。通過ELISA對22個皿篩選p24gag的產(chǎn)生。僅有以3.7 X IO4細胞/皿接種細胞的一個皿在上清液中釋放出足夠的p24gag。該皿含有40個集落，將其全部挑取出來并篩選。它們中的3個記為p24gag產(chǎn)生陽性，對其進行進一步表征。LV生產(chǎn)和滴定
通過以下質(zhì)粒的瞬時共轉(zhuǎn)染，獲得從HEK293T細胞產(chǎn)生的假型LV:包裝構(gòu)建體CMV-GPR(第3代)[或CMV-GPRT (第2代)]、VSV-G或RDl 14-TR包膜構(gòu)建體和第3代SIN-eGFP或第2代PAN-Chim3 [23]或P Λ N_eGFP轉(zhuǎn)移載體。包裝:包膜:轉(zhuǎn)移載體的比例為6.5:3.5:10 yg DNA，除非另有說明。通過表達env的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移載體的共轉(zhuǎn)染，從PK-7克隆產(chǎn)生LV，同時通過僅用合適轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染，獲得從PK-7-RD克隆和PK-7-Tat7-RD克隆產(chǎn)生的LV。用標準Ca++磷酸鹽方法或Fugene 6系統(tǒng)，按照制造商的說明(Roche DiagnosticsCorporation, Indianapolis, IN)進行瞬時轉(zhuǎn)染,得到類似結(jié)果。轉(zhuǎn)染后48小時收獲上清液并通過0.45-μ m濾器過濾。根據(jù)實驗類型，對SupTl、CEM A3.01、原代活化外周血單核細胞(PBMC)和臍帶血衍生的⑶34+ HSC計算滴度。簡而言之，通過由過夜靜止階段分開的
2次循環(huán)的離心接種(I, 240 X g, I 小時)，在 polybrene (8 μ g/ml) (Sigma-Aldrich,St Louis, MO)存在下，轉(zhuǎn)導(dǎo)SupTl和活化的原代單核細胞；將CD34+ HSC在不含polybrene的包被 retronectin 的板(Takara Bio, Otsu, Japan)上轉(zhuǎn)導(dǎo) 24 小時。如 Porcellini等，2009 & 2010 [23, 24]所述，使用 FlowJo 軟件(Tree Star, Inc., Ashland, OR),通過 eGFP 表達(SIN-eGFP)或 Λ LNFGR 表達(PAN_Chim3)的流式細胞術(shù)分析(FACS CaliburBD Bioscience, San Jose, CA)監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。僅范圍5_20%陽性細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)值用于計算每種LV制備物的滴度， 按照以下公式:TU =[細胞數(shù)X (% GFP/100)]/上清液體積(以ml 計)?；诘味鹊目寺『Y選方案
為了加快選擇，我們通過計算它們的上清液的LV滴度，篩選了所有PK-7衍生亞克隆。我們建立了小規(guī)模的基于Ca++磷酸鹽的單個或兩個質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生LV，隨后通過小規(guī)模轉(zhuǎn)導(dǎo)方案計算其對SupTl細胞的效力。簡而言之，將6 X IO4/孔PK-7衍生細胞接種在48孔板中并在24小時之后用獲得功能性LV所需的殘余質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，將200 μ I培養(yǎng)上清液用于轉(zhuǎn)導(dǎo)3 X IO4/孔的以7.5 X 104/ml濃度接種的SupTl細胞。所用滴度閾值評分為彡I X IO2 TU/mL.
RNA印跡測定和DNA印跡測定
RNA 印跡測定。用 Trizol 試劑(Life TechnologiesTM Inc., Gaithersburg, MD),按照制造商的說明，提取總RNA。將5 y g/樣品在0.8%瓊脂糖-甲醛凝膠上運行，通過毛細管轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，最后用PerfectHyb PLUS雜交緩沖液(Sigma ChemicalCorp., St.Louis, MO)中的 I X IO6 dpm/ml 32P-標記的 550-bp RDl 14-TR探針來探測。充分洗滌之后，在一 70°C將膜曝光至X光膠片。DNA印跡測定。通過QIAamp Mini試劑盒(QIAGEN GmbH, Germany),按照制造商的說明，分離基因組DNA (gDNA)。通過QIAamp DNA micro試劑盒(QIAGEN)從病毒顆粒中提取桿狀病毒DNA。用所示限制酶消化過夜之后，將10 μ g的gDNA在0.8%瓊脂糖凝膠上運行，通過DNA印跡毛細管轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Duralon, Stratagene, TX, USA),然后在PerfectHybPLUS雜交緩沖液中雜交到I X IO6 dpm/ml 32P-隨機引物標記的600_bp CMV或ll_kb GPR盒，250-bp tat, 600-bp Chim3 和 500_bp RD114-TR特異性探針。充分洗滌之后，在一 70°C將膜曝光至 X 光膠片或曝光至 PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)。分析性PCR分析
使用I ng SIN-eGFP載體作為DNA模板和以下的一組引物，得到230-bp RRE擴增子:RRE-正向:5’-AGT ACT GGA GCT TTG TTC CTT GGG-3’;RRE_ 反向:5’-AGT ACT AAA TCCCCA GGA GCT G-3’，在以下PCR條件:98°C 7分鐘，30個循環(huán)的94°C 30秒、50°C 30秒和72 0C 30 秒。對300 ng基因組gDNA進行PCR分析，用于篩選殘余整合到PK-7細胞中的AAV-R印78 質(zhì)粒，使用下組引物:AAV-R印78 正向:5，-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3’ ；AAV-R印78 反向:5’-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3’和以下 PCR 條件:98°C 7 分鐘，30個循環(huán)的94°C 30秒、66°C 30秒和72°C 1.5分鐘。為了確定2個GPR盒的方向，對300 ng gDNA進行PCR擴增，使用下組引物:rev正向:5’- CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3’； β -球蛋白反向:5’- CCC TGT TAC TTC TCCCCT TCC -3’ ；rev 正向巢式:5’ - TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3’ ；β-球蛋白巢式反向:5’ - TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3’ 和以下條件:94°C 2 分鐘，35 個循環(huán)的 94°C30 秒、52。。30 秒和 72°C 1.5 分鐘。p24gag ELISA
使用 Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 試劑盒(Perkin Elmer Life and AnalyticalSciences, Inc.Waltham, MA)，按照制造商的說明，在培養(yǎng)上清液中測量實際的LV生產(chǎn)，假定I Pg p24gag相當(dāng)于I X IO4實際顆粒。
蛋白印跡分析
如前所述[23，24]，制備來源于PK-7細胞的全細胞和核提取物以及來源于分離的無細胞VLP或LV的病毒蛋白。通過SDS-PAGE將蛋白按大小分級，并且電印跡到Hybond ECL硝基纖維素膜(GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK)。將膜在5%低脂奶粉中封閉，然后與合適的第一 Ab—起溫育。使用得自AIDS患者的1: 2，000稀釋度的抗HIV血清；1: 500稀釋度的識別蛋白外功能區(qū)的2個15聚體肽(aa 95-109，QNRRGLDLLTAEQGG和 aa 65-79，SGIVRNKIRTLQEEL)的抗 RD114-TR 兔血清[22];分別為 1:200，1:1,000 和1:500稀釋度的HIV-1 rev MoAb (Rev-6, sc-69730)和經(jīng)親和純化的兔多克隆抗YYl Ab(C-20, sc-281) (S.Cruz Biotechnology, Inc., S.Cruz, CA)和小鼠抗p24gag (AcrisAntibodies, Germany)。通過增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL (ECL, Amersham),按照制造商的說明，顯示Ab結(jié)合。通過實時TaqMan PCR對載體拷貝數(shù)(VCN)進行定量測定
通過定量 TaqMan PCR,使用 ABI Prism 7, 900 FAST 儀器(Applied Biosystems,Foster City, CA)確定整合載體的載體拷貝數(shù)(VCN)，并通過SDS 2.3軟件(AppliedBiosystems)進行分析。PCR條件如下:50°C 2分鐘，95°C 5分鐘，接著是40個循環(huán)的95°C15秒和60 V 15秒，增量為0.1°C /循環(huán)，對于GAG靶序列。用以下引物和探針擴增gDNA:
權(quán)利要求
1.一種得到穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系的方法，包括: 1.制備雜合載體(A)，其包含含有側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和 .制備表達質(zhì)粒(B)，其含有處于啟動子控制之下的AAV rep可讀框， ii1.用表達質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染細胞并隨后用雜合載體A感染該細胞， iv.在抗生素存在下培養(yǎng)所述細胞，用于選擇， V.得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的細胞， v1.將env基因整合到所述細胞中， vi1.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和env蛋白的細胞系。
2.—種得到穩(wěn)定慢病毒 包裝細胞系的方法，包括: 1.制備雜合載體(A)，其包含含有側(cè)翼為腺伴隨病毒(AAV)反向末端重復(fù)序列(ITR)并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和 .制備表達質(zhì)粒(B)，其含有處于啟動子控制之下的AAV rep ORF, ii1.用表達質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染細胞并隨后用雜合載體A感染該細胞， iv.在抗生素存在下培養(yǎng)所述細胞，用于選擇， V.得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的細胞， v1.將慢病毒tat基因整合到這樣的細胞中， vi1.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和tat蛋白的細胞系， vii1.將env基因整合到這樣的細胞中， ix.培養(yǎng)所述細胞，以得到穩(wěn)定表達gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白、tat蛋白和env蛋白的細胞系。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl a、SFFV和RSV。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述啟動子是CMVIE。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述選擇標記是潮霉素抗性基因。
8.權(quán)利要求1或7的方法，其中所述選擇標記是克隆在IRES下游。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中AAVRep蛋白是R印78。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中env基因選自MLV4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
12.權(quán)利要求11的方法，其中使用包含表達盒的SIN慢病毒載體，整合RD114-TR，所述表達盒含有從5’到3’端排列的CMV啟動子、在其序列中含有RRE元件的β -球蛋白內(nèi)含子和 RD114-TR ORF。
13.一種包含穩(wěn)定整合到其基因組中的以下部分的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系: 1.側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記， i1.至少一個拷貝的env基因。
14.權(quán)利要求13的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述細胞還含有穩(wěn)定整合到其基因組中的HIV-1 iai基因。
15.權(quán)利要求13或14的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述細胞是選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa 的人細胞系。
16.權(quán)利要求13-15中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述整合盒的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動。
17.權(quán)利要求13-16中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl a、SFFV 和 RSV。
18.權(quán)利要求13-17中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
19.權(quán)利要求13-18中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中env基因選自MLV4070env, RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114_pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
20.權(quán)利要求13-19中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
21.一種生產(chǎn)慢病毒載體的方法，包括: 1.培養(yǎng)權(quán)利要求13-20中任一項的穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系， .在所述穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉(zhuǎn)移載體。
22.一種包含穩(wěn)定整合到其基因組中的以下部分的生產(chǎn)用細胞系: 1.側(cè)翼為AAVITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記， i1.至少一個拷貝的env, ii1.轉(zhuǎn)移載體。
23.權(quán)利要求22的生產(chǎn)用細胞系，其中所述細胞還含有穩(wěn)定整合到其基因組中的至少一個拷貝的慢病毒tat基因。
24.權(quán)利要求22或23的生產(chǎn)用細胞系，其中所述細胞是選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa 的人細胞系。
25.權(quán)利要求22-24中任一項的生產(chǎn)用細胞系，其中所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅(qū)動。
26.權(quán)利要求22-25中任一項的生產(chǎn)用細胞系，其中所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α , SFFV 和 RSV。
27.權(quán)利要求22-26中任一項的生產(chǎn)用細胞系，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
28.權(quán)利要求22-27中任一項的生產(chǎn)用細胞系，其中env基因選自MLV4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、桿狀病毒GP64 env或GALVenv或其衍生物。
29.權(quán)利要求22-28中任一項的生產(chǎn)用細胞系，其中env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
30.一種生產(chǎn)慢病毒載體的方法， 包括:.1.培養(yǎng)權(quán)利要求22-30中任一項的生產(chǎn)用細胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供新的穩(wěn)定包裝細胞系和生產(chǎn)用細胞系以及得到它們的方法，以及用這樣的細胞系生產(chǎn)慢病毒載體的新方法。用用于慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白的穩(wěn)定表達的baculo-AAV雜合系統(tǒng)產(chǎn)生本發(fā)明的新方法和包裝細胞系，所述系統(tǒng)包含含有側(cè)翼為AAVITR的整合盒的桿狀病毒骨架，以及編碼rep蛋白的質(zhì)粒。該系統(tǒng)允許得到HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白gag/pol和rev的穩(wěn)定整合。所述系統(tǒng)允許得到僅包含HIV的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白gag/pol和rev的第一中間體，用作得到穩(wěn)定包裝細胞系以及生產(chǎn)用細胞系的起點。
文檔編號C12N15/867GK103228790SQ201180042473
公開日2013年7月31日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者C.博沃倫塔, A.斯托爾納約洛, P.里扎爾迪, F.馬維利奧 申請人:莫爾梅德股份有限公司