專利名稱：與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及與1-脫氧野尻霉素(其是α-葡萄糖苷酶抑制劑)一一生物合成相關(guān)的多肽，編碼該多肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，含有該載體的轉(zhuǎn)化體，以及使用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽或1-脫氧野尻霉素的方法。
背景技術(shù)：
隨著生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的西化以及老齡人口的增加，與飲食生活相關(guān)的成人疾病的代表一糖尿病的發(fā)病，已在韓國越來越普遍。糖尿病(diabetes mellitus),或簡稱糖尿病(diabetes)是一種代謝性疾病，由于胰腺不能產(chǎn)生足夠的胰島素，或由于各器官的細胞對胰島素的響應(yīng)效率非常低，使患者出現(xiàn)高血糖。糖尿病如果不進行適當?shù)闹委?，可?dǎo)致許多嚴重的并發(fā)癥，包括腎功能衰竭、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜病變，從而引起個人和社會的關(guān)注。已經(jīng)基于各種機制對糖尿病的降血糖藥進行研究和開發(fā)。其中一個典型的實例是對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，該酶催化糖原降解為葡萄糖。在研發(fā)此類降血糖藥的背景下，已知通常分離自桑葉的1-脫氧野尻霉素(DNJ)具有有效的α -葡萄糖苷酶抑制活性(Asano, N.等人，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)第 293 卷，195-382 頁，1996; Asano, N.等人，植物化學(xué)(Phytochemistry),第 53 卷，397-382 頁，2000; Asano, N.等人，農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志，(J.Agric.Food Chem.)，第 49 卷，4208-4213 頁，2001)。1-脫氧野尻霉素，是一種多羥基生物堿，其具有糖基團上的氧原子被氮原子取代的特征性結(jié)構(gòu)。1-脫氧野尻霉素的功能是抑制參與將二糖，如麥芽糖、蔗糖、果糖等分解成為單糖葡萄糖的α -葡萄 糖苷酶和甘露糖脫氫酶，從而抑制血糖。1-脫氧野尻霉素的許多種來源是已知的。例如，1-脫氧野尻霉素可分離自桑樹(Morus alba L.)或蠶(Bombyx mori L.) (Asano, N.等人，J.農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志，(J.Agric.Food Chem.),第 49 卷，4208-4213 頁,2001)，從植物中提取(Evans, S.V.等，植物化學(xué)(Phytochemistry),第 24 卷，1953-1955 頁,1985;Murao, S.和 Miyata, S.,農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.),第 44 卷，219-221 頁,1980; Yamada, H., Oya, 1.和 Nagai, T., Shoyakugaku Zasshi,第 47 期，47-55 頁，1993),或從微生物，如鏈霉菌和芽孢桿菌中制備(Ezure, Y.等人，農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)，第49卷，1119-1125 頁，1985; Hardick, D.J.和 Hutchinson, D.W.，生物化學(xué)(Biochemistry),第 49 卷，6707-6716 頁，1993; Shibano, M.等人，植物化學(xué)(Phytochemistry),第 65卷，2661-2665頁，2004)。然而，從植物中提取獲得1_脫氧野尻霉素的缺點在于，各種具有相似結(jié)構(gòu)的成分使純化困難，并降低了產(chǎn)率。另一方面，與植物提取相比，從微生物中制備1-脫氧野尻霉素，可以在相對短的時間內(nèi)完成而不破壞環(huán)境，并保證了高產(chǎn)率。然而，與1-脫氧野尻霉素生物合成相關(guān)的多肽并不是已知的，迄今也未分離出編碼該多肽的基因。出于這些原因，盡管有這些優(yōu)點，人們并沒有嘗試從微生物中提高產(chǎn)率，或開發(fā)新的α-葡萄糖苷酶。
許多構(gòu)成病毒外膜的蛋白由糖蛋白組成。為了在動物細胞內(nèi)復(fù)制，病毒利用作為合成工具的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體合成糖蛋白。在動物細胞中，糖蛋白的合成需要添加N-連接或O-連接的糖鏈。作為參與糖蛋白合成的α-葡萄糖苷酶I和II以及甘露糖脫氫酶的抑制劑，1-脫氧野尻霉素阻斷病毒外膜蛋白的合成，并形成不完整的外膜，從而干擾病毒顆粒的產(chǎn)生。因此，已報道1-脫氧野尻霉素對病毒疾病具有預(yù)防效果(Hardick，D.J.等人，四面體(Tetrahedron)，第48卷，6285-6296頁，1992)，抗癌活性和對癌癥轉(zhuǎn)移的預(yù)防作用(Olden, K.等人，藥理與治療(Pharmacol.Ther.),第 50 卷，285-290 頁，1991; Tayer, Ο-ι.等人，艾滋病(AIDS)，第5卷，693-698頁，1991)。如上所述，人們預(yù)期將1-脫氧野尻霉素是用于治療各種疾病的潛在藥物，因此，需要開發(fā)一種有效地生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法。本發(fā)明的發(fā)明人努力開發(fā)出一種用于生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法，并確定了與1-脫氧野尻霉素生物合成相關(guān)的多肽，其可用于生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種與1-脫氧野尻霉素生物合成相關(guān)的多肽。本發(fā)明的另一目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。本發(fā)明的再一目的是提供含有該多核苷酸的重組載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的再一目的是提供一種通過培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素相關(guān)多肽，或1-脫氧野尻霉素的方法。

為了實現(xiàn)前述目的，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:16的氨基酸序列的多肽，其包括gabTl、yktcl和gutBl基因的編碼區(qū)；具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽，其包括gabTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的編碼區(qū)；以及具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽，其包括 glcPl、gabTl、yktcl、gutBl、ybaR、ybaS 和 ybbA 基因的編碼區(qū)。為了實現(xiàn)前述的另一目的，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸，具有SEQ ID NO: 20的核苷酸序列的多核苷酸；以及具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸分別編碼相應(yīng)的多肽。為了實現(xiàn)前述的再一目的，本發(fā)明提供含有其中一條所述多核苷酸序列的重組載體，以及用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。為了實現(xiàn)前述的再一目的，本發(fā)明提供一種利用所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽或1-脫氧野尻霉素的方法。本發(fā)明所述的編碼與1-脫氧野尻霉素生物合成相關(guān)的多肽的多核苷酸可用于1-脫氧野尻霉素的大量生產(chǎn)。此外，所述多核苷酸可結(jié)合重組技術(shù)來尋找新的1-脫氧野尻霉素衍生物，該衍生物有效地用于開發(fā)糖尿病患者的降血糖藥以及對抗致病性病毒的抑制劑。


圖1為實施例1提取的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) MORI 3K-85的基因組經(jīng)BamH I和Hind III處理的瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道I，Ikb DNA梯狀條帶(DNA ladder),泳道2，基因組DNA ;泳道3，BamH I酶切；泳道4，Hind III酶切)。
圖2為本發(fā)明的CopyControl pCClBAC 載體的酶切圖譜示意圖。圖3為根據(jù)實施例1，從篩選的克隆的培養(yǎng)物中提取的生物堿的薄層色譜法色譜圖分析結(jié)果(泳道1:參照1-脫氧野尻霉素，泳道2:C5-26,泳道3:C26-40,泳道4:C36_4，泳道 5:C88-29，泳道 6:C91-31)。圖4A為本發(fā)明篩選的C36-4克隆子培養(yǎng)提取物的HPLC色譜圖分析結(jié)果。圖4B為用作本發(fā)明制備的化合物的參照物的1-脫氧野尻霉素的HPLC色譜圖分析結(jié)果。圖5為用作參照物的1-脫氧野尻霉素(A)，以及本發(fā)明中篩選的C36-4克隆子的培養(yǎng)提取物的LC-MS/MS圖。圖6為從篩選的C36-4克隆子中提取的質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1:DNA梯狀條帶；泳道2:質(zhì)粒)。圖7為本發(fā)明從篩選的C36-4克隆子中提取的質(zhì)粒經(jīng)限制酶消化后的瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1:寬量程DNA梯狀條帶，泳道2:空載體，泳道3:未消化的C36-4衍生質(zhì)粒，泳道4 =BamH I消化，泳道5 =EcoR I消化，泳道6:Hind III消化，泳道7:BamH I/EcoR I消化，泳道8:BamH I/Hind III消化，泳道9:空載體，泳道10:lkb DNA梯狀條帶)。圖8為本發(fā)明篩選的C36-4克隆子的基因插入的限制酶酶切圖譜示意圖。圖9為本發(fā)明篩選的C36-4克隆子的基因插入與枯草芽孢桿菌168的基因組之間的核苷酸序列比較示意圖。圖10為本發(fā)明篩選的C36-4克隆子的基因插入與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42的基因組之間的核苷酸序列比較示意圖。圖11為本發(fā)明篩選的C36-4克隆子的基因插入與枯草芽孢桿菌168和解淀粉芽孢桿菌FZB42的基因組之間的核苷酸序列比較示意圖。圖12為本發(fā)明從篩選的C36-4克隆子中提取的質(zhì)粒經(jīng)限制酶消化后的瓊脂糖凝膠電泳圖(A.泳道l:lkb DNA梯狀條帶，泳道2:Hind III消化，B.泳道1:1kb DNA梯狀條帶，泳道 2:Hind III/Nru I 消化)。圖13為顯示篩選的C36-4克隆子的質(zhì)粒上的Hind III限制酶位點的位置，以及用Hind III消化該質(zhì)粒后的DNA片段大小示意圖。圖14為顯示篩選的C36-4克隆子的質(zhì)粒上的Hind III和Nru I限制酶位點的位置，以及用Hind III和Nru I消化該質(zhì)粒后的DNA片段大小示意圖。發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。通常，本發(fā)明中使用的術(shù)語是本領(lǐng)域公知的和常用的。除非另有說明，適用如下定義。本發(fā)明中使用的術(shù)語“核酸分子”，指廣義地包括DNA CgDNA和cDNA)和RNA分子。在本發(fā)明中，形成核酸分子構(gòu)建單元的核苷酸包括糖或堿基修飾的類似物以及天然核苷酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員從本發(fā)明下面的描述中應(yīng)當理解，本發(fā)明的核酸分子并不僅限于編碼上述特定氨基酸序列的核酸分子，也解釋為包括那些編碼與所述特定氨基酸序列大體相同的氨基酸序列或具有相應(yīng)功能多肽的核酸分子。在本文中，術(shù)語“大體相同”是指當采用本領(lǐng)域中典型的算法程序進行最佳比對時，本發(fā)明的氨基酸序列及任何序列具有至少60%，更優(yōu)選至少80%，并且最優(yōu)選至少90%的序列同源性。術(shù)語“具有相應(yīng)功能的多肽”是指具有與參照多肽相同的氨基酸序列，但至少在氨基酸序列的一個氨基酸殘基上發(fā)生修飾，如缺失、取代、插入和/或添加，同時保持了與參照多肽相同功能的多肽。本發(fā)明的與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽，具有相應(yīng)功能的多肽優(yōu)選含有較少的修飾，如缺失、取代、插入和/或添加。此外，任何與上述特定的氨基酸序列具有約60%，優(yōu)選更高序列同源性的多肽，均落入本發(fā)明的與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽的范圍內(nèi)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“互補的”或“互補”是指多核苷酸通過嘌呤和嘧啶核苷酸殘基之間的氫鍵彼此之間形成堿基對，從而形成雙鏈核酸分子的能力，也指部分互補。與互補有關(guān)的堿基對如下:鳥嘌呤對胞嘧啶，腺嘌呤對胸腺嘧啶，腺嘌呤對尿嘧啶。以下將詳細描述本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種涉及1-脫氧野尻霉素合成的多肽。本發(fā)明的多肽來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)M0RI3K-85,由負責(zé)1_脫氧野尻霉素合成的基因群組(gene group)所編碼。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽，其包括gabTl、yktcl和gutBl基因的編碼區(qū)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽，其包括gabTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的編碼區(qū)。在本發(fā)明再一個實施方案中，提供具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽，其包括 glcPl、gabTl、yktcl、 gutBl、ybaR、ybaS 和 ybbA 基因的編碼區(qū)。本發(fā)明多肽的氨基酸序列選自下組:1) SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；2) SEQ IDNO: 17的氨基酸序列，由SEQ ID NO: 16的氨基酸序列加上ybaR基因編碼區(qū)構(gòu)成；以及3)SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列加上glcPl、ybaS和ybbA基因的編碼區(qū)構(gòu)成。具體地，在所述多肽中，glcPl基因編碼SEQ ID NO: 9的氨基酸序列，gabTl基因編碼SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，yktcl基因編碼SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，gutBl基因編碼SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，ybaR基因編碼SEQ ID NO: 13的氨基酸序列，ybaS基因編碼SEQID NO: 14的氨基酸序列，ybbA基因編碼SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供具有編碼所述多肽的核苷酸序列或具有與該序列互補的核苷酸序列的多核苷酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽，或與該序列互補的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽，或與該序列互補的核苷酸序列。在本發(fā)明又一個的實施方案中，提供具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽，或與該序列互補的核苷酸序列。本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列選自下組:1) SEQ ID NO: 19的核苷酸序列；2) SEQID NO: 20的核苷酸序列，由SEQ ID NO: 19的核苷酸序列加上ybaR基因的核苷酸序列構(gòu)成；以及3) SEQ ID NO:1的核苷酸序列，由SEQ ID NO:20的核苷酸序列加上glcPl、ybaS和ybbA基因的核苷酸序列構(gòu)成。具體地，在所述多核苷酸中，glcPl基因具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，gabTl基因具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列，yktcl基因具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列，gutBl基因具有SEQ ID NO: 5的核苷酸序列，ybaR基因具有SEQ ID N0:6的核苷酸序列，ybaS基因具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列，ybbA基因具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列。更具體地，glcPl基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:8的3071-1881核苷酸，gabTl基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1的3343-4611核苷酸，yktcl基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1的4608-5558核苷酸，gutBl基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1的5533-6579核苷酸，ybaR基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1的6820-8256核苷酸，ybaS基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1的8470-9322核苷酸，以及ybbA基因?qū)?yīng)于SEQ ID N0:1的9902-9333 核苷酸。由上述七個基因編碼的多肽的功能推測如下。glcPl具有跨膜轉(zhuǎn)運的功能。gabTl同時具有4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性和磷酸吡哆醛結(jié)合活性。yktcl具有肌醇或磷脂酰肌醇磷酸酶活性，gutBl同時具有氧化還原酶活性和鋅離子結(jié)合活性。ybaR具有繼發(fā)性主動(secondary active)跨膜轉(zhuǎn)運硫酸鹽的活性,ybaS具有膽汁酸:鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運活性。ybbA尚未知曉其功能(表3和表7)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述多肽優(yōu)選分離自菌株，更優(yōu)選地，分離自枯草芽孢桿菌 MORI3K-85。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供含有所述多核苷酸的重組載體，以及用該重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。編碼與1-脫氧野尻霉素生物合成相關(guān)的多肽的基因群組(group)可被克隆至適當?shù)妮d體，如BAC、質(zhì)粒、福斯質(zhì)粒(fosmid)、粘粒等,然后可將載體導(dǎo)入到合適的宿主細胞中。優(yōu)選的宿主細胞的實例為酵母、芽孢桿菌(Bacillus sp.)和大腸桿菌(E.coli)?？刹捎酶鞣N典型的技術(shù)，包括熱休克、電穿孔等將所述重組載體導(dǎo)入到宿主細胞中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是根據(jù)表達目的，可應(yīng)用于除前述宿主細胞外的各種宿主細胞。
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根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種生產(chǎn)與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽的方法，包括(I)培養(yǎng)用含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體；以及(2)從所述培養(yǎng)物中分離與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽。此外，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法，包括(I)培養(yǎng)用含有本發(fā)明所述的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體；以及(2)從所述培養(yǎng)物中分離1-脫氧野尻霉素。
具體實施例方式以下將更詳細地描述本發(fā)明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下提供的實施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1利用產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的枯草芽孢桿菌M0RI3K-85的基因組構(gòu)建文庫<1~1>菌株培養(yǎng)
從韓國傳統(tǒng)食品中分離并鑒定的枯草芽孢桿菌MORI (保藏號KCCM-10450)，經(jīng)Y射線照射，獲得具有提高的α -葡萄糖苷酶抑制活性的改良枯草芽孢桿菌M0RI3K-85菌株。具體地，將 MORI 菌株培養(yǎng)于 Difco YM[Becton Dickinson and Company (BD),美國 BD 公司]液體培養(yǎng)基中，37°C下180rpm振蕩培養(yǎng)一天，然后用3kGy或5kGy劑量的、射線(SoyaGreenTec，韓國)照射。將經(jīng)Y射線照射的培養(yǎng)液涂布于YM瓊脂板上，并在37°C培養(yǎng)18小時。然后，將形成的菌落轉(zhuǎn)移到新鮮YM瓊脂板上進行孵育。再次地，將該平板上生長的菌落接種到Y(jié)M液體培養(yǎng)基中，37°C 180rpm振蕩培養(yǎng)5天。分析細胞對α -葡萄糖苷酶的抑制活性，從而獲得改良的細胞亞株枯草芽孢桿菌M0RI3K-85。孵育一天后，將枯草芽孢桿菌M0RI3K-85按1%體積的量接種于各含500mL YM液體培養(yǎng)基的四個培養(yǎng)基中，37°C 180rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)物在8，OOOrpm下離心10分鐘，移去上清。將所形成的細胞團重懸于20mL的IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，_20°C貯存至基因提取時用?！?-2>某閔纟目提取用基因組提取試劑盒(美國Promega公司)從枯草芽孢桿菌M0RI3K-85中提取基因組DNA。取ImL貯存于-20°C的枯草芽孢桿菌M0RI3K-85菌懸液，在4°C解凍，16，000Xg離心2min。倒掉上清后，將細胞團重懸于480yL的50mM EDTA (乙二胺四乙酸)中，與120 μ L細胞裂解液在37°C孵育30min。以相同方式離心(16，000X g，2min)，然后將上清轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL微量離心管(Eppendorf管)中。向上清中加入600 μ L核裂解液(包含在基因組提取試劑盒中，美國Promega公司)，然后在80°C孵育5min，將反應(yīng)液冷卻至室溫。然后，該反應(yīng)液與3 μ L RNase溶液輕輕混合5次，37°C孵育30min，并冷卻至室溫。隨后,將該反應(yīng)液與200 μ L蛋白沉淀溶液混合并置于冰上反應(yīng)5min以除去蛋白，然后16，000 X g離心2min得到上清。向上清中加入600 μ L異丙醇，將混合物在16，000 X g離心2min。移去上清后，沉淀(pellet)用600 μ L70%乙醇洗3次，然后16，000X g離心2min。蒸發(fā)殘余乙醇來 干燥沉淀，并溶解于30 μ L DNA再水化溶液(rehydration solution)(包含在基因組提取試劑盒中，美國Promega公司)中，65°C水浴中放置60min?！?-3>用限制酶消化制備的DNA片段用限制酶BamH 1.Hind III和EcoR I (美國Promega公司)消化。將由I μ L上述獲得的基因組DNA (I μ g/ μ L)、16.3 μ L無菌水、2 μ LlO X緩沖液和0.2 μ L牛血清白蛋白(10yg/yL)與0.5 μ L限制酶組成的混合物在37°C水浴中放置lhr，然后在65 °C水浴中孵育15min以終止限制消化反應(yīng)。隨后，制備含200 μ L溴化乙錠(2 μ g/mL)的0.5%瓊脂糖凝膠120mL并成型。將
5μ L限制酶消化產(chǎn)物與I μ L染色劑緩沖液(dye buffer)混合后加樣5 μ L至0.5%瓊脂糖凝膠中。然后，將5 μ Llkb DNA標記物(美國PiOmega公司)與I μ L染色劑緩沖液混合后加樣5 μ L至0.5%瓊脂糖凝膠中。加樣后凝膠中的樣品在50V電壓下跑膠30min，用紫外透射儀(美國UVP公司)進行紫外線照射以顯示條帶。經(jīng)BamH I消化后，DNA片段的較大部分為6kb或更大。另一方面，Hind III的消化產(chǎn)物大小主要為2-7kb(圖1)。經(jīng)BamH I消化的DNA片段被用于后續(xù)構(gòu)建轉(zhuǎn)化體。<1-4>DNA片段與dCCIBAC載體連梓為克隆該DNA片段，將實施例1的〈1-3>中經(jīng)BamH I消化所得的DNA片段IOOng與 I μ L CopyControl pCClBAC Cloning-Ready BamH I 載體(美國 Epicentre 公司；圖2)混合，向該DNA混合物中加入無菌水至總體積87 μ L0所得DNA溶液在55°C孵育IOmin,在室溫下冷卻15min,與10 μ LlOXFast-Link連接緩沖液(包含在CopyControlpCClBAC Cloning-Ready BamH I 試劑盒中，美國 Epicentre 公司)、I μ LlOOmM ATP 和 2 μ LFast-Link DNA連接酶(CopyControl pCCIBAC Cloning-Ready BamH I 試劑盒，Epicentre,美國)混合，達到總體積100 μ L0所得混合物在16°C孵育4hr，然后于65°C加熱15min以滅活連接酶。為用于將所得連接產(chǎn)物溶液脫鹽，通過加熱煮沸，將0.9g葡萄糖和0.5g瓊脂糖完全溶解于50mL初級蒸餾水中，冷卻至50°C，然后以800 μ L的等份加入至1.5mL管中，在凝固之前向該管中插入0.5mL管以形成圓錐形。向其中加入連接產(chǎn)物溶液，冰上孵育lhr。所得重組載體被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。<1~5>轉(zhuǎn)化體的構(gòu)律使用TransforMax EPI300 電感受:態(tài)大腸桿菌(美國Epicentre公司)進行轉(zhuǎn)化，將電穿孔小管和1.5mL管置于冰上。在1.5mL管中，50 μ L大腸桿菌菌液在冰上緩慢解凍，并與2μ L脫鹽的連接產(chǎn)物溶液混合。將混合物轉(zhuǎn)移至冷的電穿孔小管中，采用Gene Pulser (美國Bio-Rad公司)，在12kV/cm電場下進行電穿孔。將管中轉(zhuǎn)化的細胞與950 μ L SOC培養(yǎng)基(2%Bacto牌蛋白胨，0.5%Bacto牌酵母提取物，IOmM NaCl, 2.5mMKCl, 20mM Mg2+ 緩沖液(MgCl26H20，MgS047H20)，20mM 葡萄糖)混合，轉(zhuǎn)移至 50mL 管中，37°C以220 230rpm振蕩孵育lhr。將IOOmL的細胞溶液涂布于含12.5 μ g/mL氯霉素、40 μ g/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和50 μ g/mL40mM異丙基β -D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的Luria-Bertani (LB)平板上，放置在培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)12hr。從平板上挑取白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所得培養(yǎng)物用于篩選產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的克隆。實施例2通過測定抑制α -葡萄糖苷酶活性進行篩選為了從所述白色菌落中篩選出能產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的克隆，采用測定抑制α -葡萄糖苷酶活性的方法。實施 例1的〈1-5>中制備的培養(yǎng)物在100°C加熱10min，8，OOOrpm離心lOmin。向5μ L上清中加入75μ L0.1M磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.8)、作為底物的50 μ L12mM對硝基苯基-α -吡喃葡萄糖苷和20 μ L粗酶液。為了制備該粗酶液，稱取0.Sg大鼠小腸丙酮粉(美國Sigma公司)，在IOOmL0.1M磷酸鉀緩沖液中提取lhr。所得溶液在12，OOOrpm離心lOmin，得到的上清用作粗酶液?；旌衔镌?7°C孵育35min，用50 μ L200mM碳酸鈉終止酶反應(yīng)。在酶標儀(美國分子設(shè)備(Molecular device)公司)上讀取405nm處的吸光值。通過以下公式I計算，篩選出具有20%或更高α-葡萄糖苷酶抑制活性的克隆(Sc0filed，A.M.等人，生命科學(xué)(LifeSc1.)，第 39 卷，29-32 頁，1986)。< 公式 1>
權(quán)利要求
1.具有SEQID NO: 16的氨基酸序列的多肽，其含有g(shù)abTl、yktcl和gutBl基因的編碼區(qū)。
2.具有SEQID N0:17的氨基酸序列的多肽，其含有g(shù)abTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的編碼區(qū)。
3.具有SEQID N0:18的氨基酸序列的多肽，其含有g(shù)lcPl、gabTl、yktcl、gutBl、ybaR、ybaS和ybbA基因的編碼區(qū)。
4.具有SEQID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的多肽，或與所述序列互補的核苷酸序列。
5.具有SEQID NO:20的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求2所述的多肽，或與所述序列互補的核苷酸序列。
6.具有SEQID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求3所述的多肽，或與所述序列互補的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽，其中所述多肽與1-脫氧野尻霉素的生物合成相關(guān)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽，其中所述多肽具有對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
9.含有權(quán)利要求4-6任一項所述多核苷酸的重組載體。
10.用權(quán)利要求9所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體選自下組:酵母、芽孢桿菌(Bacillus sp.)和大腸桿菌(E.coli)。
12.生產(chǎn)與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽的方法，包括: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化體；以及 (2)從培養(yǎng)物中分離出與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽。
13.生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法，包括: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化體；以及 (2)從培養(yǎng)物中分離出1-脫氧野尻霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)1-脫氧野尻霉素的生物合成相關(guān)的多肽，編碼該多肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，含有該載體的轉(zhuǎn)化體，以及將該轉(zhuǎn)化體用于生產(chǎn)與1-脫氧野尻霉素合成相關(guān)的多肽或1-脫氧野尻霉素的方法。本發(fā)明的多核苷酸可用于1-脫氧野尻霉素的批量生產(chǎn)，或通過使用重組技術(shù)用于尋找新的1-脫氧野尻霉素衍生物的研究，因此可用于開發(fā)致病性病毒的抑制劑和用于糖尿病患者的降血糖藥。
文檔編號C12N15/63GK103168047SQ201180042602
公開日2013年6月19日 申請日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者成洙一, 黃教列, 李載淵, 姜景敦, 樸永植, 趙勇錫, 陸媛晶 申請人:拓邦生物科技有限公司