專利名稱：滅活的水痘帶狀皰疹病毒疫苗、其生產(chǎn)方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含滅活水痘病毒疫苗(VZV)的疫苗組合物和用于生產(chǎn)所述組合物的方法。
背景技術(shù)：
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的初始感染通常在兒童和年輕成年人中引起水痘。盡管水痘的臨床表現(xiàn)通常在沒有醫(yī)療干預(yù)的情況下在一個短時間期間內(nèi)解決，但是VZV可以在感染后在感覺神經(jīng)元中保持潛伏持續(xù)多年。潛伏VZV的再活化和復(fù)制，經(jīng)常在幾十年后，可以導(dǎo)致帶狀皰疹(HZ)，通常被稱為帶狀皰疹，通常限于單一皮片的疼痛性皮疹。這樣的VZV再活化與細胞介導(dǎo)的免疫下降相關(guān)，其發(fā)生在老年人或免疫功能低下的那些人中(Weinbergk, Jourrml of Infectious Diseases (2009) 200:1068-77)。在一些患者中，與 HZ 相關(guān)的疼痛可以在HZ皮疹已經(jīng)痊愈后持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，被稱為皰疹后神經(jīng)痛(PHN)的并發(fā)癥?；顪p毒疫苗(ZOSTAVAX ,Merck & C0.，Inc.，Whitehouse Station, NJ)目前可用于在健康老年患者中預(yù)防帶狀皰疹(美國專利號6，214，354和5，997，880)。該疫苗已經(jīng)顯著降低了 HZ在免疫活性的患者群體中的不利影響(Oxman,麗，Clin InfectDis.(2010) 51 (2) :197-213; Sanford和Keating, Drugs Aging (2010) 27(2):159-76;Oxman等人，N.Engl.J.Med.(2005) 352:2271-83)。然而，活減毒疫苗可能不適用于免疫功能低下的患者。免疫功能低下的個體，包括患有血液惡性腫瘤的患者、經(jīng)歷免疫抑制治療的患者、接受造血干細胞移植(HCT)或?qū)嶓w器官移植(SOT)的患者、HIV感染的患者和具有自身免疫性疾病的患者，具有相對于一般群體更高的發(fā)展HZ的發(fā)病率。此外，這些患者群體處于發(fā)展嚴重和威脅生命的并發(fā)癥的增加的風(fēng)險中(Gourishankar等人.(2004)Am J.Transplant 4: 108—115， Ragozzin0.(1982) Medicine (Baltimore) 61:310-316, Wung 等人.(2005) Am J Med 118: 1416.e9-1416.el8, Dworkin & Schmader(2003) Clinical Infectious Diseases 36: 877-882，Gebo 等人.(2005) J AcquirTmmune Defic Syndr 40: 169-174，Mattiuzzi 等人.(2003) Clinical Cancer Research9: 976-980, Dworkin 等人.(2003) Neurology 60: 1274-1283.)如腦膜腦炎(Tauro 等人.(2000) Bone Marrow Transplant 26: 795-796)、橫貫性脊髓炎、視力損傷(Walton等人.(1999) Bone Marrow Transplant 23: 1317-1320)、肺炎(Wacker等人.(1989) BoneMarrow Transplant 4: 191-194)、肝炎(Rogers等人.(1995) Bone Marrow Transplant15: 805-807; Schiller等人.(1991) Bone Marrow Transplant 7: 489-491)、細菌重復(fù)感染、皮膚疤痕和缺陷(Schuchter等人.(1989) Blood 74: 1424-1427)。盡管在免疫功能低下的個體中存在與HZ相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的較高風(fēng)險，該群體不適合用針對HZ的活減毒疫苗如ZOSTAVAX 接種疫苗。因此，對于在免疫功能低下的患者群體中對于防止HZ或降低HZ或相關(guān)并發(fā)癥的嚴重度和持續(xù)時間安全且有效的疫苗有重大的需要。關(guān)于免疫功能低下患者的安全擔(dān)憂已經(jīng)導(dǎo)致研究人員研究使用針對病毒病原體的非復(fù)制型疫苗如亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和滅活的完整疫苗。許多批準的滅活疫苗含有用福爾馬林滅活的病毒，包括甲型肝炎、脊髓灰質(zhì)炎和日本腦炎疫苗。對于HZ，已經(jīng)提示，通過熱滅活VZV或通過使用亞單位疫苗可以開發(fā)對于免疫功能低下受試者的更安全的疫苗(Cohen, J.1., (2008) J.1nfect.Dis.197(Suppl 2): S237-S241)。Redman 等人(J.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通過在 50°C加熱而滅活的并導(dǎo)致
≤1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的滅活VZV疫苗。對于待施用于免疫功能低下的患者的產(chǎn)品，該感染性水平是不希望的。美國專利號6，214，354和5，997，880還提到了使用滅活VZV疫苗的潛能并公開了生產(chǎn)并測試熱處理的疫苗的例子。如果開發(fā)了滅活VZV的方法，所述方法導(dǎo)致在免疫功能低下的患者中安全并有效(即缺乏剩余感染性但保留非滅活樣品的免疫原性和抗原性)的VZV樣品，這將滿足重大的醫(yī)療需要。發(fā)明概述
本文已經(jīng)顯示，可以用Y輻射滅活VZV樣品，使得樣品中的VZV感染性在檢測不到的水平；然而，相對于沒有滅活VZV樣品，通過本文描述的方法滅活后的VZV的免疫原性和/或抗原性沒有顯著的損失并且結(jié)構(gòu)沒有顯著的變化。在一個方面，本發(fā)明提供了滅活的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是檢測不到的，其中當(dāng)施用于患者時滅活VZV誘導(dǎo)針對VZV的免疫應(yīng)答。還提供了藥物組合物/疫苗，其包含治療有效量的滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的組合物是液體或在冷凍狀態(tài)，例如，凍干的。在本文描述的組合物的一些實施方案中，用Y輻射滅活VZV。在另一個方面，本發(fā)明提供了制備滅活VZV疫苗的方法，所述方法包括用約5kGy-約50kGy的Y輻射來Y輻射包含VZV的樣品。在優(yōu)選的實施方案中，Y輻射源是6°Co，雖然本領(lǐng)域中已知的其他同位素也可以用于這方面。在本文所公開的制備方法的一些實施方案中，在輻射前將樣品凍干。在可替代的實施方案中，液體容積物暴露于Y輻射，而不首先凍干。本發(fā)明還提供了治療HZ或與VZV再活化相關(guān)的其他疾病或針對其免疫的方法，所述方法包括將疫苗或藥物組合物施用于受試者，所述組合物包含治療有效量的滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述VZV是通過Y輻射滅活的。在本文描述的治療方法的一些實施方案中，所述組合物/疫苗的施用途徑是皮下的或肌肉內(nèi)的。在本發(fā)明的這個方面的特定實施方案中，患者是50歲或更大的和/或免疫功能低下的。如說明書通篇和隨附的權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“一 (a) ”，“一 (an) ”和“該(the) ”包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有清楚指明。如說明書通篇和隨附的權(quán)利要求中所使用的，下列定義和縮寫適用:
術(shù)語“治療”是指治療性處理和預(yù)防或防止措施。需要治療的個體包括已經(jīng)患有病癥的那些個體，以及易于患有病癥的那些個體或其中病癥待防止的那些個體。用本發(fā)明的滅活VZV治療患者包括下列中的一個或多個:在患者中誘導(dǎo)/增加針對VZV的免疫應(yīng)答，在已經(jīng)感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中降低VZV再活化的可能性，防止或降低發(fā)生HZ和/或與VZV再活化相關(guān)的其他疾病或并發(fā)癥如PHN的可能性，降低HZ和/或與VZV再活化相關(guān)的其他疾病或并發(fā)癥如PHN的嚴重性或持續(xù)時間。
術(shù)語“治療有效量”是指足以產(chǎn)生所需效果的足夠的疫苗組合物，所述效果包括但不限于:在患者中誘導(dǎo)/增加針對VZV的免疫應(yīng)答，在已經(jīng)感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中防止、改善或消除VZV再活化，防止HZ和/或PHN，降低HZ和/或PHN的嚴重性或持續(xù)時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，這種水平可能變化。術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指細胞介導(dǎo)的(T細胞)免疫應(yīng)答和/或抗體(B細胞)應(yīng)答。術(shù)語“患者”是指待接受本文描述的滅活VZV疫苗或藥物組合物的任何人,包括有免疫能力的和免疫功能低下的個體。如本文所定義的，“患者”包括已經(jīng)感染水痘(通過自然感染或接種疫苗)的那些患者。術(shù)語“容積物”是指包含多于一個劑量的疫苗的液體制劑或組合物。關(guān)于特定疫苗制劑或組合物的感染性的術(shù)語“檢測不到的水平”是指該制劑或組合物包含每mL樣品的050感染單位或噬斑形成單位(“PFU”)的感染性VZV病毒，優(yōu)選<0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL,<0.020 PFU/mL,<0.015 PFU/mL,<0.010 PFU/mL,< 0.009PFU/mL,或 I 0.008 PFU/mL,更優(yōu)選 I 0.007 PFU/mL, < 0.006 PFU/mL, < 0.005 PFU/mL,
<0.004 PFU/mL, < 0.003 PFU/mL，更優(yōu)選 I 0.002 PFU/mL，或 10.001 PFU/mL。可以使用，例如，如 水痘噬斑測定如實施例1中描述和Krah等人ij.Virol.Methods (1990)27:319-26)中進一步描述的測定來確定特定樣品的PFU。也可以通過如實施例1中描述的免疫染色法確認樣品的感染性。附圖簡述


圖1顯示了 Y福射的凍干VZV的滅活動力學(xué)(log PFU/ml v.福射劑量,參見實施例4)。使用6tlCo Gammacell 輻射器用不同水平的6tlCo射線輻射VZV小瓶。在MRC-5細胞中使用水痘噬斑測定確定每輻射劑量(Gy)的每小瓶的剩余的PFU/mL。觀察到的數(shù)據(jù)點顯示為黑色菱形(“觀察值”)，通過測定可測量的最大數(shù)據(jù)顯示為灰色菱形(“〈=值”)。圖2顯示了 Y輻射的VZV容積物的滅活動力學(xué)(針對輻射時間的log pfu/mL滴度，參見實施例4)。使用不同水平的6tlCo射線輻射VZV容積物。使用MRC-5細胞在水痘噬斑測定中分析輻射的容積物的剩余感染性。圖3A-3F顯示了如通過VZV IFNy ELI SPOT測定測量的在不同的條件下滅活VZV后的VZV應(yīng)答(SFC/106 PBMC)(參見實施例5)。顯示的數(shù)據(jù)是對于5份熱處理的VZV容積物制劑和2份Y -輻射的VZV容積物制劑的6份供體PBMC樣品(圖A-F)。還顯示了對于來自與上文使用的那些相同的容積物制劑的活(未處理)VZV樣品和通過用UV光處理滅活VZV批次(VZV批號96.07)的VZV應(yīng)答。圖4A-4C顯示了如通過冷凍EM評價的VZV病毒顆粒的圖(參見實施例6)。顯示了未處理的(圖4A)、用25 kGy輻射的(圖4B)和用50 kGy輻射的(圖4C)凍干樣品。圖5顯示了小鼠免疫原性研究的結(jié)果，在該研究中，在VZV ELISA測定中評價對于一組使用各種滅活方法(參見實施例8)生成的滅活VZV制劑的VZV滴度(IgG應(yīng)答)。顯示了對于每只小鼠的調(diào)整的VZV滴度(VZV滴度減去MRC-5滴度)連同幾何平均滴度。還顯示了被認為是異常值的來自熱處理凍干組中2只小鼠的結(jié)果。圖6顯示了如實施例9中描述的在接受熱處理VZV疫苗(N = 65)或Y-輻射VZV疫苗(N = 63)的人疫苗受體中通過時間點的VZV gpELISA抗體應(yīng)答的統(tǒng)計學(xué)分析。圖7顯示了如實施例10中描述的在接受Y輻射的VZV疫苗B (16-25 kGy, N =64)或Y輻射的疫苗C(25-50 kGy, N=65)的人疫苗受體中通過時間點的VZV gpELISA抗體應(yīng)答的統(tǒng)計學(xué)分析。發(fā)明詳述
本文已經(jīng)顯示，可以用Y輻射滅活大量或凍干的VZV樣品，使得樣品中的VZV感染性在檢測不到的水平(例如，本文描述的滅活VZV樣品的感染性是10.001 PFU/mL)?？梢詫⒈疚拿枋龅姆椒ㄉa(chǎn)的滅活VZV與藥學(xué)上可接受的載體配制，以產(chǎn)生用于本發(fā)明的治療/免疫方法中的藥物組合物或疫苗。相對于沒有滅活的VZV樣品，在通過本文描述的方法滅活后，VZV的免疫原性和/或抗原性沒有顯著損失并且結(jié)構(gòu)也沒有顯著變化。因此，當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物施用于患者時，與包含相同量的沒有滅活的VZV的對照樣品引發(fā)的免疫應(yīng)答相比，組合物引發(fā)的免疫應(yīng)答沒有顯著不同。如本文所使用的，與未滅活的對照樣品“沒有顯著不同的”滅活樣品引發(fā)的免疫應(yīng)答與對照樣品的差異為約50%或更小，更優(yōu)選約40 %或更小，約30 %或更小，甚至更優(yōu)選約20 %或更小，15 %或更小，10 %或更小，或5 %或更小?？梢栽谂R床試驗中在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ突蛉巳后w中，例如，通過測量以下參數(shù)中的一個或多個而測量滅活和對照樣品引發(fā)的免疫應(yīng)答= (I)VZV特異性應(yīng)答細胞頻率(如Calandra等人，WO 94/002596中描述，(2)抗VZV細胞毒性T細胞(CTL)，或VZV特異性⑶8+細胞，(3)抗VZV輔助T細胞，或VZV特異性⑶4+細胞，(4)抗VZV特異性抗體的水平，或(5)淋巴因子如干擾素或白介素的水平。用于測量免疫應(yīng)答的技術(shù)是本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于:T細胞應(yīng)答測定法，效價測定法，VZV IFN Y ELISP0T測定法，和ELISA測定法。為了確定本發(fā)明的和本文描述的方法制備的疫苗/藥物組合物引發(fā)的免疫應(yīng)答的足夠性、并且還有滅活疫苗的效力，測量人志愿者/受試者的臨床試驗中的臨床結(jié)果以測量，例如，個體中HZ的持續(xù)時間或嚴重性的降低和/或PHN的持續(xù)時間的降低至發(fā)展帶狀皰疹后少于I個月的期間，在患者群體中帶狀皰疹的發(fā)病率的降低，在統(tǒng)計水平上，低于在一般群體中發(fā)現(xiàn)的或同樣在危險中或免疫功能低下的個體的發(fā)病率可能是有用的。如上所述，本發(fā)明顯示可以將VZV制劑滅活至檢測不到的水平，同時仍保留相似非滅活VZV的抗原性和免疫原性。因此，本發(fā)明的一個方面提供了滅活VZV，其中所述VZV的感染性是檢測不到的，其中當(dāng)施用于患者時滅活VZV誘導(dǎo)針對VZV的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用作治療有效量的VZV的適當(dāng)量的VZV抗原。這樣的量將根據(jù)預(yù)期用途或其他因素如特定患者群體而變化。在本文描述的方法和組合物的一些實施方案中，VZV的量是約I至約10 VZV抗原單位/劑量，I VZV抗原單元粗略等同于I μ g純化的VZV蛋白。在特定實施方案中，組合物中存在的VZV抗原的量是約2至約8 VZV Ag單位/劑量，或約3至約6 VZV Ag單位/劑量?？梢杂眠m當(dāng)?shù)目乖瓬y定法，例如，本文實施例2中描述的競爭性ELISA來確定抗原的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定其他適當(dāng)?shù)臏y定法以測量樣品中抗原的量。
本文還提供了藥物組合物，其包含治療有效量的上述滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。用于本發(fā)明的組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括在采用的劑量和濃度對患者無毒的任何相容試劑，如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、緩沖劑等及其組合。載體還可以含有額外組分，如穩(wěn)定劑、增溶劑、等滲調(diào)節(jié)劑，如NaCl、MgCl2或CaCl2等，表面活性劑及其混合物。本發(fā)明還提供了多劑量組合物，其含有多于一個劑量的滅活VZV、抗微生物防腐劑和藥學(xué)上可接受的載體，所述防腐劑防止在引入注射器后對包含組合物的小瓶的無意的微生物污染。可以將這樣的多劑量組合物在預(yù)定量的時間已經(jīng)經(jīng)過后多于一次提供給一位患者，或提供給多于一位患者。在本發(fā)明的一些實施方案中，組合物是液體容積物，其含有多于一個劑量的滅活VZV0在可替代的實施方案中，組合物是凍干的。凍干方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還涵蓋的是用適當(dāng)稀釋劑如注射用無菌水或注射用抑菌水重構(gòu)的凍干制劑。Y輻射通常用于對用于醫(yī)療應(yīng)用中的裝置和設(shè)備消毒。它也可以用于殺死生物制品如血液產(chǎn)品和抗體制劑中任何潛在的病原體。對于這些用途，滅活生物體而不考慮維持生物體的功能。描述通過Y 輻射滅活病毒的文獻來源是有限的。Rosen 等人(7/ .J.Racliat.Biol.52:795-804 (1987))評價了在 6ciCo 射線處理后單純皰疹病毒完整病毒顆粒的噬斑形成能力的存留和純化的基因組的DNA分子的損傷。該研究沒有評價輻射后病毒的抗原性或免疫原性。由Elliott等人的另一項研究(J.Clin.Micobiol.16:704-708 (1982))評價了用 6ciCo 射線對拉沙熱病毒(Lassa)、馬爾堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola)的滅活。對于拉沙熱病毒、埃博拉病毒和馬爾堡病毒觀察到滅活的線性動力學(xué)，并且通過使用6tlCo射線的Y輻射實現(xiàn)了病毒滅活。Elliott等人觀察到，與液體狀態(tài)相比，對于在冷凍狀態(tài)下滅活病毒需要更大劑量的輻射。如Rosen等人，該研究未能確定Y輻射后病毒的抗原性或免疫原性。Alsharifi等人(W02010/012045)描述了使用Y輻射來滅活流感病毒(來自正粘病毒科的RNA病毒)來作為疫苗。在本文描述的發(fā)明中顯示，Y輻射可以將VZV病毒制劑的感染性降低到檢測不到的水平，同時保留了未滅活對照的抗原性、免疫原性和結(jié)構(gòu)特征。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過Y輻射將VZV滅活，可以通過暴露于適當(dāng)同位素，如6°Co、137銫、99锝或99mTc而將Y輻射遞送至VZV。在優(yōu)選的實施方案中，通過暴露于6tlCo射線而將Y輻射遞送至VZV。用于滅活VZV的Y輻射的量是約5至約50千戈瑞(kGy)的Y輻射。戈瑞(Gy)是吸收劑量的標準單位，I戈瑞等于I焦耳/千克(100拉德)的吸收劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，應(yīng)改變暴露于樣品的輻射量和時間量以達到期望的輻射吸收劑量(劑量=積分通量(Huence)X時間)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠根據(jù)樣品存儲于其中的容器的大小改變樣品暴露的輻射量，使得將適當(dāng)?shù)妮椛鋭┝窟f送至整個樣品，而不過度暴露樣品部分，例如，最接近放射性源的部分。在本文描述的本發(fā)明的方法和組合物中的一些實施方案中，用于滅活VZV的Y輻射量是約25kGy或更低。在可替代的實施方案中，Y輻射量的范圍是約5 kGy至約40 kGy,約 5 kGy 至約 35 kGy,約 5 kGy 至約 30 kGy,約 5 kGy 至約 25 kGy,約 5 kGy 至約 20 kGy,約 5 kGy 至約 10 kGy,約 10 kGy 至約 50 kGy, 10 kGy 至約 40 kGy,約 10 kGy 至約 35 kGy,約 10 kGy 至約 30 kGy,約 10 kGy 至約 25 kGy,約 10 kGy 至約 20 kGy,約 15 kGy 至約 50kGy,約 15 kGy 至約 40 kGy,約 15 kGy 至約 35 kGy,約 15 kGy 至約 30 kGy,約 15 kGy 至約25 kGy，約 15 kGy 至約 20 kGy。
本發(fā)明還提供了如上所述的藥物組合物和產(chǎn)生所述組合物的方法，其中所述組合物是液體容積物，用于滅活VZV的Y輻射量是約5kGy至約IOkGy,或約5kGy約12.5kGy。在其他特定實施方案中，組合物在Y輻射前是凍干的，在這樣的實施方案中，Y輻射量是約5kGy至約25kGy或約15kGy至約25kGy。本文顯示,對于用Y福射滅活的VZV觀察到線性滅活動力學(xué),這對于允許構(gòu)建滅活模型，即可靠地估計包含滅活VZV的樣品中的剩余感染性的水平具有顯著益處。對于熱處理滅活VZV沒有觀察到這樣的線性滅活動力學(xué)。kieb等:K ^iologicals (2002)30:207-216和沿OfflaieriaJ1S (2005) 26:2033-2042)描述了通過Y輻射滅活病毒的兩種特定機制，其支持對于VZV觀察到的線性滅活動力學(xué)。第一種機制是“光子將能量沉淀進目標的直接結(jié)果”。這種直接能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致“外層電子從分子的錯位和共價鍵斷裂”。第二種“間接”機制是通常通過輻射與水分子和氧的相互作用產(chǎn)生的對自由基和活性氧種類的化學(xué)攻擊的結(jié)果。在本文描述的組合物和方法的特定實施方案中，在用Y輻射滅活前凍干VZV;因此，不可能與水分子有太多相互作用，因為水在凍干過程中已從產(chǎn)物中除去。Redman 等人 ij.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通過加熱至50°C而滅活的并導(dǎo)致 1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的滅活VZV疫苗。顯示Redman及其同事們描述的熱處理疫苗在安排經(jīng)歷自體BMT或外周血干細胞輸注或其他BMT的24位患者中降低了與VZV再活化相關(guān)的疾病嚴重性。該感染性水平不適合于所有患者，如免疫功能低下的那些患者。此外，使用熱處理滅活VZV的方法需要很長時間期間以達到低水平的感染性，這是低效的并且不是成本合算的。為此，本發(fā)明提供了滅活VZV和包含所述滅活VZV的藥物組合物/疫苗，其中所述VZV的感染性是檢測不到的水平，即 ο.050 PFU/mL，與以前公開的疫苗相比，所述滅活VZV組合物對于治療和/或預(yù)防HZ或與VZV再活化相關(guān)的疾病更安全，且適合于更高效的生產(chǎn)過程。本發(fā)明的滅活VZV在滅活后保留了未滅活VZV對照的結(jié)構(gòu)物理特征、免疫原性和抗原性。在一些實施方案中，感染性為 0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL或020 PFU/mL。本發(fā)明還提供了實施方案，其中感染性單位數(shù)為 Ο.015 PFU/mL, <0.010 PFU/mL,< 0.009 PFU/mL或￡ 0.008 PFU/mL。在可替代的實施方案中，VZV感染性為￡ 0.007 PFU/mL, < 0.006PFU/mL, < 0.005 PFU/mL, < 0.004 PFU/mL 或 I 0.003 PFU/mL。在另外可替代的實施方案中，感染性為 <0.002 PFU/mL 或 <0.001 PFU/mL。在本文提供的組合物和方法的一些實施方案中，使用水痘噬斑測定如實施例1中描述和Krah等人(J.Virol.Methods (1990) 27:319-26)中進一步描述的測定來確定樣品的感染性(PFU)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，其他方法也用于確定VZV樣品或組合物的感染性，并且可用于代替水痘噬斑測定。任何VZV株可以用于本文描述的組合物和方法中，包括野生型水痘株，或減毒株如Oka毒株，如美國專利3，985，615中描述并且可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號VR-795 , ATCC, Manassas, VA)獲得的。Oka毒株最初從一位具有自然水痘感染的健康男孩獲得并在人胚肺細胞中傳代。 它適應(yīng)于在豚鼠胚細胞培養(yǎng)物和人二倍體肺成纖維細胞培養(yǎng)物(例如MRC-5細胞)中生長。在本文描述的組合物和方法的優(yōu)選實施方案中，VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物,如Oka/Merck VZV毒株。如本文使用的,“Oka毒株衍生物”是通過以下過程獲得的毒株:將Oka毒株在適合細胞類型中進一步傳代以充分使毒株減毒，以便可用作，例如，活減毒疫苗。在本文描述的本發(fā)明的方法和組合物中，在施用于患者前用Y輻射滅活活或減毒的VZV如Oka毒株及其衍生物。本文還提供了制備滅活VZV的方法,所述方法包括用約5kGy至約50kGy的Y福射來Y輻射包含VZV的樣品。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，通過將樣品暴露于6tlCo射線而將Y輻射提供給樣品。在本發(fā)明的該方面的特定實施方案中，Y輻射量是如上討論的。本發(fā)明還提供了通過本文描述的方法產(chǎn)生或獲得的滅活VZV。另外提供了疫苗，其包含治療有效量的通過本文描述的方法產(chǎn)生的滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體。在一個方面，本發(fā)明還提供了用于在患者中治療、預(yù)防帶狀皰疹和/或與VZV再活化相關(guān)的其他疾病或并發(fā)癥(例如皰疹后神經(jīng)痛)、針對其免疫或降低其可能性的方法，所述方法包括將治療有效量的疫苗或藥物組合物施用于患者，所述組合物包含滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述VZV是通過Y輻射滅活的。由于VZV再活化與細胞介導(dǎo)的免疫力下降相關(guān)，本文的治療方法可用于在患者中加強細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述患者以前通過自然感染或接種疫苗暴露于水痘，但其免疫應(yīng)答由于年齡漸增和/或免疫系統(tǒng)功能障礙而已經(jīng)降低。在上述的治療/免疫方法中，可以通過任何合適途徑，包括但不限于下列方式，將包含滅活VZV的藥物組合物施用于患者:皮下注射、皮內(nèi)引入、通過皮膚壓入(impressionthough the skin)或其他施用方式如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或吸入遞送。在本文描述方法的優(yōu)選實施方案中，施用模式 是皮下或肌肉內(nèi)。上面描述的方法和組合物可用于在免疫活性和免疫功能低下的患者群體中預(yù)防HZ和/或PHN，或減少其嚴重性或持續(xù)時間，所述免疫活性和免疫功能低下的患者群體包括但不限于已經(jīng)經(jīng)歷造血干細胞移植(HCT)或?qū)嶓w器官移植(SOT)的健康患者和免疫功能低下的患者，HIV感染的患者，患有自身免疫性疾病的患者，患有血液癌癥的個體；接受跨越廣泛范圍的實體腫瘤惡性腫瘤的化療的個體；接受跨越廣泛范圍的病狀(包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、克羅恩氏病、牛皮癬和多發(fā)性硬化癥)的長期免疫抑制治療的患者。在本文描述方法的一些實施方案中，將滅活VZV疫苗施用于患者,所述患者處于由于疾病(例如，上文提到的疾病)導(dǎo)致的HZ的更高風(fēng)險，或疾病(如血液惡性腫瘤、實體腫瘤惡性腫瘤或化療、自身免疫性疾病)的治療中。在上面描述的任何方法和組合物的一些實施方案中，患者是50歲大或50歲以上，并且可以是健康或免疫功能低下的。在其他實施方案中，患者是55歲大或55歲以上，60歲大或60歲以上，65歲大或65歲以上，70歲大或70歲以上，或75歲大或75歲以上。在可替代的實施方案中，患者是約50至約55歲大，約55至約60歲大，約60至約65歲大，或約65至70歲大。在本文描述方法的另外實施方案中，疫苗或藥物組合物與其他通常施用的“護理標準”療法；或與其他用于靶向患者群體的疫苗(包括，例如，肺炎球菌疫苗如PNEUM0VAX 23 (PN23, Merck & C0., Inc.)、乙型肝炎(HBV)疫苗如 RECOMBIVAX HB 或 ENGERIX-B (GlaxoSmithKline Biologicals)和流感疫苗)伴隨地施用。在本文提供的治療/預(yù)防方法的特定實施方案中，所述方法進一步包括允許適當(dāng)預(yù)定量的時間經(jīng)過，并將一個或多個額外劑量的藥物組合物施用于患者。在所述實施方案中，可以在已經(jīng)經(jīng)過適當(dāng)量的時間后將一個額外劑量施用于患者，可替代地，兩個、三個或四個額外劑量，每個在已經(jīng)經(jīng)過適當(dāng)量的時間后施用。在一個示例性實施方案中，將3或4個劑量作為給藥方案的部分施用于患者，所述給藥方案在一段時間正確分開。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，劑量之間的時間量可能根據(jù)患者群體、疫苗劑量和/或患者依從性而變化。在一個示例性實施方案中，在將每個劑量施用于患者之間允許經(jīng)過約3周、約I個月、約6周、約2個月或約3個月或更長的時間期間。在一個特定實施方案中，將疫苗施用于患者，所述患者在移植前(例如，移植前3周、I個月或2個月)經(jīng)歷移植，并且將額外一個或多個劑量在移植后適當(dāng)時間(例如，移植后3周、I個月或2個月)給予患者，每個劑量之間經(jīng)過預(yù)定量的時間。本文提到的所有出版物通過引用并入，其目的為描述并公開可以與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的方法和材料。本文任何內(nèi)容均不被解釋為承認本發(fā)明無權(quán)憑借先前發(fā)明早于這樣的公開內(nèi)容。已經(jīng)參照附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于那些精確實施方案，并且在不背離如隨附權(quán)利要求定義的范圍或精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其中影響各種變化和修改。下列實施例說明但非限制本發(fā)明。材料和方法 實施例1 水痘噬斑測定
用Krah等人(7； Virol Methods (1990) 27:319-326)描述的液體覆蓋操作測量水痘帶狀皰疹病毒(VZV)制劑的感染性滴度。如下進行測定:以600，000細胞/5 mL體積的具有100 mg/L半乳糖、50 ug/mL新霉素、2 mM L-谷氨酰胺的BME (具有Hank氏平衡鹽溶液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle)將MRC-5 (人二倍體肺成纖維細胞)細胞接種在60_mm組織培養(yǎng)板中，并在5% 土 1% CO2潮濕氣體中在35土 1°C孵育。孵育24-56小時后，細胞達到50-80%匯合，并用于噬斑測定。通過抽吸除去細胞生長培養(yǎng)基，用在適當(dāng)稀釋劑如PGS穩(wěn)定劑(具有蔗糖和水解明膠的PBS)中稀釋的VZV溶液的100 μ L等分試樣感染細胞。允許細胞在5% 土 1% CO2潮濕氣體中在35土 1°C貼壁彡I小時。然后將用5mL體積的維持培養(yǎng)基(具有Earle氏鹽的最低必需培養(yǎng)基(MEM)，2 %熱滅活的胎牛血清，50Pg/mL新霉素和2 mML-谷氨酰胺)覆蓋培養(yǎng)物，并返回在5% 土 1% CO2潮濕氣體中在35土I °C孵育6-7天用于噬斑產(chǎn)生。然后從板抽吸培養(yǎng)基，通過用在乙醇、I %乙酸中0.2% (w/v)考馬斯亮藍R-250的溶液染色細胞而使噬斑可視化。噬斑計數(shù)為3-5塊重復(fù)板的平均值，并乘以稀釋系數(shù)(測試病毒的相應(yīng)稀釋度的倒數(shù))和接種體積校正因子(10，從0.1mL調(diào)整至I mL),以提供曬斑形成單位/mL(PFU/mL)。鑒于迫切需要確信不存在滅活樣品的假陽性PFU結(jié)果(其中由于單層的無意刮傷或由于存在細胞聚叢，噬斑樣點可能出現(xiàn)在用于噬斑測定的細胞單層中)，開發(fā)免疫染色方法并應(yīng)用以驗證計數(shù)為斑塊的灶(foci)確實是VZV感染的細胞灶(VZV噬斑)。簡而言之，在標準噬斑測定中用考馬斯亮藍染色后，具有可見噬斑的培養(yǎng)物用在PBS，0.05% Tween20中稀釋的多克隆抗VZV血清孵育，并在35°C孵育I小時。細胞用PBS，0.05% Tween 20洗滌以去除未結(jié)合抗體，使 用過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG抗體和當(dāng)與過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)生沉淀物的過氧化物酶底物(二氨基聯(lián)苯胺溶液)檢測結(jié)合的抗體。在含有VZV的灶周圍發(fā)生棕色沉淀物，除了用考馬斯亮藍染料觀察到的那些之外沒有檢測到任何額外噬斑。因此,使用抗VZV —級血清、過氧化物酶綴合的抗一級種類抗體和過氧化物酶底物的組合的這種免疫染色方法提供了驗證滅活樣品中疑似噬斑是否確實代表剩余的感染性VZV的方法。實施例2
競爭性VZV抗原ELISA和直接結(jié)合VZV抗原ELISA測定
使用兩種抗原測定形式表征并定量VZV抗原。在選擇研究中使用競爭性抗原ELISA，其模擬用于估計VZV商業(yè)化產(chǎn)品中的VZV抗原的測試并利用單一多克隆血清來檢測VZV抗原。為了提供Y輻射或其他滅活處理后VZV抗原的反應(yīng)性的額外表征，開發(fā)并應(yīng)用直接結(jié)合ELISA，其中將測試樣品直接吸附至微量滴定ELISA板，然后使用單克隆或多克隆抗體檢測。用于VZV抗原定量的競爭性ELISA
簡而言之，通過將來自測試樣品的VZV抗原與固定量的多克隆抗VZV血清在溶液中孵育而進行該測定。允許剩余的游離抗體(未結(jié)合抗原)結(jié)合至在ELISA微量滴定板上固定的標準VZV抗原。能夠結(jié)合板的抗體的量與測試樣品中的抗原量成反比。通過與酶聯(lián)抗人抗體和適當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)以提供分光光度法定量的有色產(chǎn)物而定量結(jié)合板的抗體。測試程序包括以下步驟:(I)用來自VZV感染或未感染的MRC-5細胞的糖蛋白(gps)包被ELISA板，并用1% (w/v)牛血清白蛋白過量包被以降低抗體非特異性吸附至板。
(2)測試VZV抗原 稀釋在聚丙烯微管中的PGS穩(wěn)定劑中。包括已知抗原滴度的VZV抗原制劑作為對照。樣品通常通過系列1: 1.25倍稀釋而稀釋以包括范圍為2.6至0.9抗原單位/mL的抗原濃度。使用VZV標準品的稀釋系列來生成用于測量測試樣品中抗原的標準曲線。
(3)人抗VZV血清稀釋在PGS穩(wěn)定劑中至期望的最終稀釋度的2倍。(4)將300μ 體積的稀釋抗原分配進聚丙烯微管中，與300 PL稀釋的抗VZV血清混合，并在35-37°C孵育15-30分鐘。使用抗VZV血清加稀釋劑(無抗原)作為對照。(5)將來自每份血清-抗原混合物(和對照)的100 μ 整分試樣加入2個一式兩份的VZV gp包被孔和2個MRC-5 gp包被孔中。(6)板在35-37°C孵育15-30 min以允許游離抗體(未與溶液中的測試抗原復(fù)合)結(jié)合在板上固定的gp抗原。(7)通過洗滌除去未結(jié)合抗體，并且孔接受堿性磷酸酶綴合的山羊抗人IgG抗體溶液以檢測結(jié)合的人抗體。(8)在35-37°C孵育15-30 min后，通過洗滌除去未結(jié)合的綴合物。通過在35-37°C與對硝基苯基磷酸鹽底物孵育10-15 min而檢測結(jié)合的綴合物。(9)通過加入50 μ 3 M NaOH而終止底物反應(yīng)后，用微孔板分光光度計定量顯色(在405nm處的0D)。測試計算和解釋包括以下步驟:(I)對重復(fù)的VZV和MRC-5 gp包被孔的各自重復(fù)的OD值取平均值。根據(jù)經(jīng)驗已知，MRC-5 OD在不同的樣品和稀釋物之間是一致的。因此，通常對測試的整個組的MRC-5 gp OD值取平均值，并用來校正一級抗體的非特異性結(jié)合(抗VZV血清)。從各自平均的VZV gp OD減去平均的MRV-5 gp OD以提供VZV特定(Λ 0D)值。(2)產(chǎn)生用于測量抗原量的標準曲線:將標準曲線△( 值針對已知抗原濃度(VZV抗原單位/mL)作圖。將數(shù)據(jù)輸入適當(dāng)?shù)膱D形程序中，鑒定該曲線的線性部分，獲得對于該線性曲線的“線性擬合公式”(y=a+bx)。(3)計算測試樣品的抗原量:因為由線性擬合公式給出了 a和b的值并且y (AOD)是已知的，然后可以計算代表單位/mL抗原的未知值X，并通過樣品稀釋度校正以獲得原始(未稀釋)測試樣品的抗原濃度。報道的抗原濃度是用提供標準曲線的線性部分內(nèi)的AOD值的最低稀釋樣品獲得的值。直接結(jié)合VZV抗原ELISA
簡而言之，通過在96孔微量滴定板中孵育來自測試樣品的VZV抗原的稀釋液以固定抗原并隨后用單克隆或多克隆抗VZV抗體檢測結(jié)合的抗原而進行該測定。通過與酶聯(lián)的抗適當(dāng)種類抗體和適當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)以提供分光光度法定量的有色產(chǎn)物而定量結(jié)合的抗VZV抗體。然后比較樣品的OD與稀釋度相比的滴定曲線(定量為滴定曲線之間的倍數(shù)稀釋差異(“曲線移位”)。測試程序包括以下步驟:(I)用200 μ I在PBS中1:20至1:2560的系列2倍稀釋的稀釋的抗原(疫苗)包被高結(jié)合ELISA板。覆蓋所述板，并在2-8°C存儲過夜。(2)倒出來自步驟#1的液體，并且板用PBS + 0.05% Tween 20沖洗3次。除去最后沖洗液并加入稀釋的抗體(100 μ /孔)。板在35 °C孵育I小時。(3)倒出來自步驟#2的液體，并且所述板用PBS + 0.05% Tween 20沖洗3次。除去最后沖洗液并加入稀釋的綴合物(100 μ I/孔)。板在35°C孵育I小時。(4)倒出來自 步驟#3的液體，并且所述板用PBS + 0.05%Tween 20沖洗3次。除去最后沖洗液并加入底物(未稀釋)。然后板在35°C孵育30min。
(5)用NaOH終止反應(yīng)。(6)通過在405nm處讀板測定光密度(OD)。用于該實驗的抗體如下:針對gE (Biodesign目錄# mab8612)、gB (Chemicon目錄 #C05102M, Millipore Corp., Billerica, MA)和 gH (Biodesign 目錄 #C05104M和 Virusys 目錄 #VA033_100, Virusys Corp., Taneytown, MD)的 EPP 血清和純化的單克隆抗體。使用的綴合物是抗人IgG(BioSource目錄# AH10305, Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA)或山羊抗小鼠 IgG (Pierce 目錄 # 31322, Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL)。使用喊性憐酸酶 pNPP (Sigma 目錄 #p7988, Sigma-Aldrich C0., St.Louis, MO) IOOmL 作為底物。實施例3
VZV IFNy ELISP0T 測定
簡而言之，范圍為I至0.125 VZV抗原單位/mL的測試抗原的連續(xù)稀釋液與來自6位供體的PBMC在一式兩份孔中孵育。孵育后，通過其產(chǎn)生干擾素Y的能力鑒定對VZV抗原應(yīng)答的細胞。使用在微量滴定板上包被的小鼠抗干擾素Y和匹配的二級抗小鼠IgG酶綴合的抗體和底物，導(dǎo)致干擾素Y產(chǎn)生細胞(“斑點”)周圍的沉淀底物的檢測，從而檢測干擾素Y產(chǎn)生。通過自動ELISP0T讀數(shù)器定量斑點形成細胞(SFC:形成表明干擾素Y分泌的斑點的那些)的數(shù)量，并且結(jié)果表示為SFC/106 PBMC。結(jié)果 實施例4
Y輻射的VZV的滅活動力學(xué)。我們以前已經(jīng)測試了熱處理作為滅活用作用于免疫功能低下患者的疫苗的凍干VZV的方法，但是發(fā)現(xiàn)，該方法導(dǎo)致病毒制劑的剩余感染性(見下文)。據(jù)認為，該剩余感染性不是“滅活”疫苗的最佳特征。實現(xiàn)了液體容積物疫苗相對于凍干疫苗更廣泛的滅活，但是測定容積物疫苗的熱處理無法提供最佳的制造過程。因此，研究使用Y輻射6tlCo的用于凍干的水痘帶狀皰疹病毒疫苗(Oka/Merck)的可替代的滅活方法，以觀察是否可以鑒定比熱處理更廣泛的感染性滅活(產(chǎn)生更有利更安全的特征)方法。本評價的目標首先是確定是否可以通過6tlCo輻射實現(xiàn)更廣泛的感染性滅活，并且然后其次，Y輻射后實現(xiàn)的抗原特性是否不同于熱處理材料的抗原特性，并且對于臨床應(yīng)用研究是否是接受的。使用 1、2、3、
4、5、6、7、8 kGy (2007)或 0.45、1.35 和 2.7 kGy 輻射 VZV 小瓶。使用 60Co Gammacell 輻射器(Best Theratronics Ltd.Corporation, Ottawa, Ontario, Canada)進行福射。使用在MRC-5細胞中的水痘噬斑測定確定每輻射劑量(Gy)的每小瓶的剩余PFU/mL。將log PFU/mL針對輻射劑量作圖，并且數(shù)據(jù)點顯示滅活的線性回歸(圖1)。動力學(xué)研究后，我們測試了 IOOmL用達12kGy的6tlCo射線輻射的滅活VZV疫苗(滅活且凍干的)以允許進一步確認滅活程度(通過測試更大的總體積)。在IOOmL樣品中檢測到零個噬斑。此外，使用6tlCo射線輻射VZV容積物。解凍容積物并等分在PETG瓶中用于在0.5、
1、2、3、4、5、6 kGy輻射(圖2)。使用MRC-5細胞在水痘噬斑測定中分析輻射的容積物的剩余感染性。在IOOmL福射的容積物中檢測到零個曬斑。通過將log pfu/mL針對福射時間作圖而觀察到線性滅活動力學(xué)。實施例5
通過VZV IFNy ELISP0T測定評價免疫原性
為了評價不同滅活方法對免疫原性的影響，使用6份供體外周血單核細胞(PBMC)樣品如實施例3中描述進行VZV IFNy ELISP0T測定。進行該研究以確定VZV在不同條件下滅活后IFN- Y應(yīng)答是否減弱。測試5份熱處理的VZV容積物制劑連同2份Y -輻射的VZV容積物制劑。熱處理的VZV制劑由在下列條件下處理的樣品組成:(I) 40°C持續(xù)24小時，
(2)451:持續(xù)3. 5小時，(3) 451:持續(xù)4.5小時，(4) 56°C持續(xù)30分鐘，和(5) 56°C持續(xù)90分鐘。Y輻射的樣品由在5.92 kGy Y輻射3或4個小時的VZV容積物組成。還測試來自與上文用于產(chǎn)生滅活樣品的那些相同的容積物制劑的活(未處理)VZV樣品用于比較。還包括通過用UV光處理而滅活的大量VZV，以ELISP0T抗原(VZV批號# 96.07)作為測定運行對照，連同PHA(陽性對照)和媒介物(陰性對照)?？缭?:40至1:320的系列2倍稀釋評價所有抗原。進行測試6份PBMC樣品的一次測定運行，所述6份PBMC樣品被選擇以代表一定范圍的VZV應(yīng)答水平。獲得的VZV斑點計數(shù)(SFC/106 PBMC)顯示于圖3A_F中。沒有任何證據(jù)提示在測試的供體中滅活的抗原制劑與未處理的抗原制劑相比的VZV應(yīng)答的差異。也沒有在特定稀釋水平在制劑(處理)和應(yīng)答之間的顯著相互作用的證據(jù)。相對于活VZV制劑，在ELISP0T計數(shù)中對于8份滅活VZV制劑(包括原始VZV批次#96.07)的倍數(shù)差異的范圍為相對于活VZV制劑的1.15倍更低(56°C持續(xù)90分鐘)至1.14倍更高(40°C持續(xù)24小時；批次#96.07)。相對于活VZV制劑，在測試的供體中，8份滅活VZV制劑都沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著更低的ELISP0T計數(shù)。因此，人ELISP0T測試顯示，使用來自一組供體的PBMC，對于通過不同程序(容積物的401:、451:、561:熱處理或Y射線)滅活的VZV制劑，在應(yīng)答中沒有顯著性差異。實施例6
滅活VZV疫苗的電子顯微鏡分析
進行熱處理和Y輻射的容積物和凍干疫苗的EM分析以提供滅活對滅活VZV制劑的影響的額外表征。選擇的分析方法是在玻璃冰中的冷凍透射電子顯微鏡(冷凍TEM)，所述玻璃冰用于在EM分析期間最佳保持病毒完整性。通過NanoImaging Services, Inc (SanDiego, CA)進行冷凍 TEM。制備滅活VZV樣品用于EM分析以評價滅活對顆粒完整性/外觀的影響。用700 μ L滅菌蒸餾水使凍干樣品再水化，并在成像前沒有進一步稀釋。樣品保存在400目銅網(wǎng)上
2.0x0.5 um C-平面多洞碳膜(Protochips, Inc., Raleigh, NC)上支持的玻璃冰的薄膜中。臨使用前在Solarus等離子體清洗器(10秒，25% O2, 75% Ar)中清洗網(wǎng)格。通過將一滴Γ3 μ L)樣品懸浮液施加到等離子體清洗的網(wǎng)格，用濾紙吸去，并立即用FEI Vitrobot (4C, 95% RH)在液態(tài)乙烷中玻璃化處理而制備所有樣品。網(wǎng)格存儲在液氮下，直到被轉(zhuǎn)移至電子顯微鏡用于成像。使用配備FEI Eagle 4K x 4K CC相機(FEI公司)在120 KeV操作的FEI Tecnai T12電子顯微鏡(FEI公司，Hillsboro, OR)進行電子顯微鏡分析。以多標尺獲得每個網(wǎng)格圖像以評價樣品的總體分布。在鑒定用于以低放大率成像的目標區(qū)域后，獲得更高放大率圖像對。使用Nanolmaging系統(tǒng)儀器(21K-52K放大率)評價樣品。比較未處理的凍干VZV、在56°C熱處理77天的凍干VZV和使用6ciCo源輻射至25或50 kGy的凍干VZV。
冷凍M結(jié)果表明在高Y輻射劑量的潛在的顆粒影響，具有電子密度的降低(也許反映了病毒DNA的降解)，但對于凍干樣品的整體顆粒和蛋白外觀沒有顯著影響。然而，凍干可以保護免于這些變化，因為凍干滅活樣品顯示出電子密度的損失，但在更高劑量時顆粒保持完整。(參見圖4)。實施例7 抗原反應(yīng)性的測定
使用針對VZV gB、gH、gE的人多克隆血清和單克隆抗體(mAb)作為檢測抗體進行VZVAg ELISA測定以確定熱或Y輻射滅活的容積物樣品或Y輻射的凍干VZV的抗原(Ag)含量。Y輻射的容積物或凍干樣品顯示抗原反應(yīng)性沒有變化。然而，在56°C熱處理90分鐘的樣品顯示與多克隆、gE和gH單克隆抗體的抗原反應(yīng)性的變化。在25kGy和50kGy Y輻射額外的VZV容積物樣品以支持使用50kGy作為用于最終滅菌的暴露上限。在與針對gpE、gB和gH的多克隆抗VZV血清和mAb的直接結(jié)合抗原ELISA測定中測試這些樣品。y輻射凍干VZV疫苗至滅菌條件(25_50kGy)沒有可檢測地影響抗原與多克隆血清或gE或gB單克隆抗體的ELISA反應(yīng)性。由于高背景染色，使用gH mAb的結(jié)果是不確定的。使用可替代的ELISA板(MaxiSorp)也觀察到用這種單克隆抗體(而不是針對gE或gB的那些)的增加的背景信號。實施例8 小鼠免疫原性
進行小鼠免疫原性研究以評價一組使用各種滅活方法產(chǎn)生的滅活VZV(iVZV)制劑。在VZV ELISA測定中評價從研究產(chǎn)生的血清樣品以確定針對通過不同滅活VZV制劑產(chǎn)生的VZV的抗體的相對滴度。產(chǎn)生并評價兩種不同VZV容積物制劑:(I)在56°C熱處理90分鐘的VZV容積物，和(2)用5，924.7戈瑞(Gy) Y輻射3小時的VZV容積物。還產(chǎn)生并評價兩種不同VZV凍干疫苗制劑:(I)在56°C熱處理50天的凍干的VZV疫苗，和(2)用25，000Gy Y輻射的凍干的VZV疫苗。評價活(未處理)VZV容積物和活(未處理)VZV凍干疫苗用于和iVZV容積物制劑比較。在第O、14和29天用4.5 VZV抗原單位(U) /小鼠(9U/mL)腹膜內(nèi)(1.p.)免疫BALB/c小鼠(對于每組n=16)。在第-1天(采血前)和第13、28和43天采集血液(血清)。在VZV ELISA中評價第28天血清(劑量2后14天)的IgG應(yīng)答。調(diào)整的VZV滴度(VZV滴度減去MRC-5滴度)顯示于圖5中。用來自第28天的相應(yīng)組測試采血前血清以確定對于MRC-5和VZV的滴度截止值。用UV處理的VZV或MRC-5提取物包被ELISA板的孔，然后與測試小鼠血清的稀釋液孵育以定量小鼠血清中對于VZV特異性的抗體的相對量。結(jié)果表明，相 對于未處理的容積物，熱處理容積物的IgG滴度平均為5.57倍更低(95% Cl =(3.45,8.99))，并且Y -輻射容積物的IgG滴度平均為2.43倍更低(95% Cl= (1.51,3.93))。與未處理的凍干病毒相比，熱處理的凍干滴度平均為1.38倍更低(95% Cl=(1.00, 1.90)), Y-輻射的凍干滴度平均為1.66倍更低(95% Cl =(1.22,2.26)) 0與用熱處理容積物免疫后獲得的滴度相比，用Y輻射容積物的抗體滴度平均為2.29倍更高(95% Cl = (1.54，3.41))。與用熱處理凍干制劑免疫后獲得的滴度相比，用Y輻射凍干病毒的抗體滴度平均為1.20倍更高(95% Cl = (0.89, 1.61))?？傮w數(shù)據(jù)支持在這個模型中凍干病毒的Y輻射對免疫原性具有最少的影響。結(jié)果顯示，與未處理的容積物相比，用2個劑量的滅活制劑免疫后在小鼠中的抗體(IgG)應(yīng)答降低。實施例9
將滅活VZV疫苗施用于50至59歲的健康患者。在隨機雙盲2部分多中心研究中將Y輻射VZV疫苗施用于50至59歲大的健康成人，其設(shè)計用于評價疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。本研究的目的是研究通過Y輻射或熱處理方法滅活的疫苗批次的安全性、耐受性和免疫原性。將總共161位50歲至59歲大的健康個體2:2:1隨機化以接受作為4劑量方案給予的16至25 kGy滅活的、輻射的VZV疫苗“A” (n=65)、熱處理VZV疫苗(n=63)或安慰劑(n=33)。相隔約30天施用每個劑量。熱處理疫苗和Y-輻射疫苗“A”源自獨立的容積物批次，但通過針對相似的抗原含量而控制。主要假設(shè)是，在16至25kGy的水平滅活的Y輻射VZV疫苗(A)可以引發(fā)可接受的VZV特異性免疫應(yīng)答，正如在劑量4后28天通過gpELISA所測量的。第二個假設(shè)是，熱處理VZV疫苗可以引發(fā)可接受的VZV特異性免疫應(yīng)答，正如在劑量4后28天通過gpELISA所測量的。成功的統(tǒng)計學(xué)標準對應(yīng)于在熱處理VZV疫苗受體中幾何平均倍數(shù)的上升(GMFR)上兩側(cè)95%置信區(qū)間的下限為〉1.0。在該研究中疫苗受體中的免疫原性結(jié)果提供在圖6中。結(jié)果表明，滿足對于測試主要和第二假設(shè)的成功標準，即當(dāng)施用于健康個體時，Y輻射的VZV疫苗A和熱處理VZV疫苗是免疫原性的。兩種疫苗都具有與安慰劑組的安全性特征類似的安全性特征。實施例10
將用不同水平Y(jié)輻射滅活的VZV疫苗批次施用于50至59歲的健康志愿者。
進行第二項研究以提供關(guān)于用更廣范圍的Y輻射滅活的疫苗批次的臨床數(shù)據(jù)。在本研究中，將總共129位50歲至59歲大的健康個體1:1隨機化以接受作為4劑量方案給予的16至25 kGy輻射的、輻射的VZV疫苗“B”(n=65)或25至50 kGy輻射的、輻射的VZV疫苗“C” (n=65)，相隔約30天施用每個劑量。本研究中使用的疫苗批次B & C源自具有相同VZV抗原含量的相同容積物批次和相同填充物/制劑，但在不同Y輻射水平被滅活。本研究的第一個主要假設(shè)是，在25至50kGy的水平滅活的Y輻射的VZV疫苗(C)可以引發(fā)可接受的VZV特異性免疫應(yīng)答，正如在劑量4后28天通過gpELISA所測量的。第二個主要假設(shè)是，在16至25kGy的水平滅活并且對于抗原含量與在25至50kGy滅活的疫苗匹配的Y輻射的VZV疫苗(B)將引發(fā)可接受的VZV特異性免疫應(yīng)答，正如在劑量4后28天通過gpELISA所測量的。對于每個假設(shè)的成功的統(tǒng)計學(xué)標準對應(yīng)于在Y輻射疫苗受體中GMFR上兩側(cè)95%置信區(qū)間的下限為> 1.0。在該研究中疫苗受體中的免疫原性結(jié)果提供在圖7中。本研究的結(jié)果表明，滿足對于測試主要假設(shè)的成功標準，即當(dāng)施用于健康個體時，Y輻射的VZV疫苗B (16-25 kGy Y輻射)和、輻射的VZV疫苗C (25-50 kGy Y輻射)是免疫原性的。兩個疫苗組具有相似的安全性特征。本研究的結(jié)果還表明，存在基線幾何平均滴度(GMT)的不平衡；B組基線GMT為 313，C組基線(GMT)為 429。盡管倍數(shù)上升差異不顯著，但是基線滴度的差異可能是測試中觀察到的倍數(shù)上升差異的原因。此外，分析數(shù)據(jù)表明，更高的Y輻射劑量(>25 kGy)導(dǎo)致更高的抗原降解。`
權(quán)利要求
1.滅活的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是檢測不到的，并且其中所述滅活的VZV當(dāng)施用于患者時誘導(dǎo)針對VZV的免疫應(yīng)答。
2.藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1的VZV和藥學(xué)上可接受的載體。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述滅活VZV的感染性是 Ο.040噬斑形成單位(PFU)/mL。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述滅活VZV的感染性是i0.0lO噬斑形成單位(PFU)/mL。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述滅活VZV的感染性是 Ο.002噬斑形成單位(PFU)/mL。
6.權(quán)利要求2-5中任一項的藥物組合物，其中所述VZV毒株是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述組合物是凍干的。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述VZV是通過Y輻射滅活的。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中與包含相同量的沒有滅活VZV的對照樣品引發(fā)的免疫應(yīng)答相比，所述組合物弓I發(fā)的免疫應(yīng)答沒有顯著不同。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述滅活VZV引發(fā)的免疫應(yīng)答與所述對照樣品引發(fā)的免疫應(yīng)答的差異為約25%或更小。
11.權(quán)利要求2- 5中任一項的藥物組合物，其中通過水痘噬斑測定來確定所述VZV的感染性。
12.制備滅活的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的方法，所述方法包括用約5至約50kGy的Y輻射來Y輻射包含VZV的樣品。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過將所述樣品暴露于6tlCo射線而將所述Y輻射提供給所述樣品。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述樣品在被輻射前凍干。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中使用的Y輻射量是約25kGy或更低。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述疫苗是液體容積物制劑，并且使用的Y輻射量是約5kGy 至約 12.5 kGy。
18.權(quán)利要求15的方法，其中使用的Y輻射量是約10kGy至約25 kGy。
19.通過權(quán)利要求12-18中任一項的方法產(chǎn)生或獲得的滅活VZV。
20.疫苗，包含治療有效量的權(quán)利要求19的滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體。
21.用于治療受試者中帶狀皰疹的方法，所述方法包括將藥物組合物施用于受試者，所述藥物組合物包含治療有效量的滅活的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述VZV是使用Y輻射滅活的。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述藥物組合物的施用途徑是皮下的或肌肉內(nèi)的。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者是50歲大或更大的。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述受試者是免疫功能低下的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述受試者具有至少一種選自下述的狀況:患有血液惡性腫瘤、經(jīng)歷免疫抑制治療、接受造血干細胞移植、接受實體器官移植、HIV感染和患有自身免疫性疾病。
26.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述方法進一步包括允許預(yù)定量的時間經(jīng)過，并將一個或多個劑量的所 述藥物組合物施用于所述受試者。
全文摘要
本發(fā)明提供了滅活的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和包含所述滅活VZV的組合物和疫苗，其中所述滅活VZV的感染性是檢測不到的，并且其中所述滅活VZV當(dāng)施用于患者時誘導(dǎo)針對VZV的免疫應(yīng)答。在本文描述的組合物的實施方案中，所述VZV是用γ輻射滅活的。本發(fā)明還提供了制備滅活VZV疫苗的方法，所述方法包括用約5kGy至約50kGy的γ輻射來γ輻射包含VZV的樣品。本發(fā)明還提供了治療HZ或與VZV再活化相關(guān)的其他疾病或針對其免疫的方法，所述方法包括將疫苗或藥物組合物施用于受試者，所述疫苗或組合物包含治療有效量的滅活VZV和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述VZV是通過γ輻射滅活的。
文檔編號C12N7/04GK103167880SQ201180046512
公開日2013年6月19日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者D.L.克拉, J.德黑文, J.A.克里斯, C.M.巴, M.亞戈迪奇 申請人:默沙東公司