專利名稱：腺病毒組裝方法
腺病毒組裝方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2010年8月16日提交的美國臨時申請61/374，198的權(quán)益，為了所有目的，該臨時申請全部并入本文。
背景技術(shù)：
有52種人類腺病毒感染不同的人組織，還有上百種腺病毒能夠感染從魚到靈長動物的其他物種。這些病毒是高效的納米級機(jī)器，能夠在感染I小時內(nèi)將它們的遺傳物質(zhì)有效負(fù)載至細(xì)胞核內(nèi)。這些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以產(chǎn)生高滴度的病毒，而且它們在為了表達(dá)異?；蜻M(jìn)行的研究和人類基因治療應(yīng)用中表現(xiàn)很安全。但是，到目前為止，由于使用幾乎只限于一個變種Ad5或Ad2/5嵌合體以及不能快速和系統(tǒng)地構(gòu)建和組合多個基因修飾，它們的潛在應(yīng)用受到了局限。因此，需要將常用的腺病毒載體擴(kuò)展到Ad2/5以外，并且要建立一個技術(shù)平臺來協(xié)助由組成部分快速離體地組裝新的腺病毒基因組，以便能夠系統(tǒng)地引入多個修飾和異源元件。這樣的系統(tǒng)可以利用天然的病毒架構(gòu)在能夠高效運送和表達(dá)36個基因(不包括剪接變體)方面的優(yōu)點。所述系統(tǒng)可以提供有力的診斷劑和治療劑，這些診斷劑和治療劑包含對不同腫瘤樣品中失去調(diào)控的途徑活性的多重和定量測量。腺病毒載體在多種應(yīng)用中的潛力受限于快速和系統(tǒng)地操縱36kb病毒基因組的能力。而且，基礎(chǔ)研究、動物模型、基因治療和溶瘤治療中使用的腺病毒載體只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早發(fā)現(xiàn)的腺病毒之列，因此傳統(tǒng)上有大量載體/工具來操縱它們的基因組，特別是El區(qū)域。Ad2/5纖維蛋白(Fiber proteins)通過結(jié)合受體CAR感染上皮細(xì)胞。不幸的是，不是所有類型的細(xì)胞都表達(dá)CAR，而且CAR在許多轉(zhuǎn)移病例中被下調(diào)。再者，接近80%的人口具有預(yù)先存在的抗Ad2/5的中和抗體，這與脫靶肝攝取和炎癥一起限制了系統(tǒng)性應(yīng)用。因此，使用Ad2/5載體進(jìn)行基因遞送和癌癥治療不一定是最佳選擇，而主要是歷史的偶然事件。我們的最終目的是建立強(qiáng)力的癌癥病毒療法，所述療法不僅能夠進(jìn)行腫瘤選擇性裂解復(fù)制，還可以在多輪治療中進(jìn)行系統(tǒng)地給藥、避免對肝臟的毒性、有效地靶向和穿越令人苦惱的腫瘤血管、經(jīng)由不同的受體感染細(xì)胞、在腫瘤內(nèi)通過前藥活化酶/毒素的局部表達(dá)產(chǎn)生腫瘤旁觀者效應(yīng)并且復(fù)蘇有益的宿主抗病毒免疫反應(yīng)。這些主要挑戰(zhàn)因為人類腺病毒不能在小鼠中復(fù)制而更加嚴(yán)重。這排除了相比異種移植模型有許多優(yōu)勢的在免疫活性癌癥基因工程小鼠模型(GEMMs)中進(jìn)行人溶瘤病毒評價的可能。52種人類腺病毒的存在表明腺病毒高度專性適應(yīng)不同宿主組織環(huán)境中的感染和復(fù)制。這些病毒中的許多可以感染不同組織，并且含有能夠結(jié)合除CAR之外的細(xì)胞受體的纖維蛋白以及一群不同的‘E3’免疫調(diào)節(jié)基因。由于缺少修飾它們的基因組所需要的工具，對它們的這些獨特屬性還沒有廣泛的研究或利用。類似地，還存在感染其他物種的腺病毒，包括鼠腺病毒(M AV-1)。本文提供了對現(xiàn)有技術(shù)中的這些和其他問題的解決方案。發(fā)明概述
本發(fā)明一方面提供了制備重組腺病毒的方法(文中又稱為“Adsembly”)。所述方法包括由兩個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸，所述模塊選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊(maciOmodule)(或者如下文描述的突變體)。本發(fā)明另一方面提供了包含復(fù)數(shù)個腺病毒基因模塊的文庫。本發(fā)明另一方面提供了實施本文提供的方法的試劑盒。附圖簡述

圖1.現(xiàn)有腺病毒載體方法和Adsembly的比較列表。Adsembly克服了現(xiàn)有系統(tǒng)中的多個限制。圖2.進(jìn)一步開發(fā)腺病毒作為治療劑所需要克服的挑戰(zhàn)。簡圖表明了該領(lǐng)域需要克服的幾個主要問題。圖3.列舉了四種不同腺病毒屬的系統(tǒng)發(fā)生樹。沒有列出所有已知腺病毒。該圖展示了腺病毒家族中的種類多樣性。圖4.52種已知的人腺病毒的受體和向性。受體和向性在血清型和亞型之間有所不同，因此可以利用這一點來重新靶向某些病毒。圖5.腺病毒各屬中保守的“核心”基因組區(qū)。頂端的圖是人Ad5基因組(SEQ IDNo: 137)的簡化圖譜，其中的核心區(qū)以虛線框強(qiáng)調(diào)。正如下端圖中圍繞基因的白框表明的，該核心區(qū)在所有腺病毒屬中保守。所有屬都含有該核心區(qū)，并且?guī)缀跞康暮诵拈_放讀框都是從IVa2(左端)到pVIII (右端)?；蚪M的多變性存在于基因組的末端。申請人將我們的模塊名稱劃分為El模塊(文中又稱為El樣模塊)(條帶指示的核心區(qū)左側(cè)的全部)、核心模塊(條帶指示的)和E·3模塊(文中又稱為E3樣模塊)(條帶指示的核心區(qū)右側(cè)的全部)，因為模塊內(nèi)容在不同腺病毒種類之間會有所變化，但它們相對核心區(qū)的位置不會變。一些情況中，纖維(fiber)緊挨著核心區(qū),而在其他(人Ads)中位于核心區(qū)之外。圖6.多種腺病毒屬的轉(zhuǎn)錄圖譜，顯示了腺病毒種類之間的保守轉(zhuǎn)錄單位。顯示了核心基因，以及在一或兩個屬中可以看到的基因。該圖可以看出不同屬之間基因組末端的多樣性。這里引用的〃Davison, Benko, Harrach〃是指 Be.nk0 M et al., (2005)FamilyAdenoviridae.Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA(eds): VirusTaxonomy.VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.Elsevier,New York pp213_228。圖7A-7C.SEQ ID NO: 32給出的人Ad5聚合酶蛋白中氨基酸966-1103 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個聚合酶蛋白中的相應(yīng)區(qū)域的比對。每個非人Ad序列在與該Ad5聚合酶序列進(jìn)行分別比較時，該區(qū)域內(nèi)至少45%相同。左側(cè)的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應(yīng)SEQ ID NO: 1-32 圖7D-7G.SEQ ID NO: 73給出的人Ad5六鄰體蛋白(hexon protein)中氨基酸501-747 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個六鄰體蛋白中的相應(yīng)區(qū)域的比對。每個非人Ad序列在與Ad5六鄰體序列進(jìn)行分別比較時，該區(qū)域內(nèi)至少45%相同。左側(cè)的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應(yīng)SEQ ID N0:33_73。圖7H-71.SEQ ID NO: 103給出的人AdOTNA結(jié)合蛋白中氨基酸408-475 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個DBPs中的相應(yīng)區(qū)域的比對。每個非人Ad序列在與AdOTBP序列進(jìn)行分別比較時，該區(qū)域內(nèi)至少35%相同。以黃色標(biāo)識的殘基在各物種之間是100%保守的。左側(cè)的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應(yīng)SEQ ID NO: 74-103。圖7J.SEQ ID NO: 135給出的人Ad5pVIII蛋白中氨基酸6-43 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個pVIII蛋白中的相應(yīng)區(qū)域的比對。每個非人Ad序列在與Ad5pVIII序列進(jìn)行分別比較時，該區(qū)域內(nèi)至少35%相同。左側(cè)的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應(yīng)SEQ ID NO: 104-135。圖8.腺病毒基因組操作的初始概念一覽。圖9.利用四個DNA片段進(jìn)行的多位點gateway的簡單示意圖。多位點gateway是我們提議的用于重新組裝基因組的系統(tǒng)。左側(cè)是提議的系統(tǒng)。圖10A.詳細(xì)說明gateway att重組位點的命名和組織的示意圖。由Gateway克隆得到了四種不同的att重 組位點。四種均含有21bp的中央attB區(qū)，這里是重組真正發(fā)生的位置。利用特異的酶混合物(BP)將attP位點與attB位點重組。得到的反應(yīng)產(chǎn)生了attL和attR位點。用另一種酶混合物(LR)可以使反應(yīng)逆向進(jìn)行，這時attL和attR重組形成attP和attB。圖10B.6個不同att位點之間的序列差別。每個位點特異地與它的配對位點重組。attBl位點只與attPl位點重組，attB2只與attP2,等等。圖11.A)人Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)分為重組裝模塊的例子。B)利用多位點gateway技術(shù)將提議的模塊重新組裝后，attB位點的插入位置。圖12.人Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)中可能的attB插入位點的例子?？梢酝ㄟ^將目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的多種腺病毒序列進(jìn)行比對，選擇非保守序列周圍的位置來確定插入位點。箭頭表示給Ad5選擇的位點。A) El和E2模塊之間的attB4插入。B) E2和L3模塊之間的attB6插入位點。C)L3和E3模塊之間的attB5插入。D)E3和E4模塊之間的attB3插入位點。對于該具體插入，我們決定通過提供雙份的位于纖維polyA/終止子和E4polyA之間的Ad5序列給該重組位點提供一個緩沖區(qū)。因此，與attB插入一起，在這兩個元件之間有27bp的重復(fù)。圖13.試圖通過PCR獲得5個Ad5模塊時的挑戰(zhàn)和結(jié)果。底部的表列出了 PCR獲得的每個片段的測序結(jié)果以及與已經(jīng)發(fā)表的Ad5序列的差別。因為所有錯誤的再現(xiàn)性都是100%，這說明我們使用的模板與發(fā)表的Ad5序列不同，且該PCR的忠實度很高。圖14.Ad5腺病毒基因模塊可以通過PCR由直接得自純化的病毒的DNA獲得。從純化的病毒中直接分離Ad5基因組DNA，作為Ad5模塊PCRs的模板。所有5個PCRs都成功。左邊小圖:一式四份的E2和L3模塊PCR。右邊小圖:一式兩份的El、E3和E4模塊PCR。紅色箭頭指示所需的PCR產(chǎn)物。右側(cè)的箭頭省略了，因為目標(biāo)產(chǎn)物非常清楚。圖15.Ad5腺病毒基因模塊在gateway BP反應(yīng)中的效率。El、E2和L3模塊在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中無效，而E3和E4模塊有效。圖16.不依賴序列和連接反應(yīng)的克隆法(SLIC)的示意圖。左側(cè)是單一片段SLIC，而右側(cè)是多(9)片段SLIC的例子。圖17.利用SLIC,在不使用gateway克隆酶的情況下制備gateway入門載體。圖18.Ad5El區(qū)對細(xì)菌有中等毒性。利用SLIC，將Ad5El區(qū)或?qū)φ?IacZ)插入gateway DONR載體。IacZ對照上的所有菌落均是“正?！贝笮。瑢acZ插入是陽性的。El平板上只出現(xiàn)了兩個“正?！贝笮〉木?，兩個菌落對El都是陰性。但是，有幾個較小的菌落(箭頭)，全部都是El陽性的。因此，Ad5El區(qū)延緩了細(xì)菌的生長。這解釋了為什么我們無法利用gateway重組反應(yīng)插入El。圖19.由5個模塊入門載體重新組裝Ad5基因組的原始的多位點gateway策略。首先，將5個入門載體中的3個與填充載體合并。然后去除填充載體以便插入反選盒(counterselection cassettes)。然后合并最后的2個入門載體從而形成完整的基因組。該特定策略顯示出與El模塊關(guān)聯(lián)的毒性，以及E2和L3模塊的大體積。圖20.人Ad5Adsembly雙DEST載體的形成。E2和L3模塊由各自的入門載體通過PCR獲得，并利用SLIC與載體骨架合并。然后，將載體消化后，通過SLIC將gateway反選盒插到模塊旁側(cè)，模塊末端帶有獨特的限制酶位點。圖21.人Ad5的Adsembly過程。將核心模塊雙DEST載體與其余的3個入門載體中的一個在gateway LR反應(yīng)中合并從而重新組裝完整的病毒基因組。圖22.Adsembly方法中嘗試的多個反選標(biāo)記物的效率。使用了 PheS+ccdB,對于通過菌落盲選，或者首先利用菌落PCR鑒定到插入然后通過標(biāo)準(zhǔn)的限制酶消化篩選都是有效的。圖23.Adsembly 載體骨架含有適合所述方法的實施方案的兩個獨特屬性。載體骨架使用的是P15A復(fù)制原點，降低了質(zhì)粒的拷貝數(shù)，從而減少Ad5El模塊介導(dǎo)的毒性。此外，載體含有哺乳動物1-SceI表達(dá)盒，這使得轉(zhuǎn)染后病毒基因組能夠從載體骨架上自剪切下來。圖24.Adsembly反應(yīng)的效率。A)Ad5的Adsembly反應(yīng)使用了 20fmol核心雙DEST載體和各IOfmol的El模塊、E3模塊和E4模塊入門載體進(jìn)行。反應(yīng)在室溫下過夜進(jìn)行，第二天轉(zhuǎn)化到NEBlO-β細(xì)胞中。長出16個克隆，經(jīng)過處理以備經(jīng)EcoRV消化進(jìn)行篩選。16個克隆中的2個顯示出正確的限制酶消化樣式(星號，克隆4和8)。“L”是DNA序列梯(ladder)?！阿濉笔顷幮詫φ?，即經(jīng)過消化的核心雙DEST載體?！阿拧笔顷栃詫φ?，經(jīng)過消化的完整Ad5基因組。B)提高El入門載體的量增強(qiáng)了 Adsembly的效率。Ad5的Adsembly反應(yīng)使用了 20fmol核心雙DEST載體、50fmol El模塊入門載體和各IOfmol的E3和E4模塊入門載體。反應(yīng)在室溫下過夜進(jìn)行，第二天轉(zhuǎn)化到NEBlO-β細(xì)胞中。長出10個克隆，經(jīng)過處理以備經(jīng)EcoRV消化進(jìn)行篩選。10個克隆中的7個顯示出正確的限制酶消化樣式(紅色星號).“L”是DNA序列梯。是陰性對照，即經(jīng)過消化的Ad5E2-E4載體?！?+) ”是陽性對照，即經(jīng)過消化的完整Ad5基因組。圖25.人Ad5的AdSlicR方法。從給Adsembly制備的E2-L3核心模塊開始，載體經(jīng)SwaI消化被線性化。然后利用SLIC將E3和E4模塊插入載體。后續(xù)的載體用PacI線性化，然后通過SLIC插入El模塊形成完整基因組。圖26.人Ad5AdSlicR方法中的效率。菌落PCR作為第一道篩選流程，然后將PCR陽性克隆進(jìn)行限制酶消化。圖27.Adsembled (經(jīng)Adsembly制得的)病毒在組織培養(yǎng)中的生長情況。A)通過Adsembly組裝的復(fù)制型腺病毒形成的噬菌斑。將Adsembled基因組轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，到第7天出現(xiàn)肉眼可見的卩遼菌斑。B) AdsembledAd5的傳代和繼續(xù)生長。從Adsembled Ad5的轉(zhuǎn)染收集總病毒，重新在新鮮的293細(xì)胞上鋪板。第3天可以看出波及整個平板上的明顯致細(xì)胞病變效應(yīng)。圖28.Adsembled Ad5生長在293細(xì)胞中時滴度只有略微下降。293細(xì)胞用MOI=IO的野生型Ad5、Adsembled Ad5或AdSLIC Ad5 (不含有attB插入或者分別含有四種attB插入中的一個)轉(zhuǎn)染。48小時后收集總病毒，經(jīng)ELISA測定滴度。唯一顯示出缺陷的病毒是Adsembled病毒和只含有attB3插入的AdSLIC病毒。與野生型水平相比,均表現(xiàn)出適度的
2倍下降。這些數(shù)據(jù)還顯示利用AdSLIC制備的病毒在293細(xì)胞中沒有復(fù)制缺陷。所有病毒的輸入水平經(jīng)過滴定，接近le7IU/mL(未顯示)。圖29.圖29A給出了本文描述的Adsembly入門載體文庫中的載體。首先列出了模塊所來源的Ad血清型，之后是對載體進(jìn)行的改變。如果沒有變化，標(biāo)記為“野生型”。圖29B給出了用于本文描述的Adsembly和AdSLIC的大模塊載體。首先列出了大模塊Ad所來源的血清型，之后是包含大模塊的模塊，然后是對載體進(jìn)行的任何改變。如果沒有變化，標(biāo)記為“野生型”。圖29C給出了利用本文描述的Adsembly或AdSLIC組裝成的腺病毒基因組。首先列出了基因組所基于的Ad血清型，之后是對病毒進(jìn)行的任何改變。如果沒有變化，標(biāo)記為“野生型”。圖30.利用SLIC將完整基因組插入質(zhì)粒。A)所述過程的示意圖，經(jīng)PCR獲得的質(zhì)粒載體含有與要插入的病毒基因組末端同源的短片段( 20bp)。然后用T4DNA聚合酶處理基因組和載體，正常用于SLIC。B)完整Ad5基因組插入質(zhì)粒骨架的例子。篩選到的所有6個克隆都含有完整的基因組。因為基因組可以正向或者反向插入，這里的情況中四個處于一個方向(克隆1、4、5和6),兩個處于另一個方向(克隆2和3)。圖31-33描述了腺病毒基因組改造的方法。圖34.上方小圖:利用AdSLICr系統(tǒng)，組裝非人腺病毒-小鼠腺病毒I型的基因組(SEQ ID NO: 104)的例子。El、E3-纖維蛋白和E4模塊質(zhì)粒的設(shè)計使得可以用限制性酶對它們進(jìn)行切割留下突 出 端，所述突出端是將它們經(jīng)過序列和連接不依賴性克隆(SLIC)到線性化(用SwaI或PmeI)核心載體中所需的。這將減少為了獲得SLIC所需的線性片段而進(jìn)行PCR的必要，從而消除引入錯誤的可能。設(shè)計還保證最終的基因組構(gòu)建體中不插入外來序列。一般方法包括切割E3-纖維蛋白和E4模塊，并與PmeI線性化的核心載體合并。這生成了 E2-E4大模塊，然后用SwaI對其進(jìn)行切割，并與切割好的El模塊合并產(chǎn)生完整的基因組。下方小圖:利用以上策略組裝了野生型I型鼠腺病毒，轉(zhuǎn)染小鼠3T6細(xì)胞后獲得能形成噬菌斑的感染性病毒。圖35.為了鑒定會妨礙生長的插入位點，對含有單一 attB重組位點插入的病毒的生長分析。因為利用Adsembly制備的病毒與野生型病毒相比，有略微的生長缺陷(圖28)，所以利用AdSLIC制備病毒,這樣它們只含有利用Adsembly制備的病毒中帶有的attB插入中的一個。293細(xì)胞(上方圖形)被以MOI=IO感染。U20S細(xì)胞(下方圖形)被以M0I=50感染。48小時后收集總病毒并滴定。模塊[L3]和[E3]之間的attB5插入與野生型病毒相比沒有影響在U20S細(xì)胞中的生長，但其他三個接點處的attB插入與野生型細(xì)胞相比的確對生長有抑制。圖36.因為位于El和E2-L2模塊之間的初始attB4插入位點造成了生長缺陷(圖35)，設(shè)計了替代的位置選項。堿基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖37.由于位于E3和E4模塊之間的初始attB3插入位點造成了生長缺陷(圖35)，設(shè)計了替代的位置選項。堿基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖38.用病毒以M0I=50感染U20S細(xì)胞，48小時后收集總病毒并滴定。將利用Adsembly生成的三種病毒與野生型病毒進(jìn)行比較。含有替代attB位點插入的病毒(黑色菱形和三角形)與原來的attB位點安置(黑色X’ s)相比，生長情況改善。所有這些病毒缺少位于L2和L3模塊之間的attB位點，并且含有不影響生長的位于L3和E3模塊之間的attB插入。圖39.Adsembly可以用于生成病毒，所述病毒中從El模塊開始表達(dá)轉(zhuǎn)基因。這種情況中，在El模塊中用GFP表達(dá)盒替換Ad5的ElA和ElB基因。利用Adsembly組裝病毒，得到了表達(dá)GFP的活病毒。圖40.Adsembly可以用于生成病毒，所述病毒中利用天然的病毒轉(zhuǎn)錄架構(gòu)從E3模塊開始表達(dá)轉(zhuǎn)基因。E3模塊經(jīng)過改造被刪除了 11.6K的蛋白(Ad5核苷酸29491-29772)，代之以mCherry。然后E3轉(zhuǎn)錄物自然剪接產(chǎn)生mCherry基因，蛋白得以表達(dá)。顯示了利用Adsembly進(jìn)行病毒的制備和U20S細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這是I)從E3模塊開始的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，和2)利用天然的病毒轉(zhuǎn)錄構(gòu)架表達(dá)外來基因的例子。圖41.利用天然的病毒轉(zhuǎn)錄架構(gòu)從E4模塊開始表達(dá)多重轉(zhuǎn)基因。將天然E4啟動子替代為CMV啟動子，3個天然E4基因替代為轉(zhuǎn)基因。然后利用Adsembly生成病毒。堿基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖42.Adsembly可以用于生成病毒，所述病毒中利用天然病毒轉(zhuǎn)錄架構(gòu)從E4模塊開始表達(dá)多重轉(zhuǎn)基因。用圖41中制備的 病毒向U20S細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時，收集總RNA，由RNA通過隨機(jī)引發(fā)合成cDNA，進(jìn)行PCR來檢測對mCherry基因的剪接。黑色箭頭指示未剪接的轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物會表達(dá)GFP。白色箭頭指示發(fā)生剪接的轉(zhuǎn)錄物,該轉(zhuǎn)錄物表達(dá)mCherry。這顯示了由單一模塊可以表達(dá)多重外來基因。泳道I和2分別是未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或者感染了野生型Ad5的細(xì)胞的陰性對照。圖43.利用Adsembly在單個基因組組裝中給多重模塊引入多種類型的變化。示意圖顯示了 Ad5基因組的5個模塊，其中的垂直箭頭指示在完整基因組組裝前給每個模塊做的改變。El模塊被轉(zhuǎn)化為熒光素酶-GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。L3模塊中的六鄰體蛋白通過點突變將Glu451改變?yōu)镚in。E3模塊中天然Ad5纖維的一部分被來自其他的人腺病毒血清型的多種纖維組分之一所替代。利用Adsembly制備了 6種病毒，每種含有代替的纖維蛋白。給Ad5列出的堿基對位點參照SEQ ID N0:137中給出的位點。登錄號DQ086466、AJ854486、BK001453、NC_001460 和 AY_737797 分別對應(yīng) SEQID NO: 139-143。圖44.利用Adsembly生成的纖維嵌合病毒與正常Ad5纖維相比，在人胚胎干細(xì)胞(hESC)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力提高。以不同MOIs將人ESC轉(zhuǎn)導(dǎo)24或48小時，經(jīng)顯微鏡測量GFP表達(dá)。頂端小圖是不含病毒的陰性對照。第二行小圖是表達(dá)處于CMV啟動子調(diào)控下的GFP的“Ad5CMV-GFP”。左側(cè)標(biāo)明了所檢驗的病毒纖維嵌合體(即Ad5/3是帶有Ad3纖維球部的Ad5)。所有圖像是在5x放大倍數(shù)攝取的。圖45.將腺病毒血清型的核心模塊進(jìn)行交換產(chǎn)生了有活性的病毒。制備了來自Adll的核心模塊。Ad5El和E3模塊經(jīng)過改造分別帶有AdllpIX和U外顯子-纖維。利用AdSLIC組裝了整個病毒，病毒在293細(xì)胞上重建?！白罱K病毒”列表中提到的堿基對位置與SEQ ID N0:137(Ad5)和 SEQ ID NO: 141 (Adll)中給出的一致。
圖46.利用AdSLIC對病毒基因進(jìn)行突變以便研究基因在病毒感染方面的功能。在El模塊中，E1B-55K基因中的His260位點被突變?yōu)锳la。其他所有模塊是野生型的。該病毒是利用AdSLIC組裝的。用復(fù)制缺陷型Ad5 (泳道I)、野生型Ad5 (泳道2)或者Ad5H260A (泳道3)以MOI=IO感染人小氣道上皮細(xì)胞。感染后36小時收集總蛋白，通過Western印跡進(jìn)行p53 (頂端小圖)、mdm2、Ad5晚期蛋白和肌動蛋白分析。與野生型Ad5不同，Ad5_H260A病毒不能降解P53，在晚期蛋白的產(chǎn)生方面有缺陷。發(fā)明詳述定義“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物，以及它們的互補(bǔ)鏈。該術(shù)語涵蓋這樣的核酸，所述核酸含有已知的核苷酸類似物或者骨架帶有修飾的殘基或連接；所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的；所述核酸與參照核酸有類似的結(jié)合性能并且與參照核苷酸的代謝方式類似。這種類似物的例子包括，但不限于硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。除非另有說明，特定核酸序列還暗含其保守性修飾的變體(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體來說，可以通過產(chǎn)生這樣的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代，所述序列中的一或多個選中(或全部)密碼子的第三個位點被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ; Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994))。術(shù)語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可以互換使用。特定核酸序列還暗含“剪接變體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白暗含由該核酸的剪接變體編碼的所有蛋白。“剪接變體”正如這個名字暗示的是基因替代剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，開始的核酸轉(zhuǎn)錄物可能發(fā)生剪接，使得不同(替代)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。剪接變體的產(chǎn)生機(jī)制可能各不相同，但都包括外顯子的替代剪接。由同一核酸經(jīng)過通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的替代的多肽也涵蓋在這個定義中。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括重組形式的剪接產(chǎn)物都包括在這個定義中。Leicher, et al., J.Biol.Chem.273 (52): 35095-35101 (1998)中討論了一例鉀離子通道剪接變體。構(gòu)建含有所需治療基因編碼和調(diào)控序列的合適載體可以采用常規(guī)的連接和限制性酶切技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域已有很好的了解(參見Maniatis et al., in MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982))?？梢詫⒎蛛x的質(zhì)粒、DNA序列或者合成寡核苷酸切割、修飾并按照需要的形式重新連接。核酸在與另一個核酸序列形成功能性關(guān)系時是“可操縱地連接”。例如，編碼前體序列或者分泌前導(dǎo)序列的DNA如果能夠表達(dá)為參與多肽分泌的前體蛋白，則所述DNA是可操縱地連接編碼多肽的DNA ;啟動子或增強(qiáng)子如果能夠影響序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動子或增強(qiáng)子是可操縱地連接編碼序列；或者核糖體結(jié)合位點如果定位方式如果能夠協(xié)助翻譯的進(jìn)行，則所述核糖體結(jié)合位點是可操縱地連接編碼序列。通常，“可操縱地連接”意味著被連接在一起的DNA序列距離很近，而且對于分泌前導(dǎo)序列的情 況，是連續(xù)的和符合讀框的。但增強(qiáng)子不需要必須連續(xù)。連接是通過在方便的限制酶切位點進(jìn)行相連完成的。如果不存在這樣的位點，可以按照常規(guī)做法使用合成寡核苷酸適配子或接頭。
在提及兩個或更多個核酸或多肽序列的語境中，術(shù)語“相同的”或“同一性”百分比是指利用BLAST或BLAST2.0序列比較算法，使用以下描述的缺省參數(shù)，或者通過人工比對和目測進(jìn)行測量(參見例如NCBI網(wǎng)站等)，所述兩個或更多個序列或子序列是相同的，或者含有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的(即在比較窗口或者指定區(qū)域內(nèi)按照最大對應(yīng)性進(jìn)行比較和對位排列時，特定區(qū)域內(nèi)有大約60%的同一性，優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同一性)。這樣的序列即可被認(rèn)為是“基本相同的”。這個定義還可以指示或者可以應(yīng)用于測試序列的互補(bǔ)序列。定義還包括含有缺失和/或添加的序列，以及含有取代的序列。正如以下描述的，優(yōu)選的算法可以can account for gaps等。優(yōu)選地,至少大約25個氨基酸或核苷酸長的區(qū)域內(nèi)存在同一性，或者更優(yōu)選地在50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)。為進(jìn)行序列比較，一般將一個序列作為參照序列，將測試序列與它相比。使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果需要還可以指定序列算法的程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)，或者可以指定替代參數(shù)。然后序列比較算法基于程序參數(shù)計算測試序列相對參照序列的序列同一性百分比。“比較窗口”用于本文包括兩個序列被最優(yōu)化對位排列后，選自多個由20-600，優(yōu)選大約50-大約200，更通常是大約100-大約150個位點組成的連續(xù)位點之一的區(qū)段，其中所述序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位點的參照序列進(jìn)行比較。用于將序列對位排列進(jìn)行比較的方法是本領(lǐng)域已知的。可以如下實施序列比較的最佳對位排列，例如通過Smith &Waterman, Adv.Appl.Math.2:482 (1981)的局部同源性算法；通過 Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源比對算法；通過 Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的尋找相似性的方法；通過這些算法的計算機(jī)化實施(WisconsinGenetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics ComputerGroup, 575Science Dr.，Madison, WI);或者通過人工比對和目測(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995supplement))。適用于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST2.0 算法，這 兩個算法分別在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和 Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)中有描述。使用了參數(shù)如文中所述的BLAST和BLAST2.0來確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列百分比同一性。正如本領(lǐng)域已知的，進(jìn)行 BLAST 分析的軟件可以通過 National Center for Biotechnology Information公開獲得。該算法涉及首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字節(jié)來鑒定高評分序列對(HSPs)，所述HSPs當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字節(jié)比對時，或者匹配或者滿足某些正數(shù)的閾值打分 T。T 代表相鄰字得分閾值(neighborhood word score threshold) (Altschulet al.,同前)。這些初始的匹配相鄰字作為種子，啟動搜索含有它們的更長的HSPs。將匹配字沿著每個序列，在累加比對得分能夠增加的情況下盡量遠(yuǎn)地向兩個方向延伸。對于核苷酸序列，利用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵分；永遠(yuǎn)>0)和N(錯配殘基的罰分；永遠(yuǎn)〈0)計算累加得分。對于氨基酸序列，利用打分矩陣來計算累加得分。當(dāng)累加比對得分從它達(dá)到的最大值下降數(shù)量X時；由于一或多個得負(fù)分的殘基比對的累積，累加得分達(dá)到零或以下時；或者到達(dá)序列的末端時，停止匹配字在每個方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省參數(shù)為字長(W)=ll、期望值(E)=10、M=5、N=-4，雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省參數(shù)為字長=3、期望值(E) =10、BLOSUM62 打分矩陣(參見 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (1989))比對(B) =50、預(yù)期值(E) =10、M=5、N=_4，雙鏈比較。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在文中可以互換使用來指代氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用這樣的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物中的一或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在氨基酸的人工化學(xué)模擬物；也適用天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及能夠按照和天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來發(fā)生修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸鹽和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即結(jié)合在氫原子上的α碳、羧基、氨基和R基團(tuán)，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物帶有被修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或者被修飾的肽骨架，但保持了和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指其結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化合物，但與天然存在的氨基酸的功能方式類似。

氨基酸在文中可以用它們的眾所周知的三字母符號或者IUPAC-1UB BiochemicalNomenclature Commission推薦的單字母符號來表示。類似地,可以用它們的公認(rèn)單字母代碼來指示核苷酸?！氨Ｊ匦孕揎椀淖凅w”適用于氨基酸和核酸序列兩者。就特定核酸序列而言，保守性修飾的變體是指那些編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或者對于不編碼氨基酸序列的核酸，是指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，有多個功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子限定是丙氨酸的每個位點，可以將密碼子改變?yōu)樯鲜鱿鄳?yīng)密碼子中的任何一個而不會改變被編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守性修飾變體的一種。本文中每個編碼多肽的核酸序列還描述了所述核酸的每個可能的沉默變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到核酸中的每個密碼子(除了 AUG，它通常是唯一的甲硫氨酸的密碼子jPTGG，通常是唯一的色氨酸的密碼子)都可以被修飾而產(chǎn)生功能相同的分子。相應(yīng)地，就表達(dá)產(chǎn)物而言，每個被描述序列中暗含了多肽編碼核酸的每個沉默變體，但對實際的探針序列來說，沒有這種含義。對于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到那些改變、增加或者刪除編碼序列中的單個氨基酸或較小百分比氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行的個別取代、缺失或添加是“保守性修飾變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。給出功能相似氨基酸的保守性取代表格是本領(lǐng)域已知的。這樣的保守性修飾變體是本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因額外的，而不是排除它們。以下8個組各自含有相互是保守性取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K); 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y),色氨酸(W) ; 7)絲氨酸(S)，蘇氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton, Proteins(1984))。提到例如細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白或載體時使用的術(shù)語“重組”表明這些細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白或載體被引入了異源核酸或蛋白或者天然核酸或蛋白被改變而被修飾，或者細(xì)胞來源于被這樣修飾的細(xì)胞。因此，重組細(xì)胞例如表達(dá)天然(非重組的)細(xì)胞中沒有的基因；或者表達(dá)的是天然基因，但是表達(dá)異常、表達(dá)下降或者根本沒有表達(dá)。術(shù)語“嚴(yán)緊雜交條件”是指這樣的條件，在所述條件下探針與通常存在于復(fù)雜的核酸混合物中它的靶子序列雜交，但不和其他序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，并且隨著環(huán)境的不同而不同。較長的序列在較高溫度下特異雜交。Tijssen, Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid aSSayS”(1993)中可以找到關(guān)于核酸雜交的全面指南。通常對于限定的離子強(qiáng)度pH，選擇的嚴(yán)緊條件比具體序列的融解溫度(Tm)低大約5-10°C。^是(一定離子強(qiáng)度、pH和核苷濃度下)與靶序列互補(bǔ)的探針有50%與靶序列平衡雜交的溫度(靶序列過量的情況下，在Tm，平衡時有50%的探針被占據(jù))。還可能通過加入去穩(wěn)定劑，比如甲酰胺來達(dá)到嚴(yán)緊條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。示范性的嚴(yán)緊雜交條件可以如下:50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS，42°C溫育，或者5x SSC、1%SDS、于65°C溫育，并于65°C在0.2x SSC和0.1%SDS中洗滌。嚴(yán)緊條件下相互不雜交的核酸如果編碼的多肽基本相同，所述核酸仍然是基本相同的。例如核酸拷貝是利用遺傳密碼所能允許的最大密碼子簡并性形成的，會發(fā)生這種情況。在這種情況中，核酸一般在中等嚴(yán)緊的雜交條件下發(fā)生雜交。示范性的“中等嚴(yán)緊雜交條件”包括在37°C下在40%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的緩沖液中雜交和在45°C在IX SSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解可以使用替代的雜交和洗滌條件來提供嚴(yán)緊度相似的條件。確定雜交參數(shù)的其他指導(dǎo)方針在許多參考文獻(xiàn)和例如Current Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel, et al., John Wiley & Sons 中有提供。對于PCRJ^ 36° C的溫度對于低嚴(yán)緊擴(kuò)增是典型的，雖然根據(jù)引物長度，退火溫度可能在約32° C和48° C之間。對于高嚴(yán)緊PCR擴(kuò)增，約62° C的溫度是典型的，雖然根據(jù)引物長度和特異性，高嚴(yán)緊退火溫度可以處于約50° C到約65° C的范圍。對高和低嚴(yán)緊擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括90° C-95° C30秒-2分鐘的變性階段，持續(xù)30秒-2分鐘的退火階段，和大約72° Cl-2分鐘的延伸階段。Innis et al.(1990)PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.N.Y.)中提供了低和高嚴(yán)緊擴(kuò)增反應(yīng)的試驗方案和指南。用于本文，術(shù)語“癌癥”是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥、腫瘤(neoplasm)或惡性腫瘤,包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)。示范性的癌癥包括腦、乳房、宮頸、結(jié)腸、頭頸、肝、腎、肺、非小細(xì)胞肺、黑素瘤、間皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宮和髓母細(xì)胞瘤的癌癥。額外的例子包括何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、原發(fā)性腦瘤、癌癥、惡性胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、惡性前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、胰腺內(nèi)分泌和外分泌的腫瘤以及前列腺癌。術(shù)語“白血 病”是泛指造血器官的進(jìn)展性、惡性疾病，通常特征在于血液和骨髓中白細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞的異常增殖和發(fā)育。白血病的臨床分類通?；?I)疾病的持續(xù)期和特點-急性或慢性；(2)涉及的細(xì)胞類型-骨髓的(髓細(xì)胞性)、淋巴的(淋巴性)或者單核細(xì)胞型；和(3)血液中異常細(xì)胞的增加或未增加-白血病或非白血性(亞白血病性)。P388白血病模型是廣泛接受的預(yù)測體內(nèi)抗白血病活性的模型。據(jù)信，在P388檢測方法中測試顯示陽性的化合物一般在體內(nèi)會表現(xiàn)出一定水平的抗白血病活性，無論被治療的白血病類型如何。相應(yīng)地，本發(fā)明包括白血病的治療方法，優(yōu)選治療下述白血病的方法:急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、成人T-細(xì)胞白血病、非白血性白血病、白細(xì)胞不增多性白血病、嗜堿性白血病、母細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚胎性白血病、嗜酸粒細(xì)胞白血病、葛氏(Gross’)白血病、毛細(xì)胞白血病、成血細(xì)胞性白血病、血胚細(xì)胞性白血病、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白血病減少性白血病、淋巴性白血病、淋巴細(xì)胞性(lymphoblastic)白血病、淋巴細(xì)胞性(lymphocytic)白血病、淋巴球性(lymphogenous)白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞白血病、巨核細(xì)胞白血病、小原粒細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞白血病、髓性(myeloblastic)白血病、髓細(xì)胞性(myelocytic)白血病、骨髓粒細(xì)胞性白血病、髓單核細(xì)胞性白血病、內(nèi)格利型(Naegeli)白血病、漿細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、李德爾氏細(xì)胞性(Rie der cell)白血病、希林氏(Schilling’s)白血病、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞白血病。術(shù)語“肉瘤”通常所指的腫瘤是由胚胎結(jié)締組織這樣的物質(zhì)組成的，一般包含包埋在纖維或均相物質(zhì)中的緊密堆積的細(xì)胞?？梢越M合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內(nèi)西氏(Abemethy’s)肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、成釉細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤、Wilms’瘤、子宮內(nèi)膜肉瘤、間質(zhì)肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細(xì)胞肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、粒細(xì)胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B細(xì)胞的免疫母細(xì)胞肉瘤、淋巴瘤、T細(xì)胞的免疫母細(xì)胞肉瘤、詹森(Jensen’s)肉瘤、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、庫柏法細(xì)胞(Kupffer cell)肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤、骨膜外肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、勞氏肉瘤(Rous sarcoma)、漿液囊性肉瘤、外陰滑膜肉瘤和毛細(xì)管擴(kuò)張性肉瘤。術(shù)語“黑素瘤”意味著從皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)生的腫瘤?？梢越M合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的黑素瘤包括例如，肢端雀斑樣痣黑素瘤、無黑素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克羅德曼(Cloudman’ s)黑素瘤、S91黑素瘤、哈帕二氏(Harding-Passey)黑素瘤、青少年性黑素瘤、雀斑樣痣惡性黑素瘤、惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、甲床黑素瘤和淺表擴(kuò)散性黑素瘤。術(shù)語“癌(carcinoma)”是指由上皮細(xì)胞構(gòu)成的惡性新生長物，易于滲透到周圍組織，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移物?？梢越M合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的示范性癌包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡上皮癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinomabasocellulare)、類基底細(xì)胞癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、細(xì)支氣管肺泡癌、細(xì)支氣管癌、支氣管癌、髓樣癌、膽管癌、絨膜上皮癌、膠樣癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、銷甲狀癌、癌瘡、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical carcinoma)、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮細(xì)胞癌、夕卜生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌(gelatiniforni carcinoma)、膠狀癌(gelatinouscarcinoma)、巨大細(xì)胞癌、巨細(xì)胞癌、腺癌、粒層細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌、肝細(xì)胞癌、許特耳氏細(xì)胞(Hurthle cell)癌、膠樣癌(hyalinecarcinoma) > hypemephroid carcinoma、幼稚型胚胎性癌、原位癌(carcinoma in situ)、表皮內(nèi)癌、上皮內(nèi)癌、克龍派切爾(Krompecher’s)癌、庫爾契茨基細(xì)胞(Kulchitzky-cell)癌、大細(xì)胞癌、豆?fàn)畎?lenticular carcinoma、carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮性癌、軟癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓樣癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma、carcinoma muciparum)、粘液細(xì)胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum、mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細(xì)胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans、osteoid carcinoma)、乳頭狀癌、門脈周癌、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘細(xì)胞癌、腦樣癌、腎臟的腎細(xì)胞癌、儲備細(xì)胞癌、肉瘤樣癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細(xì)胞癌、單純癌、小細(xì)胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細(xì)胞癌、梭細(xì)胞癌、髓樣癌(carcinomaspongiosum) 、鱗狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectaticum> carcinoma telangiectodes)、移行細(xì)胞癌、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinomatuberosum、tuberous carcinoma)、撫狀癌和絨毛狀癌。“治療有效劑量或量”在本文意味著一個能夠產(chǎn)生它的給藥效應(yīng)的劑量。確切的劑量和劑型取決于治療目的，由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用已知技術(shù)確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ；Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor(2003)和 Pickar, DosageCalculations(1999))。術(shù)語“可藥用鹽”或“可藥用載體”意味著包括活性化合物的鹽，根據(jù)本文描述的化合物帶有的取代基，所述鹽是用相對無毒的酸或堿制備的。本發(fā)明的化合物含有相對酸性的功能團(tuán)時，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需堿與所述化合物的中性形式進(jìn)行接觸獲得堿加成鹽?？伤幱脡A加成鹽的例子包括鈉、鉀、鈣、鋁、有機(jī)胺或鎂鹽或者類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對堿性的功能團(tuán)時，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需酸與所述化合物的中性形式進(jìn)行接觸獲得酸加成鹽。可藥用酸加成鹽的例子包括那些由下述無機(jī)酸衍生的鹽:鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、重碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等等，以及由下述相對無毒的有機(jī)酸衍生的鹽:乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥m酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸(mandelic)、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。還包括諸如精氨酸等的氨基酸的鹽，和諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的有機(jī)酸的鹽(參見例如Berge etal., Journal of Pharmaceutical Science66:1-19 (1977))。本發(fā)明的某些特定化合物既含有堿性功能團(tuán)也含有酸性功能團(tuán)，使得化合物能夠轉(zhuǎn)化為堿或者酸加成鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他可藥用載體也適用于本發(fā)明。
實施方案詳述1.組裝方法發(fā)明一個方面提供了制備重組腺病毒的方法(文中又稱為“Adsembly”)。所述方法包括從選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或腺病毒大模塊(或者象下文描述的它們的突變體)中的兩個或者更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。在一些實施方案中，方法包括從選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或腺病毒大模塊中的三個、四個或五個腺病毒基因模塊組裝核酸。核酸可以是腺病毒基因組構(gòu)建體。腺病毒基因組構(gòu)建體是被表達(dá)時(例如被引入哺乳動物細(xì)胞中時)能夠形成重組腺病毒的核酸。核酸還可以是部分腺病毒基因組構(gòu)建體，當(dāng)被表達(dá)時(例如被引入哺乳動物細(xì)胞中時)，能夠與其他病毒(例如輔助病毒)一起形成重組腺病毒。這樣形成的腺病毒可以復(fù)制并包裝產(chǎn)生子代病毒。因此，本文提供的方法可能包括由兩個或更多個基因組模塊或者異源元件體外組裝腺病毒基因組，所述腺病毒基因組在單獨(轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞系)或者與輔助病毒一起轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)時能夠復(fù)制并包裝產(chǎn)生子代病毒?；蚪M模塊的選擇可以基于進(jìn)化上保守的序列、轉(zhuǎn)錄或者功能元件。在一些實施方案中，方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的三個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。這樣得到的核酸(文中又稱為“組裝的核酸”)可以在組裝后被表達(dá)(例如發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和包裝)，從而形成重組腺病毒。核酸的表達(dá)可以在體外、原位、細(xì)胞內(nèi)(例如通過將核酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi))或者體內(nèi)進(jìn)行。在某些實施方案中，表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行從而導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞。術(shù)語“腺病毒基因模塊”用于本文是指El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者它們的大模塊。因此腺病毒基因模塊是核酸(例如DNA)?！皞€別腺病毒基因模塊”用于本文是指El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊或者E4模塊。在一些實施方案中，可以在組裝核酸之前由更小的子模塊組裝一或多個個別腺病毒基因模塊。腺病毒大模塊是El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊中的兩個、三個或四個的組合。因此大模塊是包含El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3 模塊、E4模塊中的兩個、三個或四個的線性核酸鏈(例如DNA)。術(shù)語“腺病毒大模塊”用于本文是指:E1-L2大模塊(即包含合并的El模塊和E2-L2模塊的核酸)；E1-L4大模塊(即包含合并的El模塊、E2-L2模塊和L3-L4模塊的核酸)；E1-E3大模塊(即包含合并的El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊和E3模塊的核酸)；E2-L4大模塊(即包含E2-L2模塊和L3-L4模塊的核酸，文中又稱為“核心大模塊”);E2-E3大模塊(即包含合并的E2-L2模塊、L3-L4模塊和E3模塊的核酸);E2-E4大模塊(即包含合并的E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的核酸)；L3-E3大模塊(即包含合并的L3-L4模塊和E3模塊的核酸)；L3-E4大模塊(即包含合并的L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的核酸)；和E3-E4大模塊(即，包含合并的E3模塊和E4模塊的核酸)。在一些實施方案中，腺病毒大模塊是E2-L4大模塊(即核心大模塊)或者E3-E4大模塊。當(dāng)腺病毒大模塊被作為兩個或更多個選中的腺病毒模塊中的一個來組裝核酸時，其他選中的腺病毒模塊不是所述腺病毒大模塊中的個別腺病毒基因模塊。換句話說，每個個別腺病毒基因模塊在組裝成的核酸中無論是單獨或者位于大模塊內(nèi)，均只出現(xiàn)一次。例如，當(dāng)兩個或更多個選中組裝核酸的腺病毒基因模塊中的一個是核心大模塊時，不會選擇E2-L2或L3-L4模塊作為組裝好的核酸中包含的另一個模塊。同樣地，對于選擇了三個或更多個腺病毒基因模塊的情況，腺病毒大模塊不是E1-E3大模塊或E2-E4大模塊。在一些實施方案中，方法包括由選自(i)El模塊，(ii)核心大模塊和(iii)E3模塊、E4模塊或E3-E4大模塊中的三個腺病毒基因模塊組裝核酸。方法還可以包括由選自El模塊、核心大模塊、E3模塊和E4模塊的四個腺病毒基因模塊組裝核酸。在一些實施方案中，可以在組裝核酸之前將一或多個腺病毒基因模塊組合形成大模塊。對于形成大模塊的情況，方法包括由大模塊和所述模塊中不包含的一或多個個別腺病毒基因模塊(即El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和/或E4模塊)組裝核酸。在一些實施方案中，大模塊是核心大模塊。因此，在一些實施方案中，方法包括利用核心大模塊和選自El模塊、E3模塊或E4模塊的一或多個腺病毒基因模塊組裝核酸。腺病毒是一種在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的無包膜二十面體病毒。本文提供的腺病毒基因模塊是指腺病毒基因組中的某些位點，象例如Davison et al., Journal of GeneralVirology, (2003)，84 ，28695-2938中描述的。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊來源于人腺病毒。圖5是人Ad5的簡圖，顯示了本文提供的腺病毒基因模塊和它們的以kb計量的大概大小。每個模塊可能編碼多重基因產(chǎn)物和替代的基因剪接排列?！癊1模塊”用于本文是含有腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)的核酸。El模塊可能另外包含與組裝成的核酸的蛋白編碼區(qū)可操縱連接的啟動子。El模塊一般來源于腺病毒ElA和/或ElB區(qū)域。除了 ITR區(qū)域，El模塊可以還含有從腺病毒基因組的El末端到病毒聚合酶編碼區(qū)的任何病毒基因(在下文中有討論)。例如，El模塊可以另外包含下述的編碼區(qū):主要轉(zhuǎn)錄激活蛋白ElA (例如編碼pRB家族的失活蛋白)、E1B-19K (例如編碼細(xì)胞凋亡阻斷劑)、E1B55K(例如p53結(jié)合、mre結(jié)合和病毒mRNA輸出蛋白)和/或PIX(例如編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白和與病毒衣殼上的六鄰體相互作用的蛋白)。El模塊可能長大約4kb、3kb、2kb或lkb。在一些實施方案中，El模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的ElA和ElB區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)?！癊2-L2”模塊用于本文是含有病毒DNA聚合酶編碼區(qū)和六鄰體蛋白編碼區(qū)中至少一個的核酸。在一些實施方案中，E2-L2模塊還包含病毒DNA結(jié)合蛋白編碼區(qū)。E2-L2模塊一般來源于腺病毒E2B的LI和/或L2區(qū)。E2-L2模塊可能另外包含下述的編碼區(qū):E2BIVa2(例如編碼晚期轉(zhuǎn)錄激活蛋白和協(xié)助病毒DNA包裝到病毒衣殼中的蛋白)、E2B Pol (例如編碼病毒DNA聚合酶)、E2B pTP (例如編碼附著在病毒基因組末端，是病毒復(fù)制或包裝必需的末端蛋白)、L152K(例如編碼病毒DNA包裝到衣殼內(nèi)所必需的蛋白)、LlIIIa(例如編碼幫助穩(wěn)定衣殼的次要結(jié)構(gòu)蛋白)、L2III(五鄰體(penton))(例如編碼形成纖維突起處的衣殼頂點的主要結(jié)構(gòu)蛋白)、L2pVII (例如編碼與組蛋白H3有同源性并且與衣殼中的病毒DNA連接的核心結(jié)構(gòu)蛋白)、L2V(例如編碼在DNA和病毒衣殼之間形成連接的核心結(jié)構(gòu)蛋白)和L2pX(例如編碼結(jié)合并凝聚病毒基因組的核心結(jié)構(gòu)蛋白)。在一些實施方案中，E2-L2模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E2B、L1和L2區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)?！癓3-L4”模塊用于本文是含有病毒DNA聚合酶編碼區(qū)和六鄰體蛋白編碼區(qū)中的至少一個的核酸。在一些實施方案中，L3-L4模塊可能還包含病毒DNA結(jié)合蛋白編碼區(qū)。在一些實施方案中，當(dāng)E2-L2模塊含有病毒DNA聚合酶編碼區(qū)時，L3-L4不含有病毒DNA編碼區(qū)，反之亦然。同樣，當(dāng)E2-L2模塊含有六鄰體蛋白編碼區(qū)時，L3-L4不含有六鄰體蛋白編碼區(qū)，反之亦然。同樣，當(dāng)E2-L2模塊含有病毒DNA結(jié)合蛋白編碼區(qū)時，L3-L4不含有病毒DNA-結(jié)合蛋白編碼區(qū)，反之亦然。換句話說，病毒DNA聚合酶編碼區(qū)、六鄰體蛋白編碼區(qū)和病毒DNA結(jié)合蛋白編碼區(qū)一般在組裝好的核酸中只出現(xiàn)一次。L3-L4模塊還可能包含下述的編碼區(qū):L3pVI (例如編碼在衣殼和病毒基因組DNA之間于頂點形成連接的次要結(jié)構(gòu)蛋白)、L3II (六鄰體)(例如編碼形成衣殼三角形面的主要結(jié)構(gòu)蛋白)、L323K(例如編碼對病毒蛋白進(jìn)行加工從而完成衣殼組裝的病毒蛋白酶)、E2A DBP(例如，編碼與病毒DNA結(jié)合并協(xié)助復(fù)制的DNA結(jié)合蛋白)、L4100K(例如編碼抑制細(xì)胞蛋白的合成并促進(jìn)病毒晚期蛋白翻譯的蛋白)、L433K(例如編碼促進(jìn)晚期病毒基因的剪接的蛋白)、一或多個纖維蛋白和L422K (例如編碼促進(jìn)晚期病毒基因表達(dá)并協(xié)助病毒DNA包裝的蛋白)。在一些實施方案中，L3-L4模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的L3、E2A和L4區(qū)的長度大概相同，或者與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的L3、E2A、L4和L5區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)?！昂诵拇竽K”(文中又稱為“E2-L4大模塊”)用于本文是指含有病毒DNA聚合酶編碼區(qū)和六鄰體蛋白編碼區(qū)中的至少一個的核酸。在一些實施方案中，核心大模塊還包含病毒DNA結(jié)合蛋白編碼區(qū)。在一些實施方案中，核心大模塊包含大多數(shù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及DNA復(fù)制和包裝所需要的蛋白。在一些實施方案中，模塊包含病毒DNA聚合酶編碼區(qū)、六鄰體蛋白編碼區(qū)和病毒DNA聚合酶編碼區(qū)。在其他實施方案中，核心可能還包含下述的編碼區(qū):L3pVI (例如編碼在衣殼和病毒基因組DNA之間于頂點形成連接的次要結(jié)構(gòu)蛋白)、L3II (六鄰體)(例如編碼形成衣殼三角面的主要結(jié)構(gòu)蛋白)、L323K(例如編碼對病毒蛋白進(jìn)行加工從而完成衣殼組裝的病毒蛋白酶)、E2ADBP (例如編碼與病毒DNA結(jié)合并協(xié)助復(fù)制的DNA結(jié)合蛋白)、L4100K(例如編碼抑制細(xì)胞蛋白的合成并促進(jìn)病毒晚期蛋白翻譯的蛋白)、L433K(例如編碼促進(jìn)晚期病毒基因的剪接的蛋白)、和L422K(例如編碼促進(jìn)晚期病毒基因表達(dá)并協(xié)助病毒DNA包裝的蛋白)、E2B IVa2(例如編碼晚期轉(zhuǎn)錄激活蛋白和協(xié)助病毒DNA包裝到病毒衣殼中的蛋白)、E2B Pol (例如編碼病毒DNA聚合酶)、E2B pTP(例如編碼附著在病毒基因組末端，是病毒復(fù)制或包裝所必需的末端蛋白)、L152K(例如編碼將病毒DNA包裝到衣殼內(nèi)所必需的蛋白)、LlIIIa(例如編碼幫助穩(wěn)定衣殼的次要結(jié)構(gòu)蛋白)、L2III (五鄰體)(例如編碼形成纖維突起處的衣殼頂點的主要結(jié)構(gòu)蛋白)、L2pVII (例如編碼衣殼中與組蛋白H3有同源性并且與病毒DNA連接的核心結(jié)構(gòu)蛋白)、L2V (例如編碼在DNA和病毒衣殼之間形成連接的核心結(jié)構(gòu)蛋白)、一或多個纖維蛋白以及L2pX (例如編碼結(jié)合并凝聚病毒基因組的核心結(jié)構(gòu)蛋白)。在一些實施方案中，L3-L4模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E2B、L1、L2、L3、E2A和L4區(qū)的長度大概相同，或者與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E2B、L1、L2、L3、E2A、L4和L5區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)。病毒DNA聚合酶基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID NO: 32 (圖7A-C)中給出的人AdOTNA聚合酶或者來源于另外一個物種的同源物的氨基酸996-1103中至少50個連續(xù)(或者全部)氨基酸有至少45%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的同一性。六鄰體基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQID N0:73(圖7D-G)中給出的人Ad5六鄰體或者來源于另外一個物種的同源物的氨基酸501-747中至少50個連 續(xù)(或者全部)氨基酸有至少45%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)的同一性。病毒 DNA 結(jié)合蛋白基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID N0:103(圖7H-1)中給出的人AdOTNA結(jié)合蛋白或者來源于另外一個物種的同源物的氨基酸408-475中至少50個連續(xù)(或者全部)氨基酸有至少35% (例如 45%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)的同一I"生。
“E4模塊”用于本文是含有腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)的核酸。在一些實施方案中，E4另外包含一或多個纖維蛋白的編碼區(qū)。E4模塊可能還包含下述的編碼區(qū):E4orf6/7(例如編碼介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄的E2F轉(zhuǎn)錄激活的蛋白)、E4orf6 (例如編碼促進(jìn)病毒DNA的合成、穩(wěn)定和輸出病毒晚期mRNAs，以及促進(jìn)剪接的蛋白)、E4orf4(例如編碼調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和剪接并且調(diào)制PP2A的蛋白)、E4orf3(例如編碼阻斷p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、破壞MRNDNA修復(fù)復(fù)合體和防止環(huán)化的蛋白)、E4orf2和E4orfl (例如編碼促進(jìn)經(jīng)由PI3激酶進(jìn)行的信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致蛋白合成和細(xì)胞存活的蛋白)。在一些實施方案中，E4模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E4區(qū)的長度大概相同，或者與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E4和L5區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)。“E3模塊”用于本文是含有一或多個纖維蛋白編碼區(qū)和/或腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)的核酸。在一些實施方案中，E3模塊包含從pVIII的蛋白編碼區(qū)末端到位于基因組右端的ITR的任何已知腺病毒序列(如圖5所示)。pVIII編碼區(qū)是任何這樣的基因，所述基因編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID:135中給出的人Ad5pVIII中氨基酸6-43(圖7J)中的至少50個連續(xù)(或者全部)氨基酸有至少35%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的同一性。E3模塊可能另外包含下述的編碼區(qū):L4pVIII (例如編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白)E312.5K、E3CR1 α (例如編碼阻斷細(xì)胞凋亡的蛋白)、E3gpl9K(例如編碼抑制MHC-1抗原呈遞的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、E3ADP (例如編碼具有有效裂解細(xì)胞以釋放病毒的功能的蛋白)、E3RID α (例如編碼去除細(xì)胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、E3RID β -(例如編碼去除細(xì)胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、E314.7K(例如編碼阻斷細(xì)胞凋亡的蛋白)和L5IV(Fiber)(例如，編碼從五鄰體基座伸出的負(fù)責(zé)受體結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)蛋白)。在一些實施方案中，E3模塊與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E3區(qū)的長度大概相同，或者與自然界中發(fā)現(xiàn)的腺病毒的E3和L5區(qū)的長度大概相同(例如參見圖5)?！癊3-E4大模塊”用于本文是包含腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)的核酸。E_3_E4大模塊可能還包含從PVIII的蛋白編碼區(qū)末端到位于基因組右端的ITR的任何已知腺病毒序列(如圖5所示)。E3-E4大模塊可能另外包含下述的編碼區(qū):E4orf6/7 (例如編碼介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄的E2F轉(zhuǎn)錄激活的蛋白)、E4orf6 (例如編碼促進(jìn)病毒DNA的合成、穩(wěn)定和輸出病毒晚期mRNAs以及促進(jìn)剪接的蛋白)、E4orf4(例如編碼調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和剪接并且調(diào)制PP2A的蛋白)、E4orf3 (例如編碼阻斷p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、破壞MRN DNA修復(fù)復(fù)合體和防止環(huán)化的蛋白)、E40rf2、E40rfI (例如編碼促進(jìn)經(jīng)由PI3激酶進(jìn)行的信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致蛋白合成和細(xì)胞存活的蛋白)、L4pVIII (例如編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白)、E312.5K、E3CR1 α (例如編碼阻斷細(xì)胞凋亡的蛋白)、E3gpl9K(例如編碼抑制MHC-1抗原呈遞的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、E3ADP(例如編碼具有有效裂解細(xì)胞以釋放病毒的功能的蛋白)、E3RIDa (例如編碼去除細(xì)胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、E3RID β -(例如編碼去除細(xì)胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調(diào)節(jié)蛋白)、Ε314.7Κ (例如編碼阻斷細(xì)胞凋亡的蛋白)和L5IV (Fiber)(例如，編碼從五鄰體基座伸出的負(fù)責(zé)受體結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)蛋白)。在一些實施方案中，一或多個腺病毒基因模塊相對腺病毒基因模塊所來源的天然腺病毒中發(fā)現(xiàn)的模塊序列(例如野生型)，包含一或多個突變(例如，核酸的取代、添加或缺失)。例如，本文提供的核酸可能編碼有效數(shù)量的腺病毒基因模塊，從而在某些細(xì)胞條件下，核酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時導(dǎo)致形成有復(fù)制能力的腺病毒。一或多個腺病毒基因模塊中的突變可能使得得到的腺病毒在一些細(xì)胞(例如，患病細(xì)胞，比如癌細(xì)胞)中能夠復(fù)制，而在其他細(xì)胞(例如，未患病細(xì)胞，比如健康細(xì)胞)中不復(fù)制。突變還可能包含一或多個蛋白編碼區(qū)的添加(例如添加一或多個外源或異源蛋白編碼區(qū)，比如非病毒蛋白編碼區(qū))。一或多個蛋白的添加可能帶來額外的病毒功能、丟失病毒功能(例如復(fù)制)、提供病毒檢測方法(例如熒光標(biāo)記物)、提供病毒純化方法(例如帶有His標(biāo)簽的衣殼蛋白)或者提供能夠產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的病毒，所述蛋白隨后經(jīng)分離和/或純化進(jìn)一步使用。因此，突變可能增加了病毒功能或者減少了病毒功能。因此本文制備的重組腺病毒包括通過引入外源(例如異源)核酸或者改變天然核酸序列而被改造的腺病毒。所述改變可以是如上所述通過一或多個腺病毒基因模塊中的突變進(jìn)行的，或者是通過將天然腺病毒基因組中存在的一或多個腺病毒基因模塊排除進(jìn)行的。因此在一些實施方案中，核酸包括發(fā)生突變的腺病毒核酸序列。腺病毒核酸序列是在自然界或者天然腺病毒(例如野生型)中發(fā)現(xiàn)的序列。發(fā)生突變的腺病毒核酸序列可能是如上所述由一或多個腺病毒基因模塊中的突變造成的，或者是通過將天然腺病毒基因組中的一或多個腺病毒基因模塊排除得到的。在某些實施方案中，核酸包括發(fā)生缺失的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者外源(例如異源)核酸序列(例如編碼非腺病毒基因產(chǎn)物)。發(fā)生突變的腺病毒核酸序列可能包括突變的E4-0RF3基因產(chǎn)物(帶來改變的功能)、突變的ElB-55k基因產(chǎn)物、突變的腺病毒纖維基因產(chǎn)物、突變的病毒外殼蛋白、前藥轉(zhuǎn)化酶、報告蛋白、突變的六鄰體蛋白、與PlX融合的蛋白、對某些細(xì)胞有毒性的蛋白、來自獲得核酸的類型以外的腺病毒的完整或部分纖維基因、和/或靶向蛋白(例如腫瘤靶向蛋白或者脈管靶向蛋白)。在一些實施方案中，核酸包含El模塊。核酸還可以包含El模塊和E4模塊。在某些實施方案中，核酸包含El模塊和E2-L2模塊。核酸還可以包含El模塊和L3-L4模塊。核酸還可以包含El模塊、E2-L2模塊和L3-L4模塊。在一些實施方案中，方法包括由選自El模塊、核心模塊、E3模塊和/或它們的衍生物或組分的至少三個腺病毒基因模塊組裝核酸。在相關(guān)實施方案中，例如對于人Ad5，方法包括由El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊組裝核酸。在某些實施方案中，形成的核酸至少長 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12、13、14、15kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長12kb。

由本文提供的方法形成的核酸可以是任何能夠表達(dá)的核酸。核酸可以被表達(dá)從而產(chǎn)生腺病毒。腺病毒可能是感染性的和/或可以自我復(fù)制的(例如復(fù)制型的)。在一些實施方案中，核酸是質(zhì)粒。在一些實施方案中，組裝包括將腺病毒基因模塊(或大模塊)組合在一起形成核酸，其中腺病毒模塊或大模塊的方向有助于在導(dǎo)入細(xì)胞時形成有復(fù)制能力的腺病毒(例如能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或形成病毒)。因此，在一些實施方案中，腺病毒基因模塊(例如大模塊)被組裝成特定的取向?？梢圆捎萌魏芜m合的克隆技術(shù)，包括例如所謂的“gateway”技術(shù)和/或不依賴序列和連接反應(yīng)的克隆技術(shù)(“SLIC”)。Gateway技術(shù)或者類似的技術(shù)采用位點特異性重組將來自一條核酸的核酸(例如DNA)片段交換為另一個。最終結(jié)果是將一個核酸序列插入了目標(biāo)載體或質(zhì)粒。這些技術(shù)和方法在文中一起被稱為“位點特異性重組法”或者“ SSR方法”。在SSR方法的一個這樣的應(yīng)用中，DNA片段被從入門載體轉(zhuǎn)移到目標(biāo)載體中，其結(jié)果是目標(biāo)載體的繁殖(圖9)。入門載體和目標(biāo)載體一般含有重組位點。在一些實施方案中，入門載體是能夠重組型的。在其他實施方案中，入門載體是能夠雜交的。雜交型入門載體可能含有一或多個腺病毒基因模塊，這些模塊可以通過限制性酶切從入門載體中釋放出來，從而釋放出腺病毒基因模塊。本文提供了吸取了 gateway技術(shù)的SSR方法，可以將腺病毒基因模塊插入目標(biāo)載體從而形成核酸(例如核酸質(zhì)粒)。使用gateway技術(shù)的一般方法在例如 Sone et.al., J Biotechnol.(2008) SeplO; 136 (3-4): 113-2l>Hartley, et al., GenomeRes.(2000)，10，1788 - 1795 和 Sasaki, et al.，J.Biotechnol.(2004)，107，233 - 243 中有描述。例如，使用SSR方法時，組裝包括將重組型目標(biāo)載體(例如包含重組位點核酸序列`的目標(biāo)載體)和一或多個腺病毒基因模塊與整合酶(例如λ噬菌體整合酶、λ噬菌體切除酶或細(xì)菌宿主的整合因子)接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。所述一或多個腺病毒基因模塊是有重組能力的腺病毒基因模塊(例如包含重組位點核酸序列的腺病毒基因模塊)O在一些實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊是通過給腺病毒基因模塊添加重組位點核酸序列，從而形成一或多個重組型腺病毒基因模塊。在其他實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊是重組型入門載體的一部分。在一些實施方案中，含有一或多個腺病毒基因模塊的重組型入門載體是通過將一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊和重組型供體載體與整合酶接觸形成，從而形成含有一或多個腺病毒基因模塊的重組型入門載體。因此，在一些實施方案中，重組型目標(biāo)載體和含有一或多個腺病毒基因模塊的一或多個重組型入門載體與整合酶活性接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。圖20-21示意了本文提供的建立人Ad5的方法的實施方案。組裝包括將目標(biāo)載體和各含有腺病毒基因模塊的一或多個入門載體與一或多個λ曬菌體整合酶、λ曬菌體切除酶或細(xì)菌宿主的整合因子組合，從而形成腺病毒基因模塊載體。在一些實施方案中，入門載體是通過給腺病毒基因模塊添加重組位點，然后將供體載體和一或多個λ噬菌體整合酶、λ噬菌體切除酶或細(xì)菌宿主的整合因子組合，從而形成腺病毒基因模塊入門載體。目標(biāo)載體是腺病毒基因模塊與之連接的核酸，比如質(zhì)粒。所述連接可能是通過含有要包含(插入)到目標(biāo)載體中的腺病毒基因模塊的一或多個入門載體的交換進(jìn)行的。在與重組型目標(biāo)載體和一或多個腺病毒基因模塊與整合酶(例如整合酶、切除酶和/或宿主整合因子)接觸(例如組合)之前，目標(biāo)載體中可能存在一或多個腺病毒基因模塊。重組位點核酸序列，文中又稱為“att”位點是協(xié)助兩個核酸之間進(jìn)行體外位點特異性重組的核酸序列。在一些實施方案中，重組位點核酸序列大約長21bp。例如，重組位點核酸序列可能是gateway重組信號，比如圖10所示的和/或Sone et.al., J Biotechnol.(2008) SeplO;136(3-4):113-21;Hartley, et al., Genome Res.(2000)，10，1788 - 1795 和Sasaki, et al., J.Biotechnol.(2004), 107, 233 - 243 中給出的(例如 attB 位點、attL 位點、attR位點、attP位點、attBr位點、attPr位點等)。在一些實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊形成供體載體的一部分(或者存在于供體載體中)。所述供體載體可以是與gateway技術(shù)或者相似類型的克隆技術(shù)相容的質(zhì)粒。在一些實施方案中，DEST載體含有不同反選盒。反選盒是在某些條件下阻止細(xì)菌細(xì)胞生長的任何DNA片段。圖22描 述了本文提供的方法中使用的各種反選盒的效率。圖19詳細(xì)描述了利用多位點gateway策略，重組Ad5腺病毒基因模塊的原始方案。這個具體策略涉及四個入門載體的組合，其中三個是腺病毒基因模塊，第四個是無關(guān)的填充模塊。這四個模塊一經(jīng)組合，即可通過gateway反應(yīng)除去填充模塊從而形成目標(biāo)載體。最后，通過gateway反應(yīng)插入其余兩個腺病毒基因模塊得到完整的病毒基因組。當(dāng)gateway反應(yīng)中使用的是較大的腺病毒基因模塊時，這個原始方案效率不高，并且存在Ad5El模塊帶來的毒性問題。組合方法(例如SLIC和SSR方法)使得更容易由模塊組裝基因組(例如，進(jìn)行的步驟更少，每個步驟效率更高)。SLIC技術(shù)通過依靠兩個核酸(例如DNA片段)中由外切核酸酶生成的單鏈核酸(例如DNA)突出，進(jìn)行了單鏈同源序列的退火(圖16)。因此，SLIC技術(shù)采用依靠在插入核酸(例如DNA)和目標(biāo)載體中由外切核酸酶生成的單鏈核酸(例如DNA)突出進(jìn)行的同源重組和單鏈退火(例如雜交)。本文提供的方法采用SLIC技術(shù)將腺病毒基因模塊插入到目標(biāo)載體中從而形成核酸(例如核酸質(zhì)粒)。這個過程在文中還被稱為AdSlic或AdSlicR。例如 Li et al., Nature Methods (2007)，4，251-256 中描述了使用 SLIC 技術(shù)的一般方法。圖25示意了給人Ad5建立的AdSlicR的例子。圖26詳細(xì)描述了 AdSlicR方法中反應(yīng)的效率。例如，使用SLIC技術(shù)(或類似的克隆技術(shù))的情況中，組裝包括將(例如每個末端)帶有單鏈核酸(例如DNA)突出的可雜交型目標(biāo)載體(例如目標(biāo)載體(例如線性載體))與一或多個腺病毒基因模塊進(jìn)行雜交(例如退火)，從而形成腺病毒基因模塊載體。所述可雜交型目標(biāo)載體在文中還可以被稱為SLIC型載體。所述一或多個腺病毒基因模塊可以是可雜交型腺病毒基因模塊(例如，這樣的腺病毒基因模塊(例如，線性腺病毒基因模塊)，所述模塊(在例如每個末端)帶有至少一個單鏈核酸(例如DNA)突出能夠有效地與目標(biāo)載體上的單鏈核酸(例如DNA)突出互補(bǔ)，從而協(xié)助(在例如嚴(yán)緊條件下)雜交)。在一些實施方案中，目標(biāo)載體突出和腺病毒基因模塊突出各種長大約20到25bp。可雜交型目標(biāo)載體可以利用任何合適的方法形成。例如，在一些實施方案中，當(dāng)目標(biāo)載體是環(huán)形的(例如質(zhì)粒)，將目標(biāo)載體(例如利用內(nèi)切核酸酶)切割形成線性目標(biāo)載體。任何將線性目標(biāo)載體與外切核酸酶(即具有外切核酸酶活性的酶，比如T4DNA聚合酶)接觸，從而形成可雜交型目標(biāo)載體。類似地，可以通過將腺病毒基因模塊與外切核酸酶接觸(例如處理)而形成可雜交型腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，可雜交型目標(biāo)載體與一或多個腺病毒基因模塊的雜交可能包括將可雜交型目標(biāo)載體和腺病毒基因模塊與DNA聚合酶合并在一起。在一些實施方案中，當(dāng)腺病毒基因模塊是環(huán)形或者包含在環(huán)形質(zhì)粒中時，在外切核酸酶處理前通過內(nèi)切核酸酶將腺病毒基因模塊線性化。因此，在一些實施方案中，一或多個可雜交型腺病毒基因模塊是通過將包含一或多個入門載體腺病毒基因模塊的入門載體與內(nèi)切核酸酶接觸，從而形成一或多個釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊。所述一或多個釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊可以與外切核酸酶接觸，從而形成一或多個可雜交型腺病毒基因模塊。文中提到的入門載體腺病毒基因模塊是作為入門載體的一部分的腺病毒基因模塊。文中提到的釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊是由例如限制性內(nèi)切酶從入門載體上釋放出來的腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊不是環(huán)形的(例如通過PCR或基因合成獲得的)，不需要在外切核酸酶處理前進(jìn)行線性化。在一些實施方案中，將SLIC型載體與一或多個腺病毒基因模塊進(jìn)行退火可能包括將SLIC型載體和腺病毒基因模塊與DNA聚合酶組合。在一些實施方案中，SLIC型載體在與SLIC型腺病毒基因模塊退火前，含有一或多個腺病毒基因模塊。因此在一些實施方案中，可以順序進(jìn)行多重SLIC反應(yīng)來插入多重腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，為了獲得處于質(zhì)粒中的腺病毒基因組以便作為產(chǎn)生腺病毒基因模塊的模板，可以利用SLIC將整個腺病毒基因組插入質(zhì)粒骨架。在一些實施方案中，SLIC型腺病毒基因組是從純化的病毒保藏物中獲得的。圖30示意了這一過程的一個實施方案，并提供了人Ad5的例子。腺病毒基因模塊載體是含有至少一個腺病毒基因模塊的核酸。利用合適的克隆技術(shù)，給目標(biāo)載體添加所需數(shù)量的 腺病毒基因模塊，從而形成腺病毒基因模塊載體。例如，一旦形成后，可以利用合適的克隆技術(shù)(例如gateway克隆技術(shù)和/或SLIC克隆技術(shù))進(jìn)一步改造腺病毒基因模塊(例如腺病毒基因模塊載體)，以便加入更多腺病毒基因模塊，從而形成核酸，后者即可(在例如細(xì)胞內(nèi))被表達(dá)形成腺病毒(例如可以復(fù)制的腺病毒)。因此，在一些實施方案中，可以利用合適的克隆技術(shù)將第一個腺病毒基因模塊進(jìn)一步改造形成第二個、第三個和/或第四個腺病毒模塊，其中分別向載體添加了第二、第三和/或第四腺病毒基因模塊，從而形成了核酸，核酸經(jīng)表達(dá)形成腺病毒(例如可復(fù)制的腺病毒)。因此在一些實施方案中，核酸是腺病毒基因模塊載體。的確，可以使用不同的克隆技術(shù)來組裝核酸或腺病毒基因模塊載體。在一些實施方案中，組裝包括將可雜交型目標(biāo)載體與第一腺病毒基因模塊雜交(例如退火)從而形成第一腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊可能是可雜交型腺病毒基因模塊。第一腺病毒基因模塊載體可以和第二腺病毒基因模塊入門載體與整合酶(例如整合酶、切除酶或者宿主整合因子)進(jìn)行接觸(例如合并)，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。第二腺病毒基因模塊載體可能是可重組型第二腺病毒基因模塊載體(例如目標(biāo)載體)，第二腺病毒基因模塊可能是可重組型第二腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，第一腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊或者E2-L4大模塊。第二腺病毒基因模塊可以是El模塊、E3模塊或者E4模塊。圖20-21提供了聯(lián)合使用克隆方法來組裝腺病毒基因模塊的例子，其中聯(lián)用了 SLIC和 gateway。在其他實施方案中，組裝包括將可重組型目標(biāo)載體和第一腺病毒基因模塊與(在有)整合酶(例如，整合酶、切除酶或者宿主整合因子)進(jìn)行接觸(例如合并)，從而形成第一腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊是可重組型第一腺病毒基因模塊(例如入門載體)。第一腺病毒基因模塊載體與第二腺病毒基因模塊雜交，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊載體是可雜交型腺病毒基因模塊載體(例如目標(biāo)載體)。第二腺病毒基因模塊是可雜交型腺病毒基因模塊(例如入門載體)。在一些實施方案中，第二腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊或者E2-L4大模塊。第一腺病毒基因模塊可以是El模塊、E3模塊或者E4模塊。在一些實施方案中(例如人Ad5的例子中)，E2-L2模塊和L3-L4模塊分別大約14kb和10kb。文中提供的一個發(fā)現(xiàn)是E2-L2和L3-L4模塊的大小太大，在一些實施方案中利用標(biāo)準(zhǔn)或者gateway (例如多位點gateway)克隆技術(shù)不能有效地組裝為核酸。圖15中提供了例子。因此在一些實施方案中，SLIC克隆技術(shù)(或類似的克隆技術(shù))被用來將這些模塊插入到目標(biāo)載體(例如入門載體)中。利用例如gateway克隆技術(shù)添加其他腺病毒基因模塊。因此在一些實施方案中，當(dāng)E2-L2模塊和L3-L4模塊被組裝為核酸時，優(yōu)選聯(lián)用SLIC和gateway (例如多位點gateway)克隆策略來組裝核酸。圖20-21中給出了 SLIC和gateway (例如多位點gateway)克隆策略聯(lián)用的特定實施方案。本文提供的方法的某些實施方案實現(xiàn)了快速有效的腺病毒基因組構(gòu)建體的組裝。一些情況中，腺病毒基因組構(gòu)建體在不到10、9、8、7、6、5、4、3、2或者I個小時內(nèi)即可組裝好。本文提供的方法還使得可以進(jìn)行腺病毒片段到載體的插入、在個別載體內(nèi)進(jìn)行的簡單獨立突變、和/或多位點特異性體外組裝。如下文所述，在一些實施方案中，一個或全部腺病毒基因模塊可能選自重組腺病毒基因模塊庫。因此，Adsembly過程的某些實施方案能夠快速有效地構(gòu)建多種重組腺病毒，從而可以根據(jù)腺病毒基因模塊的最佳組合快速優(yōu)化定制腺病毒的功能性。因此方法提供了通過將來自各種腺病毒血清型的部分進(jìn)行混合和匹配以制備新的腺病毒血清型嵌合體的能力。這使得不僅能將每個血清型的獨特屬性結(jié)合在一起，而且能夠利用到血清型的不同向性以及避開對流行血清型已有的免疫能力的可能性。本文提 供的方法的某些實施方案避免了對有限的限制酶位點克隆技術(shù)的依賴性。方法還可以避開對腺病毒血清型5的單一依賴性。確實在人Ad5的例子中，當(dāng)采用了 El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊所有5種模塊時，相對以前的已知方法突變體選擇顯著增加。在某些實施方案中，本文提供的方法能夠在基因組中同時形成復(fù)合的變化。所述方法還可能避開以前的單一依賴在專門化細(xì)菌菌株或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物(例如MAGIC)中經(jīng)常需要幾個月進(jìn)行低效同源重組的已知基因組組裝方式。而且，本文提供的方法的某些實施方案給出了簡單的試驗方案，只需常見試劑而無需使用專門的細(xì)菌(例如ccdB抗性)。本文提供的方法和文庫的用途包括例如:(I)為了基因功能分析而進(jìn)行的腺病毒基因的突變，(2)獲得腺病毒突變體，其中腺病毒基因功能的丟失使它們不能在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但在能夠補(bǔ)充其功能的腫瘤細(xì)胞中可以選擇性地發(fā)生裂解性復(fù)制。(3)靶向基因表達(dá)，作為復(fù)制缺陷型載體或者可復(fù)制型病毒。(4)方法可以提供用于基因表達(dá)的新的復(fù)制缺陷型腺病毒?？梢詫⒗梦闹兴龇椒ńM裝的腺病毒為了這個目的進(jìn)行優(yōu)化。在人Ad5的情況中，El模塊文庫可能包括例如多個ElA或ElB缺失的模塊和/或每個含有不同的哺乳動物啟動子從而允許使用者能夠選擇最佳啟動子來表達(dá)目的基因。(5)利用已有的腺病毒基因組轉(zhuǎn)錄構(gòu)架進(jìn)行多基因表達(dá)。在El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊中每一種都運用了的實施方案中，只有E4模塊中不存在突變?？梢岳萌魏芜m宜的方法(例如PCR技術(shù)或者基因合成)，從任何合適的腺病毒獲得El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊以及它們的大模塊。例如，可以用從純化病毒獲得的病毒基因組DNA進(jìn)行PCR(圖14)。圖13詳細(xì)描述了人Ad5腺病毒基因模塊的PCR效率。在一些實施方案中，El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的組合構(gòu)成了或者它們的大模塊構(gòu)成了完整的或者基本完整的腺病毒基因組。利用文中提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定模塊之間中斷處的確切位置。例如，可以利用生物信息學(xué)手段確定重組位點核酸序列(例如，gateway重組信號或者gateway重組位點)的最佳插入位點?？梢詫⒍鄠€腺病毒血清型進(jìn)行比對，并在腺病毒基因模塊之間進(jìn)行基因組區(qū)域的保守性分析。在一些實施方案中，避開了血清型之間的核苷酸保守區(qū)，而簡并區(qū)域是可以接受的插入位點。例如，圖12、圖35、圖36、圖37和圖38中箭頭指示了人Ad5中某些適宜的重組位點核酸序列的插入位點。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊之間的序列可能較短，因此需要序列的重復(fù)。圖12提供了一個例子，其中由于Ad5纖維蛋白polyA和E4polyA之間的序列短,與attB位點插入一起插入了一個27bp的Ad5序列重復(fù)。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含一或多個重組位點核酸序列。圖35-39中公開了一些例子，但這些例子不是意圖限制重組位點核酸序列在重組腺病毒中的核酸序列位置如何影響重組腺病毒的生長速率。因此在一些實施方案中，包含一或多個重組位點核酸序列(例如att位點)的重組腺病毒可能比沒有一或多個重組位點核酸序列的重組腺病毒生長地慢。在其他實施方案中，包含一或多個重組位點核酸序列(例如att位點)的重組腺病毒可能與沒有一或多個重組位點核酸序列的重組腺病毒生長地至少一樣快。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于E3模塊和E4模塊之間的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，E3模塊和E4模塊之間的重組位點核酸序列是attB3重組位點核酸序列。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸32904之后的或者位于所述序列同源物中的等同核苷酸之后的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于El模塊和E2-L2模塊之間的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸4035之后的或者位于所述序列同源物中的等同核苷酸之后的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸3608之后的或者位于所述序列同源物中的等同核苷酸之后的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位于L3-L4模塊和E3模塊之間的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，L3-L4模塊和E3模塊之間的重組位點核酸序列是attB5重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒 基因模塊載體)包含位于El模塊和E2模塊之間的第一重組位點核酸序列、L3-L4模塊和E3模塊之間的第二重組位點核酸序列、E3模塊和E4模塊之間的第三重組位點核酸序列。在其他實施方案中，第一重組位點核酸序列包含在核酸中如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸4035之后或者所述序列的同源物中等同核苷酸之后，第三重組位點核酸序列包含在核酸中如SEQ ID NO: 137給出的核苷酸32904之后或者所述序列同源物中等同核苷酸之后。以下列出的插入策略的例子顯示了 Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)中的四個插入。數(shù)字表示已公開的Ad5基因組序列中重組位點核酸序列插入所位于的核苷酸位點。在以下例子中，attB序列(即重組位點核酸序列)帶有下劃線，最后一個插入的Ad5序列重復(fù)顯示為粗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易識別相似情景中或者同源病毒序列中合適的和/或等同的插入位點。4075 和 4076 之間的:CAACTTTTCTATACAAAGTTGTA17959 和 17960 之間的:CAACTTTTTAATACAAAGTTG27173 和 27174 之間的:TCAACTTTGTATACAAAAGTTGTG32815 和 32816 之間的:ACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG圖21中的組裝策略被使用17次來產(chǎn)生感染性人Ad5病毒。圖24詳細(xì)描述了本文提供的方法的效率。在四·個獨立情景中，野生型Adsembled腺病毒被轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生了病毒。此外，該實驗方案生成了 13個突變體腺病毒，全部能夠產(chǎn)生感染性病毒。圖27提供了由轉(zhuǎn)染重組裝得到的表現(xiàn)為單個噬菌斑并且在293細(xì)胞上進(jìn)行了傳代的野生型Ad5的圖像。由圖20-21和圖25中的策略產(chǎn)生的病毒在293細(xì)胞中測試了復(fù)制效率，如圖28所
/Jn ο另一方面，提供了通過本文公開的方法制備的腺病毒。在一些實施方案中，腺病毒是可復(fù)制型的。在另一個實施方案中，腺病毒不是可復(fù)制型的。I1.腺病毒基因模塊和大模塊文庫另一方面，提供了包含復(fù)數(shù)個腺病毒基因模塊(例如大模塊)的文庫。在一些實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同El模塊。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同E3模塊。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同E4模塊。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同核心大模塊。在一些實施方案中，根據(jù)以上描述的方法制備了腺病毒基因組文庫。在其他實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同El模塊、復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同E3模塊、復(fù)數(shù)個不同E4模塊和/或復(fù)數(shù)個不同核心大模塊。在一些實施方案中，文庫包含復(fù)數(shù)個不同大模塊，其中所述大模塊包含復(fù)數(shù)個不同E1-L2大模塊、復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊(即核心大模塊)和/或復(fù)數(shù)個不同E3-E4大模塊。在一些實施方案中，復(fù)數(shù)個不同腺病毒基因模塊和/或大模塊區(qū)別在于它們來源于不同的腺病毒類型(例如不同種或者不同血清型)。例如，在一些實施方案中，復(fù)數(shù)個不同El模塊、復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同E3模塊、復(fù)數(shù)個不同E4模塊和/或復(fù)數(shù)個不同大模塊(例如核心大模塊)包含來自復(fù)數(shù)個腺病毒類型(例如一個以上人腺病毒血清型)的腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，復(fù)數(shù)個不同腺病毒基因模塊和/或大模塊區(qū)別在于它們編碼不同的突變體模塊或大模塊(例如缺失的腺病毒核酸序列、取代的腺病毒核酸序列、異常的腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列)。例如，文庫可能包含復(fù)數(shù)個不同的El模塊、復(fù)數(shù)個不同的E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同的L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同的E3模塊、復(fù)數(shù)個不同的E4模塊或者復(fù)數(shù)個不同的大模塊(例如核心大模塊)，所述模塊包含缺失的腺病毒核酸序列、突變的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。在一些實施方案中，復(fù)數(shù)個不同的腺病毒基因模塊和/或大模塊是可重組型的(例如，包含在入門載體中)。例如，文庫可以包含可重組型的復(fù)數(shù)個不同的El模塊、復(fù)數(shù)個不同的E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同的L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同的E3模塊、復(fù)數(shù)個不同的E4模塊和/或復(fù)數(shù)個不同的E2-L4大模塊。在一些實施方案中，復(fù)數(shù)個不同的腺病毒基因模塊和/或大模塊是可雜交型的(例如比如線性化后是SLIC型的)。例如，在一些實施方案中，文庫包含可雜交型的復(fù)數(shù)個不同的El模塊、復(fù)數(shù)個不同的E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同的L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同的E3模塊、復(fù)數(shù)個不同的E4模塊和/或復(fù)數(shù)個不同的E2-L4大模塊。

本文提供的文庫的部分可以由不同使用者制備，在不同使用者之間共享。可以將各種腺病毒基因模塊混合和匹配構(gòu)建具有所需功能或者沒有某功能的新的腺病毒構(gòu)建體。因此本文的方法和文庫提供了通過將來自各種腺病毒血清型的部分進(jìn)行混合和匹配以制備新的腺病毒血清型嵌合體的能力。腺病毒基因模塊文庫給使用者提供了構(gòu)建理想腺病毒載體的多項選擇。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊可能對細(xì)菌是有毒的。例如，圖18顯示了人Ad5El模塊的毒性。在一些實施方案中,可能需要將腺病毒基因模塊包含在以低拷貝數(shù)維持的質(zhì)粒中(例如P15A復(fù)制原點)。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊毒性、大小或者其他因素可能會妨礙它們在SSR方法(例如gateway反應(yīng))中的用途。例如，圖15詳細(xì)描述了 5個人Ad5腺病毒基因模塊的標(biāo)準(zhǔn)gateway BP反應(yīng)效率。在一些實施方案中，使用SSR方法(例如gateway反應(yīng))效率低的腺病毒基因模塊可以通過替代的克隆方法(例如SLIC)來操作。圖17示意了用SLIC代替SSR方法(例如利用gateway克隆酶)來制備入門載體的策略。II1.試劑盒另一方面，提供了供本文描述的方法和文庫使用的試劑盒，所述試劑盒包含含有選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊(或者如下所述的它們的突變體)的兩個或更多個腺病毒基因模塊的核酸。試劑盒的合適成分包括以上I和/或II部分中討論過的組合物和成分。例如在一些實施方案中，試劑盒可能包含核酸，所述核酸含有選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊中的3、4或5個腺病毒基因模塊。正如上文討論過的,核酸可能構(gòu)成載體(例如質(zhì)粒)(例如目標(biāo)載體或供體載體)的一部分。在一些方面中，本文提供的試劑盒可能包含帶有或者沒有腺病毒基因模塊的載體。可用于試劑盒的載體可能包含一或多個重組位點核酸序列和/或單鏈核酸突出(或者在與合適的酶接觸時能夠形成單鏈核酸突出的核酸序列)。在一些實施方案中，載體是如上所述的可雜交型的目標(biāo)載體、SLIC型載體或者供體載體。載體可以包含一或多個腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，載體中包含反選盒。參考本文對Adsembly方法和文庫的描述，用于實施本文提供的方法的試劑盒的其他成分是顯而易見的(例如外切核酸酶、整合酶、啟動子序列等)。IV.實施例以下實施例僅供闡釋而非限制要求保護(hù)的發(fā)明。A.病毒組裝方法1.“組合”化學(xué)和“重組”病毒基因組以開發(fā)新一代病毒載體和復(fù)制裂解性癌癥療法我們開發(fā)了由組成部分快速離體組裝病毒基因組的新的重組策略，從而能夠?qū)Χ嘀匦揎椇彤愒丛M(jìn)行系統(tǒng)地組合。腺病毒載體的多種應(yīng)用潛能受限于快速和系統(tǒng)地改造和組合多重基因修飾的能力。當(dāng)前使用的方法主要依賴于基因組中在合適位置上存在的獨特的合適限制酶位點，一般來說不適合系統(tǒng)地使用或者不能在快速的單一步驟中生成準(zhǔn)確的復(fù)合修飾。大基因組DNA片段的操作和缺乏獨特的限制位點使這種方法有技術(shù)上的難度和受到限制。另一種方法需要生成帶有要改造基因組區(qū)域的小“穿梭”載體，和帶有病毒基因組的“骨架”載體。對這些載體來說主要限速步驟是重組，所述重組或者是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)通過同源重組發(fā)生的(概率非常小的事件，發(fā)生在隨機(jī)位點，需要進(jìn)行多輪噬菌斑純化來分離所需的重組體)，或者是在特殊的細(xì)菌菌株中通過同源重組發(fā)生的。這些方法有它們的局限性。

為了克服目前技術(shù)的局限性，我們開發(fā)了新的腺病毒基因組組裝策略，使得能夠快速和系統(tǒng)地過夜生成復(fù)合病毒突變體。這樣可以省略在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的低效不準(zhǔn)確重組、對BACs或穿梭載體的需要、費時費力的噬菌斑純化。這個策略提供了由組成部分快速體外組裝新的病毒基因組的能力，包括:1)對病毒基因的多重突變/修飾；2)來自其他病毒亞型的基因(例如結(jié)合不同受體的病毒外殼蛋白)，和改變血清型；3)異常基因，例如前藥轉(zhuǎn)化酶以便誘發(fā)強(qiáng)力的腫瘤旁觀者效應(yīng)；4)添加熒光報告物或標(biāo)簽用于體內(nèi)造影和診斷，以及5)定向體外病毒進(jìn)化。此外，這項技術(shù)利用了天然的病毒轉(zhuǎn)錄構(gòu)架，對于人Ad5它編碼了 36個基因(不包括剪接變體)，因此多蛋白復(fù)合體和整個途徑可以經(jīng)由腺病毒感染來組裝、遞送和共表達(dá)。為了克服Ad2/5和目前的方法學(xué)的局限，我們開發(fā)了 Adsembly方法，使得能夠體外由基因組組成部分和異源元件快速離體組裝腺病毒基因組。利用生物信息學(xué)手段，我們根據(jù)進(jìn)化保守序列、轉(zhuǎn)錄和功能模塊，將不同腺病毒基因組(36-38kb)分為5個單位。這5個單位的每一個包含基因組構(gòu)成成分文庫的相容部分，通過突變或異源元件的加入可以改變它們的功能和多樣性，并且這些功能和多樣性可以通過添加來自完全不同的腺病毒血清型、突變體和種的等同單位進(jìn)一步擴(kuò)展。為了制備具有獨特性能的新腺病毒，從文庫中選擇每個單位各一個，利用Adsembly (例如Ad-SlicR)快速體外重新組裝成完整基因組?？梢岳肁dsembly通過多位點特異性重組來組裝新的基因組，所述基因組在轉(zhuǎn)染后，即從質(zhì)粒骨架上自我剪接并復(fù)制產(chǎn)生新的病毒?？梢岳肁d-SlicR策略除去插入的重組序列以便實現(xiàn)更強(qiáng)力的病毒復(fù)制(如果需要)和臨床應(yīng)用。本文公開的策略可以使用基因組構(gòu)成元件文庫，所述文庫是由具有不同Ad2/5向性和其他所需特性的人和/或動物腺病毒制備的或者已經(jīng)經(jīng)過基因改造被賦予了改變的功能性。為了實現(xiàn)這一目的，我們利用了經(jīng)過修飾，特異性和效率得以提高的噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)，又被稱為Gateway 。被命名為attB、attP、attL和attR的四類重組位點經(jīng)由不同噬菌體酶進(jìn)行重組。最近鑒定到了新的att位點特異性，可以允許多個DNA片段以一定的順序和方向進(jìn)行同時重組。本文公開的是該系統(tǒng)的新應(yīng)用，即由基因組組成部分離體組裝整個病毒基因組。令人驚訝的是這項技術(shù)革新了腺病毒載體的建立和潛在應(yīng)用。使用引入了獨特attB位點(編號1-6)對的引物組來擴(kuò)增與之匹配的相鄰病毒基因組。Ad5腺病毒基因組長36kb，暫時劃分為“早期”(E)和“晚期”(L)轉(zhuǎn)錄單位，它們共同編碼36-40個基因。野生型Ad5/2、Ad5/2的突變體和完全不同的腺病毒亞型或動物病毒被用做DNA模板。將PCR片段重組到“入門”載體中生成含有腺病毒基因組組成元件的文庫。LR重組到目標(biāo)載體中使得個體元件多種排列組裝成新的病毒基因組(圖1B)。通過對目標(biāo)載體的抗生素抗性進(jìn)行的陽性選擇和對大腸桿菌中未反應(yīng)目標(biāo)載體進(jìn)行的陰性選擇(毒性基因ccdB提供的(Hartley et al.，2000))來協(xié)助這一過程。對于片段的數(shù)量或大小限制了重組效率的情況，制備了中間目標(biāo)載體，其中的第二 BP/LR反應(yīng)中發(fā)生modular replacement或者完全組裝。該快速病毒DNA操作新方法通過利用DNA重組的固有化學(xué)屬性改變了新病毒的工程化過程。還引入 了其他組合，例如，腺病毒34纖維蛋白，該蛋白與CD46細(xì)胞受體結(jié)合，能夠規(guī)避針對Ad2/5病毒產(chǎn)生的中和抗體。2.材料與方法采用以上指導(dǎo)方針，用以下參照成分制備了經(jīng)過改造的腺病毒。使用了 GatewayDONR載體。在人Ad5的例子中，經(jīng)PCR獲得El模塊并利用SLIC插入載體pDONR P1P4。利用PCR擴(kuò)增包含attLl和attL4重組位點的pDONR P1P4載體骨架，并通過SLIC與Ad5El模塊組合。為了制備替代的反選盒，對載體pDONR P1P4進(jìn)行了改造。包含attPl和attP4重組位點的該載體骨架利用PCR擴(kuò)增，并與PheSA294(:突變和四環(huán)素抗性盒(來自pENTR L3-pLac-Tet-L2的pLac-Tet盒)組合形成新的DONR載體。然后經(jīng)PCR擴(kuò)增新DONR 載體中的 attRl-PheSA294G-Tet (r) _attR4 片段，并插入到 Adsembly DEST 載體中。參見“MultiSite Gateway Pro Plus”，Cat#12537-100 和 Sone, T.et al.J Biotechnol.2008S印10;136(3-4):113—21。在人Ad5的例子中，E3模塊經(jīng)gateway BP反應(yīng)插入pDONR P5P3r載體。E4模塊經(jīng)gateway BP 反應(yīng)插入 pDONR P3P2 載體。來自 pDONR P5P2 載體的 attR5-ccdB_Cm(r) _attR2片段經(jīng) PCR 擴(kuò)增，插入 Adsembly DEST 載體中。參見 “MultiSite Gateway ProPlus”，Cat#12537-100;and Sone,T.et al.JBiotechnol.2008S印10;136 (3-4):113-21。用于Adsembly DEST載體的載體骨架是由來自三個不同來源的部分構(gòu)成的。Amp (r)盒和IacZ基因是從質(zhì)粒pUC19擴(kuò)增的。將它們與pl5A復(fù)制原點組合，所述復(fù)制原點來自質(zhì)粒 pSB3K5_I52002 (BioBricksiGEM2007partsdistribution 的一部分)。使質(zhì)粒保持在較低(10-12)拷貝數(shù)的pl5A ori是減少El毒性所需要的。最后，為了產(chǎn)生能夠自身切除的病毒，從pAdZ5-CV5-E3+質(zhì)粒PCR 1-SceI酶的哺乳動物表達(dá)盒。將該盒克隆到載體骨架中形成被稱為P15A-Scel的載體。這是啟動基因組組裝所使用的載體。在Ad5的例子中，基因模塊全部得自由野生型Ad5病毒純化的DNA或者質(zhì)粒pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen)。對于人Ad5例子中的DEST載體，將E2和L3模塊通過3片段SLIC插入質(zhì)粒pl5A_SceI。旁側(cè)帶有attR5和attR2位點的表達(dá)ccdB的反選標(biāo)記物和Chlor (r)通過PCR從質(zhì)粒pDONR P5P2獲得。第二反選標(biāo)記物(PheS-Tet)是經(jīng)PCR從載體pDONRPlP4PheSA294G-Tet (見上文)獲得。將這兩個反選標(biāo)記物用加在E2和L4模塊末端的獨特限制酶切割后，通過SLIC插入pl5A-SceI E2-L4的右側(cè)(ccdB/Cm)和左側(cè)(PheS/Tet)從而形成DEST載體。對于人Ad5的例子中含有腺病毒基因模塊的多位點gateway入門載體，將El模塊通過SLIC插入pDONR P1P4。E3模塊通過gateway BP反應(yīng)插入pDONR P5P3R。E4模塊經(jīng)gateway BP 反應(yīng)插入 pDONR P3P2。

對于Amp (r)盒:質(zhì)粒 pUC19、pl5A or1:質(zhì)粒 pSB3K5_I52002 是 BioBricksiGEM2007parts distribution的一部分。腺病毒基因模塊或者是來自由Ad5毒粒純化的DNA 或者是質(zhì)粒 pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen)。DONR 載體 pDONR P1P4、P5P2、P5P3R、P3P2來自Jon Chesnut (Invitrogen)。PheS基因來源于DH5alpha細(xì)菌基因組DNA,隨后通過Quickchange 形成 PheSA294G 突變體。對于 Tet (r)基因，質(zhì)粒 pENTR L3-pLac_Tet_L2 來自JonChesnut(Invitrogen)。對于Adsembly方法的實施方案，將20fmol雙DEST載體(一般含有旁側(cè)帶有兩個反選盒的核心模塊)與其余含有基因模塊的入門載體各IOfmol組合。在Ad5的例子中，這包括將20fmol E2-L3雙DEST載體與各IOfmol的El模塊入門載體、E3模塊入門載體和E4模塊入門載體組合。在一些情況中，增加一或多個入門載體的量可能提高效率(例如，給Ad5使用50fmolEl模塊入門載體)。將這些載體與2 μ I LR Clonase II (Invitrogen)在終體積10 μ I中組合。反應(yīng)于25° C過夜(12-16小時)溫育。加入I μ I蛋白酶K(Invitrogen)并在37° C溫育10分鐘來終止反應(yīng)。然后取5 μ I反應(yīng)轉(zhuǎn)化至對ccdB基因產(chǎn)物敏感的高感受態(tài)細(xì)菌(>le9cfu/μ g)，并鋪在 YEG-Cl 瓊脂板(如 Kast，P.Gene, 138 (1994) 109-114 中所描述的使用PheSA294(:反選時)或者其他對于載體使用的反選來說合適的培養(yǎng)基上。對于PCRs，所有PCR均使用Phusion酶(NEB)進(jìn)行。由Ad5獲得腺病毒基因模塊的PCR用Ix HF緩沖液、dNTP各200 μ Μ、引物各0.5 μ M和IOng模板進(jìn)行。對于E2-L2模塊，還添加了 3%DMS0。模板是質(zhì)粒 pAd/PL-DEST (Invitrogen;對于 E2-L2、L3-L4 和 E4 模塊)或者Ad5基因組DNA(對于El和E3模塊)。PCR條件如下。對于E2-L2和L3_L4:98。C30秒-98。ClO秒、65° C30秒(每2個循環(huán)降低1° C) ,72° C7分鐘，10個循環(huán)-98° ClO秒、60° C30秒、72° C8分鐘，29個循環(huán)-72° ClO分鐘-保持在4° C。對于E3:98° C30秒-98° ClO秒、70° C30秒(每個循環(huán)降低0.5° C)、72° C2分30秒，10個循環(huán)-98° ClO秒、68° C30秒、72° C2分30秒，25個循環(huán)-72° ClO分鐘-保持在4° C。對于E4:98° C30秒-98° ClO秒、63° C30秒(每個循環(huán)降低0.5° C)、72° C2分鐘，6個循環(huán)-98° ClO秒、60° C30秒、72° C2分鐘，29個循環(huán)-72° C5分鐘-保持在4° C。對于由純化的病毒獲得病毒基因組DNA，將最多100 μ I純化病毒加入300 μ I含有IOmM Tris pH8、5mM EDTA、200mM NaCl和0.2%SDS的裂解緩沖液?；旌弦河?0。C溫育5分鐘，之后加入5 μ I蛋白酶K儲液( 20mg/mL)，在60° C繼續(xù)溫育I小時。然后將樣品置于冰上5分鐘，隨后于15K X g轉(zhuǎn)15分鐘。取上清液加入等體積的異丙醇、混合均勻，15K X g于4° C旋轉(zhuǎn)15分鐘。沉淀用70%乙醇洗滌，再次4° C旋轉(zhuǎn)15分鐘。將沉淀干燥，重懸待用。對于SLIC，線性片段用外切核酸酶于室溫下在如下20μ I反應(yīng)中處理20分鐘:50mM Tris pH8、10mM MgCl2、50 μ g/mL BSA、200mM 脲、5mM DTT 和 0.5μ1 T4DNA 聚合酶。加入I μ 10.5Μ EDTA并在75° C溫育20分鐘來終止反應(yīng)。然后將等量的Τ4處理的DNA在新試管中混合至20 μ I。對于組合兩個片段的SLIC，每個反應(yīng)各使用10 μ I。對于組合三個片段的SLIC，每個反應(yīng)各使用7 μ I。通過加熱至65° ClO分鐘，然后每5秒降低0.5° C緩慢冷卻至25° C使片段退火。退火后，取5μ I反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化并篩選克隆。對于用于例如Ad5的AdSlicR，使用IOOng T4處理的pl5A_SceI (經(jīng)PCR線性化)和各300ng的E2和L3模塊(由它們各自的入門載體經(jīng)PCR獲得)進(jìn)行3片段SLIC反應(yīng)。這產(chǎn)生了載體 pl5A-SceI E2-L4。5μ g pl5A_SceI E2-L4 用 SwaI 切割并使用 QiagenQiaexII凝膠純化。E3和E4模塊由它們各自的入門載體經(jīng)PCR獲得。將各個被線性化的載體(450ng)和PCR產(chǎn)物(200ng)用T4DNA聚合酶處理，用150_200ng載體和 IOOng各模塊PCR正常進(jìn)行SLIC。分離陽性克隆，取5μ g新載體用PacI切割并凝膠純化，然后與ElPCR產(chǎn)物(IOOng T4處理過的)在新的SLIC反應(yīng)中組合?；蚪M組裝至此完成，質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)染來重建病毒。B.經(jīng)過改造的腺病毒腺病毒常用于基因轉(zhuǎn)移的用途。例如，它們被用于將轉(zhuǎn)基因遞送給培養(yǎng)物中的細(xì)胞、體內(nèi)動物組織或者對于基因治療遞送遞送給體內(nèi)人類細(xì)胞。這種方式使用腺病毒的一個限制因素是基因表達(dá)只是暫時的。腺病毒是非整合型病毒，因此一旦發(fā)生細(xì)胞分裂就會丟失轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。其他能夠發(fā)生整合的病毒系統(tǒng)，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒，被用于同樣的基因轉(zhuǎn)移目的。但是，這些天然具有整合能力的病毒較小，因此限制了可以表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的量，很難生長到高滴度，難以由它們表達(dá)多個轉(zhuǎn)基因，而且它們會整合到基因組中的隨機(jī)位置。已有試驗表明PhiC31整合酶可以介導(dǎo)含有 280bp attB序列的外來環(huán)形DNA整合到宿主細(xì)胞染色體中的特定位置，被稱為假性attP位點。已經(jīng)使用環(huán)形質(zhì)粒DNA展示了這個過程，但還沒有在諸如腺病毒的病毒中證明，可能是因為腺病毒基因組是線性的，因此或者不發(fā)生整合或者整合導(dǎo)致染色體斷裂。這里我們提供了可以這樣形成重組腺病毒基因組的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)在轉(zhuǎn)導(dǎo)后，基因組的一部分經(jīng)由ere介導(dǎo)的1xP位點重組變成環(huán)形，從而使得可以通過PhiC31整合酶/attB進(jìn)行定向整合。對于這項技術(shù)，以多種方式將腺病毒基因組進(jìn)行了改造(參見圖31-33)。首先，刪除了 El和E3區(qū)以便表達(dá)多個轉(zhuǎn)基因。E4區(qū)被表達(dá)ere重組酶和PhiC31整合酶的盒代替。利用tet-反應(yīng)性啟動子或其他類似的可調(diào)控元件來調(diào)節(jié)這些酶的表達(dá)?；蚪M中安置了兩個1xP位點，一個在El區(qū)的左端表達(dá)轉(zhuǎn)基因的地方，第二個位于纖維蛋白和E4區(qū)之間。因此位于兩個1xP位點之間的全部都被插入到細(xì)胞染色體中。最后，在E3區(qū)內(nèi)安置PhiC31attB位點，雖然可以將 這個短序列安排在其他位置只要是位于1xP位點之間(雖然本實施例中ere重組酶和PhiC31整合酶是由含有1xP位點和轉(zhuǎn)基因的同一個腺病毒表達(dá)的，也可以由分開的病毒表達(dá)這些酶)。在腺病毒被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中時，ere重組酶和PhiC31整合酶被誘導(dǎo)。Cre協(xié)助腺病毒基因組中的1xP位點的重組。這導(dǎo)致位于1xP位點之間的DNA發(fā)生環(huán)化。然后這使得整合酶利用片段中的attB位點將環(huán)形片段重組到細(xì)胞染色體中(參見圖33)。最終的結(jié)果是腺病毒基因組中選定的一部分被穩(wěn)定(非回復(fù)性)整合到宿主細(xì)胞染色體中有限的幾個位置之一。從這個整合片段穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因。沒有腺病毒復(fù)制或復(fù)活的風(fēng)險，因為1)E1區(qū)被刪除和2)在這個過程中病毒基因組的末端被刪除。這兩個區(qū)域是病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的。該系統(tǒng)與現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒系統(tǒng)相比的優(yōu)勢包括I)在基因組內(nèi)數(shù)量有限的位置發(fā)生整合，而不是隨機(jī)整合，2)提高了轉(zhuǎn)基因表達(dá)允許的大小，3)通過纖維蛋白修飾(圖39-42)或者使用其他腺病毒血清型和種(圖45)將腺病毒重新導(dǎo)靶到特異細(xì)胞或組織的能力，4)使用Adsembly系統(tǒng)操作的簡易性，5)生產(chǎn)高滴度病毒的簡易性和6)由單一載體進(jìn)行多基因表達(dá)的簡易性。該系統(tǒng)通過利用病毒介導(dǎo)的DNA遞送推進(jìn)了目前的PhiC31整合技術(shù)(由LifeTechnologies以“ Jump-1n”產(chǎn)品線銷售)?，F(xiàn)有技術(shù)只是基于質(zhì)粒的，因此局限于可以被有效地轉(zhuǎn)染或電穿孔的細(xì)胞。而且不能體內(nèi)使用除非生成特定的轉(zhuǎn)基因小鼠。腺病毒被常規(guī)用于體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因，因此極大地擴(kuò)展了現(xiàn)有技術(shù)的能力。一個體現(xiàn)是利用多基因表達(dá)盒通過將改造過的腺病毒可滴定地和定向地遞送到特異組織中來產(chǎn)生小鼠模型。另一個體現(xiàn)是含有att位點以便進(jìn)行靶向敲入的小鼠系。再一個體現(xiàn)是iPS。C.利用ADSEMBLY制備完整的近乎野生型腺病毒5型利用以下策略,使用Adsembly構(gòu)建了 Ad5的近乎野生型版本。將側(cè)翼帶有g(shù)ateway反選盒的野生型核心序列與野生型Ad5El模塊、野生型Ad5E3模塊和野生型Ad5E4模塊混合(圖21)。分離到含有完全組 裝好的基因組的克隆并轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。7天后可以看到噬菌斑，收集病毒并在更多293細(xì)胞上擴(kuò)增。生長分析顯示該近乎野生型的病毒(與真正的野生型病毒相比，它含有3個attB插入)達(dá)到的滴度只比真正的野生型病毒略低(圖28)。D.復(fù)制缺陷型突變體AD5的制備，所述突變體表達(dá)GFP，含有來自另外的血清型的纖維蛋白我們利用Adsembly制備了突變體Ad5。Ad5El模塊經(jīng)過改變，其中的ElA和ElB區(qū)被缺失，因此使得任何用這個新載體制備的病毒都是復(fù)制缺陷型的。除去ElA和ElB后，插入了含有CMV IE啟動子和GFP基因的哺乳動物表達(dá)盒。Ad5E3模塊的改變是用來自Ad34的纖維蛋白基因代替Ad5纖維蛋白基因。將這些突變體El和E3-纖維蛋白模塊與側(cè)翼帶有g(shù)ateway反選盒的野生型Ad5E4模塊和野生型Ad5核心模塊在標(biāo)準(zhǔn)Adsembly反應(yīng)中組合(圖21)。分離到含有完全組裝好的基因組的克隆并轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中。7天后可以看到噬菌斑，收集病毒并在更多293細(xì)胞上擴(kuò)增。該病毒的生長情況表明這一策略可以用于I)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，2)熒光基因表達(dá)，3)復(fù)制缺陷型病毒構(gòu)建體，4)制備嵌合腺病毒，和5)在Ad5背景中的替代的纖維蛋白表達(dá)。 E.利用ADSLICR制備可復(fù)制型AD5
利用AdSlicR由腺病毒基因模塊構(gòu)建野生型Ad5。野生型E3和E4模塊從它們的腺病毒基因模塊載體經(jīng)PCR獲得。將它們與SwaI切割的野生型Ad5核心模塊在標(biāo)準(zhǔn)SLIC反應(yīng)中組合(圖25)。分離到成功含有核心模塊和E3和E4模塊的克隆并用PacI進(jìn)行切害I]。然后將其與通過PCR從腺病毒基因模塊載體獲得的野生型Ad5El模塊在第二個SLIC反應(yīng)中組合。分離到含有完全組裝好的基因組的克隆并轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。到第7天有可見的噬菌斑。將得到的病毒在更多293細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增。對該病毒進(jìn)行的生長分析顯示它與野生型Ad5可以生長到同樣的滴度(圖28)。V.表格表1-9公開了利用本文提供的方法制備的腺病毒基因模塊載體、目標(biāo)載體和入門
載體的例子。
權(quán)利要求
1.制備重組腺病毒的方法，所述方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、和E4模塊的三個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述核酸包含El模塊。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸還包含E4模塊。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸還包含E2-L2模塊、L3-L4模塊，或者既有E2-L2模塊也有L3-L4模塊。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在組裝所述核酸之前，通過將三個或更多個腺病毒基因模塊中的兩個組合而形成大模塊。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中大模塊是E2-L4大模塊。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該方法包括由所述E2-L4大模塊和選自El模塊、E3模塊、或E4模塊的一或多個腺病毒基因模塊組裝所述核酸。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E 3模塊、和E4模塊的至少四個腺病毒基因模塊組裝所述核酸。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，該方法包括由El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、和E4模塊組裝所述核酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述核酸至少12kb。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述核酸包含缺失的腺病毒核酸序列、突變的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的E4-ORF3基因產(chǎn)物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的ElB-55k基因產(chǎn)物。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的腺病毒纖維蛋白基因產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的病毒外殼蛋白。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述異常腺病毒核酸序列編碼前藥轉(zhuǎn)化酶。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述非腺病毒基因產(chǎn)物是報告蛋白。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述非腺病毒基因產(chǎn)物是靶向蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述靶向蛋白是腫瘤靶向蛋白或者脈管系統(tǒng)靶向蛋白。
20.如權(quán)利要求I所述的方法，還包括轉(zhuǎn)錄所述核酸，從而形成重組腺病毒。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述重組腺病毒是可復(fù)制型的。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的。
23.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法是在體外實施的。
24.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組裝包括將可雜交型目標(biāo)載體與一或多個可雜交型腺病毒基因模塊雜交，從而形成腺病毒基因模塊載體。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述可雜交型目標(biāo)載體的形成是通過 (i)切割目標(biāo)載體從而形成線性目標(biāo)載體，和(ii)將所述線性目標(biāo)載體與外切核酸酶進(jìn)行接觸從而形成可雜交型的目標(biāo)載體。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述一或多個可雜交型腺病毒基因模塊的形成是通過 (i)將包含一或多個入門載體腺病毒基因模塊的入門載體與外切核酸酶進(jìn)行接觸，從而形成一或多個釋放出的入門載體腺病毒基因模塊，和 (ii)將一或多個釋放的入門載體腺病毒基因模塊與外切核酸酶進(jìn)行接觸，從而形成一或多個可雜交型腺病毒基因模塊。
27.如權(quán)利要求I所述的方法，其中組裝包括將可重組型的目標(biāo)載體和一或多個含有一或多個所述腺病毒基因模塊的可重組型入門載體與整合酶進(jìn)行接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中含有一或多個所述腺病毒基因模塊的所述可重組型入門載體的形成，是通過將一或多個可重組型腺病毒基因模塊和可重組型供體載體與整合酶進(jìn)行接觸，從而形成含有一或多個所述腺病毒基因模塊的所述可重組型入門載體。
29.如權(quán)利要求I所述的方法，其中組裝包括 (i)將可雜交型目標(biāo)載體與可雜交型第一腺病毒基因模塊雜交，從而形成第一腺病毒基因模塊載體；和 (ii)將所述第一腺病毒基因模塊載體和可重組型第二腺病毒基因模塊入門載體與整合酶進(jìn)行接觸，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述第一腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊、或E2-L4大模塊；第二腺病毒基因模塊是El模塊、E3模塊或E4模塊。
31.文庫，所述文庫包含復(fù)數(shù)個不同El模塊、復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、復(fù)數(shù)個不同E3模塊、復(fù)數(shù)個不同E4模塊或者復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊。
32.如權(quán)利要求31所述的文庫，其中所述復(fù)數(shù)個不同El模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、所述復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E3模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E4模塊、或所述復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊包含來自復(fù)數(shù)個腺病毒種的腺病毒基因模塊。
33.如權(quán)利要求32所述的文庫，其中所述復(fù)數(shù)個不同El模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、所述復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E3模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E4模塊或所述復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊包含來自一個以上人腺病毒血清型的腺病毒基因模塊。
34.如權(quán)利要求31所述的文庫，其中所述復(fù)數(shù)個不同El模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、所述復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E3模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E4模塊或所述復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊包含缺失的腺病毒核酸序列、取代的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列、或者編碼非腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。
35.如權(quán)利要求31所述的文庫，其中所述復(fù)數(shù)個不同El模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、所述復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E3模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E4模塊或所述復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊是可重組型的。
36.如權(quán)利要求31所述的文庫，其中所述復(fù)數(shù)個不同El模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E2-L2模塊、所述復(fù)數(shù)個不同L3-L4模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E3模塊、所述復(fù)數(shù)個不同E4模塊或所述復(fù)數(shù)個不同E2-L4大模塊是可雜交型的。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述方法制備的腺病毒基因組文庫。
全文摘要
本文提供了組裝改良腺病毒的方法、腺病毒基因模塊文庫和它們的組合物。
文檔編號C12N7/01GK103237889SQ201180050029
公開日2013年8月7日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者C.奧謝, C.鮑爾斯 申請人:薩克生物研究學(xué)院