專利名稱：體外肝分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多能人類細(xì)胞，尤其是人iPS細(xì)胞中肝分化的體外誘導(dǎo)。
背景技術(shù)：
通過過表達(dá)體細(xì)胞中的一些轉(zhuǎn)錄因子衍生人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(hIPSC)的可能性為再生醫(yī)學(xué)和體外疾病模型化開辟了新的機(jī)會(huì)[I]。已經(jīng)從患有各種疾病的患者產(chǎn)生了hIPSC[2] [3] [4]，當(dāng)這些細(xì)胞隨后分化為神經(jīng)祖細(xì)胞時(shí)它們具有多組報(bào)告疾病特異性表型[5] [6]。然而，迄今為止，并沒有報(bào)道過用于特異于非神經(jīng)元細(xì)胞(例如中胚層和內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞)的基于hIPSC的模型，也沒有報(bào)道作為僅在完全分化的成體細(xì)胞中觀察到的功能喪失的結(jié)果而發(fā)生的疾病(晚發(fā)性疾病)。此外，仍然關(guān)注的是，重編程和分化中固有的細(xì)胞應(yīng)力阻止hIPSC來源的細(xì)胞模型保留控制蛋白質(zhì)運(yùn)輸和活性的大量微妙的相互作用。理解這些相互作用對(duì)于理解多種疾病的機(jī)制是至關(guān)重要的并且還可為目前不能解釋的在相同基因背景的個(gè)體之間觀察到的臨床表型變化提供研究方向[7] [8] [9]。這些問題尤其與肝病有關(guān)并且尤其是肝臟的遺傳性代謝紊亂(MD)。這些疾病是由肝細(xì)胞中影響關(guān)鍵蛋白的基因突變?cè)斐傻摹１M管可通過全器官肝移植來治療這些疾病，但這一過程會(huì)帶來相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要更好地理解疾病機(jī)制并開發(fā)替代性治療方法[10] [11]。這樣的研究受到培養(yǎng)原代肝細(xì)胞的困難以及不能提供如實(shí)復(fù)制造成疾病的蛋白質(zhì)功能障礙和隨之而來的細(xì)胞缺陷的相關(guān)人類干細(xì)胞樣細(xì)胞系的限制[12]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于高效體外誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞成為肝祖細(xì)胞和肝細(xì)胞的方法。這種方法可用于例如產(chǎn)生用于基于細(xì)胞的治療或疾病模型化(disease modelling)的肝細(xì)胞。 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種用于誘導(dǎo)肝分化的方法，包括:( i )提供誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞的群體，(ii)在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該群體以產(chǎn)生前層確定型內(nèi)胚層(前確定性內(nèi)胚層，anterior definitive endoderm, ADE)細(xì)胞的群體，其中，該內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(chemically definedmedium)，其具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性并且刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路以及SMADU SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的信號(hào)通路并抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β (GSK3P);以及(iii)在肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADE細(xì)胞的群體以產(chǎn)生肝祖細(xì)胞的群體，其中，該肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(chemically defined medium),其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。該方法還可以包括:(iv)在肝成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖細(xì)胞的群體以產(chǎn)生肝細(xì)胞的群體。
優(yōu)選地，iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞是多能細(xì)胞,其來源于非多能性的完全分化的祖細(xì)胞(ancestor cells)。適合的祖細(xì)胞包括成體成纖維細(xì)胞和外周血細(xì)胞。通常通過向細(xì)胞中引入多潛能性基因或蛋白(例如0ct4、Sox2和Soxl)而對(duì)祖細(xì)胞進(jìn)行重新編程。該基因或蛋白可通過任何適合的技術(shù)被引入到分化的細(xì)胞中，包括質(zhì)?；蚋鼉?yōu)選地病毒轉(zhuǎn)染或直接蛋白遞送。也可以向細(xì)胞中引入其他基因以增加誘導(dǎo)效率，例如Kif基因，如Kif-1、Kif-2、Kif-4和Kif-5 ；Myc基因，如C-myc、Liyc和Niyc ；nanog ；以及Lin28。在引入多潛能基因或蛋白之后，可對(duì)祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。表達(dá)多潛能性標(biāo)記物的細(xì)胞可被分離和/或純化以產(chǎn)生iPS細(xì)胞的群體。用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(Yamanaka等人Nature2007;448:313_7;Yamanaka62007 年 6 月 7 日；I (I): 39-49.Kim 等人 Nature.2008Jul31; 454 (7204):646-50;Takahashi Cell.2007 年 11 月 30 日；131 (5):861-72.Park 等人 Nature.2008 年 I 月 10H ;451 (7175):141-6;Kim等人Cell Stem Cell.2009年6 月 5 日;4(6):472-6; Vallier, L.等人 Stem Cells, 2009.9999 (999A):ρ.Ν/Α.)iPS細(xì)胞可表達(dá)以下多潛能相關(guān)標(biāo)記物中的一種或多種:0ct4、Sox2、堿性磷酸酶、SSEA-3、Nanog,SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4 和 c_myc。在一些實(shí)施方式中，本文所述方法中使用的iPS細(xì)胞來源于獲自個(gè)體的健康細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞，即，沒有疾病相關(guān)表型或基因型的細(xì)胞。來源于健康細(xì)胞的iPS細(xì)胞可如本文所述使用以產(chǎn)生表現(xiàn)出正常(即，非疾病相關(guān))表型的肝細(xì)胞。健康細(xì)胞可獲自具有正常肝功能的個(gè)體或具有損傷的或功能障礙的肝細(xì)胞的患者，例如具有肝損傷或肝病的患者，例如肝炎(例如甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎)、肝硬化、肝細(xì)胞癌、非酒精性脂肪性肝病(non alcoholic fatty liver disease)、藥物引起的肝損傷、酒精性肝病或自身免疫性肝病。在一些實(shí)施方式中，iPS細(xì)胞可來源于獲自具有不同遺傳背景的個(gè)體。例如，iPS細(xì)胞可由患有肝病的個(gè)體、 具有高肝病患病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體和/或具有低肝病患病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的健康細(xì)胞產(chǎn)生。如本文所述由具有不同遺傳背景的個(gè)體產(chǎn)生的肝細(xì)胞可用于研究肝病的機(jī)制并確定治療靶標(biāo)。表現(xiàn)出正常(S卩，非疾病相關(guān))表型的肝細(xì)胞可用于對(duì)患有肝損傷或肝病的患者進(jìn)行治療，如下文所述，例如作為健康細(xì)胞來源的患者，iPS細(xì)胞獲自該患者。在其他的實(shí)施方式中，本文所述的方法中使用的iPS細(xì)胞來源于獲自個(gè)體的疾病相關(guān)細(xì)胞，即，表現(xiàn)出與肝病或肝功能障礙相關(guān)的表型或基因型的細(xì)胞，例如肝臟的遺傳性代謝病GMD)，如α I抗胰蛋白酶缺乏癥、糖原貯積病如Ia型糖原貯積病、家族性高膽固醇血癥、遺傳性酪胺酸血癥(遺傳性高酪胺酸血癥)、克里格勒-納賈爾(Crigler Najjar)綜合征、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、或因子IX缺乏癥或其他血友病(haemophilia)、血色病(haemochromatosis)、威爾遜氏病、杜賓-約翰遜綜合征、家族性淀粉樣變性病、或雷夫敘姆病?？梢圆捎镁哂欣缗cIMD或其他肝病相關(guān)的基因突變或缺陷的基因型的細(xì)胞，實(shí)例為成纖維細(xì)胞，例如可常規(guī)獲得的皮膚成纖維細(xì)胞。可以如本文所示使用來源于獲自個(gè)體的疾病相關(guān)細(xì)胞的iPS細(xì)胞(S卩，疾病特異性iPS細(xì)胞:ds-1PS或dhIPS)以產(chǎn)生表現(xiàn)出肝病相關(guān)的表型的肝細(xì)胞，例如MD表型。通常，肝細(xì)胞含有與該肝病相關(guān)的基因突變或缺陷。這些細(xì)胞可用于治療患有如上文所述的肝損傷或疾病的患者或用于肝病模型化(modelling)和篩查。在其他的實(shí)施方式中，來源于獲自患有肝病的個(gè)體的疾病相關(guān)細(xì)胞的iPS細(xì)胞(即，疾病特異性iPS細(xì)胞:ds-1PS或dhIPS)含有與該肝病相關(guān)的基因突變或缺陷，例如α 1-抗胰蛋白酶中的Glu342Lys，其是AlAT缺乏的原因。該突變或缺陷可在分化前在iPS細(xì)胞中被修正。例如，可用野生型核苷酸序列替換含有疾病相關(guān)的基因突變或損傷的ds-1PS細(xì)胞中的核苷酸序列。用于修正基因突變和缺陷的適合方法是本領(lǐng)域中公知的并且在本文中其他地方描述。這些修正的iPS細(xì)胞(c-1PSC)可被用于對(duì)患有如上文所述的肝損傷或肝病的患者進(jìn)行治療。肝病如上文所述，并且可以包括遺傳性代謝紊亂(MD)。MD可以是與ER中的蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊相關(guān)的MD，例如α 1-抗胰蛋白酶缺乏；肝相關(guān)性受體功能喪失，例如家族性高膽固醇血癥(FH);代謝紊亂，例如糖原儲(chǔ)存病，如GSDla。肝病可以是遲發(fā)性病癥或與成熟成體肝細(xì)胞相關(guān)的病癥。在iPS細(xì)胞群體產(chǎn)生之后，可利用常規(guī)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)或維持(Vallier，L.等人 Dev.Biol.275，403-421 (2004)，Cowan, C.A.等人 N.Engl.J.Med.350，1353-1356 (2004)，Joannides, A.等人 Stem Cells24, 230-235 (2006) Klimanskaya, 1.等人 Lancet365, 1636-1641 (2005)，Ludwig, T.E.等人 Nat.Biotechnol.24，185-187 (2006))。例如，適合用于本方法中的iPS細(xì)胞，尤其是人iPS細(xì)胞，可以在培養(yǎng)皿中在飼養(yǎng)細(xì)胞層上常規(guī)培養(yǎng)，例如經(jīng)輻照的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，例如在補(bǔ)充有4ng/ml FGF2的Knockout (KS)培養(yǎng)基中以適當(dāng)?shù)拿芏?例如IO5至IO6細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)，或在具有飼養(yǎng)條件培養(yǎng)基或成分確定的培養(yǎng)基的適當(dāng)基質(zhì)(substrate)上培養(yǎng)。優(yōu)選地，本文所述的方法中使用早期傳代iPS細(xì)胞。早期傳代iPS細(xì)胞是經(jīng)過40代或更少，優(yōu)選35代或更少，或 30代或更少次培養(yǎng)的細(xì)胞。本發(fā)明方法中使用的iPS細(xì)胞可通過酶促方法或機(jī)械方法進(jìn)行傳代。適合用于iPS細(xì)胞的培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有4ng/ml FGF2的Knockout (KS)培養(yǎng)基；補(bǔ)充有20%血清補(bǔ)充物、1%非必需氨基酸、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM β -巰基乙醇以及4ng/ml至10ng/ml人FGF2的Knockout達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(K0-DMEM);以及補(bǔ)充有20%的 knockout 血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、6ng/ml FGF2(PeproTech)、ImM L-GlnUOO μ m非必需氨基酸、100 μ M2-巰基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的DMEM/F12。優(yōu)選地，在培養(yǎng)期間利用無膠原酶試劑例如Accutase (Bioffest)來收獲細(xì)胞。iPS細(xì)胞根據(jù)本文所述方法分化為肝細(xì)胞在三個(gè)階段中發(fā)生。在第一階段，iPS細(xì)胞的群體分化為前層確定型內(nèi)胚層(anterior definitive endoderm, ADE)細(xì)胞。在第二階段，ADE細(xì)胞分化為肝祖細(xì)胞(h印atic progenitor)，并且在可選的第三階段，該肝祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞。這些方法中使用的所有培養(yǎng)基都是化學(xué)成分確定的并且優(yōu)選是人源化的。為了誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的群體分化為ADE細(xì)胞，在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該iPS細(xì)胞的群體。內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基為化學(xué)成分確定培養(yǎng)基(chemically defined medium, CDM),其(i)刺激由SMAD1、SMAD2、SMAD3和SMAD5介導(dǎo)的信號(hào)通路；(ii)抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β (GSK3 0 );并且(iii)具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)活性。
化學(xué)成分確定培養(yǎng)基是用于培養(yǎng)細(xì)胞的營養(yǎng)液，其僅含有特定的組分，優(yōu)選為已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的組分。優(yōu)選地，該化學(xué)成分確定培養(yǎng)基是人源化的。人源化的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基缺乏來源于非人類動(dòng)物的組分或補(bǔ)充物，例如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)和小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞。內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含化學(xué)成分限定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有胰島素(例如0.5 μ g/ml至70 μ g/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(例如濃度為1.5 μ g/ml至150 μ g/ml)、抗氧化劑(例如1_硫代甘油,例如濃度為45 μ M至4.5mM)和脂質(zhì)的MDM和/或F12。適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Johansson and Wiles CDM (Johansson和Wiles (1995)Mol Cell Bioll5, 141-151)，其中補(bǔ)充有聚乙烯醇、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和確定的脂質(zhì)。Johansson and Wiles CDM 由以下物質(zhì)組成:50%MDM (Gibco)+50%F12NUT_MIX(Gibco) ；7 μ g/ml胰島素、15 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；lmg/ml聚乙烯醇(PVA) ; 1%化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物(Invitrogen);以及450 μ Ml-硫代甘油。其他適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中公知的。為了避免使用牛血清白蛋白或人血清白蛋白，該化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基補(bǔ)充了濃度為0.5mg/ml至50mg/ml的聚乙烯醇(PVA)。補(bǔ)充有聚乙烯醇的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常被稱為CDM-PVA。在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，CDM-PVA補(bǔ)充有另外的因子，優(yōu)選重組人因子，其誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化為前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞。例如，CDM-PVA補(bǔ)充有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一種通過與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)結(jié)合而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞分化的蛋白因子。適合的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括FGF家族的任何成員，例如FGFl至FGF14以及FGF15至FGF23中的任一種。 優(yōu)選地，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為FGF2 (NCBI GeneID:2247，核酸序列NM_002006.361:41352694,氨基酸序列 NP_001997.4G1:41352695) ；FGF7 (也被稱為角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(或 KGF)，NCBI GeneID:2247，核酸序列 NM_002006.3G1:41352694，氨基酸序列 NP_001997.4G1:41352695)；或 FGFlO (NCBI GeneID:2247,核酸序列NM_002006.3G1: 41352694，氨基酸序列 ΝΡ_001997.461:41352695)。更優(yōu)選地，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為FGF2 (Amit, M.，等人DevelopmentalBiology227:271-278 (2000))。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如FGF2、FGF7和FGF10)可以利用常規(guī)重組技術(shù)獲得或獲自供應(yīng)商(例如，R&D Systems, Minneapolis, MN; Stemgent Inc, USA)。方便地，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的FDF濃度為I至500ng/ml,優(yōu)選約為40ng/ml。CDM-PVA可進(jìn)一步補(bǔ)充有第一 TGF β配體，其在iPS細(xì)胞中刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。TGFβ配體是TGFii超家族的肽。TGFβ超家族的成員具有特征結(jié)構(gòu)并且是本領(lǐng)域中公知的。第一 TGFP配體可以為活化素(Activin)或TGFβ?；罨?活化素A:NCBI GeneID:3624 核酸參考序列 NM_002192.2G1:62953137，氨基酸參考序列NP_002183.1G1:4504699)是一種二聚體多肽，其通過刺激活化素/Nodal通路發(fā)揮一定范圍的細(xì)胞作用(Vallier等人，Cell Sciencel 18:4495-4509 (2005) )0活化素可容易地從商業(yè)來源獲得(例如Stemgent Inc.MA USA)。方便地，培養(yǎng)基中活化素的濃度可以為10至1000ng/ml,優(yōu)選約為100ng/ml。TGFP (NCBI GeneID:7040 核酸參考序列 ΝΜ_000660.4G1:260655621，氨基酸參考序列NP_000651.3G1:63025222)是一種調(diào)節(jié)增殖和分化的同源二聚體多肽(Watabe，T.等人(2009).Cell Res.19:103-115)。重組人TGFP可容易地從商業(yè)來源獲得(例如StemgentInc.MA USA)。方便地，培養(yǎng)基中TGFP的濃度可以為10至1000ng/ml，優(yōu)選約為100ng/ml。CDM-PVA可進(jìn)一步補(bǔ)充有第二 TGFP配體，其在iPS細(xì)胞中刺激SMAD1、SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào) 通路。第二 TGFP配體可以是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合于骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)并通過由SMAD1、SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的通路刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。適合的骨形態(tài)發(fā)生蛋白包括BMP家族的任何成員，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6或BMP7。優(yōu)選地,第二 TGFP 配體為 BMP2 (NCBI GeneID: 650，核酸序列 NM_001200.2G1:80861484 ;氨基酸序列 NP_001191.1G1:4557369)或 BMP4 (NCBIGeneID:652,核酸序列NM_001202.3G1:157276592 ;氨基酸序列 NP_001193.2G1: 157276593)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白可利用常規(guī)重組技術(shù)產(chǎn)生或獲自供應(yīng)商(例如R&D, Minneapolis, USA, Stemgent Inc, USA)。方便地，培養(yǎng)基中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP2或BMP4)的濃度可以為I至500ng/ml,優(yōu)選為約10ng/ml。因此，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以包含補(bǔ)充有聚乙烯醇、FGF、第一和第二 TGFii配體、PI3K抑制劑和GSK3 β抑制劑的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。ΡΙ3Κ抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶(例如磷脂酰肌醇_4，5_ 二磷脂酸鹽3_激酶(EC2.7.1.153))的活性。適合的ΡΙ3Κ抑制劑包括渥曼青霉素、LY301497(17-b-羥基渥曼青霉素);LY294002(2-嗎啉-4 基-8-苯并色-4-酮=Maclean 等人(2007) Stem Cells2529_38) ；CLB1309(KN309: (±) -2- ({1- [7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧-批啶并[I，2_a]嘧啶 _9_基]乙基}氨基)苯甲酸);PX-866( (IE, 4S, 4aR, 5R, 6aS, 9aR) -5-(乙酰氧基)_1_[(二 _2_ 丙烯-1-基氨基)亞甲基]-4，4a, 5, 6, 6a, 8, 9, 9a_八氫-11-輕基_4_(甲氧基甲基)_4a, 6a_ 二甲基環(huán)戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2，7，10(1!1)-三酮)；比87114 (喹諾酮吡咯并嘧啶;#6圖17)；GDC-0941(#3圖17; 2-(IH-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺?；?-1-哌嗪基]甲基]_4_(4-嗎啉基)-噻吩并[3，2-d]嘧啶)；TGX-221 (7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[1-(苯基氨基)乙基]-4H-吡啶并[I, 2-a]嘧啶-4-酮)、槲皮素；BEZ235 (#4 圖 17)；XL147 (#1 圖 17)；X1765(#2 圖 17) ;PX-866 (#5 圖 17) ;ZSTK474 (2-(2-二氟甲基苯丙咪唑-1-基)4，6-二嗎啉代-1, 3，5-三嗪);和SF1126 (2-[2-甲氧基乙基氨基]_8_苯基-4H-1-苯并吡喃_4_酮)。其他的PI3K抑制劑是本領(lǐng)域可獲得的。適合的PI3K抑制劑可獲自供應(yīng)商(例如Calbiochem CA USA)。例如，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以含有I至100 μ M的ΡΙ3Κ抑制劑(例如LY294002)，優(yōu)選約10 μ Mo
GSK3 0抑制劑抑制糖原合酶激酶3β (Gene ID2932:EC2.7.11.26)的活性。適合的抑制劑包括CHIR99021 (6- ((2- ((4- (2，4- 二氯苯基)_5_ (4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶 _2_ 基)氨基)乙基)氨基)煙腈；Ring D.B.等人，Diabetes, 52:588-595 (2003))alsterpaullone、kenpaullone (9-溴-7，12- 二氫卩引哚并[3，2-D] [I]苯并氮雜卓-6(5H)_ 酮)、SB216763 (3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡P各-2，5- 二麗)，和SB415286 (3_[ (3-氣~4~輕苯基)氨基]~4~ (2-硝基苯基)-1H-批咯-2，5-二酮)。適合的糖原合酶激酶3 β抑制劑可獲自供應(yīng)商(例如，Stemgent Inc.MAUSA; Cayman Chemical C0.MI USA)。例如，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以含有0.3 μ M至30 μ M的GSK3 β抑制劑，例如CHIR99021，優(yōu)選約3 μ M0在一些實(shí)施方式中，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以由補(bǔ)充有活化素、FGF2、ΒΜΡ-4、磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑(優(yōu)選LY294002)、和糖原合酶激酶3 β抑制劑(優(yōu)選CHIR99021)的CDM-PVA基礎(chǔ)培養(yǎng)基構(gòu)成。優(yōu)選地，內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的活化素、FGF2和ΒΜΡ-4均為重組人蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物是本領(lǐng)域中公知的(參見，例如Basic CellCulture Protocols, C.Helgason, Humana Press Inc.U.S.(2004 年 10 月 15 日)ISBN:1588295451;Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular MedicineS.) Humana Press Inc., U.S.(2004 年 12 月 9 日)ISBN:1588292223;Culture of AnimalCells: A Manual of Basic Technique, R.Freshney, John ffiley&Sons Inc (2005 年 8 月2 日)ISBN:0471453293，Ho WY et al J Immunol Methods.(2006)310:40-52，Handbookof Stem Cells (ed.R.Lanza) ISBN:0124366430)。培養(yǎng)基及其成分可獲自商業(yè)來源(例如，Gibco, Roche, Sigma, Europa bioproducts, R&D Systems)。可以米用標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件，例如37° C，21%氧氣，5% 二氧化碳。優(yōu)選每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基并使得細(xì)胞通過重力沉降。 優(yōu)選在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的單層中在涂覆有血清(優(yōu)選人血清)或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如纖連蛋白、層粘連蛋白或膠原)的基質(zhì)(substrate)上培養(yǎng)細(xì)胞。適合的培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，iPS細(xì)胞分化為前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞可在三個(gè)單獨(dú)的步驟中進(jìn)行。例如，iPS細(xì)胞群體向ADE細(xì)胞的分化可以包括:(a)在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)iPSC群體例如12至36小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)；(b)在沒有糖原合酶激酶3 β抑制劑的內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)該群體例如12至36小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)；以及(c)在刺激SMAD2和SMAD3信號(hào)通路并且具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)該群體例如12至36小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)，以產(chǎn)生前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體。ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其包含化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括RPM1-1640。RPM1-1640 (Moore, G.E.和 Woods L.K., (1976) Tissue Culture AssociationManual.3，503-508)是一種無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、抗氧化劑和緩沖劑。RPM1-1640是本領(lǐng)域中公知的并且可容易地從商業(yè)來源獲得(例如，Sigma-AldrichMI USA)。表2中示出了 RPM1-1640培養(yǎng)基的組分?；瘜W(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充物。適合的無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充物包括 B27 (Brewer 等人 J.Neurosci Res35567_576 (1993))和 NS21 (Chen 等人J.Neurosci Meths (2008) 171239-247)。無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充物，例如B27和N21是本領(lǐng)域公知的并且可從商業(yè)渠道廣泛獲得(例如，Invitrogen;Sigma Aldrich Inc)。在ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基還補(bǔ)充有另外的因子(優(yōu)選重組人因子)以產(chǎn)生前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體。例如，化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可補(bǔ)充有刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)通路的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和第一TGF^配體。上文中更加詳細(xì)地描述了 FGF和第一 TGF β配體。在一些實(shí)施方式中，ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以包含補(bǔ)充有I至1000ng/ml第一 TGF β配體，例如活化素，優(yōu)選100ng/ml,以及4至400ng/ml的FGF,例如FGF2,優(yōu)選40ng/ml FGF的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有B27或NS21培養(yǎng)基補(bǔ)充物的RPM1-1640。優(yōu)選地，培養(yǎng)iPS細(xì)胞的群體2至4天，最優(yōu)選3天，以產(chǎn)生ADE細(xì)胞的群體。前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞可以表達(dá)內(nèi)胚層標(biāo)記物，例如Soxl7、foxA2、GSC、Mixl1、LhxI，、CXCR4、GATA6、Eomes 和 Hex。前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體可以不表達(dá)多潛能性標(biāo)記物或與外胚層或中胚層譜系相關(guān)的標(biāo)記物。例如，ADE細(xì)胞可以不以可檢測(cè)水平表達(dá)以下標(biāo)記物中的一種或多種，優(yōu)選全部:0ct4、Sox2、堿性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60 和 KLF-4。

可在分化中的細(xì)胞群體中監(jiān)測(cè)和/或檢測(cè)一種或多種ADE細(xì)胞標(biāo)記物和/或一種或多種多能細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。這使得能夠確定該細(xì)胞群體的分化或內(nèi)胚層誘導(dǎo)的范圍。在分化之后，可將ADE細(xì)胞的群體與其他細(xì)胞類型基本上分離。例如，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，該群體可含有85%或更多，90%或更多，95%或更多，或98%或更多的ADE細(xì)胞。優(yōu)選地，該ADE細(xì)胞的群體與不需要純化的其他細(xì)胞類型充分分離。如果需要，通過任何常規(guī)技術(shù)(例如FACS)來純化ADE細(xì)胞的群體。在一些實(shí)施方式中，可在進(jìn)一步分化為肝譜系之前擴(kuò)增該ADE細(xì)胞的群體?？赏ㄟ^任何常規(guī)技術(shù)例如在補(bǔ)充有FGF的培養(yǎng)基(例如上文所述的ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中擴(kuò)增ADE細(xì)胞。為了誘導(dǎo)ADE細(xì)胞的群體分化為肝祖細(xì)胞，在肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該ADE細(xì)胞的群體。肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)，其刺激由SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路并誘導(dǎo)分化為肝譜系。肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含補(bǔ)充有一種或多種誘導(dǎo)ADE細(xì)胞分化為肝祖細(xì)胞的另外的因子(優(yōu)選重組人因子)的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CDM)包括上文所述的RPM1-1640。CDM可以補(bǔ)充有刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路的第一 TGFP配體，例如上文所述的TGF β或活化素。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5至500ng/ml的第一 TGFP配體，例如活化素，優(yōu)選約50ng/ml οADE細(xì)胞的群體可培養(yǎng)4至6天，優(yōu)選約5天，以產(chǎn)生肝祖細(xì)胞的群體。
可在分化中的細(xì)胞群體中監(jiān)測(cè)和/或檢測(cè)一種或多種肝祖細(xì)胞標(biāo)記物和/或一種或多種ADE細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。這使得能夠確定所培養(yǎng)的分化的范圍(程度)。肝祖細(xì)胞能夠分化為肝細(xì)胞或分化為膽管上皮細(xì)胞并表達(dá)兩種譜系的標(biāo)記物。肝祖細(xì)胞可表達(dá)α-胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白18 (CK18)、細(xì)胞角蛋白19 (CK19)、肝細(xì)胞核因子4 (HNF4)、和肝細(xì)胞核因子6 (HNF6)中的一種或多種。這些標(biāo)記物中的一種或多種的檢測(cè)是分化為肝譜系的指征?？蓪⒏巫婕?xì)胞的群體與其他細(xì)胞類型基本上分離。例如，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，該群體可含有80%或更多，85%或更多，90%或更多，或95%或更多的肝祖細(xì)胞。優(yōu)選地，將肝祖細(xì)胞的群體與不需要純化的其他細(xì)胞類型充分分離。如果需要，通過常規(guī)技術(shù)來純化肝祖細(xì)胞的群體。在如上文所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，將肝祖細(xì)胞的群體與培養(yǎng)基分離和/或從培養(yǎng)基除去。適合的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的?？蓪⒏巫婕?xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增、保持、儲(chǔ)存，例如利用常規(guī)技術(shù)冷凍儲(chǔ)存，或用于治療或本文所述的其他應(yīng)用。例如，如下文所述，肝祖細(xì)胞可用于基于細(xì)胞的治療。在一些實(shí)施方式中，方法可包括誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞。為了誘導(dǎo)分化，在肝成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖細(xì)胞的群體，該肝成熟培養(yǎng)基由補(bǔ)充有另外的因子(優(yōu)選重組人因子)的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CDM)構(gòu)成，以誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞成熟為肝祖細(xì)胞。適合的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CDM)包括CMRL和h印atozyme SFM(GIBCO ; Invitrogen Inc)。

CMRL基礎(chǔ)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中公知的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基并且可容易地通過商業(yè)來源獲得(例如 Cat No: 11530037Invitrogen; Product#C0422Sigma)o 表 3 中示出了 CMRL 培養(yǎng)基的組成。hepatozyme SFM是一種可通過商業(yè)來源獲得的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如CatNol7705; InvitrogenX化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CDM)可補(bǔ)充有一種或多種誘導(dǎo)肝母細(xì)胞或肝祖細(xì)胞分化或成熟為肝細(xì)胞的因子。例如，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可補(bǔ)充有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)或表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)0肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)(NCBI GeneID: 3082，核酸序列 ΝΜ_000601.4G1: 58533168，氨基酸序列NP_000592.3G1:33859835)是一種間充質(zhì)來源的分裂素，其是SI肽酶的纖溶酶(plasminogen)亞家族的成員JGF可利用常規(guī)重組技術(shù)產(chǎn)生或獲自供應(yīng)商(例如PeprotechIncNJ USA)。通常，培養(yǎng)基中HGF的濃度可以是2至200 μ g/ml，優(yōu)選約20 μ g/ml。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF) (NCBI GeneID: 1950,核酸序列ΝΜ_001178130.1G1: 296011012，氨基酸序列 NP_001171601.1G1: 296011013; Reynolds, B.A.等人J.Neurosc1.12:4565-4574(1992))是一種通過與其受體(EGFR)結(jié)合來調(diào)節(jié)增殖和分化的生長(zhǎng)因子。EGF可利用常規(guī)重組技術(shù)產(chǎn)生或獲自供應(yīng)商(例如P印rotech Inc NJUSA, Stemgent IncUSA) 通常，培養(yǎng)基中EGF的濃度為2至200 μ g/ml，優(yōu)選約20 μ g/ml。化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)也可以補(bǔ)充有一種或多種誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化和成熟的因子，例如制瘤素-M (oncostatin-M)。制瘤素_M (NCBIGeneID:5008,核酸序列NM_020530.3G1:28178862,氨基酸序列 NP_065391.1G1: 10092621)是 IL-6 家族的細(xì)胞因子。制瘤素-M可以利用常規(guī)重組技術(shù)產(chǎn)生或獲自供應(yīng)商(例如R&D Systems, MN USA; AbeamLtd, UK)o通常，培養(yǎng)基中制瘤素-M的濃度可以為I至100 μ g/ml,優(yōu)選約10 μ g/ml。肝祖細(xì)胞的群體可培養(yǎng)10至40天，優(yōu)選約25天，以產(chǎn)生肝細(xì)胞的群體。肝細(xì)胞可以表達(dá)白蛋白，α 1-抗胰蛋白酶(AAT)，細(xì)胞色素p450 (CYP)例如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9 和 CYP2D6，因子 IX，載脂蛋白 A2，CEBPa 和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中，肝細(xì)胞可以不表達(dá)祖細(xì)胞(progenitor)標(biāo)記物如AFP、CK18和Soxl7中的一種或多種?？杀O(jiān)測(cè)和/或檢測(cè)細(xì)胞群體中一種或多種肝祖細(xì)胞標(biāo)記物和/或一種或多種肝細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。例如，可確定肝細(xì)胞的群體表達(dá)或產(chǎn)生的白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。這使得能夠確定和/或監(jiān)測(cè)培養(yǎng)的群體中分化的程度。可通過任何適合的技術(shù)來確定細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，包括免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光分析、RT-PCR、熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)以及酶分析?？梢员O(jiān)測(cè)和/或確定執(zhí)行一種或多種肝細(xì)胞功能的群體中細(xì)胞的能力。例如，可以監(jiān)測(cè)和/或確定細(xì)胞執(zhí)行解毒作用、糖原貯積、分泌AAT或白蛋白、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素產(chǎn)生、血管緊張素產(chǎn)生、氨轉(zhuǎn)化為尿素(尿素循環(huán))、膽固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪形成中的一種或多種的能力。可將肝細(xì)胞的群體與其他細(xì)胞類型基本分離。例如，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，該群體可含有80%或更多，85%或更多，90%或更多，95%或更多，的肝細(xì)胞。如上文所述，可通過白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶的 表達(dá)來確定群體中肝細(xì)胞的存在或比例。優(yōu)選地，肝細(xì)胞的群體與不需要純化的其他細(xì)胞類型充分分離。如果需要，通過任何常規(guī)技術(shù)(包括FACS)來純化肝細(xì)胞的群體。可對(duì)在本文所述方法中的任意階段產(chǎn)生的ADE細(xì)胞、肝祖細(xì)胞和/或肝細(xì)胞進(jìn)行分離和/或純化。可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)將細(xì)胞與群體中的其他細(xì)胞類型分離，包括那些基于通過抗體和磁珠或熒光活化細(xì)胞分選(FACS)來識(shí)別細(xì)胞外抗原決定簇(表位，epitope)的技術(shù),包括使用抗如下文所述的特征標(biāo)記物的細(xì)胞外區(qū)域的抗體?？衫脴?biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)來擴(kuò)增、培養(yǎng)或保持如本文所述產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體。在一些實(shí)施方式中，可通過冷凍干燥和/或低溫貯存來儲(chǔ)存如本文所述產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體?？蓪⒏渭?xì)胞的群體與其他試劑混合，例如緩沖劑、載體、稀釋劑、防腐劑或藥用賦形劑。下文中更加詳細(xì)地描述了適合的試劑。如上文所述，疾病特異性iPS細(xì)胞可用于產(chǎn)生顯示出與肝病(例如MD)相關(guān)的表型的肝細(xì)胞。具有與疾病相關(guān)表型的肝細(xì)胞可以表現(xiàn)出一種或多種與該疾病相關(guān)的病理學(xué)(特征)。如本文所述的方法包括檢測(cè)或測(cè)量肝細(xì)胞群體中的一種或多種疾病病理學(xué)。疾病病理學(xué)可以包括在所述肝細(xì)胞群體中的異常生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡增加、異?；虮磉_(dá)；對(duì)胰升糖素(胰高血糖素，glucagon)刺激的異常響應(yīng)；蛋白聚集或聚合；ER中的蛋白捕獲(protein entrapment);膽固醇攝取；脂質(zhì)和/或糖原累積；乳糖產(chǎn)生；以及上文所述的一種或多種肝細(xì)胞功能缺失中的一種或多種。產(chǎn)生具有疾病病理學(xué)的肝細(xì)胞的方法可以包括:如上文所述誘導(dǎo)ds-1PS細(xì)胞的群體的體外肝分化，從而產(chǎn)生具有疾病病理學(xué)的肝細(xì)胞的群體。來源于ds-1PS細(xì)胞的肝細(xì)胞可在從ds-1PS細(xì)胞開始分化的10天、20天或40天內(nèi)顯示出疾病病理學(xué)特征。在具有疾病表型(例如MD表型)的肝細(xì)胞產(chǎn)生后，可對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增或保持，例如用于篩選。保持具有疾病表型的肝細(xì)胞的方法包括如上文所述培養(yǎng)來源于ds-1PS細(xì)胞的具有疾病表型的肝細(xì)胞群體。本發(fā)明的另一方面提供了由上述方法產(chǎn)生的分離的肝細(xì)胞的群體或肝祖細(xì)胞的群體。該群體可含有80%或更多，85%或更多，90%或更多，或95%或更多的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞。由本文所述方法產(chǎn)生的肝細(xì)胞可以顯示出一種或多種特異于成熟肝細(xì)胞的功能或功能性特征。例如，該肝細(xì)胞能夠儲(chǔ)存糖原和LDL、分泌AAT和/或白蛋白、通過CytP450途徑代謝藥物以及在肝細(xì)胞特異性Ap0AII啟動(dòng)子的控制下表達(dá)GFP蛋白。該肝細(xì)胞能夠產(chǎn)生膽汁、血小板生成素(thrombopoietin)、血管緊張素、尿素和膽固醇中的一種或多種；并執(zhí)行糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中，肝細(xì)胞可以不完全分化為成熟的成體肝細(xì)胞而是可以繼續(xù)表達(dá)一種或多種祖細(xì)胞標(biāo)記物(例如AFP);表達(dá)降低水平的Alb和/或顯示出與成熟成體肝細(xì)胞相比降低的CYP3A4活性。肝細(xì)胞可以顯示出以下特征中的一種或多種:偶發(fā)性雙核(occasionalbinucleity);糖原忙積；頂部微突(apical microprotrusion);粗糙和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)以及突出的高爾基體。由本文所述的方法產(chǎn)生的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞不表達(dá)用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞的外源性重編程因子，其仍可以作為逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因(retroviral transgene)而存在于細(xì)胞中。肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞的群體可用于人體或動(dòng)物體治療的方法中，例如對(duì)具有損傷的或功能障礙的肝組織的患者進(jìn)行治療。該群體也可用于制造用于治療損傷的或功能障礙的肝組織的藥物。具有損傷的或功能障礙的肝組織的個(gè)體可能患有肝炎(例如、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎(hepatitis K))、肝硬化、肝細(xì)胞癌、非酒精性脂肪性肝病、藥物引起的肝損傷、酒精性肝病、自身免疫性肝病或遺傳性代謝病例如α I型抗胰蛋白酶缺乏癥、糖原貯積病例如Ia型糖原貯積病、家族性高膽固醇血癥、遺傳性(高)酪胺酸血癥、克里格勒-納賈爾(crigler-najjar)綜合征、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、或因子IX缺乏癥或其他血友病、血色病、威爾遜氏病(Wilson’s disease)、杜賓-約翰遜綜合征(Dubin-Johnson syndrome)、家族性淀粉樣變性病、或雷夫敘姆病(Refsum，s disease)。對(duì)于治療性應(yīng)用，該肝細(xì)胞優(yōu)選為臨床級(jí)肝細(xì)胞。對(duì)具有損傷的或功能障礙的肝組織的患者進(jìn)行治療的方法包括:向需要其的個(gè)體給予如上文所述產(chǎn)生的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞的群體。
肝細(xì)胞的群體可以被移植、灌注(輸注)或以其他方式給予至個(gè)體的肝臟中。適合的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。肝細(xì)胞的群體可由來源于獲自該個(gè)體的細(xì)胞的iPS細(xì)胞產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，如上文所述，可在iPS細(xì)胞分化為肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞之前修正iPS細(xì)胞中的與疾病相關(guān)的突變或遺傳缺陷。本發(fā)明的一些方面還擴(kuò)展至包含如本文所述產(chǎn)生的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞的藥物組合物、藥物、藥品或其他組合物；包括向患者給予這樣的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞的方法，例如如上文所述用于治療(可包括預(yù)防性治療)損傷的或功能障礙的肝組織；以及制造藥物組合物的方法，包括將這樣的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞與藥用賦形劑、媒劑或載體以及可選地一種或多種其他成分混合。向個(gè)體給予的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可被基因改造以產(chǎn)生治療性分子，例如藥物或生長(zhǎng)因子(Behrstock S 等人，Gene Ther2006 年 3 月;13 (5):379-88，Klein SM 等人，HumGene Ther2005 年 4 月；16 (4):509-21)。本發(fā)明提供了含有根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞以及一種或多種其他組分的組合物。除了肝細(xì)胞之外，根據(jù)本發(fā)明并且根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物還可包含藥用賦形劑、載體、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他物質(zhì)。這樣的物質(zhì)應(yīng)該是無毒的并且應(yīng)該不會(huì)妨礙肝細(xì)胞的活性。載體或其他物質(zhì)的準(zhǔn)確性質(zhì)取決于給藥途徑。液體藥物組合物通常包括液態(tài)載體，例如水、石油、動(dòng)物油或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、組織培養(yǎng)液或細(xì)胞培養(yǎng)液(tissueor cell culturemedia)、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。該組合物可以為可腸胃外施用的水溶液，其是無熱原的并且具有適合的pH、等張性和穩(wěn)定性。相關(guān)技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員能夠利用例如等張媒劑如氯化鈉、林格氏注射液或乳酸化林格氏注射液很好地制備適合的溶液?？衫萌斯つX脊髓液來制備組合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)將肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞移植到患者體內(nèi)(例如 Lindval 1，0.(1998) Mov.Disord.13，Suppl.1: 83-7 ; Freed, C.R 等人，(1997)Cell Transplant,6,201-202;Kordower 等人，(1995)New England Journalof Medicine,332,1118-1124;Freed,C.R., (1992)New England Journal ofMedicine, 327，1549-1555，Le Blanc 等人，Lancet2004 年 5 月 I 日;363 (9419): 1439-41 )。尤其是，可將細(xì)胞懸液注射到患者的門靜脈(portal vein)中。優(yōu)選以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”(盡管預(yù)防在有些情況下也被認(rèn)為是治療)給予根據(jù)本發(fā)明的組合物，其足以顯示出對(duì)于個(gè)體的益處。實(shí)際給予的量，以及給藥的速率和時(shí)程將取決于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的處方例如劑量的確定等是普通醫(yī)療從業(yè)人員和其他醫(yī)生的職責(zé)。取決于所治療的病癥，可單獨(dú)給予組合物或與其他治療同時(shí)或順序地聯(lián)合給予組合物。在一些實(shí)施方式中，如本文中所述產(chǎn)生的群體中的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可顯示出正常的表型。例如，細(xì)胞可獲自具有肝損傷或功能障礙的個(gè)體并且可用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該iPS細(xì)胞可以含有突變或基因缺陷并且可利用常規(guī)重組技術(shù)來修正這種突變或缺陷以產(chǎn)生具有正常表型的iPS細(xì)胞?？捎杀疚闹兴龅倪@些iPS細(xì)胞產(chǎn)生具有正常表型的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞，并將其移植到患者體內(nèi)以修復(fù)或改善肝損傷或功能障礙。在其他的實(shí)施方式中，如本文中所述產(chǎn)生的群體中的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可顯示出疾病表型。例如，細(xì)胞可獲自具有肝損傷或功能障礙的個(gè)體并被用于產(chǎn)生疾病特異性iPS(ds-1PS)細(xì)胞。具有疾病表型的肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可獲自如本文中所述的這些iPS細(xì)胞。然后可對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理以恢復(fù)正常表型。例如，可體外修正引起疾病表型的基因突變或缺陷。各種技術(shù)均可用于修正分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因突變或缺陷。在缺陷或突變被修正并恢復(fù)了正常表型之后，可將肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞移植到患者體內(nèi)以修復(fù)或改善肝損傷或功能障礙。如上文所述產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體可用于模型化測(cè)試化合物與肝細(xì)胞之間的相互作用，例如在毒性篩選、模型化肝病和篩選具有潛在治療效果的化合物中。用于篩選化合物的方法可包括:使通過上文所述方法產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體與測(cè)試化合物接觸，以及確定該測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞的影響和/或所述肝細(xì)胞對(duì)該測(cè)試化合物的影響。肝細(xì)胞可顯示出正常表型或疾病表型。相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，可在存在測(cè)試化合物的情況下確定肝細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活力。生長(zhǎng)或存活力的下降是該化合物具有肝毒性效應(yīng)的指征。相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，可在存在測(cè)試化合物的情況下確定基因表達(dá)。例如，可確定白蛋白，α 1-抗胰蛋白酶(AAT)，細(xì)胞色素p450酶例如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、 CYP2C9和CYP2D6，因子IX、載脂蛋白A2，CEBPa和/或轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達(dá)。表達(dá)的下降是化合物具有肝毒性效應(yīng)的指征?；虮磉_(dá)可例如通過RT-PCR以核酸水平來確定，或例如通過免疫學(xué)技術(shù)(如ELISA)或通過活性測(cè)定以蛋白質(zhì)水平來確定。細(xì)胞色素P450測(cè)定(例如發(fā)光測(cè)定、熒光測(cè)定或生色測(cè)定)是本領(lǐng)域中公知的并且可從供應(yīng)商處獲得?？梢源_定測(cè)試化合物通過肝細(xì)胞的代謝、降解或分解。在一些實(shí)施方式中，可以連續(xù)地或在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定或測(cè)量測(cè)試化合物和/或所述測(cè)試化合物的代謝產(chǎn)物的量或濃度隨時(shí)間的變化。例如，可以確定或測(cè)量測(cè)試化合物的量或濃度的下降和/或所述測(cè)試化合物的代謝產(chǎn)物的量或濃度的增加。在一些實(shí)施方式中，可以確定測(cè)試化合物和/或代謝產(chǎn)物的量或濃度的變化。適合用于測(cè)量測(cè)試化合物或代謝產(chǎn)物的量的技術(shù)包括質(zhì)譜測(cè)定法。這可用于確定測(cè)試化合物的體內(nèi)半衰期、毒性、效力或其他體內(nèi)性質(zhì)。相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況下，可在存在測(cè)試化合物的情況下確定和/或測(cè)量肝細(xì)胞的一種或多種功能。例如，可以確定和/或測(cè)量肝細(xì)胞執(zhí)行有機(jī)化合物的解毒作用、糖原貯積、AAT或白蛋白分泌、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素蛋白產(chǎn)生、血管緊張素產(chǎn)生、氨轉(zhuǎn)化為尿素、膽固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一種或多種的能力。相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，在存在測(cè)試化合物的情況下肝細(xì)胞執(zhí)行這些功能中的一種或多種的能力下降是該化合物具有肝毒性效應(yīng)的指征。用于篩選可用于治療肝病的化合物的方法可包括:
使如上文所述產(chǎn)生的顯示出疾病表型的肝細(xì)胞群體與測(cè)試化合物接觸，以及
確定該測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞的影響。
該肝細(xì)胞可以顯示出疾病表型?？梢源_定測(cè)試化合物對(duì)肝細(xì)胞中一種或多種疾病病理學(xué)的影響。例如，可以確定測(cè)試化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)聚集或聚合；ER中的蛋白質(zhì)捕獲；膽固醇攝取、脂質(zhì)和/或糖原累積；以及乳酸產(chǎn)生中的一種或多種的影響。
適合的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的并且包括免疫染色、質(zhì)譜、蛋白質(zhì)印跡法和酶促測(cè)定。
相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，在存在測(cè)試化合物的情況下肝細(xì)胞中一種或多種疾病病理學(xué)的減少或改善 可以是該測(cè)試化合物可用于治療肝病(例如遺傳性代謝病癥)的指征。上文中提供了遺傳性代謝紊亂的實(shí)例。
本文中所述的方法可以包括鑒定使得肝細(xì)胞中的一種或多種疾病病理學(xué)(例如IMD病理學(xué))減少或改善的測(cè)試化合物的步驟。使得疾病病理學(xué)減少的化合物可用于開發(fā)用于治療肝病的治療方法。
在其他的實(shí)施方式中，肝細(xì)胞可顯示出正常的表型并且可以例如來源于相對(duì)于一般群體具有肝病的高患病風(fēng)險(xiǎn)或高易感性的個(gè)體?？梢源_定測(cè)試化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或基因表達(dá)，例如細(xì)胞色素 p450 (CYP)如 CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9 和 CYP2D6 中的一種或多種的表達(dá)的影響?？梢源_定測(cè)試化合物對(duì)肝細(xì)胞的一種或多種功能的影響。例如，可以確定和/或測(cè)量相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況下，在存在測(cè)試化合物情況下肝細(xì)胞執(zhí)行有機(jī)化合物的解毒作用、糖原貯積、AAT或白蛋白分泌、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素蛋白產(chǎn)生、血管緊張素產(chǎn)生、氨轉(zhuǎn)化為尿素、膽固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一種或多種的能力。
相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，在存在測(cè)試化合物的情況下基因表達(dá)、生長(zhǎng)和/或一種或多種功能的提高可以是該化合物可用于治療肝病例如肝炎(例如，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎)、肝硬化、肝細(xì)胞癌、非酒精性脂肪性肝病、藥物引起的肝損傷、酒精性肝病或自身免疫性肝病的指征。
在鑒定能夠減少或改善肝細(xì)胞中的一種或多種疾病病理學(xué)的化合物之后，可對(duì)該化合物進(jìn)行修飾以優(yōu)化其藥學(xué)性質(zhì)。這可利用本領(lǐng)域中公知的模型化技術(shù)來進(jìn)行。
可利用一次或多次二次篩選對(duì)利用一次或多次初始篩選鑒定出的能夠減少或改善肝細(xì)胞中的一種或多種疾病病理學(xué)(例如MD病理學(xué))的測(cè)試化合物進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
二次篩選可涉及例如在動(dòng)物模型中對(duì)生物學(xué)功能和或活性進(jìn)行體外和/或體內(nèi)測(cè)試。例如，可以確定測(cè)試化合物減少或改善疾病的動(dòng)物模型中與肝病相關(guān)的一種或多種癥狀或病理學(xué)的能力。
在鑒定出能夠減少或改善肝細(xì)胞中一種或多種疾病病理學(xué)的測(cè)試化合物之后，分離和/或純化該化合物，或可替代地利用重組表達(dá)或化學(xué)合成的常規(guī)技術(shù)來合成該化合物。此外，可在制備(即，組合物的制造或配制)中制造和/或使用該化合物，例如，藥物、藥物組合物或藥品。可將它們給藥至個(gè)體以用于治療肝病。
根據(jù)本文公開內(nèi)容，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的各個(gè)其他方面和實(shí)施方式是顯而易見的。
本申請(qǐng)說明書中提到的所有文獻(xiàn)均以其全文結(jié)合于本文作為參考。
本文中使用的“和/或”被理解為具體披露兩個(gè)具體特征或組分中的每一個(gè)或兩者，包括另一者或不包括另一者。例如，“A和/或B”被認(rèn)為具體披露了(i) A, (ii) B和(iii)A和B中的每一種，就像本文中單獨(dú)提到每一種時(shí)一樣。
除非上下文中另外指出，上文中所述特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓绞?，而是等同地適用于所述的所有方面和實(shí)施方式。


現(xiàn)在以舉例的方式并參照附圖和下述表格來說明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方式。
圖1至圖5示出了由疾病特異性hIPSC (dhIPSC)生成肝細(xì)胞。
圖1示出了概括了用于使dhIPSC文庫分化為肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案的流程圖。
圖2示出了標(biāo)記肝細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵階段的特異性蛋白表達(dá)的免疫染色分析(第4天內(nèi)胚層:CXCR4、Soxl7和Foxa2 ;第20天，肝祖細(xì)胞CK18、CK19和α胎蛋白(AFP);第25天，胎肝細(xì)胞:白蛋白(Alb)、AFP和α 1-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ))。
圖3示出了標(biāo)記dhIPSC分化為肝細(xì)胞的關(guān)鍵階段的基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。
圖4示出了在確定的培養(yǎng)條件下來源于hESC的確定型內(nèi)胚層向胎肝細(xì)胞的分化。圖4A示出了在誘導(dǎo)肝分化的條件下在生長(zhǎng)25天的DE細(xì)胞中肝細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。圖4B示出了 FACS分析，其示出了白蛋白(ALB) α -1-抗胰蛋白酶(AAT)和α -1-胎蛋白(AFP)在來源于hESC的胎肝細(xì)胞中的共表達(dá)(第25天)。圖4C示出了 hESC來源的肝胎細(xì)胞中白蛋白(ALB)、角蛋白18 (CK18)和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的表達(dá)的免疫染色分析(第25天)。比例尺為50 μ Μ。圖4D示出了 ELISA分析，其示出了 hESC來源的肝胎細(xì)胞的培養(yǎng)基中的α -1 -抗胰蛋白酶(AAT )和白蛋白分泌。圖4E示出了在hESC來源的肝胎細(xì)胞中可由地塞米松(DEX)誘導(dǎo)的CYP3A4活性。圖4F示出了 DIL測(cè)定，該測(cè)定顯示出膽固醇的攝取和PAS染色，其中PAS染色示出hESC來源的胎肝細(xì)胞中的糖原貯積。比例尺為50 μ M0
圖5示出了在如FACS分析所示肝分化25天之后表達(dá)白蛋白的細(xì)胞的部分。
圖6示出了通過透射電子顯微鏡進(jìn)行的dhIPSC來源的肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析，顯示出存在(I)頂絨毛狀突起(apical microvilli )和(2)糖原玫瑰花結(jié)(glycogen rosette)。所示出的該數(shù)據(jù)獲自一個(gè)細(xì)胞系(line)(患者1，細(xì)胞系I)，但其為所有類似特征的細(xì)胞系的代表性細(xì)胞系。
圖7至圖10示出了 利用dhIPSC的α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AlATD)的體外模型化。
圖7示出了分化為肝細(xì)胞的lATD-dhlPSC，其顯示出包括存在如過碘酸雪夫氏染色(PAS) (Glycogen)所示的細(xì)胞內(nèi)白蛋白(Albumin)、糖原忙積的原代人肝細(xì)胞的功能活性特征，如熒光素化低密度脂蛋白(DIL)結(jié)合(LDL結(jié)合)所示的低密度脂蛋白膽固醇攝取，白蛋白分泌和活性CytP450代謝(Cyp3A4活性)。
圖8示出了在患者特異性肝細(xì)胞(A1ATD，上部圖)和對(duì)照hIPSC來源的肝細(xì)胞(對(duì)照，下部圖)中利用聚合物特異性2C1抗體(中間圖，綠色熒光)或檢測(cè)所有形式的α 1-抗胰蛋白酶(左側(cè)圖，紅色熒光)進(jìn)行的錯(cuò)折疊的聚合α 1-抗胰蛋白酶表達(dá)的免疫染色分析。
圖9示出了來源于AlATD dhIPSC的肝細(xì)胞微粒體亞細(xì)胞部分的內(nèi)切糖苷酶H(Endo H)消化，證實(shí)了錯(cuò)折疊的聚合α 1-抗胰蛋白酶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保持。η=3
圖10示出了 ELISA以評(píng)價(jià)在用MG132蛋白質(zhì)體(proteosomal)抑制過夜之后，患者特異性(AlATD)和對(duì)照hIPSC來源的肝細(xì)胞(對(duì)照)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(細(xì)胞)和所有(All)以及聚合的(Polymeric) α 1-抗胰蛋白酶蛋白的分泌(培養(yǎng)基)。η=3
圖11和圖12示出了利用dhIPSC進(jìn)行的家族性高膽固醇血癥的體外模型化。
圖11示出了分化為肝細(xì)胞的FH-dhIPSC，其顯示出包括細(xì)胞內(nèi)存在白蛋白(Albumin)、糖原忙積(Glycogen)、白蛋白分泌和活性CytP450代謝(Cyp3A4活性)的原代人肝細(xì)胞的功能活性特征。
圖12示出了熒光素化的低密度脂蛋白結(jié)合的FACS分析，其證實(shí)了與陽性對(duì)照(對(duì)照，藍(lán)色曲線)相比，F(xiàn)H-dhIPSC來源的肝細(xì)胞(ra，紅色曲線)缺少有效吸收低密度脂蛋白的能力。使用在不存在LDL的條件下生長(zhǎng)的hIPSC作為陰性對(duì)照(未染色)。
圖13至圖17示出了利用dhIPSC進(jìn)行的Ia型糖原貯積病的體外模型化。
圖13示出了分化為肝細(xì)胞的GSD-dhlPSC，其顯示出包括細(xì)胞內(nèi)存在白蛋白(Albumin)、白蛋白分泌和活性CytP450代謝(Cyp3A4活性)的原代人肝細(xì)胞的功能活性特征。
圖14示出了過碘酸雪夫氏染色，其示出了與獲自對(duì)照對(duì)象(對(duì)照)的hIPSC來源的肝細(xì)胞相比，GSD-dhlPSC來源的肝細(xì)胞(GSDla)中細(xì)胞內(nèi)糖原的過量累積。n=3
圖15示出了 BODIPY染色，其示出了與獲自對(duì)照對(duì)象(對(duì)照)的hIPSC來源的肝細(xì)胞相比，GSD-dhlPSC來源的肝細(xì)胞(GSDla)中細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的過量累積。n=3
圖16示出了如PEPCK、G6P和IGFBPl的表達(dá)的qRT_PCR分析所示的dhIPSC來源的肝細(xì)胞適當(dāng)上調(diào)高血糖素的轉(zhuǎn)錄靶，在用IOOnM鹽酸高血糖素(升糖素)鹽酸鹽(glucagonhydrochloride)刺激0、1、2和3小時(shí)候進(jìn)行分析。
圖17示出了當(dāng)利用24小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)基的ELISA進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，GSD-dhlPSC來源的肝細(xì)胞(GSDla)與來自對(duì)照對(duì)象的hIPSC來源的肝細(xì)胞(對(duì)照)分泌更多的乳酸鹽(GSDla)0 n=3
圖18示出了 PI3K抑制劑的實(shí)例。
圖19示出了 c-hIPSC來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中恢復(fù)的AlAT的功能性分析。圖19A示出了免疫熒光結(jié)果，其 示出了由c-hIPSC生成的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中不存在聚合的AlAT蛋白。所有形式的AlAT (左圖)和錯(cuò)折疊的聚合12A1AT (中間圖)。圖19B和圖19C示出了 ELISA數(shù)據(jù)以評(píng)價(jià)來源于AlATD-hlPSC (ZZ)、chIPSC (RR)和對(duì)照hIPSCs (++)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中聚合AlAT蛋白的細(xì)胞內(nèi)水平(19B)和分泌水平(19C)。圖19D示出了由未修正的(ZZ)、修正的(RR)和對(duì)照(++)hIPSC來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(上圖)和對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基(下圖)免疫沉淀AlAT的內(nèi)切糖苷酶H (E)和肽:N-糖苷酶(P)消化。圖19E示出了糜蛋白酶ELISA，其示出了修正的細(xì)胞(RR)具有優(yōu)于未修正細(xì)胞(ZZ)且接近于成體肝細(xì)胞的AlAT酶抑制活性。圖19F和圖19G示出了檢測(cè)人白蛋白(圖19F)和AlAT (圖19G)的移植的肝部分的免疫熒光。用DAPI復(fù)染DNA。圖19H示出了小鼠血清中人白蛋白的ELISA讀數(shù)，對(duì)每只小鼠進(jìn)行縱向跟蹤。星號(hào):對(duì)小鼠進(jìn)行組織學(xué)分析。比例尺:100μπι。B、C和E中的數(shù)據(jù)以平均值土s.d.(n=3)示出。進(jìn)行學(xué)生氏t檢驗(yàn)。NS:不顯著。
具體實(shí)施方式
SM.
通
hIPSC衍牛和培養(yǎng)
在經(jīng)過適當(dāng)?shù)膫惱韺W(xué)審查和患者同意之后,從在Addenbrooke’s Hospital就醫(yī)的志愿患者獲得8mm皮膚穿孔活檢(倫理委員會(huì)編號(hào)08/H0311/201 ;R&D No:A091485)。成纖維細(xì)胞利用標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)方案獲自在GMP條件下捐獻(xiàn)的組織，并在標(biāo)準(zhǔn)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。另外的成纖維細(xì)胞樣品獲自INSERM (法國)和Coriell Biorepository 如表I中詳細(xì)記載的，從7位不同的患者總共獲得5個(gè)不同的疾病樣品。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)來源的載體均含有四個(gè)人基因(0ct_4、Sox2、c_Myc和Klf4)之一的編碼序列，而相應(yīng)的病毒顆粒由Vectalys (Toulouse,法國)生成并用于以10倍的多重感染力感染成纖維細(xì)胞，如Yamanaka和他的同事原來描述的以及我們最近描述的[29]。衍生完成后，在標(biāo)準(zhǔn)hESC 培養(yǎng)條件(knockout [KSR]，(Gibco) +FGF2 (4ng/ml; R&DSystems Inc.，Minneapolis)下在含有經(jīng)輻照的小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)hIPSC。_3] RNA提取和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)
利用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden,德國)從hIPSC或分化的祖細(xì)胞提取總RNA。用無RNA酶的DNA酶(RNase-Free DNase) (Qiagen)處理每個(gè)樣品以避免DNA污染。對(duì)于每個(gè)樣品，利用 Superscript II Reverse Transcriptase( Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄0.6 μ g的總RNA。如所述制備實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)混合物(SensiMiX實(shí)驗(yàn)方案；Quantace,倫敦)，然后在94° C變性5分鐘并在94° C循環(huán)30秒，在60° C循環(huán)3秒，并在72° C循環(huán)30秒,接著在完成40次循環(huán)之后在72° C最后延伸10分鐘。在別處描述了引物序列[16]。利用Stratagene Mx3005P (La Jolla, CA)—式三份進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)并在同一次運(yùn)行中歸一化為膽色素原脫氨酶(porphobilinogen deaminase, PB⑶)。QPCR數(shù)據(jù)表不為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條指示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。在末尾處的表格中列出了用于實(shí)時(shí)PCR分析的引物。_5] 免疫熒光
在4° C在4%多聚甲醒(paraformaldehyde)中將hIPSC或其分化的祖細(xì)胞固定20分鐘，然后在PBS中洗滌3次。在室溫下將細(xì)胞在含有10%驢血清(Serotec Ltd.)的PBS中培養(yǎng)20分鐘，并隨后與溶解在1%驢血清的PBS溶液中的一抗一起在4° C培養(yǎng)過夜，如下所述:Oct-4 (1:100; Abeam ab 18976 [Cambridge, U.K.])、Sox2 (1:100; Abeamab15830)、Brachyury (1:100;Abeam ab20680 或 R&D Systems Inc.) > Sox17(R&D SystemsInc.)、FoxA2 (1:50 ; Abeam ab5074)、GATA4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology Inc.) >GATA6(1:200;Abeam ab22600 或 Santa Cruz Biotechnology Inc.) > CXCR4(1:100;R&DSystems Inc.或 BD Pharmingen)、CK18 (1: 50，Dako)、CK19 (1:50，Dako)、白蛋白(1:100; R&D1455)、α -胎蛋白(1: 300，Dako A008)、α 1-抗胰蛋白酶(1: 100，SigmaA0608)。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌3次并與德克薩斯紅或結(jié)合了異硫氰酸熒光素的抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich; 1:200,在 1%驢血清的 PBS 溶液中)或兔 IgG( Jackson Laboratory, BarHarbor, ME; 1:400,在驢血清的 PBS 溶液中)或山羊 IgG (Jackson Laboratory; 1:400,在驢血清的PBS溶液中)在室溫下一起培養(yǎng)2小時(shí)。 通過在PBS中洗滌3次除去未結(jié)合的二抗。向第一洗漆物中加入Hoechst33258( Sigma-Aldrich; 1:10，000)。為了使脂質(zhì)可見,使用脂質(zhì)特異性染色 BODIPY (硼-二吡咯亞甲基染料；B0DIPY 493/503Invitrogen.D-3922)。
畸胎瘤(Teratomas)
機(jī)械收集hIPSC后立即進(jìn)行移植，并且將大約IO6個(gè)細(xì)胞接種于8周齡C.B.-17/GbmsTac-scidbgDFN7 雄性小鼠(Taconic M&B, ejby, Denmark)的辜丸囊之下，在20° C-24° C，50%室內(nèi)濕度，14小時(shí)-10小時(shí)的亮-暗循環(huán)以及充足食物和水的條件下圈養(yǎng)并保持。60天處死小鼠，然后利用剃刀刀片(razor blade)將經(jīng)注射的睪丸切成等份。將材料在4%中性緩沖甲醛中固定過夜，并通過醇/ 二甲苯的分級(jí)系列將其脫水。將組織包埋在石蠟中，以5 μ m連續(xù)切片，之后進(jìn)行H&E染色和表征。通過原位熒光雜交來證實(shí)所選區(qū)域的人類來源(人特異性探針，CEP XY;Vysis Inc., Downers Grove, IL)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)地區(qū)委員會(huì)(Regional Committee for Animal Experimentation)允許后進(jìn)行(Stockholm, Sweden;Dnr N107/06)。
核型分析(Karytotype analysis)
使hIPSC在IOcm培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)至匯合(confluency),然后收獲，中期染色體涂片(metaphase spread)通過劍橋大學(xué)醫(yī)院細(xì)胞遺傳學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室獲得。
hIPSC向肝細(xì)胞的分化
利用5mg/ml膠原酶IV/分散酶(0.1%, GIBCO) 1:1 (v/v)混合物將hIPSC傳代；然后將其轉(zhuǎn)移至預(yù)先涂覆有CDM-PVA中的胎牛血清(FBS)的平板上或如前所述轉(zhuǎn)移至預(yù)先涂覆有人纖連蛋白的平板中[16]。對(duì)于接下來的第一天，細(xì)胞在補(bǔ)充有CHIR99021(3 μ M, Stemgent)、Ly294002 (10 μ M, Calbiochem)、活化素(100ng/ml, R&D systems)、FGF2(40ng/ml, R&D systems)和 BMP4 (lOng/ml, R&D systems)的 CDM-PVA 中生長(zhǎng)，以使得 hIPSC分化為原條樣細(xì)胞(primitive streak like cell)。在第二天,使得到的細(xì)胞在補(bǔ)充有Ly294002 (10 μ Μ, Calbiochem)、活化素(100ng/ml)、FGF2 (40ng/ml, R&D systems)和 BMP4(10ng/ml，R&D systems)的CDM-PVA中生長(zhǎng)，以使得它們朝向確定型內(nèi)胚層(definitiveendoderm)分化。在第三天，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基換成RPMI (Gibcol640)并補(bǔ)充有活化素(IOOng/ml, R&D systems)、FGF2 (40ng/ml, R&D systems)和B27以獲得前層確定型內(nèi)胚層細(xì)胞(ADE)。為了誘導(dǎo)肝內(nèi)胚層，然后將ADE細(xì)胞在補(bǔ)充有活化素(50ng/ml，R&D systems)的RPMI (Gibcol640)存在條件下培養(yǎng)5天。最后，為了使所得的肝祖細(xì)胞成熟，使細(xì)胞在補(bǔ)充有 HGF (20 μ g/ml, Peprotech)和制瘤素 M (10 μ g/ml, R&D)的 CMRL/Hepatozyme(Invitrogen)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
流式細(xì)胞術(shù)
為了檢測(cè)白蛋白陽性細(xì)胞，在肝細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)方案結(jié)束時(shí)將貼壁細(xì)胞在PBS中洗滌兩次，然后在細(xì)胞分裂緩沖液(Invitrogen，Carlsbad, CA)中在37° C培養(yǎng)20分鐘。通過輕柔地移液管吸打分離細(xì)胞并在含有0.1%疊氮化物(azide)(Serotec Ltd., Oxford, U.K.)和0.l%Triton-X的PBS+3%正常山羊血清(NGS)中以大約0.1-1XlO5個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮。然后在4° C將細(xì)胞與原代小鼠抗人白蛋白抗體(R&D1455; 1/100)或小鼠IgG同種型對(duì)照(BD Pharmingen)一起培養(yǎng) 40 分鐘。然后通過 FACS Calibur 機(jī)(BDBiosciences, SanJose,加利福尼亞州，USA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。記錄白蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)目，其為三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值。
禾1|用石典克》酉享(OptiPrep Axis Shield2010)步講梯度矛口 EndoH消ih講對(duì)于亞細(xì)胞分級(jí)分離
使dhIPSC來源的肝細(xì)胞在6孔平板中生長(zhǎng)并利用細(xì)胞刮刀收獲細(xì)胞。然后通過使細(xì)胞在具有小球的均質(zhì)器中反復(fù)通過將其機(jī)械破壞。以3000g離心細(xì)胞懸液5分鐘(4° C)，稀釋上清液至35%0ptiPr印的最終濃度并將其轉(zhuǎn)移至新的離心管中。小心地使2ml的30%0ptiPrep和Iml的0%0ptiprep在上清液頂部上順序分層并以70，OOOg使管旋轉(zhuǎn)2小時(shí)(4° C)。小心地抽吸在兩個(gè)底層之間形成的液體界面并再次以100，OOOg旋轉(zhuǎn)45分鐘(4° C)。將隨后形成的沉淀物(球粒，pellet)重懸浮于50 μ I緩沖液中并標(biāo)記為微粒體部分。對(duì)于糖類內(nèi)切酶H[EC3.2.1.96，糖肽-D-甘露糖基-N4-(N-乙酰基-D-葡糖胺基)2-天冬酰胺1，4-N-乙?；?b-葡糖胺水解酶]消化，在37° C用500單位的EndoH酶(Boehringher Mannheim,曼海姆,德國)消化微粒體細(xì)胞部分3小時(shí)并如下文所述進(jìn)行分析。
SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析
將30 μ I樣品與10 μ 14χ上樣緩沖液(含有10% (ν/ν) β -巰基乙醇和4% (w/v)SDS)混合并利用8% (w/v)丙烯酰胺SDS-PAGE進(jìn)行分析。在200mA下經(jīng)2h將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至Immobilon P膜(Millipore Corp.，Bedford, MA)上以用于進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。向轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20% (v/v)甲醇。轉(zhuǎn)移后，在PBT (PBS+0.1% (v/v) Tween20)中洗滌膜并在PBT+5% (w/v)干燥的脫脂奶粉中阻斷(封閉)過夜。第二天，將該膜與在PBT乳中以1:10，000稀釋的抗-α 1-抗胰蛋白酶抗體一起培養(yǎng)I小時(shí)，用PBT以5分鐘洗滌6次，然后與1:100, 000抗小鼠IgG辣根過氧化物酶抗體在PBT乳中培養(yǎng)I小時(shí)。在5分鐘內(nèi)用PBT再洗漆該膜 6 次并在顯影前利用 ECL Super Signal West Femto maximum sensitivitysubstrate (Pierce)在PBS中洗漆15分鐘并曝光膜。
α 1-抗胰蛋白酶的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)
以2 μ g/ml在碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液(Na2C03/NAHC03，pH9.5)中用親和純化的抗α 1-抗胰蛋白酶兔多克隆抗體(Abcam31657，Cambridge, UK)涂覆高結(jié)合表面C0STAR96-孔板(Corning, NY, USA)過夜。洗滌(0.9%w/v NaCl, 0.05%v/v Tween20)后，將平板在阻斷緩沖液(PBS，0.25%w/v BSA, 0.05%v/v Tween20)中阻斷2小時(shí)。在阻斷緩沖液中稀釋樣品(培養(yǎng)基或在 50 μ I 的 Nonidet 裂解緩沖液(150mM NaCl, 50mMTris-Cl, ρΗ7.5，1%(ν/ν))Nonidet Ρ-40中裂解的細(xì)胞)和標(biāo)準(zhǔn)品(等離子體純化的M或Z α 1-抗胰蛋白酶)并向每個(gè)孔中加入50 μ 1，然后培養(yǎng)2小時(shí)。洗滌后，將孔與9C5或2C1單克隆抗體(I μ g/ml，在阻斷緩沖液中稀釋)一起培養(yǎng)，并培養(yǎng)2小時(shí)。用兔抗小鼠IgG HRP標(biāo)記的抗體(SigmaAldrich, Haverhill, UK, 1:20, 000)檢測(cè)結(jié)合的單克隆抗體I小時(shí)。用TMB液態(tài)底物(SigmaAldrich, Haverhill, UK)將反應(yīng)在暗處顯影10分鐘，并用IM H2SO4終止反應(yīng)。在Thermo-max微板讀數(shù)器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)上在 450nm 處讀取吸光度。對(duì)于蛋白體阻斷試驗(yàn)，使細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)并在收獲前16小時(shí)(過夜)向培養(yǎng)基中加入1/10，000稀釋的MG132 (AG Scientific, USA)。對(duì)照樣品與向其中加入的PBS體積相等。
白蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)
劍橋大學(xué)醫(yī)院生物化學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用實(shí)驗(yàn)室人白蛋白特異性ELISA試劑盒(BioSupply UK)平行三次對(duì)24小時(shí)后收集的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行了分析。數(shù)值表示為ng/百萬細(xì)胞/ml培養(yǎng)基。
細(xì)朐色素P450活件
根據(jù)制造商說明書利用P450-G1O測(cè)試試劑盒平行三次測(cè)量進(jìn)行Cyp3A4活性試驗(yàn)。然后利用P450-GloMax96微板照度計(jì)(Iuminometer)分析細(xì)胞色素活性。
過碘酸雪夫氏(Periodic acid Schiff, PAS)染色
根據(jù)制造商說明書的指導(dǎo)利用試劑盒(Sigma395B_lKT)平行三次在細(xì)胞上進(jìn)行PAS染色。隨后進(jìn)行淀粉酶(diastase)消化以證實(shí)陽性染色是由于存在糖原造成的。
誘射電子顯微鏡(TEM)
在0.9%NaCl中簡(jiǎn)單漂洗細(xì)胞并在4%戊二醛中在4° C固定2小時(shí)。然后在固定下從平板刮取細(xì)胞并通過漂洗重懸浮于0.1M PIPES中。通過TEM進(jìn)行分析。
LDL 攝取
從(Stoughton, MA)購買Dil-LDL染色試劑盒并根據(jù)制造商說明書進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)施FACS分析，比較ra疾病特異性hIPSC肝細(xì)胞中的Dil結(jié)合與對(duì)照(!fepG2細(xì)胞)中的Dil結(jié)合
GFP報(bào)告子
如前所述用AP0A-11-GFP慢病毒載體(Ientivector)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞[16]并通過顯微鏡檢查。
對(duì)高升糖素刺激的代謝酶應(yīng)答
在補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺、100U/1青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、和0.5%牛血清白蛋白(全部來自Sigma-Aldrich)的無血清、高葡萄糖DMEM中培養(yǎng)dhIPSC來源的肝細(xì)胞 6 小時(shí)。用 IOOnM 鹽酸高血糖素 23 (NovoNordisk, Bagsvaerd, Denmark)或PBS (Sigma-Aldrich)作為陰性對(duì)照刺激細(xì)胞。根據(jù)制造商的指導(dǎo)利用RNeasy Kit(Qiagen, Hilden,德國)在刺激后0、1、2或3小時(shí)收獲總RNA并進(jìn)行純化。根據(jù)制造商的指導(dǎo)在25 μ I含有200U莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、500ng隨機(jī)引物和0.5mM脫氧三磷酸核苷(全部來自Promega, Wisconsin, MA)的反應(yīng)混合物中在I μ gRNA上實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄。利用Taqman PCR Mastermix (Applied Biosystems)和基因特異性正向引物和反向引物以及突光探針使 cDNA 在 ABI7900 檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA)上經(jīng)歷實(shí)時(shí)定量PCR。將所有結(jié)果歸一化為人36B4作為參照基因。PEPCK (Hs00159918_ml)、G6P(Hs00609178_ml)和IGFBPl (Hs00426285_ml)的引物和探針作為預(yù)制儲(chǔ)備購自AppliedBiosystems。利用 Sigma-Aldrich (正向引物:5，-GCAGATCCGCATGTCCCTT-3’ ;反向引物:5’ -TGTTTTCCAGGTGCCCTCG-3’；探針:5’ -[J0EE]AGGCTGTGGTGCTGATG[TAMRA]_3’)在實(shí)驗(yàn)室中設(shè)計(jì)并合成36B4的寡核苷酸。
AlATD-hlPSC 中 Z 突奪的修 if
AlATD-hlPSC如上文所述。將2 X IO6個(gè)hIPSC與ZFN表達(dá)載體以及供體模板共轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后4天開始經(jīng)歷嘌呤霉素選擇(I μ g/ml)。為于進(jìn)行轉(zhuǎn)位子(transposon)切除，用 pCMV-yPBase 轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(Yusa，K.等人，PNAS U S A108, 1531-1536 (2011))，培養(yǎng) 4天，重新鋪板并在250ηΜ1-(2-脫氧-2-氟代-β -D-阿糖呋喃基)_5_碘尿嘧啶(FIAU)中進(jìn)行選擇。為了增加克隆發(fā)生(clonogenicity),在分離前4小時(shí)和鋪板后24小時(shí)用ROCK抑制劑26，Y-27632 (10 μ M)處理細(xì)胞。在2周后挑取得到的克隆，利用PCR進(jìn)行分析并通過DNA印跡分析進(jìn)一步證實(shí)。
免疫缺陷UPA轉(zhuǎn)基因小鼠中的hIPSC來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞移植
將所有小鼠在無熱原條件下圈養(yǎng),動(dòng)物研究獲得了 Institut Pasteur動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)和法國工業(yè)部的批準(zhǔn)。將分化的細(xì)胞(5X IO5個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物在50 μ I DMEM中)注射到3-4周齡Alb-uPA+/+;Rag2-/-; I12rg-/_小鼠(n=7)小鼠的脾臟中。在移植2周后處死接受注射的小鼠以用于組織學(xué)分析。收集血液樣品并利用ELISA (Bethy Laboratories)量化血漿中的人白蛋白。用人白蛋白(Dako)或人AlAT (Dako)特異性抗體利用免疫熒光來分析冷凍肝切片。未進(jìn)行移植的小鼠用作對(duì)照。
益果
發(fā)現(xiàn)獲自患病患者的5個(gè)hIPSC來源的肝細(xì)胞成功地概括了在相關(guān)疾病中觀察到的細(xì)胞病理學(xué)的關(guān)鍵特征，例如錯(cuò)折疊的突變?chǔ)?1-抗胰蛋白酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的聚集、缺乏LDL受體介導(dǎo)的膽固醇攝取和細(xì)胞脂質(zhì)升高以及糖原累積。這些數(shù)據(jù)首次證明了 hIPSC能夠被用于模型化成體細(xì)胞中不同范圍的遺傳性疾病。
來自患有肝的遺傳性代謝病(IMD)的患者的hIPSC文庫的產(chǎn)生
皮膚成纖維細(xì)胞獲自來自患有一定程度MD的7個(gè)個(gè)體和3個(gè)健康對(duì)照的皮膚活檢切片(20hIPSC個(gè)細(xì)胞系，7位患者，5種疾病-表I)。然后利用Yamanaka等人[13]開發(fā)的四因子方法(four factor approach)將這些體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)個(gè)體，hIPSC衍生的成功率可在0.01%至0.1%的較大范圍內(nèi)變化，這證實(shí)了能夠重編程來自不同年齡和性別的患者的皮膚成纖維細(xì)胞的現(xiàn)有可變性。在可能的情況下，隨后3個(gè)hIPSC細(xì)胞系/個(gè)體用于進(jìn)行進(jìn)一步分析，以確定來源于相同個(gè)體的細(xì)胞系之間現(xiàn)有分化能力的保守可變性(conserved variability)。對(duì)所得的hIPSC細(xì)胞系的文庫(來自10個(gè)個(gè)體的20個(gè)細(xì)胞系)的形態(tài)學(xué)、多能性標(biāo)記物表達(dá)、體內(nèi)和體外形成三個(gè)胚層的衍生物的能力、正常染色體組型以及內(nèi)源性和外源性多能基因的表達(dá)譜進(jìn)行表征。
所有的hIPSC均表達(dá)內(nèi)源性多能性標(biāo)記物并且能夠分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞、內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞，這證實(shí)了我們能夠從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞。令人感興趣的是，hIPSC細(xì)胞系均能夠分化為一個(gè)特定的胚層，這表明在為了本研究生成的hIPSC細(xì)胞系分化能力中不存在強(qiáng)可變性。此外，僅在化學(xué)成分確定條件下長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)的hIPSC (40代)中觀察到異常的染色體組型。這暗示了用于擴(kuò)增hIPSC的培養(yǎng)體系能夠影響它們的遺傳穩(wěn)定性，如已針對(duì)人類胚胎干細(xì)胞(hESC) 描述的[14]。因此，僅“早期傳代”的hIPSC (<p30)被用于本研究。病毒整合的數(shù)目在細(xì)胞系和患者之間是不同的(可變的)，這支持前述的研究，這表明完全重編程與病毒整合的具體方式無關(guān)[15]。
最后,在我們的hIPSC細(xì)胞系中很少檢測(cè)到外源性轉(zhuǎn)基因的異位表達(dá)(ectopicexpression)，這證明了我們的病毒載體在多能干細(xì)胞中待沉默的效力。所有這些結(jié)果表明，用于本研究生成的hIPSC細(xì)胞系被完全重編程，并因此表現(xiàn)出來源于患有IMD的患者的hIPSC細(xì)胞系的獨(dú)特文庫。
從患者特異性hIPSC產(chǎn)生肝細(xì)胞的有效且簡(jiǎn)單的方法的開發(fā)
我們最近已經(jīng)開發(fā)出了使人ES和正常hIPSC分化為肝細(xì)胞的有效實(shí)驗(yàn)方法[16]。這種培養(yǎng)體系提供為分化的新方法提供了基礎(chǔ)，并優(yōu)選用于患者特異性hIPSC。我們的主要目的是開發(fā)一種能夠使大量的hIPSC細(xì)胞系有效地分化為肝細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。來源于健康個(gè)體(n=6; 2種不同對(duì)象)和患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥(η=6; 3個(gè)不同患者)的個(gè)體的hIPSC細(xì)胞系用于經(jīng)驗(yàn)性篩選大范圍的培養(yǎng)條件。
圖1中描述了所得的實(shí)驗(yàn)方案。該三步實(shí)驗(yàn)方案遵循肝細(xì)胞發(fā)育的天然途徑的關(guān)鍵階段。第一步由利用補(bǔ)充有活化素、FGF2、BMP-4和PI3激酶抑制劑的CDM-PVA培養(yǎng)基使hIPSC成為表達(dá)前層確定型內(nèi)胚層的特異性標(biāo)記物SOX17、CXCR4、fOXA2和Hex的內(nèi)胚層細(xì)胞組成，其中肝細(xì)胞由該前層確定型內(nèi)胚層產(chǎn)生(圖1b和圖lc)。然后利用活化素和B27補(bǔ)充劑使所得的內(nèi)胚層細(xì)胞分化為表達(dá)AFP、CK18、CK19、HNF4和HNF6的肝祖細(xì)胞(圖2、圖3)。
到第25天，在補(bǔ)充有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和制瘤素-M的CMRL/肝細(xì)胞培養(yǎng)基混合物中的最終成熟產(chǎn)生表達(dá)白蛋白和α 1-抗胰蛋白酶的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(圖2、圖3和圖4)。FACS分析顯示，在這些培 養(yǎng)條件下產(chǎn)生的細(xì)胞中的80%表達(dá)白蛋白(圖4)，這證實(shí)了利用這種方法產(chǎn)生的細(xì)胞群的同源性。到第25天，細(xì)胞表現(xiàn)出與人肝細(xì)胞的強(qiáng)烈形態(tài)學(xué)相似性，顯示偶發(fā)性雙核(圖1)、糖原貯積和頂部微突(圖5)，粗糙和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)以及突出的高爾基體。另外，hIPSC來源的肝細(xì)胞與天然人肝細(xì)胞共有類似的體外功能特征，從而其能夠儲(chǔ)存糖原和LDL、分泌白蛋白、經(jīng)由CytP450通路代謝藥物(圖6)并在肝細(xì)胞特異性Ap0AII啟動(dòng)子的控制下表達(dá)GFP蛋白。此外，在這些細(xì)胞中依然抑制外源性重編程因子的表達(dá)，這證實(shí)了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因中分化后保持沉默。
盡管這些數(shù)據(jù)提供了重要證據(jù)以示出在我們的培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的肝臟細(xì)胞的相關(guān)功能性特征，但我們意識(shí)到這些細(xì)胞并沒有最終分化，如通過其繼續(xù)表達(dá)AFP所證明的(圖2和圖3)。相對(duì)而言，這些肝細(xì)胞有可能在胎兒胚胎發(fā)育的頭三個(gè)月結(jié)束至完全的成體細(xì)胞之間的某處發(fā)育，如通過其α 1-抗胰蛋白酶基因表達(dá)水平和通過FCS觀察到的白蛋白表達(dá)細(xì)胞的百分比所顯示的(圖1d)。
在我們的培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的肝臟細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記物，例如白蛋白(ALB)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、aAP0F、TAT、TD02、TTR、HNF4a 和 HHEX (圖 4A)。胎兒標(biāo)記物如α甲胎蛋白(AFP)和CYP3A7的表達(dá)在整個(gè)分化過程中也得以保持，但成體細(xì)胞色素CYP3A4的表達(dá)仍然相對(duì)較低(圖4A)，這暗示了這些細(xì)胞為胎兒樣肝細(xì)胞并且需要進(jìn)一步成熟以產(chǎn)生成體細(xì)胞。這些觀察結(jié)果通過免疫染色和FACS分析得到了證實(shí)，其示出了 ALB、細(xì)胞角蛋白18 (cytokeratinl8)、AAT和AFP的同源共表達(dá)(圖4B和圖4C)。然而，這些細(xì)胞也顯示出肝細(xì)胞的功能性特征，例如(i) ALB和AAT分泌(圖4D)，(ii)可通過地塞米松誘導(dǎo)的Cyp3A4活性(圖4E)，(iii)膽固醇攝取和(iv)糖原貯積(圖4F)。
最后，我們觀察了將這種培養(yǎng)體系應(yīng)用于大量的細(xì)胞系(來自10個(gè)個(gè)體的20個(gè)hIPSC細(xì)胞系)，并且僅有兩個(gè)hIPSC細(xì)胞系不能分化為肝臟細(xì)胞。
總之，這些結(jié)果證明了我們的確定培養(yǎng)條件使hIPSC分化為胎兒肝細(xì)胞的近似同源細(xì)胞群的效力，其顯示出特異于成熟肝細(xì)胞的一些功能性特征。
利用患者特異性hIPSC的肝病的體外模型化:α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥
通過調(diào)查疾病特異性hIPSC (dhIPSC)來源的肝細(xì)胞是否能復(fù)制從其獲得的疾病的關(guān)鍵特征來評(píng)價(jià)我們的方法用于體外模型化肝病的有效性。我們首先關(guān)注α -抗胰蛋白酶缺乏的dhIPSC。之前的研究已經(jīng)顯示出Z等位基因(Glu342Lys)導(dǎo)致形成保持在ER中的α 1-抗胰蛋白酶的有序聚合物[17]。這些聚合物累積在肝細(xì)胞中，使得純合子容易發(fā)生新生性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[18]。α 1-抗胰蛋白酶聚合的這種通路集中于臨床表型[17]。因此，我們使用2C1聚合物特異性單克隆抗體[30]來檢測(cè)α 1_抗胰蛋白酶缺乏dhIPSC來源的肝細(xì)胞中的聚合物。通過免疫染色(圖8)并通過ELISA分析(圖10)來檢測(cè)聚合物。這些數(shù)據(jù)表明，α 1-抗胰蛋白酶聚合物的累積僅在來自患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥的個(gè)體的dhIPSC來源的肝細(xì)胞中發(fā)生。來自對(duì)照對(duì)象的hIPSC來源的肝細(xì)胞中均不存在聚合物。在用內(nèi)切核苷酶H消化之后，通過細(xì)胞的亞細(xì)胞分級(jí)分離來證實(shí)聚合物的細(xì)胞定位(圖9)，內(nèi)切核苷酶H是這樣一種酶，在高爾基體中加入唾液酸之后其除去仍為高甘露糖ER形式的N-連接的聚糖而不影響寡糖鏈。
內(nèi)切核苷酶H處理使得患者特異性hIPSC來源的肝細(xì)胞中的全部胞內(nèi)α 1-抗胰蛋白酶減少至單一 50-kDa條帶而對(duì)照hIPSC來源的肝細(xì)胞沒有減少，這表明在ER中保留了所有這樣的胞內(nèi)α 1-抗胰蛋白酶。重要的是，觀察到的聚合物增加在取自相同患者的三個(gè)不同hIPSC細(xì)胞系之間一致而在取自不同患者的hIPSC細(xì)胞系之間則有差異。這種表型差異性與患者中的疾病狀態(tài)相關(guān)并因此反映了這種疾病的臨床特征。然而，在來源于AlATD患者2的hIPSC細(xì)胞系中觀察到低水平的聚合物表達(dá)，其也尤其耐內(nèi)胚層分化。因此，在本研究中觀察到的疾病表型中的差異性主要反映了 hIPSC實(shí)現(xiàn)有效肝分化的能力。
最后，為了研究這種細(xì)胞系將來用于體外藥物篩選的潛在應(yīng)用，我們?cè)u(píng)價(jià)了向培養(yǎng)基中加入蛋白酶體抑制劑(MG132)過夜的影響。這種重要蛋白降解途徑的阻斷揭示了α 1-抗胰蛋白酶聚合物的疾病特異性細(xì)胞內(nèi)增加(圖10)。綜合這些結(jié)果表明，dhIPSC來源的肝細(xì)胞能夠在體外模型化α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥的關(guān)鍵病理學(xué)特征并且還證明其將來可用于藥物篩選試驗(yàn)。
利用患者特異性hIPSC進(jìn)行肝病的體外模型化:家族性高膽固醇血癥
為了證實(shí)我們的培養(yǎng)體系能夠模型化臨床疾病，以及為了研究其用于研究特異于其他亞細(xì)胞位置的疾病過程的潛力，我們表征了來自一位患有家族性高膽固醇血癥(FH)的患者的dhIPSC來源的肝細(xì)胞。FH中的主要缺陷是LDL受體的功能削弱從而導(dǎo)致過量的血漿LDL和過早發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化[19]。從患有的個(gè)體產(chǎn)生的dhIPSC細(xì)胞系分化為表現(xiàn)出典型功能特征的肝細(xì)胞(圖11)。分化細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了不存在LDL受體。
我們的模型中也保留了這種受體缺乏的體內(nèi)功能意義(functionalimplication),如通過免疫染色和FACS分析所示出的，表明FH-dhIPSC來源的肝細(xì)胞與LDL結(jié)合的能力被削弱(圖12)。這些結(jié)果表明，dhIPSC能夠成功應(yīng)用于模型化并且因此可適用于模型化涉及跨膜蛋白運(yùn)輸和受體功能紊亂的其他疾病。
利用患者特異性hIPSC進(jìn)行肝病的體外模型化:Ia型糖原貯積病(GSD-1a)
最后，我們使用我們的方法模型化細(xì)胞質(zhì)代謝削弱的代表性病癥。GSD-1a是由葡萄糖-6-磷酸酶缺乏引起的，葡萄糖-6-磷酸酶是催化葡萄糖-6-磷酸酯水解為葡萄糖和磷酸酯的主要酶，這是糖原生成和糖原分解的最終步驟。患有GSD-1a的個(gè)體不能保持葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡而會(huì)發(fā)生高血脂、乳酸過多癥、高尿酸血癥、肝腫大、腎腫大和生長(zhǎng)延遲[20]。使來自一個(gè)對(duì)象的三個(gè)GSD-1a細(xì)胞系分化并針對(duì)其肝細(xì)胞樣特性表征所得的細(xì)胞(圖13)。
在過碘酸雪夫氏染色之后觀察細(xì)胞疾病表型的確認(rèn)，其顯示出與對(duì)照相比，GSDladhIPSC來源的肝細(xì)胞累積顯著較高量的細(xì)胞內(nèi)糖原(圖14)。此外，相同的細(xì)胞還復(fù)制了疾病的其他特征，例如過量的脂質(zhì)累積(圖15)和乳酸的過量產(chǎn)生(圖17)。關(guān)鍵的是，在胰高血糖素刺激之后細(xì)胞表現(xiàn)出三個(gè)典型相關(guān)胰高血糖素-響應(yīng)基因的表達(dá)的誘導(dǎo)(圖16)[21][22]。這些結(jié)果證明了不僅GSDla的關(guān)鍵細(xì)胞特性(cellular aspect)能夠進(jìn)行體外模型化，而且在我們的培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的肝細(xì)胞還對(duì)中間代謝的關(guān)鍵激素顯示出至少一些反應(yīng)性，因此這暗示了我們的方法能夠被應(yīng)用于模型化其他更多的一般代謝紊亂。
通過開發(fā)使得大量hIPSC細(xì)胞系能夠有效分化為成熟肝細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞的簡(jiǎn)單的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)體系，我們已經(jīng)舉例證明了幾組非神經(jīng)元來源的疾病的模型化，其表型為成體細(xì)胞中復(fù)雜蛋白失調(diào)的結(jié)果。我們已模型化的這三種疾病包括不同類型的病理學(xué)機(jī)制，從ER中的蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊到細(xì)胞表面受體功能障礙以及最后的細(xì)胞質(zhì)代謝障礙，從而證明了這種新的方法的開發(fā)應(yīng)用于其他研究領(lǐng)域的潛在廣泛應(yīng)用。
可通過首先考慮最常見的和最好表征的病癥從我們的疾病類型α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥來舉例說明我們的模型化系統(tǒng)的潛力。之前的研究已經(jīng)證明了 ER中Z聚合物的錯(cuò)折疊和捕獲是臨床表型的根本機(jī)制[17]。然而，還沒有解釋具有相同表型的個(gè)體之間顯示出的表型變化。這樣的變化可能是由于不同患者處理錯(cuò)折疊蛋白的能力不同[23][24][8] [9，18] [7]?，F(xiàn)在正在試圖闡明負(fù)責(zé)處理這樣的蛋白的肝細(xì)胞特異性質(zhì)量控制機(jī)制[25，26]。盡管一種這樣的途徑(蛋白體)在一些肝細(xì)胞系[27]和肝外哺乳動(dòng)物細(xì)胞系[28]中的Za 1-抗胰蛋白酶代謝中起到重要作用，但其在人類干細(xì)胞的蛋白體中僅能夠近似處理蛋白(approximate protein handling)。此外,盡管我們?cè)黾恿藢?duì)蛋白質(zhì)降解途徑的理解，但仍然不清楚Za 1-抗胰蛋白酶的累積如何導(dǎo)致細(xì)胞死亡和肝功能衰竭。為了增加我們對(duì)這種機(jī)制和其他相關(guān)機(jī)制(對(duì)類似的蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊病癥的病因是很關(guān)鍵的)的理解，闡明特異于人類肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)降解途徑是研究的至關(guān)重要的下一階段。通過產(chǎn)生能夠保留疾病特異性蛋白質(zhì)聚合和ER捕獲的核心要素的患者特異性hIPSC來源的肝細(xì)胞，我們?cè)诒疚闹惺境隽四軌蚶迷撔滦腕w外細(xì)胞體系來有效地研究這樣的微妙細(xì)胞內(nèi)過程。
此外，我們的數(shù)據(jù)還提供了相同細(xì)胞內(nèi)過程可被準(zhǔn)確保留的指征，盡管存在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離體(離體回輸)重編程和分化實(shí)驗(yàn)方案的高緊迫意義(stressful implication)[8，24]。
隨后用我們的模型系統(tǒng)評(píng)價(jià)的兩種其他疾病，強(qiáng)化證明了在以患者特異性方式利用dhIPSC中保留了肝細(xì)胞中蛋白質(zhì)功能障礙的下游作用。我們首先通過復(fù)制缺少LDL受體介導(dǎo)的LDL脂質(zhì)吸收到肝細(xì)胞中成功構(gòu)建了家族性高膽固醇血癥的新型細(xì)胞模型。!^模型示出了該平臺(tái)如何唯一 地裝配以提供控制受體功能障礙的肝細(xì)胞特異性固有過程的整體印象，從核合成到通過ER運(yùn)輸以及最終在細(xì)胞膜處回收。該平臺(tái)可良好地適用于對(duì)大范圍的各種肝相關(guān)受體病理學(xué)(receptoropathy)的其他后續(xù)研究。
hIPSC來源的肝細(xì)胞中基因缺陷的修IH
接下來，我們利用piggyback轉(zhuǎn)位子修正了來源于患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AlATD)的個(gè)體的 hIPSC 的突變(Yusa 等人(2011)PNAS USA1081531-1536;Wang 等人(2008) 1059290-9295)。AlATD 是一種常染色體隱性(遺傳)病癥(autosomal recessivedisorder),以1/2000的比率在北歐世系的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)并且為最常見的肝臟遺傳性代謝病(Perlmutter, D.H.Cell Death Differl6, 39-45(2009);Gooptu, B.&Lomas, D.A.AnnuRevBiochem78, 147-176(2009))。其由AlAT基因(Z等位基因；Glu342Lys)上的單點(diǎn)突變?cè)斐桑瑢?dǎo)致蛋白在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成有序的聚合物。所得的內(nèi)含物引起肝硬化，目前肝硬化只能通過肝移植來治療。供體的愈加不足和免疫抑制治療的有害作用是器官移植的主要限制因素，使得基于hIPSC的治療潛力高度引人關(guān)注。我們采用了 ZFN技術(shù)，其刺激hESC和hIPSC 中的基因革巴向(Urnov, F.D.et al.Nat Rev Genetll, 636-646 (2010).Hockemeyer, D.et al.Nat Biotechnol27, 851-857(2009);Zou, J.et al.CellStem Cell5, 97-110(2009))。ZFN對(duì)被設(shè)計(jì)為特異性切割Z突變的位點(diǎn)。利用piggyBac重復(fù)(側(cè)接PGK-puix) tk基因盒)從同基因(isogenic) DNA構(gòu)建祀載體。為了使突變和piggyBac轉(zhuǎn)位子之間的距離最小，將CTG亮氨酸密碼子(突變的IObp上游)轉(zhuǎn)變?yōu)門TA亮氨酸密碼子，形成TTAA序列，其將在piggyBac切除后留在基因組中。
通過PCR針對(duì)靶克隆篩選在ZFN表達(dá)載體的共電穿孔之后獲得的耐嘌呤霉素hIPSC克隆和靶載體。來源于3位不同患者的AlATD-hlPSC細(xì)胞系產(chǎn)生靶克隆(表4)。顯著地，54%的耐嘌呤霉素克隆靶向于一個(gè)等位基因，而4%的耐嘌呤霉素克隆同時(shí)靶向于兩個(gè)等位基因。
為了從這些修飾的克隆除去piggyBac側(cè)接的(flanked)選擇基因盒，我們用過度活化形式的piggyBac轉(zhuǎn)座酶順時(shí)轉(zhuǎn)染兩個(gè)純合的祀克隆(B-16和C-G4) (Yusa etal (2011) supra)并使它們經(jīng)歷FIAU選擇。通過PCR分析所得的耐FIAU克隆的基因型并通過DNA印跡法確認(rèn)。在11%的耐FIAU克隆中觀察到雙等位基因切除(表5)。序列分析證明了 Z突變?cè)趦蓚€(gè)等位基因上被修正并且轉(zhuǎn)座子切除產(chǎn)生了最初計(jì)劃的TTAA序列。所得修正的AlATD-hlPSC (c -hIPSC)細(xì)胞系在超過20次傳代中保持了多能標(biāo)記物的表達(dá)以及其分化為表達(dá)三個(gè)胚層的標(biāo)記物的細(xì)胞的能力，這證明了基因組修飾并未改變c-hIPSC的多能性。
我們利用比較基因組雜交(CGH)分析了 hIPSC細(xì)胞系的基因組完整性。三分之二的AlATD-hlPSC原代細(xì)胞系與它們的親代成纖維細(xì)胞不同，這顯示出20kb至1.3Mb的擴(kuò)增或刪除(缺失)，包括獲得(gain) 20ql1.21 (其為hESC中頻繁擴(kuò)增的區(qū)域)(Lefort, N.et al.Nat Biotechnol 26, 1364-1366 (2008) ; Spits, C.et al.NatBiotechnol26, 1361-1363(2008))。與其親代成纖維細(xì)胞相比，細(xì)胞系A(chǔ)保留了正?；蚪M含量。令人備受鼓舞的是，我們發(fā)現(xiàn)在ZFN刺激的靶向之后，六個(gè)純合子克隆中的四個(gè)具有與它們的親代hIPSC細(xì)胞系相比未發(fā)生變化的基因組。將16個(gè)具有雙等位基因piggyBac切除的細(xì)胞系與它們的相應(yīng)原代hIPSC進(jìn)行比較，12個(gè)細(xì)胞系具有未發(fā)生變化的基因組。我們還通過SNP測(cè)試分析了 hIPSC細(xì)胞系以檢查雜合性的損失，并發(fā)現(xiàn)所分析的所有細(xì)胞系均在其整個(gè)基因組中保留了雜合性。這種觀察結(jié)果證明了雙等位基因的基因修正是由于在兩個(gè)等位基因處同時(shí)切除后同時(shí)發(fā)生的同源重組，并且有絲分裂重組與這一過程無關(guān)。
我們對(duì)修正的B-16-C2細(xì)胞系及其親代成纖維細(xì)胞的外顯子組(exome)進(jìn)行測(cè)序。比較這些外顯子組識(shí)別出29個(gè)突變。通過原代hIPSC細(xì)胞系的分析和純合靶向的中期基因(中間物，intermediate)來確定這些突變的起源(genesis)。在原代hIPSC細(xì)胞系中檢測(cè)到24個(gè)點(diǎn)突變和一個(gè)Ι-bp缺失，并且在基因修正期間引發(fā)了 4個(gè)突變:一個(gè)在靶向期間，三個(gè)在PiggyBac切除期間。所出現(xiàn)的這些突變?cè)谂囵B(yǎng)過程中發(fā)生，因?yàn)樗鼈兊幕蚪M標(biāo)簽(genomic signature)與ZFN脫祀(off-target)位點(diǎn)或piggyBac整合位點(diǎn)不一致?？傊覀兊贸鼋Y(jié)論認(rèn)為ZFN與piggyBac的組合使得能夠快速且徹底地修正hIPSC中的點(diǎn)突變，而不會(huì)影響它們的基本特征。
為了證實(shí)hIPSC的基因修正帶來期望的表型修正，使hIPSC體外分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，其是受到AlATD疾病影響的主要細(xì)胞類型。如所期望的發(fā)生修正細(xì)胞系的分化，產(chǎn)生肝細(xì)胞樣細(xì)胞的近似純合群體。
顯著地，分化細(xì)胞的CGH分析顯示出肝分化既不增加基因異常的數(shù)目也不選擇具有異常染色體組型的細(xì)胞。所得的細(xì)胞共有其體內(nèi)配對(duì)物的關(guān)鍵功能性質(zhì)，包括糖原貯積、LDL-膽固醇攝取、白蛋白分泌和細(xì)胞色素P450活性。重要的是，免疫熒光和ELISA均證實(shí)了在c-hlPSCs-來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中不存在突變聚合A1AT，而是有效分泌正常內(nèi)切核苷酶H-不敏感的單體(monomeric)AlAT (圖19A-圖19D)。另外，分泌的AlAT顯示出酶促抑制活性可比得上獲自正常成體肝細(xì)胞的那些(圖19E)，從而指示了能夠?qū)崿F(xiàn)酶抑制活性的生理學(xué)恢復(fù)。
最后，在經(jīng)由脾臟內(nèi)注射移植到Alb-uPA+/+;Rag2-/-; 112rg_/_小鼠肝臟中之后評(píng)價(jià)c-hIPSC來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(B-C16-2細(xì)胞系)的體內(nèi)功能。注射后14天收獲的肝臟被發(fā)現(xiàn)通過利用特異于人白蛋白和AlAT的抗體鑒別的人類細(xì)胞克隆(圖19F、圖19G)。這些人肝細(xì)胞樣細(xì)胞分布在整個(gè)肝頁中并且觀察到其被整合到現(xiàn)有的小鼠薄壁組織(parenchyma)中(圖19F、圖19G)。另外，在至少5周內(nèi)檢測(cè)到移植的動(dòng)物的血清中的人白蛋白(圖18H)，而在小鼠中均未檢測(cè)到腫瘤形成。因此，c-hIPSC-來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞能夠在體內(nèi)克隆肝臟并且顯示出它們的人ESC來源配對(duì)物的功能活性特征(Touboul，T.et al.Hepatology51, 1754-1765 (2010))?？傊?，這些分析證明了導(dǎo)致患者來源的細(xì)胞中AlAT功能恢復(fù)的Z突變的基因修正。
上述實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了用于基于細(xì)胞的AlATD治療中的患者特異性iPSC中基因修正的適用性。利用由具有仙臺(tái)病毒載體(Sendaiviral vector)的成纖維細(xì)胞重編程的患者特異性iPSC在眾多臨床相關(guān)細(xì)胞中重復(fù)進(jìn)行基因修正，這是一種非整合型(integration-free) 方法(Fusaki, N.，et al.Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci85, 348-362 (2009))。通過上述方法修正通過CGH分析具有完整基因組的原代hIPSC細(xì)胞系。最終產(chǎn)物iPSC-3-G5-A7具有經(jīng)修正的A1AT，其與親代成纖維細(xì)胞相比具有完整基因組，并且在分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)表達(dá)正常AlAT蛋白。這首次證明了突變修正的患者特異性iPSC的產(chǎn)生。
經(jīng)修正的iPS C有效分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞并將其移植到肝損傷而沒有腫瘤形成的動(dòng)物模型中。另外，發(fā)現(xiàn)來源于不同患者的hIPSC被有效修正，這表明本發(fā)明的方法能夠適用于大量的AlATD-hlPSC細(xì)胞系。盡管雙等位基因修正能夠在少于4個(gè)月內(nèi)進(jìn)行，但我們的方法可與大規(guī)模產(chǎn)生經(jīng)修正的患者特異性hIPSC相容，不僅適用于AlATD而且也適用于其他單基因病癥。
因此，本研究以若干種方式處于先進(jìn)的hIPSC領(lǐng)域。首先，證明利用單一平臺(tái)模型化患有不同疾病的成體細(xì)胞的可能性回答了 hIPSC-疾病模型化領(lǐng)域中最緊迫的問題之一。因而這種認(rèn)識(shí)使得我們提供了強(qiáng)有力且容易的可重現(xiàn)技術(shù)資源以用于不同研究領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。第二，通過證明hIPSC來源的肝細(xì)胞能夠從不同遺傳背景和疾病背景的多個(gè)患者產(chǎn)生，顯示出我們的系統(tǒng)是一種用于早期安全和治療性篩選可能與制藥行業(yè)有關(guān)的肝臟靶標(biāo)化合物的有效新方法。最后并且或許也是最重要的，證明了能夠從一組疾病純合衍生地得到大量的患者特異性肝細(xì)胞的能力，這對(duì)于基于細(xì)胞的治療是理想的，說明我們已經(jīng)朝向患者特異性hIPSC技術(shù)領(lǐng)域又邁進(jìn)了一大步。
參考文獻(xiàn)
1.Sahaj K.and R.Jaenisch Cell Stem Cell, 2009.5 (6):p.584-595.
2.Park, 1.H.Cell, 2008.134:p.877—886.
3.Maehr，R.，et al.PNAS2009.106(37):p.15768-15773.
4.Dimosj J.T.Science, 2008.321:p.1218-1221.
5.Lee，G.，et al.Nature, 2009.461 (7262):p.402-406.
6.Ebert, A.D Nature, 2009.457: p.277-280.
7.Balch，W.E., et al.Science, 2008.319 (5865):p.916-919.
8.Pan, S., et al.Hepatologyj 2009.50 (I):p.275-281.
9.Perlmutter, D.H..Cell Death Differ, 2008.16(1):p.39-45.
10.Enns，G.M.et al Molecular Genetics&Metabolism.95 (1-2): 3-10.
11.Fisher, R.A.et al Transplantation, 2006.82(4):p.441-9.
12.Guillouzoj A.et al Expert Opinion on Drug Metabolism&Toxicology, 2008.4(10):1279-1294.
13.Takahashij K.and S.Yamanaka Cell, 2006.126:p.663—676.
14.Bronsj 1.G., et al Nature, 2007.448 (7150):p.191-5.
15.Chin，M.H.，et al.Cell Stem Cell, 2009.5(1):p.111-123.
16.Touboul, T.，et al.Hepatologyj 2009.9999 (999A):p.NA.
17.Gooptu, B.et al Ann.Rev.Biochem.2009.78 (I):p.147-176.
18.Perlmutter, D.H.Pediatr Res, 2006.60: p.233-238.
19.Rader, D.J.et al J.Clin.1nvest.2003.1ll (12):p.1795-1803.
20.Shiehj J.-J.，et al.J.Biol.Chem.2002.277(7):p.5047-5053.
21.Salavertj A.et al.J.Biol.Chem.1982.257 (22):p.13404-13412.
22.Dentin, R., et al.Nature, 2007.449 (7160):p.366-369.
23.Piitulainenj E., et al Chest, 2005.128:p.2076-2081.
24.Wuj Y., et al.Proc Natl Acad Sci USA，1994.91:p.9014-9018.
25.CabraljC.M., et al J.Biol.Chem2000.275 (32):p.25015-25022.
26.Cabral, C.M.，et al.Mol.Biol.Cell, 2002.13(8):p.2639-2650.
27.Teckmanj J.H.，et al.J.Biol.Chem2001.276(48):p.44865-44872.
28.Quj D.，et al.J.Biol.Chem.，1996.271 (37):p.22791-22795.
29.Vallierj L., et al.Stem Cells, 2009.9999 (999A):p.N/A.
30.Miranda, E.，et al.，(in press-Hepatology).表 I
權(quán)利要求
1.一種用于誘導(dǎo)肝分化的方法，包括: (i)提供誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞的群體， (ii)在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述群體，以產(chǎn)生前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體， 其中，所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性并且刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路以及SMAD1、SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的信號(hào)通路，并且抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3 β (GSK3 β );以及 (iii)在肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADE細(xì)胞的群體，以產(chǎn)生肝祖細(xì)胞的群體， 其中，所述肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含第一TGF3配體，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述第一TGFii配體為活化素。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含第二TGF β配體，其刺激SMAD1、SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的信號(hào)通路。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所 述的方法，其中，所述第二TGFii配體為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含ΡΙ3Κ抑制劑和GSK3 0抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述ΡΙ3Κ抑制劑為L(zhǎng)Y294002。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述GSK30抑制劑為CHIR99021。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含第一TGF β配體，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述第一TGFii配體為活化素。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(ii)包含: Ca)在所述內(nèi)胚層培養(yǎng)基中培養(yǎng)iPSC的群體， (b)在缺少GSK30抑制劑的所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)所述群體；以及 (c)在ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)所述群體，以產(chǎn)生所述前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體，所述ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基刺激SMAD2和SMAD3信號(hào)通路并具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述ADE誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，所述AE誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含第一TGFii配體，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述第一TGFii配體為活化素。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述群體在步驟a)至步驟c)中均培養(yǎng)24小時(shí)。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括:(iv)在肝成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝祖細(xì)胞的群體，以產(chǎn)生肝細(xì)胞的群體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞的群體培養(yǎng)10至20天，以產(chǎn)生所述肝細(xì)胞的群體。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，包括確定由所述肝細(xì)胞的群體產(chǎn)生的白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少80%的所述肝細(xì)胞的群體表達(dá)白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)所述的方法，包括擴(kuò)增所述肝祖細(xì)胞或肝細(xì)胞的群體。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)所述的方法，包括培養(yǎng)或維持所述肝祖細(xì)胞或肝細(xì)胞的群體。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至22中任一項(xiàng)所述的方法，包括儲(chǔ)存所述肝祖細(xì)胞或肝細(xì)胞的群體。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，包括將所述肝祖細(xì)胞或肝細(xì)胞的群體與藥用賦形劑混合。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞被傳代30次或更少。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述 的方法，其中，所述iPS細(xì)胞來源于獲自個(gè)體的成纖維細(xì)胞。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞來源于獲自具有損傷的或功能障礙的肝組織的個(gè)體的細(xì)胞，并且所述群體中的肝細(xì)胞表現(xiàn)正常表型。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞中與肝病相關(guān)的基因突變或缺陷被修正，使得所述肝細(xì)胞表現(xiàn)正常表型。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述肝病為遺傳性代謝紊亂。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述MD選自由α 抗胰蛋白酶缺乏癥、糖原貯積病、家族性高膽固醇血癥、遺傳性酪胺酸血癥、克里格勒-納賈爾綜合征、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、因子IX缺乏癥、血色病、威爾遜氏病、杜賓-約翰遜綜合征、家族性淀粉樣變性病和雷夫敘姆病組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述基因突變或缺陷為AlAT中的Glu342Lys突變，所述肝病為α I抗胰蛋白酶缺乏癥。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞來源于獲自患有肝病的個(gè)體的細(xì)胞，并且所述群體中的肝細(xì)胞表現(xiàn)疾病表型。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述肝病為遺傳性代謝紊亂。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述MD選自由α 抗胰蛋白酶缺乏癥、糖原貯積病、家族性高膽固醇血癥、遺傳性酪胺酸血癥、克里格勒-納賈爾綜合征、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、因子IX缺乏癥、血色病、威爾遜氏病、杜賓-約翰遜綜合征、家族性淀粉樣變性病和雷夫敘姆病組成的組。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)所述的方法，包括檢測(cè)或測(cè)量所述肝細(xì)胞的群體中的一種或多種疾病病理學(xué)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，通過測(cè)量或確定所述肝細(xì)胞群體中的蛋白質(zhì)聚集或聚合；ER中的蛋白質(zhì)捕獲；膽固醇攝?。恢|(zhì)和/或糖原累積；以及乳酸產(chǎn)生中的一種或多種來檢測(cè)所述疾病病理學(xué)。
38.根據(jù)權(quán)利要求33至37中任一項(xiàng)所述的方法，包括修正所述群體中的所述肝細(xì)胞中的基因突變或缺陷，以使得所述肝細(xì)胞表現(xiàn)正常表型。
39.一種由根據(jù)權(quán)利要求1至35或38中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的分離的肝祖細(xì)胞或肝細(xì)胞的群體，其中，所述祖細(xì)胞或肝細(xì)胞表現(xiàn)正常表型。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的群體，其用于對(duì)人體或動(dòng)物體進(jìn)行治療的方法中。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的群體，其用于對(duì)具有損傷的或功能障礙的肝組織的患者進(jìn)行治療的方法中。
42.一種由根據(jù)權(quán)利要求3 6至37中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體，其中，所述肝細(xì)胞表現(xiàn)疾病表型。
43.一種對(duì)具有損傷的或功能障礙的肝組織的患者進(jìn)行治療的方法，包括: 向需要其的個(gè)體給予根據(jù)權(quán)利要求39所述的肝細(xì)胞的群體。
44.權(quán)利要求39所述的群體在制備用于對(duì)具有損傷的或功能障礙的肝組織的患者進(jìn)行治療的藥物中的應(yīng)用。
45.一種篩選化合物的方法，包括: 使由根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的分離的肝細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，以及 確定所述測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞的影響和/或所述肝細(xì)胞對(duì)所述測(cè)試化合物的影響。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，包括相對(duì)于不存在所述測(cè)試化合物的情況，在存在所述測(cè)試化合物的情況下確定所述肝細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活力或所述肝細(xì)胞執(zhí)行一種或多種肝細(xì)胞功能的能力， 其中，生長(zhǎng)、存活力或執(zhí)行一種或多種肝細(xì)胞功能的能力下降是所述化合物具有肝毒性效應(yīng)的指征。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，確定所述肝細(xì)胞對(duì)所述測(cè)試化合物的代謝。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，包括確定或測(cè)量測(cè)試化合物的量或濃度的下降和/或所述測(cè)試化合物代謝物的量或濃度的增加。
49.一種篩選用于治療肝病的化合物的方法，包括: 使由根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的肝細(xì)胞的群體與測(cè)試化合物接觸，以及 確定所述測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞的影響。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述肝細(xì)胞表現(xiàn)疾病表型，并且確定所述測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞中的一種或多種疾病病理學(xué)的影響。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，確定所述測(cè)試化合物對(duì)蛋白質(zhì)聚集或聚合；ER中的蛋白質(zhì)捕獲；膽固醇攝?。恢|(zhì)和/或糖原累積；以及乳酸產(chǎn)生中的一種或多種的影響。
52.根據(jù)權(quán)利要求50至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中，相對(duì)于不存在所述測(cè)試化合物的情況，在存在所述測(cè)試化合物的情況下所述肝細(xì)胞中的一種或多種疾病病理學(xué)的減少或改善是所述測(cè)試化合物可用于治療肝病的指征。
53.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述肝細(xì)胞表現(xiàn)正常表型，并且確定所述測(cè)試化合物對(duì)所述肝細(xì)胞執(zhí)行一種或多種肝細(xì)胞功能的能力的影響。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述一種或多種肝細(xì)胞功能選自解毒作用、糖原貯積、分泌AAT或白蛋白、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素產(chǎn)生、血管緊張素產(chǎn)生、氨轉(zhuǎn)化為尿素、膽固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪形成。
55.根據(jù)權(quán)利要求53至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中，相對(duì)于不存在測(cè)試化合物的情況，在存在所述測(cè)試化合物的情況下所述肝細(xì)胞執(zhí)行一種或多種肝細(xì)胞功能的能力提高是所述測(cè)試化合物 可用于治療肝病的指征。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞以產(chǎn)生前層確定型內(nèi)胚層(ADE)細(xì)胞的群體，然后在肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該ADE細(xì)胞的群體以產(chǎn)生可以可選地分化為肝細(xì)胞的肝祖細(xì)胞的群體，從而誘導(dǎo)肝分化。該內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基為具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路以及SMAD1、SMAD5和SMAD9介導(dǎo)的信號(hào)通路，并抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)；并且該肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其刺激SMAD2和SMAD3介導(dǎo)的信號(hào)通路。這些方法可用于例如產(chǎn)生肝細(xì)胞和肝祖細(xì)胞以用于基于細(xì)胞的治療或疾病模型化。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103180436SQ201180051351
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者盧多維克·瓦利耶, 謝赫·塔米爾·拉希德, 尼古拉斯·漢南, 卓欣樺 申請(qǐng)人:劍橋?qū)崢I(yè)有限公司