專利名稱：用于向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)入基因的腺相關(guān)病毒粒子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于導(dǎo)入基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)粒子。更具體而言，本發(fā)明涉及用于高效率地向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)入目的基因的能夠通過(guò)血腦屏障的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)粒子、以及含有該病毒粒子的組合物等。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)障礙給公共衛(wèi)生方面帶來(lái)了大的問(wèn)題。據(jù)推測(cè)，即使僅僅由神經(jīng)細(xì)胞的變性脫落導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的阿爾茨海默病(Alzheimer)，在日本國(guó)內(nèi)也有60萬(wàn)人以上的患者?，F(xiàn)在，很多中樞神經(jīng)障礙是采用治療藥進(jìn)行全身給藥來(lái)治療。但是，當(dāng)全身給藥時(shí)，很多情況下藥物無(wú)法通過(guò)血腦屏障，往往是低效率的，很多有潛力的有用的治療用蛋白質(zhì)等不能予以全身給藥。利用腺相關(guān)病毒(AAV)作為基因治療用的病毒來(lái)源的載體的方法是公知的(例如，W02003/018821、W02003/053476、W02007/001010等)。但是，當(dāng)試圖將基因?qū)肽X等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞時(shí)，有必要研究上述血腦屏障等的防御機(jī)能、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的導(dǎo)入效率、表達(dá)效率、更安全的給藥方法等的問(wèn)題。Nakai H 等(Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associatedvirus serotype8vectors in mice.J.Virol.2005Jan ；79 (I ):214-24.)中記載了，將基因?qū)敫渭?xì)胞作為目的，使用了通過(guò)EFl α啟動(dòng)子對(duì)LacZ基因的標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)的8型AAV載體 AAV8-EF1 a (-nlslacZ)的例子。Foust KD 等(Intravascular AAV9preferentially targets neonatal neuronsand adult astrocytes.Nat.Biotechnol.2009Jan ；27 (I):59-65.)中記載了關(guān)于具有 9型AAV (AAV9)的外殼蛋白，通過(guò)雞β -肌動(dòng)蛋白雜合啟動(dòng)子(chicken β -actin hybridpromoter) (CB)來(lái)表達(dá)突光蛋白GFP的自補(bǔ)(self-complementary (sc))型載體。另夕卜，Duque S 等(Intravenous Administration of Self-complementary AAV9EnablesTransgene Delivery to Adult Motor Neurons.Mol.Ther.2009Jul ;17 (7):1187-96.)(結(jié)果的概要參照表I)中公開(kāi)了具有9型AAV (AAV9)的衣殼蛋白、并且在巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子(cytomegalovirus immediate early promoter)的控制下表達(dá)突光蛋白GFP的自補(bǔ)型載體(scAAV9-GFP )。雖然通過(guò)這些重組AAV9載體的血管內(nèi)給藥將基因?qū)肓四X(新生兒的神經(jīng)元、成人的星形膠質(zhì)細(xì)胞等)，但由于需要含有使病毒基因組成為SC型的逆向序列的緣故，該基因組中可整合的基因成為非SC型時(shí)一半的長(zhǎng)度。具體而言，在SC型載體中可整合的基因，被限制為含啟動(dòng)子和poly (A)區(qū)域的2kb短的基因?；谠撓拗?，重組病毒載體的治療用途也受到限制。如上所述，雖然以往制作了各種重組腺相關(guān)病毒載體，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠采用簡(jiǎn)易的給藥方法通過(guò)生物 體的血腦屏障、特別是將基因有效地導(dǎo)入腦神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞并且能夠利用有望更廣泛的治療用途的非sc型AAV基因組的重組AAV載體。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:NakaiH 等(J.Virol.2005Jan ;79 (I):214-24.)非專利文獻(xiàn)2:FoustKD 等(Nat.Biotechnol.2009Jan ;27 (I):59-65.)非專利文獻(xiàn)3:DuqueS 等(Mol.Ther.2009Jul ; 17 (7):1187-96.)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決 的課題如上所述的狀況中，希望開(kāi)發(fā)一種病毒載體(病毒粒子)且該病毒載體能夠通過(guò)采用高效率且更簡(jiǎn)易的給藥方法將目的治療用基因送入到生物體的腦、脊髄等內(nèi)存在的神經(jīng)細(xì)胞、特別是腦神經(jīng)細(xì)胞中，由于能夠更廣泛地選擇目的基因的長(zhǎng)度，從而能夠包裝非SC型病毒基因組。解決課題的方法本發(fā)明人等反復(fù)進(jìn)行了精心研究的結(jié)果，對(duì)通常的單鏈AAV進(jìn)行野生型衣殼蛋白質(zhì)的改變，進(jìn)而通過(guò)組合含有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞有特異性的少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、或者突觸蛋白I啟動(dòng)子的重組AAV基因組，成功制作了通過(guò)對(duì)被檢體外周給藥能夠非常高效率地將基因?qū)肷窠?jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的病毒粒子。S卩，本發(fā)明提供一種能夠高效率地將治療用基因?qū)肷矬w的腦、脊髄等的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)并且能夠通過(guò)血腦屏障的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的病毒粒子、以及含有該粒子的醫(yī)藥組合物等。[I] 一種重組腺相關(guān)病毒粒子，其包括:Ca)殼粒,該殼粒含有能夠形成病毒粒子的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有在相對(duì)于序列號(hào)2、4或6的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列中至少一個(gè)表面露出的酪氨酸殘基被置換為其它氨基酸殘基的氨基酸序列；以及(b)多核苷酸，該多核苷酸被包裝于該殼粒內(nèi)，并且該多核苷酸含有神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列和以能夠操作的方式連結(jié)于該啟動(dòng)子序列的核苷酸序列。[la]如[I]所述的病毒粒子，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列來(lái)自神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者少突膠質(zhì)細(xì)胞。[2]如[I]所述的病毒粒子，其中，所述蛋白質(zhì)含有至少序列號(hào)2中的445位的酪氨酸殘基、序列號(hào)4中的444位的酪氨酸殘基、或者序列號(hào)6中的446位的酪氨酸殘基被置換了的氨基酸序列。[3]如技術(shù)方案I或2所述的病毒粒子，其中，所述酪氨酸殘基被置換為苯丙氨酸殘基。[4]如[I] [3]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述蛋白質(zhì)含有序列號(hào)8、10或12的氨基酸序列、或者在序列號(hào)8、10或12的氨基酸序列的444 446位以外的位置中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入和/或添加的氨基酸序列，并且能夠形成病毒粒子。[5]如[I] [4]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子,其中,在所述多核苷酸的5’末端和3’末端，分別含有來(lái)自AAVl、AAV2、AAV3或者AAV4的5’末端和3’末端的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)ITR序列。[6]如[I] [5]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子,其中，在所述多核苷酸的5’末端和3’末端，分別含有序列號(hào)13和序列號(hào)14的核苷酸序列。[7]如[I] [5]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述多核苷酸具有總長(zhǎng)約2 6kb的長(zhǎng)度，并且是正義鏈或者反義鏈的單鏈DNA。[8]如[I] [6]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述啟動(dòng)子序列選自于由下列啟動(dòng)子序列所構(gòu)成的組中:突觸蛋白I啟動(dòng)子序列；髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子序列；神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng)子序列；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II (CMKII)啟動(dòng)子；微管蛋白α I啟動(dòng)子；血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子β鏈啟動(dòng)子；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子序列；L7啟動(dòng)子序列(小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子);以及谷氨酸受體S 2啟動(dòng)子(小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)。 [9]如[7]所述的病毒粒子，其中，所述啟動(dòng)子序列含有序列號(hào)23或者序列號(hào)24所述的多核苷酸。[10]如[7]所述的病毒粒子，其中，以能夠操作的方式連結(jié)于所述啟動(dòng)子序列的核苷酸序列，編碼選自于由抗體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)因子(HGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)以及β淀粉樣蛋白分解酶(Neprilysin:腦啡肽酶)所構(gòu)成的組中的蛋白質(zhì)。[10a]如[7]所述的病毒粒子，其中，以能夠操作的方式連結(jié)于所述啟動(dòng)子序列的核苷酸序列，表達(dá)了相對(duì)于芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)或者α -突觸核蛋白(a -Synuclein)的 dsRNA、siRNA、shRNA、或者 miRNA。[11]如[9]所述的病毒粒子，其中，所述抗體是對(duì)凝集性β淀粉樣蛋白的抗體。[11a]如[9]所述的病毒粒子，其中，所述抗體是對(duì)凝集性β淀粉樣蛋白的單鏈抗體。[lib]如技術(shù)方案10所述的病毒粒子，其中，所述核苷酸序列是β淀粉樣蛋白分解酶(Neprilysin:腦啡肽酶)。[12]如[1] [11]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，其能夠通過(guò)被檢體的血腦屏障。[12a]如[1] [12]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，其用于通過(guò)對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥而將基因?qū)肷窠?jīng)細(xì)胞中。[12b]如[1] [12]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，被檢體是母體中的胎兒，并且用于通過(guò)對(duì)母體進(jìn)行外周給藥而將基因?qū)胩旱纳窠?jīng)細(xì)胞中。[13]如[1] [12]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述病毒粒子是腺相關(guān)病毒載體。 [14] 一種醫(yī)藥組合物，其中，其含有[I] [13]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子。[15]如[14]所述的醫(yī)藥組合物，其中，其使被檢體腦中的凝集性β淀粉樣蛋白減少。[15a]如[13]所述的醫(yī)藥組合物，其中，其使被檢體腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的α -突觸核蛋白(a -Synuclein)的量減少。
[16]如[14]或者[15]所述的醫(yī)藥組合物，其中，其是阿爾茨海默病的治療藥。[16a]如[14]或者[15a]所述的醫(yī)藥組合物，其中，其對(duì)帕金森氏病的治療有作用。[17] 一種方法，其包括將[I] [12]中任一項(xiàng)所述的病毒粒子對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥的工序。[17a]如[17]所述的方法，其中，被檢體是母體中的胎兒，并且將病毒粒子對(duì)母體進(jìn)行外周給藥。[18]如[17]所述的方法，其中，其還包括使被檢體的腦中的凝集性β淀粉樣蛋白減少的工序。[18a]如[17a]所述的方法，其中，其還包括使被檢體腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的α -突觸核蛋白(a -Synuclein)量減少的工序。[19]如[18]所述的方法，其中，其是用于治療阿爾茨海默病。[19a]如[18a]所述的方法，其中，其對(duì)帕金森氏病的治療有作用。發(fā)明效果本發(fā)明的重組病毒載體，因?yàn)槟軌蛲ㄟ^(guò)血腦屏障，所以能夠通過(guò)外周給藥將基因?qū)肽X神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。并且，通過(guò)本發(fā)明的載體對(duì)非SC型基因組加以利用，能夠更廣泛地選擇特別是與長(zhǎng)度相關(guān)的目的治療用基因。因此，例如，通過(guò)使用本發(fā)明的rAAV載體并且該載體包裝了含有對(duì)抗體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等有用蛋白質(zhì)(可以是一種以上)進(jìn)行編碼的目的基因的病毒基因組，并 且采用外周給藥等更安全的給藥方法，能夠?qū)⒒驅(qū)氡粰z體的腦等的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。例如，在本發(fā)明的重組載體中，整合對(duì)治療帕金森氏病有作用的α-突觸核蛋白(a-Synuclein)進(jìn)行編碼的基因、對(duì)成為阿爾茨海默病的原因的β淀粉樣蛋白凝集體的抗體進(jìn)行編碼的基因等，能夠提供用于治療各疾病的更安全的治療藥。另外，采用本發(fā)明的病毒載體制備方法和/或使用本發(fā)明的試劑盒，能夠制作一種rAAV載體，該載體用于通過(guò)外周給藥將目的基因高效率地送入并導(dǎo)入腦、中樞神經(jīng)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中。


圖1是通過(guò)圖表來(lái)示出使用了本發(fā)明rAAV病毒粒子的每一個(gè)大腦中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)的圖。圖2A是表示將含有yfAAV9-CAG-GFP的rAAV載體進(jìn)行外周給藥后的小鼠腦組織的冠狀斷面照片及其部分放大照片的圖。GFP陽(yáng)性細(xì)胞多數(shù)是膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭)(綠色:GFP(綠色熒光蛋白)；紅色=NeuN (神經(jīng)元核))。圖2B是表示將含有yfAAV9-Syn1-GFP的rAAV載體進(jìn)行外周給藥后的小鼠腦組織的冠狀斷面照片及其部分放大照片的圖。圖2C是表示將含有yfAAV9-MBP-GFP的rAAV載體外進(jìn)行外周給藥后的小鼠腦組織的冠狀斷面照片及其部分放大照片的圖。圖3是表示使用本發(fā)明rAAV病毒粒子后的大腦皮質(zhì)每0.04mm3的GFP陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)的圖。圖4是表示使用本發(fā)明rAAV病毒粒子后的脊髄中的GFP和ChAT表示陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞的照片及其部分放大照片的圖。
圖5是表示使用了本發(fā)明rAAV病毒粒子的、通過(guò)對(duì)母親小鼠進(jìn)行心腔內(nèi)給藥而將基因?qū)胩耗X神經(jīng)細(xì)胞中的結(jié)果的圖像照片(左圖)及其部分放大圖(右圖)。圖6是表示將實(shí)施例3所述的yfAAV9-Syn1-GFP_miAADC進(jìn)行心腔內(nèi)給藥后的小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的黑質(zhì)致密部中的各種抗體免疫染色結(jié)果的圖像照片的圖。使用的一次抗體是 ant1-GFP (左圖)、ant1-AADC (中間圖)、ant1-TH (右圖)。
具體實(shí)施例方式1.本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的病毒粒子本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中提供了下述的rAAV病毒粒子，其包括:Ca)殼粒,該殼粒含有能夠形成病毒粒子的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有在相對(duì)于序列號(hào)
2、4或6的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列中至少一個(gè)表面露出的酪氨酸殘基被置換為其它氨基酸殘基的氨基酸序列；以及(b)多核苷酸，該多核苷酸被包裝于該殼粒內(nèi)，并且該多核苷酸含有神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列和以能夠操作的方式連結(jié)于該啟動(dòng)子序列的核苷酸序列。1.1腺相關(guān)病毒(AAV)天然的腺相關(guān)病毒(AAV)是非病原性病毒。通過(guò)利用該特征來(lái)制作各種重組病毒載體，然后送入用于基因治療所需的基因(例如，參照W02003/018821、W02003/053476、W02007/001010、藥學(xué)雜志126 (11) 1021-1028等)。野生型AAV基因組，是具有總長(zhǎng)為約5kb的核苷酸長(zhǎng)度的單鏈DNA分子，并且是正義鏈或者反義鏈。AAV基因組，通常在基因組的5’側(cè)和3’側(cè)的兩末端具有約145個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)(ITR)序列。已知該ITR具有作為AAV基因組的復(fù)制起點(diǎn)的功能以及作為該基因組的病毒粒子內(nèi)的包裝信號(hào)的功能等多種功能(例如，參照上述文獻(xiàn)的藥學(xué)雜志126(11)1021-1028等)。ITR所插入的野生型AAV基因組的內(nèi)部區(qū)域(下稱“內(nèi)部區(qū)域”)含有AAV復(fù)制(rep)基因和衣殼(cap)基因。這些rep基因和cap基因，分別編碼參與病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)R印以及形成作為正20面體結(jié)構(gòu)的外殼的殼粒的衣殼蛋白質(zhì)(例如，VP1、VP2和VP3中的至少一個(gè))。更詳細(xì)而言，例如參照:Human Gene Therapy, 13, pp.345-354, 2002 ；Neuronal Development45, pp.92-103,2001 ;實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) 20，pp.1296-1300,2002 ;藥學(xué)雜志 126 (11) 1021-1028 ；Hum Gene Ther,16，541-550，2005 等。天然的腺相關(guān)病毒，已知有各種類型，已發(fā)現(xiàn)分別有感染對(duì)象細(xì)胞的傾向(例如，在“Gao，G 等 Curr.Gene Ther.5:285 - 297,2005 ；Xin, K-Q 等 J.Virol.80:11899-910，2006 ；Hellstroem, M 等 Gene Ther.16:521-32，2009” 等中有記載)。本發(fā)明的 rAAV 載體，優(yōu)選能夠采用來(lái)自天然的腺相關(guān)病毒I型(AAV1)、2型(AAV2)、3型(AAV3)、4型(AAV4)、5型(AAV5)、6型(AAV6)、7型(AAV7)、8型(AAV8)、9型(AAV9)等來(lái)進(jìn)行制作，但并不限定于這些。這些腺相關(guān)病毒基因組的核苷酸序列是公知的，能夠分別參照GenBank登記編號(hào)AF063497.1(AAV1)、AF043303(AAV2)、NC_001729(AAV3)、NC_001829.1(AAV4)、NC_006152.1(AAV5)、AF028704.1 (AAV6)、NC_006260.1 (AAV7)、NC_006261.1 (AAV8)、AY530579 (AAV9)的核苷酸序列。其中，2型、3型、5型和9型是人源的。本發(fā)明中，特別優(yōu)選為利用對(duì)來(lái)自AAVU AAV2或者AAV9的衣殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核苷酸序列。已有報(bào)道AAVl和AAV9是人源AAV中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的感染效率比較高的(Taymans等Hum Gene Therl8:195-206, 2007等)。另外，AAV2已經(jīng)被臨床應(yīng)用于對(duì)帕金森氏病的基因治療等(Kaplitt等，Lancet369:2097-2105, 2007 ;Marks 等，Lancet Neurol7:400-408, 2008 ;Christine 等，Neurology73:1662-1669,2009 ;Muramatsu 等，Mol Therl8:1731-1735，2010 等)。1.2本發(fā)明的rAAV病毒粒子中的衣殼蛋白質(zhì)本發(fā)明rAAV病毒粒子含有的衣殼蛋白質(zhì)，在VPl氨基酸序列(序列號(hào)2、4或者6)中表面露出的酪氨酸殘基(例如，在病毒粒子表面所露出氨基酸側(cè)鏈的酪氨酸殘基)中的至少一個(gè)被置換為其它的氨基酸。作為如上所述蛋白質(zhì)，可以舉出如下所述的蛋白質(zhì):該蛋白質(zhì)包含與序列號(hào)2、4或者6的氨基酸序列具有約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上的同一性的氨基酸序列，并且在表面所露出的酪氨酸殘基中的至少一個(gè)被置換為其它氨基酸，且該蛋白質(zhì)能夠形成病毒粒子。上述數(shù)值通常優(yōu)選為較大的數(shù)值。本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所含的衣殼蛋白質(zhì)，能夠單獨(dú)或與其它衣殼蛋白質(zhì)成員(例如，VP2和/或VP3等)一起形成殼粒，并且能夠形成在該殼粒內(nèi)包裝有AAV基因組(或者AAV載體基因組)的本發(fā)明的rAAV病毒粒子。上述本發(fā)明的rAAV，能夠通過(guò)生物的血腦屏障(包括不成熟的胎兒和新生兒的血腦屏障、以及已獨(dú)立的成體的血腦屏障)。并且，本發(fā)明的rAAV病毒粒子，能夠通過(guò)外周給藥而以成體的腦、脊髄等所含的神經(jīng)細(xì)胞作為靶標(biāo)。本說(shuō)明書(shū)中，所謂外周給藥，是指靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、心腔內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、臍帶血管內(nèi)給藥(例如，當(dāng)以胎兒為對(duì)象時(shí))等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的作為外周給藥的給藥途徑。作為能夠相互置換的氨基酸殘基，可以舉出其殘基所屬的相似氨基酸殘基的組(后述)內(nèi)所含的其它殘基。根據(jù)相互能夠置換的氨基酸殘基而得到改變的衣殼蛋白質(zhì)，能夠按照通常的基因操作技術(shù)等、本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行制作。關(guān)于上述基因操作規(guī)程，例如，能夠參照:Molecular Cloning3rd Edition, J.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Lab.Press.2001>Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons1987-1997 等。本發(fā)明的rA AV病毒粒子中所含的衣殼蛋白質(zhì)，優(yōu)選為序列號(hào)2中露出表面的252位、273位、445位、701位、705位或731位的酪氨酸殘基中的一個(gè)以上被其它的氨基酸、優(yōu)選被苯丙氨酸殘基所置換的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為序列號(hào)2的氨基酸序列中445位的酪氨酸殘基被置換為苯丙氨酸殘基。本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所含的衣殼蛋白質(zhì)，優(yōu)選為序列號(hào)4中露出表面的252位、272位、444位、500位、700位、704位或730位的酪氨酸殘基中的一個(gè)以上被其它氨基酸、優(yōu)選被苯丙氨酸殘基所置換的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為序列號(hào)4的氨基酸序列中444位的酪氨酸殘基被置換為苯丙氨酸殘基。本發(fā)明的rAAV病毒粒子含有的衣殼蛋白質(zhì)，優(yōu)選為序列號(hào)8中露出表面的252位、274位、446位、701位、705位、706位或731位中的至少一個(gè)酪氨酸殘基中一個(gè)以上被其它氨基酸、優(yōu)選被苯丙氨酸殘基所置換的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為序列號(hào)6的氨基酸序列中446位的酪氨酸殘基被置換為苯丙氨酸殘基。本發(fā)明的rAAV病毒粒子的殼粒，既可以單獨(dú)含有上述蛋白質(zhì)，也可以共同含有上述蛋白質(zhì)及其它成員(VP2和/或VP3)。本發(fā)明中，上述被置換的氨基酸殘基的位置，包括:分別與病毒型的VP2和VP3對(duì)應(yīng)的位置的氨基酸殘基的置換,優(yōu)選為對(duì)應(yīng)的酪氨酸殘基置換成為苯丙氨酸殘基的置換。這些被改變的衣殼蛋白質(zhì)，能夠按照通常的基因操作技術(shù)等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行制作。關(guān)于上述基因操作規(guī)程，例如，參照《分子克隆>々-，一.々口一二 V^O(Mc)Iecular Cloning3rd Edition:分子克隆第三版)》等。含有這些衣殼蛋白質(zhì)的本發(fā)明的病毒粒子，如上所述，能夠通過(guò)成體和胎兒的血腦屏障。優(yōu)選含有相同功能的衣殼蛋白質(zhì)的病毒粒子能夠通過(guò)外周給藥感染成體的腦、脊髄等所含的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。所謂在本發(fā)明中所使用的神經(jīng)系統(tǒng)，是指通過(guò)神經(jīng)組織構(gòu)成的器官系統(tǒng)。本發(fā)明中，作為基因?qū)氚袠?biāo)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，至少包括腦、脊髄等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所含的神經(jīng)細(xì)胞，并且也可以包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星狀膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在導(dǎo)入了基因的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中的神經(jīng)細(xì)胞的比例，優(yōu)選為70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上、或者100%。本發(fā)明的rAAV病毒粒子，進(jìn)一步含有一種如下所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有在序列號(hào)為8、10或12的氨基酸序列、或者序列號(hào)為8、10或12的氨基酸序列中在444 446位以外的位置上有一個(gè)以上的氨基酸的缺失、置換、插入和/或添加而成的氨基酸序列，并且依然能夠形成病毒粒子。更詳細(xì)而言，本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所含的衣殼蛋白質(zhì)，能夠單獨(dú)或者與其它衣殼蛋白質(zhì)成員(例如，VP2和/或VP3等)一起包含于本發(fā)明的rAAV病毒粒子的殼粒中，該殼粒內(nèi)包裝有AAV基因組(或者重組AAV載體基因組)。也可以同時(shí)產(chǎn)生上述氨基酸的缺失、置換、插入和添加中的兩種以上。作為上述蛋白質(zhì)，可以舉出，例如，該蛋白質(zhì)含有序列號(hào)8、10或者12的氨基酸序列、或序列號(hào)8、10或者12的氨基酸序列中在444 446位以外的位置上、例如有I 50個(gè)、I 40個(gè)、I 39個(gè)、I 38個(gè)、I 37個(gè)、I 36個(gè)、I 35個(gè)、I 34個(gè)、I 33個(gè)、I 32個(gè)、I 31個(gè)、I 30個(gè)、I 29個(gè)、I 28個(gè)、I 27個(gè)、I 26個(gè)、I 25個(gè)、I 24個(gè)、I 23個(gè)、I 22個(gè)、I 21個(gè)、I 20個(gè)、I 19個(gè)、I 18個(gè)、I 17個(gè)、I 16個(gè)、I 15個(gè)、I 14個(gè)、I 13個(gè)、I 12個(gè)、I 11個(gè)、I 10個(gè)、I 9個(gè)(I 數(shù)個(gè))、I 8個(gè)、I 7個(gè)、I 6個(gè)、I 5個(gè)、I 4個(gè)、I 3個(gè)、I 2個(gè)、或者I個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失、置換、插入和/或添加而形成的氨基酸序列，且該蛋白質(zhì)能夠形成病毒粒子的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、置換、插入和/或添加的數(shù)目，通常優(yōu)選為較小的數(shù)目。所形成的本發(fā)明rAAV病毒粒子，如上所述，能夠通過(guò)成體和胎兒的血腦屏障，并且優(yōu)選通過(guò)外周給藥能夠?qū)⒒驅(qū)肽X、脊髄等的神經(jīng)細(xì)胞中。另外，本發(fā)明的rAAV病毒粒子，通過(guò)針對(duì)母體進(jìn)行外周給藥而能夠?qū)⒒驅(qū)肽阁w中胎兒的腦、脊髄等所含的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中。這些被改變的衣殼蛋白質(zhì)，能夠按照通常的基因操作技術(shù)等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行制作。下面示出本發(fā)明的蛋白質(zhì)(多肽)中能夠相互置換的氨基酸殘基的例子。在同一組中所含的氨基酸殘基能夠相互置換。A組:亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙胺酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙胺酸、環(huán)己基丙胺酸；B組:天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組:賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E組:脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸疋組:絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；6組:苯丙氨酸、酪氨酸。 本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所含的上述衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP2和/或VP3，是通過(guò)一種以上的多核苷酸來(lái)進(jìn)行編碼所獲得。優(yōu)選本發(fā)明中的衣殼蛋白質(zhì)全部通過(guò)一種多核苷酸來(lái)進(jìn)行編碼。更優(yōu)選為衣殼蛋白質(zhì)是通過(guò)序列號(hào)為7、9或11的多核苷酸來(lái)進(jìn)行編碼。對(duì)本發(fā)明rAAV病毒粒子中所含的上述衣殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸，能夠針對(duì)可形成本發(fā)明的重組病毒粒子的衣殼蛋白質(zhì)以及功能相同的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。上述多核苷酸，包括例如在序列號(hào)為7、9或11的多核苷酸序列、或者在序列號(hào)為7、9或11的多核苷酸序列中具有I個(gè)以上(例如，I 50個(gè)、I 40個(gè)、I 30個(gè)、I 25個(gè)、I 20個(gè)、I 15個(gè)、I 10個(gè)、I 9個(gè)(I 數(shù)個(gè))、I 8個(gè)、I 7個(gè)、I 6個(gè)、I 5個(gè)、I 4個(gè)、I 3個(gè)、I 2個(gè)、I個(gè)等)的核苷酸的缺失、置換、插入和/或添加的多核苷酸，并且其對(duì)可以形成含有下述氨基酸序列的病毒粒子的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸，該氨基酸序列是通過(guò)在序列號(hào)為8、10或12的氨基酸序列、或者序列號(hào)8、10或12的氨基酸序列中在444 446位以外的位置上有I個(gè)以上的氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入和/或添加而成的氨基酸序列。在這些缺失、置換、插入和添加的情況中，也可以同時(shí)產(chǎn)生兩種情況以上。含有根據(jù)上述多核苷酸進(jìn)行編碼的衣殼蛋白質(zhì)的本發(fā)明的rAAV病毒粒子，如上所述，能夠通過(guò)成體和胎兒的血腦屏障。優(yōu)選本發(fā)明的rAAV病毒粒子能夠經(jīng)過(guò)外周給藥將基因?qū)氤审w的腦、脊髄等所含的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中。另外，本發(fā)明的rAAV病毒粒子，能夠通過(guò)針對(duì)母體進(jìn)行外周給藥而將基因?qū)肽阁w中胎兒的腦、脊髄等所含的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中。上述核苷酸的缺失、置換、插入和/或添加的數(shù)目，通常優(yōu)選為較小的數(shù)目。上述多核苷酸，能夠包括例如是在嚴(yán)格雜交條件下能夠與序列號(hào)為7、9或11的序列或者其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的多核苷酸，并且是針對(duì)可形成本發(fā)明重組病毒粒子的蛋白質(zhì)(例如，含有序列號(hào)為8、10或12的氨基酸序列、或者序列號(hào)為8、10或12的氨基酸序列中在444 446位以外的位置上有I個(gè)以上的氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入和/或添加而成的氨基酸序列的蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼的多核苷酸。雜交能夠按照公知的方法或以公知方法為標(biāo)準(zhǔn)的方法、例如《分子克隆》(Molecular Cloning3rd Edition (分子克隆第三版),J.Sambrook 等 Cold Spring HarborLab.Press.2001)中所記載的方法等來(lái)進(jìn)行。另外，若使用市售的文庫(kù)，則能夠按照制造業(yè)者提供的使用說(shuō)明書(shū)中等所記載的方法來(lái)進(jìn)行。其中，“嚴(yán)格條件”，可以是低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件和高嚴(yán)格條件中的任意條件?！暗蛧?yán)格條件”，例如是5XSSC、5X鄧哈特溶液(DenhardtJ s soluti on)、。.5%SDS、50%甲酰胺、32°C的條件。另外，“中嚴(yán)格條件”，例如是5XSSC、5X鄧哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42°C的條件?！案邍?yán)格條件”，例如是5 X SSC、5X鄧哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50°C的條件。在這些條件中越是提高溫度，則越能夠有望有效地獲得具有高同源性的DNA。其中，作為影響雜交嚴(yán)格度的因素，被認(rèn)為有溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多個(gè)因素；若是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可通過(guò)對(duì)這些因素進(jìn)行適當(dāng)選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)相同的嚴(yán)格度。作為可雜交的多核苷酸，可以舉出如下所述多核苷酸:該多核苷酸在通過(guò)FASTA、BLAST等同源性檢索軟件并使用默認(rèn)的參數(shù)計(jì)算時(shí)具有與序列號(hào)為7、9或11的核苷酸序列的例如70%以上、80%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上的同一性。上述同源性的數(shù)值通常優(yōu)選為較大的數(shù)值。此外，氨基酸序列和多核苷酸序列的同一性，能夠采用由卡爾林(Karlin)和阿爾丘爾(Altschul)提出的算法 BLAST (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264-2268,1990 ；Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873,1993)來(lái)進(jìn)行確定。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出基于BLAST算法的被稱為BLASTN 和 BLASTX 的程序(Altschul SF 等 J Mol Biol215:403，1990)。當(dāng)使用 BLASTN 分析堿基序列時(shí),設(shè)定參數(shù)例如為score = 100、wordlength = 12。另外，當(dāng)使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，設(shè)定參數(shù)例如為score = 50、wordlength = 3。當(dāng)使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。本發(fā)明中使用的R印蛋白質(zhì)，只要具有與識(shí)別ITR序列而依據(jù)該序列進(jìn)行基因組復(fù)制的功能、向病毒粒子內(nèi)補(bǔ)充野生型AAV基因組(或者rAAV基因組)后將其進(jìn)行包裝的功能、形成本發(fā)明rAAV病毒粒子的功能等公知的功能相同水平的功能，即可具有與上述同樣數(shù)量的氨基酸序列同一性，并能夠包含與上述相同數(shù)量的氨基酸殘基的缺失、置換、插入和/或添加。關(guān)于在功能上同等水平的范圍，可以舉出與上述比活性相關(guān)的說(shuō)明中所記載的范圍。本發(fā)明中，優(yōu)選使用公知的AAV3來(lái)源的Rep蛋白質(zhì)。更優(yōu)選使用具有序列號(hào)16所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。對(duì)本發(fā)明中使用的Rep蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸，只要是編碼具有與識(shí)別ITR序列而依據(jù)該序列進(jìn)行基因組復(fù)制的功能、向病毒粒子內(nèi)補(bǔ)充野生型AAV基因組(或者rAAV基因組)并將其進(jìn)行包裝的功能、形成本發(fā)明rAAV病毒粒子的功能等公知的功能相同水平的Rep蛋白質(zhì)，即可具有與上述同樣數(shù)量的同一性，并可以包含與上述相同數(shù)量的核苷酸的缺失、置換、插入和/或添加。關(guān)于在功能上同等水平的范圍，可以舉出與上述比活性相關(guān)的說(shuō)明中所記載的范圍。本發(fā)明中，優(yōu)選使用AAV3來(lái)源的rep基因。更優(yōu)選使用具有序列號(hào)15所記載的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的實(shí)施方式I中，由上述野生型AAV基因組的內(nèi)部區(qū)域進(jìn)行編碼的衣殼蛋白質(zhì)VPl等(VP1、VP2和/或VP3)和R印蛋白質(zhì)，是通過(guò)將編碼它們的多核苷酸整合于本發(fā)明的AAV輔助質(zhì)粒中來(lái)提供。本發(fā)明中所用的衣殼蛋白質(zhì)(VP1、VP2和/或VP3)以及R印蛋白質(zhì)，可以根據(jù)需要而整合于一種、兩種、三種或更多種的質(zhì)粒中。根據(jù)不同情況，這些衣殼蛋白質(zhì)和Rep蛋白質(zhì)中的一種以上可以被包含于AAV基因組中。本發(fā)明中，優(yōu)選衣殼蛋白質(zhì)(VP1、VP2和/或VP3)和Rep蛋白質(zhì)全部由一種多核苷酸進(jìn)行編碼并且作為AAV輔助質(zhì)粒進(jìn)行提供。例如，參見(jiàn) 本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例。I.3本發(fā)明的rAAV基因組本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所包裝的重組腺相關(guān)病毒基因組(下面，本發(fā)明的rAAV基因組)，能通過(guò)如下方法進(jìn)行制作，即:采用包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸(治療用基因)和用于轉(zhuǎn)錄該多核苷酸的啟動(dòng)子序列等的基因盒(gene cassett)，對(duì)位于野生型基因組的5’側(cè)和3’側(cè)的ITR之間的內(nèi)部區(qū)域(S卩，r印基因和cap基因中的一者或者兩者)的多核苷酸進(jìn)行置換而制作。優(yōu)選位于5’側(cè)和3’側(cè)的ITR分別位于AAV基因組的5’末端和3’末端。本發(fā)明的rAAV基因組，優(yōu)選位于5’末端和3’末端的ITR含有AAV1、AAV2、AAV3或者AAV9的基因組中所含的5’側(cè)ITR和3’側(cè)ITR。特別優(yōu)選本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所包裝的病毒基因組，5’側(cè)的ITR是序列號(hào)為13的多核苷酸、3’側(cè)ITR是序列號(hào)為14的多核苷酸。通常，ITR部分容易取得互補(bǔ)序列替換而成的序列(flip and flop structure:來(lái)回?fù)Q位結(jié)構(gòu))，因此，本發(fā)明的rAAV基因組中所含的ITR的5’和3’的方向也可以逆轉(zhuǎn)。與本發(fā)明rAAV基因組中的內(nèi)部區(qū)域之間所置換的多核苷酸(S卩，治療用基因)的長(zhǎng)度，在實(shí)用上優(yōu)選與原來(lái)的多核苷酸的長(zhǎng)度同等的水平。即，本發(fā)明的rAAV基因組的全長(zhǎng)與野生型的全長(zhǎng)5kb是同等的水平,例如是約2 6kb,優(yōu)選為約4 6kb。本發(fā)明的rAAV基因組中所整合的治療用基因的長(zhǎng)度，若減去含有啟動(dòng)子、多聚腺苷酸等的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的長(zhǎng)度(例如，當(dāng)假定為約I 1.5kb時(shí))，則優(yōu)選長(zhǎng)度約0.0l 3.7kb，更優(yōu)選長(zhǎng)度約0.01 2.5kb，進(jìn)一步優(yōu)選約0.01 2kb，但不限定于這些。并且，使用公知的介于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES:internal ribozyme entry site)序列之間等的公知方法,只要rAAV基因組全長(zhǎng)是在上述范圍內(nèi)，即可同時(shí)整合約0.01 1.5kb的兩種以上的多個(gè)治療用基因。通常，重組腺相關(guān)病毒粒子內(nèi)所包裝的病毒基因組存在的問(wèn)題是:因該基因組為單鏈，從而引起表達(dá)基因組中所含的目的基因時(shí)需要時(shí)間(數(shù)日)。為了解決該問(wèn)題，將被導(dǎo)入的治療用基因設(shè)計(jì)成為自互補(bǔ)性(被稱作自補(bǔ)(self-complementary (sc))型載體)并實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒載體感染后的表達(dá)進(jìn)行促進(jìn)的目的。此時(shí)，為了形成雙鏈也存在包含反向序列的必要性，因而，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)上述治療用基因的長(zhǎng)度是與非SC型基因組載體相比大概有一半長(zhǎng)度。更具體而言，當(dāng)重組病毒基因組為SC型時(shí)，能夠整合的目的基因的長(zhǎng)度，包括啟動(dòng)子、多聚腺苷酸等需要的區(qū)域在內(nèi)，被設(shè)計(jì)為約2kb。關(guān)于具體實(shí)施的詳細(xì)情況，例如前述FoustKD等(Nat Biotechnol.2009Jan ；27 (I):59-65 ;非專利文獻(xiàn)3)等中所記載的內(nèi)容。本發(fā)明中，當(dāng)目的基因的長(zhǎng)度短時(shí)，也能夠利用sc型基因組載體。即，本發(fā)明中使用的rAAV基因組，即可以是非SC型也可以是SC型。當(dāng)是SC型時(shí)，含有目的基因的表達(dá)盒的整體或其局部能夠形成雙鏈DNA。對(duì)本發(fā)明的rAAV基因組而言，為了表達(dá)目的多肽，將對(duì)該多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸序列以能夠操作的方式與各種公知的啟動(dòng)子序列組合在一起。但是，例如，當(dāng)對(duì)采用作為通常所用的強(qiáng)力的啟動(dòng)子的CMV啟動(dòng)子而成的rAAV載體加以利用時(shí)，在成體中是將大部分目的基因?qū)肽z質(zhì)樣細(xì)胞中而不導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞中(例如，參照本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例1)。因此，本發(fā)明的rAAV病毒粒子中所使用的啟動(dòng)子序列是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞有特異性的序列。在本發(fā)明中所使用的所謂神經(jīng)系統(tǒng)，是指如前面所述的由神經(jīng)組織構(gòu)成的器官系統(tǒng)。在本發(fā)明中所使用的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列，例如，來(lái)自神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦室上皮細(xì)胞等，但并不限定于這些。作為上述啟動(dòng)子序列，具體而言，可以舉出突觸蛋白I啟動(dòng)子序列、髓鞘堿性蛋白質(zhì)啟動(dòng)子序列、神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng) 子序列、膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動(dòng)子序列、L7啟動(dòng)子序列(小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)、谷氨酸受體δ 2啟動(dòng)子(小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)，但并不限定于這些。另外，本發(fā)明的rAAV病毒粒子中，也能夠使用鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CMKII)啟動(dòng)子、微管蛋白α I啟動(dòng)子、血小板由來(lái)生長(zhǎng)因子β鏈啟動(dòng)子等啟動(dòng)子序列。上述這些啟動(dòng)子序列，既可以是單獨(dú)的啟動(dòng)子序列，也可以是任意多個(gè)啟動(dòng)子序列的組合。特別優(yōu)選為突觸蛋白I啟動(dòng)子序列和髓鞘堿性蛋白質(zhì)啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的rAAV基因組，可以進(jìn)一步含有輔助mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等的增強(qiáng)子序列、Kozak序列、適當(dāng)?shù)木巯汆堰驶盘?hào)序列等公知序列。在本發(fā)明的rAAV基因組中整合有目的治療用基因。該治療用基因，可以編碼用于治療各種疾病的蛋白質(zhì)。進(jìn)行編碼的蛋白質(zhì)，既可以是一種也可以是一種以上，但包含目的基因在內(nèi)所得到包裝的rAAV基因組的長(zhǎng)度應(yīng)該在約5kb以下(除ITR區(qū)域以外約在
4.7kb以下)。例如，當(dāng)被包裝的rAAV基因組是非sc型時(shí)，整合于rAAV基因組中的目的基因長(zhǎng)度實(shí)質(zhì)上被限制在約3.5kb以下。若是sc型基因組，則進(jìn)一步被限制為上述一半的長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，目的治療用基因，優(yōu)選使用對(duì)通過(guò)短多肽所構(gòu)成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸。作為這種蛋白質(zhì)，例如，可以舉出抗體(包括抗原結(jié)合部位、Fab、Fab2、單鏈抗體(scFv)等)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)因子(HGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3和NT-4/5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞系由來(lái)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、神經(jīng)秩蛋白(Neurturin)、集聚蛋白的調(diào)節(jié)蛋白(heregluin(、> ^ >ι >))/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任一者、腦信號(hào)蛋白/腦衰蛋白、神經(jīng)突起生長(zhǎng)導(dǎo)向因子7 'J >)-1和神經(jīng)突起生長(zhǎng)導(dǎo)向因子(彳、')>)_2、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)、β淀粉樣蛋白分解酶(Neprilysin:腦啡肽酶)等,但并不限定于這些。另外，也能夠整合與呈現(xiàn)神經(jīng)障礙的代謝酶病(例如，包括高歇氏病的粘多糖貯積病、包括高胱氨酸尿癥的氨基酸代謝異常癥、包括異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的脂質(zhì)代謝異常癥等)相關(guān)的基因，例如，對(duì)葡糖腦苷脂酶、胱硫醚合成酶、芳香基硫酸酯酶A (Τ -J7寸> 7 7夕一七Α)等進(jìn)行編碼的基因。本發(fā)明的實(shí)施方式I中，由本發(fā)明的rAAV基因組所編碼的抗體的類別，并沒(méi)有特別限定，包括具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意的同型的抗體。其中，關(guān)于對(duì)抗體進(jìn)行編碼的多核苷酸的長(zhǎng)度，應(yīng)該注意在實(shí)用上存在限制。本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“抗體”的意思還包括任意的抗體片斷或者衍生物，例如，包括Fab、Fab’ 2、⑶R、人源化抗體、嵌合抗體、多功能抗體、單鏈抗體(ScFv)等。本發(fā)明中 ，優(yōu)選利用編碼單鏈抗體(ScFv)的多核苷酸作為目的治療用基因。由本發(fā)明的rAAV基因組所編碼的蛋白質(zhì)，只要具有目的功能即可包括通過(guò)基因操作而含有氨基酸殘基的插入、缺失、置換和/或添加的蛋白質(zhì)突變體。該蛋白質(zhì)突變體中，也可以同時(shí)發(fā)生上述的缺失、置換、插入和添加中的兩種以上。優(yōu)選這些蛋白質(zhì)突變體具有與原來(lái)的蛋白質(zhì)相同的功能(例如，抗原結(jié)合能力)。優(yōu)選作為上述蛋白質(zhì)突變體可以舉出如下所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是通過(guò)在例如抗β淀粉樣蛋白(Αβ)的單鏈抗體(scFv)的氛基酸序列中有例如I 50個(gè)、I 40個(gè)、I 39個(gè)、I 38個(gè)、I 37個(gè)、I 36個(gè)、I 35個(gè)、I 34個(gè)、I 33個(gè)、I 32個(gè)、I 31個(gè)、I 30個(gè)、I 29個(gè)、I 28個(gè)、I 27個(gè)、I 26個(gè)、I 25個(gè)、I 24個(gè)、I 23個(gè)、I 22個(gè)、I 21個(gè)、I 20個(gè)、I 19個(gè)、I 18個(gè)、I 17個(gè)、I 16個(gè)、I 15個(gè)、I 14個(gè)、I 13個(gè)、I 12個(gè)、I 11個(gè)、I 10個(gè)、I 9個(gè)(I 數(shù)個(gè))、I 8個(gè)、I 7個(gè)、I 6個(gè)、I 5個(gè)、I 4個(gè)、I 3個(gè)、I 2個(gè)、或者I個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失、置換、插入和/或添加而成的氨基酸序列構(gòu)成的、并且具有與原來(lái)的蛋白質(zhì)相同的抗原結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，所謂具有相同的功能，是指具有比活性例如約0.01 100倍、優(yōu)選約0.5 20倍、更優(yōu)選約0.5 2倍的范圍內(nèi)所含的抗原結(jié)合能力的意思，但并不限定于這些。本發(fā)明的rAAV基因組中所整合的目的治療用基因，是用于使反義分子、核酶、干擾RNA (iRNA)、微RNA (miRNA)等的作為靶標(biāo)的內(nèi)源性基因的功能發(fā)生變化(例如，破壞、降低)的多核苷酸，或者還可以是用于使內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生變化(例如，降低)的多核苷酸。作為靶標(biāo)的基因，可以舉出各種疾病發(fā)生的病因基因，例如，可以舉出與帕金森氏病相關(guān)的α-突觸核蛋白的編碼基因，成為癌的病因的公知的各種致癌基因，但并不限定于這些。例如，為了使用反義序列而有效抑制目的基因的表達(dá)，優(yōu)選反義核酸的長(zhǎng)度在10個(gè)堿基以上、15個(gè)堿基以上、20個(gè)堿基以上、100個(gè)堿基以上，更優(yōu)選在500個(gè)堿基以上。通常所使用的反義核酸的長(zhǎng)度短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb。通過(guò)使用核酶,能夠特異性地切斷目的蛋白質(zhì)的mRNA從而抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)。關(guān)于上述核酶的設(shè)計(jì)，能夠參照各種公知的文獻(xiàn)(例如，參照FEBS Lett.228:228，1988 ；FEBS Lett.239:285,1988 ；Nucl.Acids.Res.17:7059,1989 ；Nature323:349,1986 ；Nucl.Acids.Res.19:6751,1991 ；Protein Eng3:733,1990 ；Nucl.Acids Res.19:3875,1991 ；Nucl.Acids Res.19:5125,1991 ；Biochem Biophys Res Communl86:1271,1992 等)。另外，所謂“RNAi”是指:當(dāng)將具有與目的基因序列相同或相似的序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)所導(dǎo)入的外來(lái)基因和靶向內(nèi)源性基因的表達(dá)均受到抑制的現(xiàn)象。作為這里所用的RNA，例如產(chǎn)生21 25個(gè)堿基長(zhǎng)的干擾RNA的雙鏈RNA，例如，可以舉出dsRNA(double strand RNA:雙鏈 RNA)、siRNA (small interfering RNA:小干擾 RNA)、shRNA(short hairpin RNA:短發(fā)夾 RNA)或者 miRNA (microRNA:小分子 RNA)。如上所述的 RNA,能夠通過(guò)脂質(zhì)體等送入系統(tǒng)向所希望的部位進(jìn)行局部送入，還能夠通過(guò)使用使得上述雙鏈RNA生成的載體來(lái)對(duì)其進(jìn)行局部表達(dá)。上述雙鏈RNA (dsRNA、siRNA、shRNA或miRNA)的制備方法、使用方法等，是來(lái)自很多文獻(xiàn)的公知方法(參照日本的特表2002-516062號(hào)公報(bào)；美國(guó)的公開(kāi)專利第 2002/086356A 號(hào)；Nature Genetics, 24 (2)，180-183，2000Feb.;Genesis，26 (4)，240-244，2000April ；Nature,407:6802,319-20,2002Sep.21 ；Genes&Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002Apr.15 ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA., 99 (8)，5515-5520,2002Apr.16 ；Science,296(5567),550-553, 2002Apr.19 ；Proc Natl.Acad.Sc1.USA,99:9,6047-6052,2002Apr.30 ；Nature Biotechnology,Vol.20(5),497-500,2002May ；Nature Biotechnology,Vol.20 (5),500-505,2002May ;Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002Mayl5 等)。在本說(shuō)明書(shū)中使用“病毒粒子(virus virion)”、“病毒載體(virus vector)”、“病毒顆粒(virus particle)”各術(shù)語(yǔ)時(shí)，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，均能夠相互替換使用。在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”時(shí)，該術(shù)語(yǔ)能夠與“核酸”、“基因”或者“核酸分子”進(jìn)行替換使用，意 在表示核苷酸的聚合物。在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”時(shí)，該術(shù)語(yǔ)能夠與“核酸序列”或“堿基序列”替換使用，并且以脫氧核糖核苷酸(簡(jiǎn)寫為A、G、C和T)的序列的方式示出。例如，所謂“含有序列號(hào)I的核苷酸序列的多核苷酸或者其片段”，意思是指含有以序列號(hào)I的各脫氧核苷酸A、G、C和/或T所示出的序列的多核苷酸或者其片斷部分。本發(fā)明的各個(gè)“病毒基因組”和“多核苷酸”分別能夠以DNA的方式(例如，cDNA或基因組DNA)存在，根據(jù)情況也可以是RNA (例如，mRNA)的方式。本說(shuō)明書(shū)中所使用的各個(gè)病毒基因組和多核苷酸，可以是雙鏈或是單鏈的DNA。當(dāng)是單鏈DNA或者RNA時(shí)，既可以是編碼鏈(已知也作為正義鏈)，也可以是非編碼鏈(已知也作為反義鏈)。在不特別予以說(shuō)明的情況下，在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)針對(duì)rAAV基因組進(jìn)行編碼的啟動(dòng)子、目的基因、多聚腺苷酸信號(hào)等的基因上的配置進(jìn)行說(shuō)明時(shí)，若rAAV基因組是正義鏈則是針對(duì)其鏈自身進(jìn)行描述，若是反義鏈則針對(duì)其互補(bǔ)鏈進(jìn)行描述。本說(shuō)明書(shū)中，“蛋白質(zhì)”與“多肽”能夠相互替換使用，意思是指氨基酸的聚合物。本說(shuō)明書(shū)中所使用的多肽，按照肽標(biāo)記的慣例，左端為N末端(氨基末端)、右端為C末端(羧基末端)。作為本發(fā)明的多肽的部分肽(本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)略記為“本發(fā)明的部分肽”)，是前述本發(fā)明的多肽的部分肽，優(yōu)選是與前述本發(fā)明的多肽具有相同的性質(zhì)的部分肽。本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！保侵父鞣N公知的基因要素，例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體等。質(zhì)粒能夠在特定的宿主中復(fù)制，并且能夠在細(xì)胞間輸送基因序列。本說(shuō)明書(shū)中，質(zhì)粒，含有各種公知的核苷酸(DNA、RNA、PNA及其混合物)，既可以是單鏈也可以是雙鏈，優(yōu)選為雙鏈。例如，本說(shuō)明書(shū)中，在沒(méi)有特別寫明的情況下，術(shù)語(yǔ)“rAAV載體質(zhì)粒”的意思包括通過(guò)rAAV載體基因組及其互補(bǔ)鏈所形成的雙鏈。在本發(fā)明中所使用的質(zhì)粒，既可以是直鏈狀也可以是環(huán)狀。本發(fā)明的rAAV基因組中所整合的目的治療用基因，被以高于以往的效率送入神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中、并整合于該細(xì)胞的基因組中。當(dāng)使用本發(fā)明的rAAV載體時(shí)，與使用以往的rAAV載體時(shí)相比，能夠?qū)⒒驅(qū)爰s10倍以上、約20倍以上、約30倍以上、約40倍以上或者約50倍以上數(shù)量的神經(jīng)細(xì)胞中。對(duì)導(dǎo)入了基因的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量能夠通過(guò)如下方法進(jìn)行測(cè)定，例如，制作對(duì)整合了任意標(biāo)記基因的rAAV載體基因組進(jìn)行包裝的rAAV病毒粒子，接著，將該rAAV病毒粒子給藥于待測(cè)動(dòng)物，并測(cè)量對(duì)整合于rAAV載體基因組中的標(biāo)記基因(或者標(biāo)記蛋白質(zhì))進(jìn)行表 達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的數(shù)量。作為所使用的標(biāo)記基因，能夠選擇公知的標(biāo)記基因。作為上述標(biāo)記基因，例如，可以舉出LacZ基因、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)基因、發(fā)光蛋白質(zhì)基因(熒火蟲(chóng)熒光素酶等)等。本發(fā)明中，對(duì)rAAV載體基因組進(jìn)行包裝的rAAV病毒粒子，能夠通過(guò)生物體的血腦屏障，因此通過(guò)對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥，能夠向被檢體的腦、脊髄等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中導(dǎo)入目的治療用基因。當(dāng)本發(fā)明的rAAV基因組是非sc型時(shí)，能夠選擇更廣范圍的長(zhǎng)度的啟動(dòng)子和目的基因，也能夠利用多個(gè)目的基因。本說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“包裝”是指包括單鏈病毒基因組的制備、外殼蛋白質(zhì)(衣殼)的組裝、以及通過(guò)衣殼來(lái)包覆病毒基因組(衣殼化(encapsidation))等的現(xiàn)象。將適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體(通常是多個(gè)質(zhì)粒)在適當(dāng)?shù)臈l件下導(dǎo)入可包裝的細(xì)胞株中時(shí)，被組裝成重組病毒顆粒(即病毒粒子、病毒載體)并被分泌于培養(yǎng)物中。2.本發(fā)明的rAAV病毒粒子的制備本發(fā)明的其它實(shí)施方式中提供了制備本發(fā)明的rAAV病毒粒子的方法。該方法能夠包括如下工序:將(a)編碼本發(fā)明衣殼蛋白質(zhì)的第一多核苷酸(通常被稱為“AAV輔助質(zhì)粒”)、以及(b)在本發(fā)明rAAV病毒粒子內(nèi)所包裝的第二多核苷酸(含有目的治療用基因)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的工序。本發(fā)明中的制備方法，能夠進(jìn)一步包括(c)將對(duì)被稱為腺病毒(AdV)輔助質(zhì)粒的腺病毒來(lái)源的因子進(jìn)行編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于培養(yǎng)細(xì)胞的工序，或者還包括使腺病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行感染的工序。并且，還能夠包括培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞的工序以及從培養(yǎng)上清液中收集重組腺相關(guān)病毒載體的工序。上述方法已經(jīng)是公知方法，也被利用于本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中。優(yōu)選本發(fā)明rAAV病毒粒子的制備方法中包括對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染下列多核苷酸:(a)第一多核苷酸，其對(duì)含有選自于由序列號(hào)8、10和12所構(gòu)成的組中的氨基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼；以及(b)第二多核苷酸，其在序列號(hào)13的核苷酸序列與序列號(hào)14的核苷酸序列之間具有:包含神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列的多核苷酸以及以能夠操作的方式連結(jié)于該啟動(dòng)子序列的多核苷酸序列。上述第一多核苷酸和第二多核苷酸，包括例如實(shí)施例的表I中所記入的多核苷酸的組合。第一多核苷酸中的對(duì)本發(fā)明的衣殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核苷酸，優(yōu)選以能夠操作的方式與培養(yǎng)細(xì)胞中作為能夠操作的公知的啟動(dòng)子序列相結(jié)合。作為上述啟動(dòng)子序列，例如，能夠適當(dāng)使用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、EF-1a啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等。并且，可以適當(dāng)含有公知的增強(qiáng)子序列、Kozak序列、聚A附加信號(hào)序列等。第二多核苷酸在能夠與神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子進(jìn)行操作的位置上含有治療用基因。并且，可以適當(dāng)含有公知的增強(qiáng)子序列、Kozak序列、聚A附加信號(hào)序列等。該第一多核苷酸，在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列的下游，也可以含有通過(guò)各種公知的限制酶能夠切斷的克隆位點(diǎn)。更優(yōu)選含有多個(gè)限制酶識(shí)別部位的多克隆位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員，能夠按照公知的基因操作規(guī)程而在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的下游整合目的治療用基因。關(guān)于上述基因操作規(guī)程，例如參照《分子克隆》(Molecular Cloning3rd Edition (分子克隆第三版),J.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Lab.Press.2001)等。AAV是輔助依賴性病毒，因此，為了制備本發(fā)明的rAAV病毒粒子，在對(duì)病毒粒子生產(chǎn)用細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞)進(jìn)行感染時(shí)，需要與輔助病毒(例如，腺病毒、皰疹病毒或者牛痘)進(jìn)行共感染。當(dāng)沒(méi)有與輔助病毒共感染時(shí)，雖然AAV將病毒基因組插入宿主細(xì)胞染色體中，但不生成被插入的病毒基因組來(lái)源的感染性AAV病毒粒子。具有該被插入的病毒基因組的宿主，在被輔助病毒感染時(shí)，能夠生成被整合的基因組來(lái)源的感染性AAV病毒粒子。AAV自身能夠感染來(lái)自不同種的細(xì)胞，但需要輔助病毒是與宿主細(xì)胞相同的種。例如，人AAV能夠在被狗的腺病毒共感染的狗的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。本發(fā)明rAAV病毒粒子的制備中，能夠使用輔助病毒質(zhì)粒(例如，腺病毒、皰疹病毒或者牛痘)并與上述第一和第二多核苷酸同時(shí)導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中。優(yōu)選本發(fā)明的制備方法中還含有導(dǎo)入腺病毒(AdV)輔助質(zhì)粒的工序。AdV的輔助質(zhì)粒，對(duì)復(fù)制AAV基因組等所需的Ela、Elb、E2a、E4orf4等的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。或者，也可以利用輸送需要的輔助功能的重組病毒或非病毒載體(例 如，質(zhì)粒、附加體等)。這樣的重組病毒，在本技術(shù)領(lǐng)域中是既知的而且能夠按照公開(kāi)的技術(shù)進(jìn)行制造。多種腺病毒株能夠從ATCC (American Type CultureCollection:美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)中獲取，另外在市場(chǎng)上也有銷售?；蛘?，很多腺病毒株的序列，例如，能夠從公用的數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，PubMecU Genbank等)中獲取。本發(fā)明中，優(yōu)選AdV輔助體來(lái)自與培養(yǎng)細(xì)胞相同種的病毒。例如，當(dāng)使用人培養(yǎng)細(xì)胞293T時(shí)，能夠使用人AdV來(lái)源的輔助病毒載體。作為上述AdV輔助載體，能夠使用市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品(例如，Agilent Technologies社制造的AAV Helper-Free系統(tǒng)(產(chǎn)品目錄編號(hào)為 240071))。在本發(fā)明rAAV病毒粒子的制備中將上述一種以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于培養(yǎng)細(xì)胞中的方法，例如，能夠采用磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等公知的各種方法。上述方法例如有 “Molecular Cloning3rd Ed.(分子克隆第三版)、Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley&Sonsl987_1997” 等中所記載的方法。3.本發(fā)明的含有rAAV病毒粒子的醫(yī)藥組合物本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了含有本發(fā)明的rAAV病毒粒子(rAAV載體)的醫(yī)藥組合物。并且，提供了一種通過(guò)利用含有本發(fā)明rAAV病毒粒子的醫(yī)藥組合物(下稱“本發(fā)明的醫(yī)藥組合物”)能夠?qū)⒒蚋咝实貙?dǎo)入被檢體的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中并通過(guò)該導(dǎo)入的基因能夠治療目的疾病的方法。本發(fā)明的rAAV能夠通過(guò)生物體的血腦屏障，因此，通過(guò)對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥，能夠?qū)⒈景l(fā)明rAAV基因送入腦、脊髄等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中。S卩，當(dāng)使用本發(fā)明的rAAV時(shí)，無(wú)需采用腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥等的需要更慎重的操作的給藥方式，因此能夠期待有更高的安全性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的rAAV病毒粒子，優(yōu)選含有神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列以及與其啟動(dòng)子序列以能夠操作的方式相連結(jié)的治療用基因。本發(fā)明的rAAV病毒粒子，能夠包含對(duì)神經(jīng)疾病(例如帕金森氏病、阿爾茨海默病、三核苷酸重復(fù)疾病(Triplet R印eat)、朊病毒病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髄小腦變性癥、離子通道病(channelopathy)、癲癇等)、先天性代謝障礙(威爾遜氏病、過(guò)氧化物酶體病等)、脫髄性疾病(多發(fā)性硬化癥等)、中樞神經(jīng)感染癥(例如HIV腦炎、細(xì)菌性髄膜炎等)、血管障礙(腦梗死、腦出血、脊髄梗死)、外傷(腦挫傷、脊髄損傷等)、視網(wǎng)膜疾病(老年性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病等)等的治療有用的基因，能夠?qū)⑦@些基因例如通過(guò)血腦屏障而整合于腦、脊髄、視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞中。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中具有包含上述治療用基因的rAAV病毒粒子。作為上述治療用基因，能夠選擇對(duì)例如上述的抗體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)因子(HGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)等進(jìn)行編碼的多核苷酸。例如，作為與帕金森氏病相關(guān)的治療靶向基因，可以舉出對(duì)α-突觸核蛋白(a-Synuclein)的表達(dá)進(jìn)行抑制的反義多核苷酸、RNAi等。例如，通過(guò)選擇對(duì)能夠識(shí)別凝集性β淀粉樣蛋白的單鏈抗體進(jìn)行編碼的多核苷酸，能夠制作用于治療阿爾茨海默病的rAAV病毒粒子。通過(guò)采用上述rAAV病毒粒子對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥，能夠期待治療帕金森氏病、阿爾茨海默病等神經(jīng)疾病。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，例如，是通過(guò)降低患者的腦神經(jīng)細(xì)胞中的ct -突觸核蛋白(a -Synuclein)的表達(dá)水平從而對(duì)治療帕金森氏病有作用，或者是通過(guò)對(duì)凝集性β淀粉樣蛋白的抗體進(jìn)行表達(dá)來(lái)降低患者腦中的凝集性β淀粉樣蛋白從而對(duì)治療阿爾茨海默病有作用。當(dāng)使用本發(fā)明的醫(yī)藥組合物時(shí)，例如能夠通過(guò)口服、非口服(靜脈內(nèi))、肌肉、口腔粘膜、直腸、陰道、皮膚、鼻腔途徑或者通過(guò)吸入途徑等進(jìn)行給藥，優(yōu)選非口服方式給藥。更優(yōu)選為靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明醫(yī)藥組合物的有效成分，既可以單獨(dú)配制也可以組合配制，也能夠通過(guò)對(duì)其配合有制藥學(xué)上容許的載體或者制劑用添加物而以制劑的方式進(jìn)行提供。此時(shí)，本發(fā)明的有效成分，例 如能夠在制劑中含有0.1 99.9重量％。作為制藥學(xué)上的容許的載體或添加劑，例如，能夠使用賦形劑、崩解劑、崩解助劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、涂敷劑、色素、稀釋劑、溶解劑、溶解助劑、等滲劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑等。作為適于口服的制劑的例子，例如，可以舉出散劑、片齊[J、膠囊劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、液劑或者糖漿劑等。在口服的情況下，能夠與下列物質(zhì)一起使用:微晶質(zhì)纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鉀、甘氨酸等的各種賦形劑；淀粉，優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯的淀粉，以及藻酸或某種硅酸復(fù)鹽等的各種崩解劑；以及，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠、阿拉伯膠等的顆粒形成結(jié)合劑。另外，在多數(shù)情況下，硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉、滑石等潤(rùn)滑劑對(duì)片劑的形成也是非常有效的。也能夠?qū)⑼N固體組合物填充到明膠膠囊后進(jìn)行使用。作為與此關(guān)聯(lián)的優(yōu)選物質(zhì)，可以舉出乳糖或者除乳糖之外還可以舉出高分子量的聚乙二醇。當(dāng)要將水性懸浮液和/或酏劑作為口服用時(shí)，能夠?qū)⒒钚猿煞峙c各種甜味料或香味料、色素或染料并用、此外在需要的情況下還與乳化劑和/或懸浮劑并用、與水、乙醇、丙二醇、甘油等、以及將它們組合而成的稀釋劑一起使用。
作為適于非口服的制劑，例如，可以例舉出注射齊U、栓劑等。在非口服給藥的情況下，能夠使用將本發(fā)明的有效成分溶解于芝麻油或花生油中的任一者中、或者溶解于丙二醇水溶液中而形成的溶液。根據(jù)需要，對(duì)水溶液適當(dāng)進(jìn)行緩沖(優(yōu)選PH8以上)，并需要首先使液體稀釋劑進(jìn)行等滲化。作為上述液體稀釋劑，例如，能夠使用生理鹽水。所制備的水溶液適于靜脈內(nèi)注射；另一方面，油性溶液適于關(guān)節(jié)內(nèi)注射、肌肉注射和皮下注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按照公知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)容易地實(shí)現(xiàn)在無(wú)菌狀態(tài)下制造上述這些全部溶液。并且，也能夠?qū)⒈景l(fā)明的有效成分對(duì)皮膚等局部給藥。此時(shí)優(yōu)選按照標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)藥常規(guī)而以乳霜、膠凍劑、糊劑、軟膏的形式進(jìn)行局部給藥。對(duì)本發(fā)明醫(yī)藥組合物的給藥量沒(méi)有特別限定，能夠根據(jù)疾病種類、患者年齡和癥狀、給藥途徑、治療目的、有無(wú)并用藥劑等各種條件而選擇適當(dāng)?shù)慕o藥量。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥量，例如，成人(例如，體重60kg)每天I 5000mg,優(yōu)選為10 IOOOmg,但并不限定于這些。這些一天的給藥量也可以分成2次 4次給藥。另外，當(dāng)利用vg (vectorgenome:基因組數(shù)量)作為給藥單位時(shí)，例如，能夠選擇每Ikg體重的給藥量為IO9 1014vg、優(yōu)選為101° 1013vg、更優(yōu)選為101° IO12Vg的范圍，但并不限定于這些。4.使用本發(fā)明rAAV病毒粒子向生物體導(dǎo)入基因的方法本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供一種通過(guò)使用本發(fā)明rAAV病毒粒子而在生物體的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中導(dǎo)入基因的方法(下稱“本發(fā)明的方法”)。具體而言，本發(fā)明的方法中，包括將本發(fā)明rAAV病毒粒子對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥的工序。本發(fā)明的方法，還包括將包含本發(fā)明rAAV病毒粒子的治療用基因送入腦、脊髄等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中的工序。本發(fā)明rAAV病毒粒子，能夠如上所述地通過(guò)生物體(包括成體和胎兒)的血腦屏障。因此，無(wú)需采用腦內(nèi)給藥等的需要更慎重的操作的給藥方式，因此能夠期待有更高的安全性。實(shí)施方式I中，本發(fā)明的rAAV病毒粒子，優(yōu)選具有包含神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列以及以能夠操作的方式連結(jié)于該啟動(dòng)子序列的治療用基因的重組病毒基因組(這種病毒基因組處于被包裝狀態(tài))。作為上述治療用基因，能夠選擇對(duì)例如上述的抗體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)因子(HGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)等進(jìn)行編碼的多核苷酸。本發(fā)明的實(shí)施方式I中，例如，將含有對(duì)能夠識(shí)別凝集性β淀粉樣蛋白的單鏈抗體進(jìn)行編碼的多核苷酸的rAAV病毒粒子，對(duì)被檢體進(jìn)行外周給藥，由此能夠減少被檢體腦中的凝集性β淀粉樣蛋白，并且期待能夠治療阿爾茨海默病。另外，通過(guò)使用本發(fā)明的rAAV病毒粒子，期待能夠治療(緩和、改善、修 復(fù)等)神經(jīng)細(xì)胞中的基因上的缺陷(包括先天的缺陷和后天的缺陷)。5.本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的其它實(shí)施方式中提供了用于制作本發(fā)明的rAAV的試劑盒。上述試劑盒，例如，能夠含有上述的(a)第一多核苷酸和(b)第二多核苷酸。例如，第一多核苷酸包括編碼序列號(hào)8、10和12的蛋白質(zhì)的多核苷酸。例如，第二多核苷酸，既可以含有也可以不含有目的治療用基因，但優(yōu)選能夠包含用于整合這種目的治療用基因的各種限制性酶切位點(diǎn)。用于制作本發(fā)明rAAV病毒粒子的試劑盒，還能夠進(jìn)一步含有本說(shuō)明書(shū)中所記載的任何結(jié)構(gòu)(例如，AdV輔助體(AdV helper)等)。本發(fā)明的試劑盒還能夠進(jìn)一步包括記載有使用本發(fā)明的試劑盒來(lái)制作rAAV病毒粒子用的規(guī)約的指示書(shū)。本說(shuō)明書(shū)中未特別說(shuō)明的術(shù)語(yǔ)的含義，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的術(shù)語(yǔ)的意思的范圍。實(shí)施例下面，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不局限于下述實(shí)施例。材料和方法(I) AAV的外被(衣殼)蛋白VPl的改變對(duì)I型AAV (AAV1)、2型AAV (AAV2)、9型AAV (AAV9)這三種AAV分別以含有編碼各外殼蛋白VPl的堿基序列的質(zhì)粒pAAVl-RC、pAAV2-RC、pAAV9-RC作為模板來(lái)使用。這些質(zhì)粒來(lái)自文獻(xiàn)(Handa等，J Gen Virol，81:2077-2084，2000)中所記載的AAV3R印/VP，并含有AAV3 的 Rep 序列的(Muramatsu 等 Virology221, 208-217( 1996))。這些 AAV 的 VPl 的喊基序列，已經(jīng)分別在基因庫(kù)(GeneBank)中作為登錄號(hào)(Accession N0.) AF063497、AF043303、AY530579進(jìn)行了報(bào)道(分別如序列號(hào)1、3和5所示)。通過(guò)合成如下所示的引物、使用QuickChange II XL (商品名稱)定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene公司),分別用苯丙氨酸(F)殘基置換位于AAVl的VPl氨基酸序列(序列號(hào)2)的第445位點(diǎn)、AAV2的VPl氨基酸序列(序列號(hào)4)的第444位點(diǎn)、AAV9的VPl氨基酸序列(序列號(hào)6)第446位點(diǎn)上的酪氨酸(Y)殘基。制作了包含分別對(duì)被置換的氨基酸序列AAVl-yfVPl (序列號(hào)8)、AAV2_yfVPl (序列號(hào)10)和AAV9-yfVPl-3 (序列號(hào)12)進(jìn)行編碼的多核苷酸的質(zhì)粒pAAVl-yfRC、pAAV2_yfRC、pAAV9-yfRC。另外，pAAVl-yfRC、pAAV2_yfRC、pAAV9_yfRC 均包含對(duì) AAV2 的 R印進(jìn)行編碼的核苷酸序列(序列號(hào)15)。yfAAVl-F:5’-CGACCAATACCTGTATTTCCTGAACAGAACTC-3’(序列號(hào) 17)yfAAVl-R:3’-GCTGGTTATGGACATAAAGGACTTGTCTTGAG-5’(序列號(hào) 18)yfAAV2-F:5’-CGACCAGTACCTGTAITTCTTGAGCAGAACAAAC-3’(序列號(hào) 19)yfAAV2-R:3’-GCTGGTCATGGACATAAAGAACTCGTCTTGTTTG-5，(序列號(hào) 20)yfAAV9-F:5，-CGACCAATACTTGTACTTTCTCTCAAAGAC-3，(序列號(hào) 21)yfAAV9-R:3’-GCTGGTTATGAACATGAAAGAGAGTTTCTG-5’(序列號(hào) 22)(2) rAAV載體的制作(a)載體基因組質(zhì)粒的制作作為神經(jīng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子使用了突觸蛋白I (Synapsin I (SynI)啟動(dòng)子(GeneBank登錄號(hào)M55300.1，序列號(hào)23)，或者作為少突膠質(zhì)細(xì)胞(少突神經(jīng)膠質(zhì))特異性啟動(dòng)子使用了髓鞘堿性蛋白 (MBP)啟動(dòng)子(GeneBank登錄號(hào)M63599，序列號(hào)24)。另外，作為對(duì)照使用了巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter) (CAG)的啟動(dòng)子(Niwa H 等，Genel08:193-200,1991)。通過(guò)在含有3型AAV (AAV3)的DNA序列的質(zhì)粒pAAV3的5’側(cè)和3’側(cè)的、被稱為倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)(inverted terminal repeats (ITR))的發(fā)夾DNA序列之間插入這些啟動(dòng)子和綠色突光蛋白質(zhì)(GFP)的堿基序列(TAKARA產(chǎn)品編碼Z2468N)，制作了三種質(zhì)粒pAAV-SynI_GFP、pAAV-MBP-GFP、pAAV-CAG-GFP。這些質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)在“Li 等，Mol Ther13:160-166.2006”
中有記載。(b)對(duì)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染< 第一天 >將1.5 X IO6的HEK293細(xì)胞接種于225cm2燒瓶中，并使用10%的FCS-DMEM/F12培養(yǎng)基在5%C02、37 °C下進(jìn)行了培養(yǎng)。<第三天>采用磷酸鈣法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將下面10種組合的質(zhì)粒(AAV載體質(zhì)粒+ AAV的輔助質(zhì)粒)以及含有腺病毒(AdV)的堿基序列的輔助質(zhì)粒pHelper (Agilent Technologies公司制造的AAV Helper-Free System (登記號(hào):240071)),分別按每次25 μ g (總計(jì)75yg)逐步混合于0.3M的CaCl2中。表I
權(quán)利要求
1.一種重組腺相關(guān)病毒粒子，其包括: (a)殼粒,該殼粒含有能夠形成病毒粒子的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有在相對(duì)于序列號(hào)2、4或6的氨基酸序列具有90%以上的同一'I"生的氨基酸序列中至少一個(gè)表面露出的酪氨酸殘基被置換為其它氨基酸殘基的氨基酸序列；以及 (b)多核苷酸,該多核苷酸被包裝于該殼粒內(nèi)，并且該多核苷酸含有神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列和以能夠操作的方式連結(jié)于該啟動(dòng)子序列的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的病毒粒子，其中，所述蛋白質(zhì)含有至少序列號(hào)2中的445位的酪氨酸殘基、序列號(hào)4中的444位的酪氨酸殘基、或者序列號(hào)6中的446位的酪氨酸殘基被置換了的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的病毒粒子，其中，所述酪氨酸殘基被置換為苯丙氨酸殘基。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述蛋白質(zhì)含有序列號(hào)8、10或12的氨基酸序列、或者在序列號(hào)8、10或12的氨基酸序列的444 446位以外的位置中具有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入和/或添加的氨基酸序列，并且能夠形成病毒粒子。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的病毒粒子,其中,在所述多核苷酸的5’末端和3’末端，分別含有來(lái)自AAVl、AAV2、AAV3或者AAV4的5’末端和3’末端的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)ITR序列。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的病毒粒子,其中,在所述多核苷酸的5’末端和3’末端，分別含有序列號(hào)13和序列號(hào)14的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的病毒粒子,其中，所述多核苷酸具有總長(zhǎng)約2 6kb的長(zhǎng)度，并且是正義鏈或者反義鏈的單鏈DNA。
8.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述啟動(dòng)子序列選自于由下列啟動(dòng)子序列所構(gòu)成的組中:突觸蛋白I啟動(dòng)子序列；髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子序列；神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng)子序列；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II啟動(dòng)子、即CMKII啟動(dòng)子；微管蛋白α I啟動(dòng)子；血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子β鏈啟動(dòng)子；膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP啟動(dòng)子序列；L7啟動(dòng)子序列、即小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；以及谷氨酸受體δ 2啟動(dòng)子、即小腦浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求7所述的病毒粒子，其中，所述啟動(dòng)子序列含有序列號(hào)23或者序列號(hào)24所述的多核苷酸。
10.如權(quán)利要求7所述的病毒粒子，其中，以能夠操作的方式連結(jié)于所述啟動(dòng)子序列的核苷酸序列，編碼選自于由抗體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、生長(zhǎng)因子HGF、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子aFGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、芳香族氨基酸脫羧酶AADC以及β淀粉樣蛋白分解酶的腦啡肽酶所構(gòu)成的組中的蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求7所述的病毒粒子，其中，以能夠操作的方式連結(jié)于所述啟動(dòng)子序列的核苷酸序列，表達(dá)了相對(duì)于芳香族氨基酸脫羧酶AADC或者α -突觸核蛋白的dsRNA、siRNA、shRNA、或者 miRNA。
12.如權(quán)利要求9所述的病毒粒子，其中，所述抗體是對(duì)凝集性β淀粉樣蛋白的抗體。
13.如權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，該病毒粒子能夠通過(guò)被檢體的血腦屏障。
14.如權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的病毒粒子，其中，所述病毒粒子是腺相關(guān)病毒載體。
15.一種醫(yī)藥組合 物，其中，其含有權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的病毒粒子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用高效率且更簡(jiǎn)易的方法將目的治療用基因送入神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的方法。更詳細(xì)而言，本發(fā)明提供一種使用腺相關(guān)病毒(AAV)的重組載體、制作該載體的方法、以及使用該載體的方法。更具體而言，提供一種重組腺相關(guān)病毒粒子、含有該粒子的醫(yī)藥組合物、制作該粒子的方法、以及試劑盒等，其中，該重組腺相關(guān)病毒粒子能夠通過(guò)血腦屏障且用于高效率地將目的治療用基因?qū)肷窠?jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/09GK103189507SQ20118005204
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者村松慎一 申請(qǐng)人:學(xué)校法人自治醫(yī)科大學(xué)