專利名稱：新表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于使重組體蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)的新表達(dá)載體，具體涉及包括基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)、位于其下游的編碼所需蛋白質(zhì)的基因、進(jìn)一步位于下游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和進(jìn)一步位于下游的編碼谷氨酰胺合成酶的基因的表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
使用通過整合有編碼所需蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來制造重組體蛋白質(zhì)的方法是在醫(yī)藥品制造等工業(yè)領(lǐng)域中廣泛普及的技術(shù)，0-半乳糖苷酶么、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖腦苷脂酶、加硫酶、a -L-艾杜糖醛酸酶、酸性α -葡糖苷酶等溶酶體酶、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子VI1、凝血因子珊、凝血因子IX等凝血因子、紅細(xì)胞生成素、干擾素、血栓調(diào)節(jié)蛋白、卵泡刺激素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、各種抗體藥物等使用該技術(shù)制造，作為醫(yī)藥品在市場(chǎng)上銷售。這時(shí)，作為表達(dá)載體，一般采用在誘導(dǎo)強(qiáng)基因表達(dá)的基因調(diào)控位點(diǎn)、例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟 動(dòng)子、SV40初期啟動(dòng)子、延伸因子la (EF-1)啟動(dòng)子等的下游整合有編碼所需蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)載體。導(dǎo)入了這樣的表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可表達(dá)整合至表達(dá)載體的所需蛋白質(zhì)，其表達(dá)量根據(jù)各個(gè)細(xì)胞而不同，并不一致。因此，為了高效地生產(chǎn)重組體蛋白質(zhì)，需要從導(dǎo)入了表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中篩選所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平高的細(xì)胞的步驟。為了進(jìn)行該篩選，表達(dá)載體整合有起到篩選標(biāo)記物的作用的基因。作為篩選標(biāo)記物，最一般的是分解嘌呤霉素、新霉素等藥劑的酶(耐藥性標(biāo)記物)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在一定濃度以上的上述藥劑的存在下死亡。但是，導(dǎo)入了表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過整合至表達(dá)載體中的藥劑篩選標(biāo)記物分解上述藥劑，將其無毒化或低毒化，所以在上述藥劑的存在下也可生存。因此，如果在含有一定濃度的上述藥劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)導(dǎo)入了表達(dá)載體的細(xì)胞，僅以高水平表達(dá)藥劑篩選標(biāo)記物的細(xì)胞增殖，結(jié)果篩選出那些細(xì)胞。以高水平表達(dá)藥劑篩選標(biāo)記物的細(xì)胞存在同時(shí)整合至表達(dá)載體中的編碼所需蛋白質(zhì)的基因也以高水平表達(dá)的傾向，所以結(jié)果獲得以高水平表達(dá)所需蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為篩選標(biāo)記物，還已知使用谷氨酰胺合成酶(GS)的表達(dá)載體(參照專利文獻(xiàn)1、2)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。如果將哺乳動(dòng)物細(xì)胞在作為谷氨酰胺合成酶的抑制劑的一定濃度的蛋氨酸磺酸鹽(MSX)的存在下用谷氨酰胺缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，則細(xì)胞死亡。但是，如果將作為篩選標(biāo)記物整合了谷氨酰胺合成酶的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則該細(xì)胞中谷氨酰胺合成酶的表達(dá)水平上升，所以在更高濃度的MSX的存在下也可增殖。這時(shí)，如果使MSX的濃度逐漸上升的同時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)，則可獲得在更高濃度的MSX的存在下也可增殖的細(xì)胞。該現(xiàn)象被認(rèn)為是因整合至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組內(nèi)的該表達(dá)載體在基因組內(nèi)進(jìn)行復(fù)制來增加拷貝數(shù)而引發(fā)。即，由于拷貝數(shù)增加，一個(gè)細(xì)胞中的基因組內(nèi)存在的藥劑篩選標(biāo)記物的基因數(shù)增加，基因的表達(dá)量相對(duì)增加。這時(shí)，整合至表達(dá)載體中的編碼所需蛋白質(zhì)的基因的拷貝數(shù)也復(fù)制而增加，所以可獲得以高水平表達(dá)所需蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，專利文獻(xiàn)I中記載，通過使用GS表達(dá)載體和蛋氨酸磺酸鹽(MSX)，與使用DHFP (二氫葉酸還原酶)/MTX (甲氨蝶呤)的情況相比，可實(shí)現(xiàn)更高的拷貝數(shù)。此夕卜，專利文獻(xiàn)2中記載，通過使用GS基因和MSX，宿主細(xì)胞的DNA中，隨著GS基因的拷貝數(shù)的增加，也可以使與之不同的異型基因的拷貝數(shù)也增加，由此可增加所需多肽的生產(chǎn)水平。如上所述，含篩選標(biāo)記物的表達(dá)載體適合于效率良好的重組體蛋白質(zhì)的制造，得到廣泛應(yīng)用。表達(dá)載體上，編碼所需蛋白質(zhì)的基因和編碼篩選標(biāo)記物的基因一般分別整合至不同的基因調(diào)控位點(diǎn)下(參照專利文獻(xiàn)3)。但是，還已知一個(gè)基因調(diào)控位點(diǎn)下串聯(lián)整合編碼所需蛋白質(zhì)和篩選標(biāo)記物的基因使其表達(dá)的方法(參照專利文獻(xiàn)4、5、6、7)，這時(shí)在編碼所需蛋白質(zhì)和篩選標(biāo)記物的基因之間插入有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES:1nternalribosome entry site)等，由此可由一個(gè)基因調(diào)控位點(diǎn)表達(dá)2個(gè)基因。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)已知有多種，有來源于例如微小核糖核酸病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腦心肌炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒的位點(diǎn)(參照專利文獻(xiàn)8、9、10)。作為應(yīng)用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的表達(dá)載體，已知在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游作為篩選標(biāo)記物整合有單純皰疹病毒胸苷激酶的表達(dá)載體(參照專利文獻(xiàn)11)、使用2個(gè)以上的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)結(jié)合有3種以上的基因的表達(dá)載體(參照專利文獻(xiàn)12)。如上所述，通過各種表達(dá)載體的開發(fā)，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞制造重組體蛋白質(zhì)的方法在紅細(xì)胞生成素等醫(yī)藥品的制造中得到實(shí)用化，為了降低其制造成本，始終要求效率更高的表達(dá)載體的開發(fā)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本專利特表昭63-502955號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本專 利特表平5 - 504050號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本專利特開2009-273427號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本專利特開昭59-173096號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本專利特開昭60-199387號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6:日本專利特表平4 - 500004號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7:日本專利特開平8-256776號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8:日本專利特表平6 - 509713號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9:日本專利特表平8 - 502644號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10:日本專利特開平10-327871號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11:日本專利特表2008-539785號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)12:日本專利特表2004-520016號(hào)公報(bào)發(fā)明的概要發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供用于使重組體蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)的新表達(dá)載體、通過該載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞及該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制造方法。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為了上述目的的研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使用整合有基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)以及位于其下游的編碼人葡糖腦苷脂酶等所需蛋白質(zhì)的基因、進(jìn)一步位于下游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和進(jìn)一步位于下游的編碼谷氨酰胺合成酶的基因的表達(dá)載體使哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可使編碼該蛋白質(zhì)的基因以高水平表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下的發(fā)明。[1]表達(dá)載體，它是用于使蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)載體，其中，包括基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)以及位于其下游的編碼該蛋白質(zhì)的基因、進(jìn)一步位于下游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和進(jìn)一步位于下游的編碼谷氨酰胺合成酶的基因。[2]如上述[1]的表達(dá)載體，其中，該基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)選自來源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子、SV40初期啟動(dòng)子、延伸因子I啟動(dòng)子。[3]如上述[1]或[2]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于選自微小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸道病毒、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus)、柯薩奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白基因、果蜆觸角足(Antennapedia)基因、果蜆超雙胸(Ultrabithorax)基因的病毒或基因的5’非翻譯區(qū)。[4]如上述[1]或[2]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻譯區(qū)。[5]如上述[1]或[2]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于小鼠腦心肌炎病毒的5’非翻譯區(qū)。[6]如上述[1] [5]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)是在野生型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的堿基序列中加入了 I個(gè)或2個(gè)以上的突變的位點(diǎn)。[7]如上述[6]的表達(dá)載體，其中，在該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)存在多個(gè)起始密碼子，其中的一部分被破壞。[8]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)I的堿基序列。[9]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)2的堿基序列。[10]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)3的堿基序列。[11]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)4的堿基序列。[12]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)5的堿基序列。[13]如上述[5]的表達(dá)載體，其中，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)6的堿基序列。[14]如上述[1] [13]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中，在編碼蛋白質(zhì)的該基因與該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)之間的區(qū)域或編碼谷氨酰胺合成酶的該基因的下游區(qū)域，除該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)之外，還包含其它內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)及位于其下游的耐藥性基因。[15]如上述[1] [13]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中，除該基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)之夕卜，還包含其它基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)及位于其下游的耐藥性基因。[16]如上述[14]或上述[15]的表達(dá)載體，其中，該耐藥性基因?yàn)猷堰拭顾乜剐曰蚧蛐旅顾乜剐曰颉?br> [17]如上述[I] [16]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中，編碼蛋白質(zhì)的該基因?yàn)閬碓从谌说幕?。[18]如上述[17]的表達(dá)載體，其中，來源于人的基因選自編碼溶酶體酶、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子、紅細(xì)胞生成素、干擾素、血栓調(diào)節(jié)蛋白、卵泡刺激素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和抗體的基因。[19]如上述[17]的表達(dá)載體，其中，來源于人的基因?yàn)榫幋a溶酶體酶的基因。[20]如上述[19]的表達(dá)載體，其中，該溶酶體酶選自α -半乳糖苷酶A、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖腦苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶。[21]如上述[17]的表達(dá)載體，其中，來源于人的基因?yàn)榫幋a紅細(xì)胞生成素的基因。[22]哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，通過上述[I] [21]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。[23]如上述[22]的細(xì)胞，其中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞。[24]使編碼蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制造方法，其中，包括:將上述[I] 中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟；將導(dǎo)入了該表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在谷氨酰胺合成酶抑制劑的存在下或者谷氨酰胺合成酶抑制劑和與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑的存在下進(jìn)行篩選培養(yǎng)的步驟。發(fā)明的效果

如果采用本發(fā)明，則可獲得用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)使所需重組體蛋白質(zhì)高效地表達(dá)的表達(dá)載體。通過將該表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，再進(jìn)行篩選培養(yǎng)，可獲得高效地生產(chǎn)該重組體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。如果使用這樣得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，則可大幅降低該重組體蛋白質(zhì)的制造成本。附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1-1是表示pE-neo載體的構(gòu)建方法的流程的圖。圖1-2是表示pE-neo載體的構(gòu)建方法的流程的圖。圖2-1是表示pE-hygr載體的構(gòu)建方法的流程的圖。圖2-2是表示pE-hygr載體的構(gòu)建方法的流程的圖。圖2-3是表示pE-hygr載體的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-1是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-2是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-3是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-4是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-5是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-6是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-7是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-8是表示pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖3-9是表不pE-1RES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖4是表示pE-mIRES-GS-puro的構(gòu)建方法的流程的圖。圖5是表示pE-mIRES-GS的構(gòu)建方法的流程的圖。
圖6-1是表示用表達(dá)載體(pE-mIRES-GS (GBA))轉(zhuǎn)化的hGBA表達(dá)細(xì)胞的活細(xì)胞密度的圖。圖6-2是表示用表達(dá)載體(pE-mIRES-GS (GBA))轉(zhuǎn)化的hGBA表達(dá)細(xì)胞的葡糖腦苷脂酶的表達(dá)量(GBA活性)的圖。圖7-1 是表示用表達(dá)載體(pE-1RES-GS-puro (GBA)和 pE-mlRES-GS-puro (G BA))轉(zhuǎn)化的hGBA表達(dá)細(xì)胞的活細(xì)胞密度的圖。圖7-2 是表示用表達(dá)載體(pE-1RES-GS-puro (GBA)和 pE-mlRES-GS-puro (G BA))轉(zhuǎn)化的hGBA表達(dá)細(xì)胞的人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)量(GBA活性)的圖。圖 8-1 是表示用表達(dá)載體(pE-1RES-GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (E PO))轉(zhuǎn)化的hEPO表達(dá)細(xì)胞的活細(xì)胞密度的圖。圖 8-2 是表示用表達(dá)載體(pE-1RES-GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (E PO))轉(zhuǎn)化的hEPO表達(dá)細(xì)胞的人紅細(xì)胞生成素的表達(dá)量的圖。實(shí)施發(fā)明的方式本發(fā)明中，“基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)”是指可調(diào)節(jié)存在于其下游的基因的轉(zhuǎn)錄頻率的DNA上的區(qū)域，一般被稱為 啟動(dòng)子或啟動(dòng)子基因?；虮磉_(dá)調(diào)控位點(diǎn)存在于生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的幾乎所有的基因的上游側(cè)，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄頻率，其堿基序列多樣。本發(fā)明中可使用的基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)只要能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)力誘導(dǎo)整合于其下游的基因的轉(zhuǎn)錄即可，無特別限定，較好是來源于巨細(xì)胞病毒(SMV)的啟動(dòng)子、SV40初期啟動(dòng)子等來源于病毒的啟動(dòng)子和延伸因子la (EF-1)啟動(dòng)子等。本發(fā)明中，“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”是指存在于mRNA鏈內(nèi)部的核糖體直接結(jié)合且可不依存于帽結(jié)構(gòu)開始翻譯的區(qū)域(結(jié)構(gòu))或者通過轉(zhuǎn)錄生成該區(qū)域的DNA鏈的區(qū)域(結(jié)構(gòu))。此外，本發(fā)明中，“編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的基因”是指通過轉(zhuǎn)錄生成該區(qū)域的DNA鏈的區(qū)域(結(jié)構(gòu))。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)一般被稱為IRES (internal ribosome entrysite)，在微小核糖核酸病毒科的病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、小鼠腦心肌炎病毒等)、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸道病毒、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒、柯薩奇病毒B型等病毒的5’非翻譯區(qū)和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白、果蠅觸角足、果蠅超雙胸等基因的5’非翻譯區(qū)中被發(fā)現(xiàn)。微小核糖核酸病毒的情況下，其IRES是由存在于mRNA的5’非翻譯區(qū)的約450bp形成的區(qū)域。在這里，“病毒的5’非翻譯區(qū)”是指病毒的mRNA的5’非翻譯區(qū)或通過轉(zhuǎn)錄生成該區(qū)域的DNA鏈的區(qū)域(結(jié)構(gòu))。本發(fā)明中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)只要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)、特別是來源于中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢的細(xì)胞(CH0細(xì)胞)內(nèi)起到內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的作用即可，無特別限定，可以使用任一種位點(diǎn)。其中，可優(yōu)選例舉來源于病毒的5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，更優(yōu)選例舉來源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，進(jìn)一步更優(yōu)選例舉來源于小鼠腦心肌炎病毒的5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。本發(fā)明中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)可直接使用具有野生型的堿基序列的位點(diǎn)。此外，這些野生型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的堿基序列中加入了I個(gè)或2個(gè)以上的突變(指例如置換、缺失或/和插入等)的突變型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)也只要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)(特別是CHO細(xì)胞內(nèi))起到內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的作用，可以使用任一種位點(diǎn)。此外，還可以使用融合了 2個(gè)以上的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的嵌合體型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。
此外，本發(fā)明中，通過在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的控制下配置編碼谷氨酰胺合成酶的基因(GS基因)，可調(diào)節(jié)GS基因的表達(dá)量。如果通過所述調(diào)節(jié)將GS基因的表達(dá)量調(diào)節(jié)至篩選培養(yǎng)中可獲得足夠的選擇壓力的一定范圍內(nèi)的量，如后所述，可篩選出以高水平表達(dá)重組體蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。調(diào)節(jié)GS基因的表達(dá)量的情況下，通過從各種內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)中適當(dāng)選擇使GS基因的表達(dá)量進(jìn)一步增加或進(jìn)一步減少的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使用，可實(shí)現(xiàn)該目的。此夕卜，通過在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)中加入突變，也可實(shí)現(xiàn)該目的。該情況下，對(duì)加入該突變的位置等無特別限定，只要可將存在于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游的GS基因的表達(dá)量調(diào)節(jié)至一定范圍內(nèi)的量即可，可以是任意條件。例如，為了使GS基因的表達(dá)量減少而加入突變的情況下，存在于野生型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的能用作翻譯起點(diǎn)的多個(gè)起始密碼子(ATG)可成為靶位。例如，通過突變破壞這些起始密碼子，可使整合至與這些起始密碼子同一閱讀框內(nèi)的GS基因的表達(dá)量減少。在這里，“破壞”是指通過向某一基因序列中加入突變而使該基因序列本來具有的功能無法發(fā)揮。例如，在野生型的小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的3’末端存在3個(gè)起始密碼子(ATG),將其序列示于序列編號(hào)1(5’ -ATGataatATGgccacaaccATG-3’:起始密碼子為了明確表示而以大寫字母表示)。使該存在于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游的GS基因的表達(dá)量減少的情況下，加入突變破壞的起始密碼子較好是自5’側(cè)第2個(gè)和第3個(gè)的起始密碼子，更好是第2個(gè)起始密碼子。因此，作為這樣的加入了突變的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，可例舉例如其3’末端為序列編號(hào)2(5’ -atgataatnnngccacaaccnnn-3’:n為任意的堿基)或序列編號(hào)32(5’ -atgataannnngccacaaccnnn-3’:n為任意的堿基)的堿基序列或者序列編號(hào) 3(5’ -atgataatnnngccacaaccatg-3’:n 為任意的喊基)或序列編號(hào) 33(5’ -atgataannnngccacaaccatg-3’:n為任意的堿基)的堿基序列。更具體為其3’末端為序列編號(hào)4(5’ -atgataagcttgccacaaccatg-3’ )的堿基序列的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，自5’側(cè)第2個(gè)的起始密碼子通過突變被破壞。更具體來說，野生型的小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)5 (5’ -cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataag gccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg-3> )的喊基序 列。此外，作為在該堿基序列中加入了突變的序列，可例舉序列編號(hào)6(5’-CCCCCCCCCCtCtCcctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatg-3’ )的減基序列。此外，也可以通過其它方法調(diào)節(jié)存在于野生型和/或突變型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游的GS基因的表達(dá)量。例如，使GS基因的表達(dá)量減少的情況下，通過將GS基因整合至與這些內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的起始密碼子同一閱讀框或者將抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯的堿基序列導(dǎo)入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)與存在于其下游的GS基因之間，也可以使該基因的表達(dá)量減少。抑制轉(zhuǎn)錄的堿基序列只要抑制整合至內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游的GS基因的轉(zhuǎn)錄的序列即可，無特別限定，例如有聚合酶加尾信號(hào)(5，-aataaa-3’ )等。此外，抑制翻譯的堿基序列只要是抑制整合至內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的下游的該基因的翻譯的序列即可，無特別限定，例如有誘導(dǎo)通讀的終止密碼子等妨礙正確翻譯的序列等。本發(fā)明中，提到“谷氨酰胺合成酶”時(shí)，只要是可由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶即可，無特別限定，可以是來源于包括哺乳動(dòng)物、爬蟲類、鳥類、兩棲類、屬于鱗翅目(Lepidoptera)的香蛾(Bombyx mori)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、尺蠖(Geometridae)等、屬于雙翅目(Diptera)的果蜆(Drosophila)等昆蟲、原核生物、線蟲、酵母、放線菌、絲狀菌、子囊菌、擔(dān)子菌和植物在內(nèi)的任何生物，較好是哺乳動(dòng)物的谷氨酰胺合成酶，可優(yōu)選使用來源于人或中國(guó)倉(cāng)鼠的谷氨酰胺合成酶(特別是來源于CHO細(xì)胞的谷氨酰胺合成酶)。此外，提到“谷氨酰胺合成酶抑制劑”時(shí)，只要可抑制上述谷氨酰胺合成酶的活性即可，無特別限定，可使用任一種酶，可優(yōu)選例舉蛋氨酸磺酸鹽(MSX)。

本發(fā)明中，表達(dá)載體中除GS基因外可導(dǎo)入追加的篩選標(biāo)記物基因。該追加的篩選標(biāo)記物基因是可賦予導(dǎo)入表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以耐藥性的基因(耐藥性基因)。本發(fā)明中，可用作耐藥性基因的基因只要是可賦予哺乳動(dòng)物細(xì)胞以耐藥性的基因即可，無特別限定，較好是可賦予細(xì)胞以對(duì)于嘌呤霉素、潮霉素、殺稻瘟素、新霉素等藥劑的抗性的基因。其中，嘌呤霉素、潮霉素、殺稻瘟素、新霉素等藥劑分別為“與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑”。這些耐藥性基因中，可更優(yōu)選例舉嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、殺稻瘟素抗性基因、新霉素抗性基因。本發(fā)明中，對(duì)于耐藥性基因，通過設(shè)置與重組體蛋白質(zhì)受到其控制的基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)不同的其它基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)(第二基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn))并整合至其下游，可控制表達(dá)量。該情況下，該第二基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)可使用能將耐藥性基因的表達(dá)量調(diào)節(jié)至篩選培養(yǎng)中可獲得足夠的選擇壓力的一定范圍內(nèi)的量。即，通過相對(duì)抑制耐藥性基因的表達(dá)量，可提高通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)藥劑的感受性，由此可篩選出以高水平表達(dá)編碼所需蛋白質(zhì)的基因而以高水平生產(chǎn)該重組體蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，本發(fā)明中，耐藥性基因可介以位于其上游的第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)整合至編碼重組體蛋白質(zhì)的基因與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)之間的區(qū)域或GS基因的下游的區(qū)域。由此，可通過第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制耐藥性基因的表達(dá)量。該情況下，作為第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，可使用與GS基因的上游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)相同的位點(diǎn)，也可使用其它位點(diǎn)。此外,第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)可從上述各種內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)任意選擇。對(duì)于第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，如上所述，可通過選擇適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)或加入突變等來調(diào)節(jié)耐藥性基因的表達(dá)量。本發(fā)明中，對(duì)于整合至表達(dá)載體的編碼重組體蛋白質(zhì)的基因的動(dòng)物種類，包含來源于包括人的哺乳動(dòng)物的基因，無特別限定。例如，將本發(fā)明的載體用于醫(yī)療用醫(yī)藥品的制造時(shí)，該基因基本上來源于人，用于家畜用醫(yī)藥品的制造時(shí)，基本上是來源于作為治療對(duì)象的家畜的基因。此外，對(duì)該編碼所需蛋白質(zhì)的基因的種類也無特別限定，較好是編碼α-半乳糖苷酶Α、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖腦苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α -葡糖苷酶等溶酶體酶、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子VI1、凝血因子珊、凝血因子IX等凝血因子、紅細(xì)胞生成素、干擾素、血栓調(diào)節(jié)蛋白、卵泡刺激素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或者各種抗體藥品的基因，更好是編碼溶酶體酶和紅細(xì)胞生成素的基因，進(jìn)一步更好是編碼葡糖腦苷脂酶和紅細(xì)胞生成素的基因。本發(fā)明中，導(dǎo)入表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞只要可表達(dá)目標(biāo)重組體蛋白質(zhì)即可，無特別限定，可以是從取自生物體的臟器、肌肉組織、皮膚組織、結(jié)締組織、神經(jīng)組織、血液、骨髓等采集的細(xì)胞的初代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代培養(yǎng)細(xì)胞和即使繼代培養(yǎng)也性狀穩(wěn)定而形成細(xì)胞株的細(xì)胞中的任一種。此外，細(xì)胞可以是正常細(xì)胞、癌細(xì)胞中的任一種?？商貏e優(yōu)選使用的細(xì)胞是來源于中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢的CHO細(xì)胞、來源于人的成纖維細(xì)胞和非洲綠猴的腎成纖維細(xì)胞的COS細(xì)胞。本發(fā)明中，表達(dá)載體向哺乳動(dòng)物細(xì)胞的導(dǎo)入為了使編碼重組體蛋白質(zhì)的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而進(jìn)行，只要可實(shí)現(xiàn)該目的，可使用任何的方法。表達(dá)載體通常為環(huán)狀的質(zhì)粒，它可以直接呈環(huán)狀或用限制酶剪切成直線狀后導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入了表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞)在添加了谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如MSX等)的不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基或低谷氨酰胺培養(yǎng)基(該情況下，進(jìn)一步添加了與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑(例如抗生素等)的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，僅選擇出細(xì)胞內(nèi)GS基因(該情況下，耐藥性基因)(所謂的篩選標(biāo)記物)表達(dá)的細(xì)胞。將其稱為篩選培養(yǎng)，這時(shí)使用的培養(yǎng)基稱為篩選培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)中，表達(dá)的篩選標(biāo)記物的量與所添加的GS抑制劑或藥劑的量等相比過多的情況下，無法產(chǎn)生足夠的選擇壓力，無法獲得重組體蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對(duì)較多的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞；另一方面，表達(dá)的篩選標(biāo)記物的量極端過少的情況下，細(xì)胞死亡或無法充分增殖，還是無法獲得表達(dá)量相對(duì)較多的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。但是，如果可通過將表達(dá)的篩選標(biāo)記物的量調(diào)節(jié)至一定范圍內(nèi)的量而提高對(duì)GS抑制劑或藥劑的感受性獲得足夠的選擇壓力，則如下所述，可獲得重組體蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對(duì)較多的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。S卩，將表達(dá)的篩選標(biāo)記物的量調(diào)節(jié)至一定范圍內(nèi)的量而使得在篩選培養(yǎng)中可獲得足夠的選擇壓力后，通過使添加至篩選培養(yǎng)基中的GS抑制劑的濃度(該情況下，進(jìn)一步為與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑的濃度)分階段上升，可篩選出篩選標(biāo)記物的表達(dá)量更多的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。這是由于篩選培養(yǎng)的過程中，表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中整合的篩選標(biāo)記物的數(shù)量通過復(fù)制而增加，僅篩選標(biāo)記物的表達(dá)量相對(duì)增加了的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞選擇性增殖等原因。這時(shí)，整合至表達(dá)載體的編碼重組體蛋白質(zhì)的基因的拷貝數(shù)也增加，所以該基因的表達(dá)量也增加。因此，通過像這樣篩選培養(yǎng)表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，可篩選出所需重組體蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對(duì)較多的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。本說 明書中，將這樣篩選出的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明中，將作為篩選標(biāo)記物整合了 GS基因以及耐藥性基因的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況下，可篩選出表達(dá)量比僅整合了 GS基因的情況更多的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明中，使添加至篩選培養(yǎng)基中的GS抑制劑或與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑的濃度分階段上升的情況下，例如GS抑制劑為蛋氨酸磺酸鹽時(shí)，其最大濃度較好是100 1000 μ Μ，更好是200 500 μ Μ，進(jìn)一步更好是約300 μ Μ?；蛘?，藥劑為嘌呤霉素時(shí)，其最大濃度較好是3 30 μ Μ，更好是5 20 μ Μ，進(jìn)一步更好是約10 μ Μ。
實(shí)施例以下，參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限定于實(shí)施例。[pE-neo載體和pE-hygr載體的構(gòu)建]將pEF/myc/nuc載體(英杰公司(、y ^卜口夕工 >社))用Kpn I和Nco I進(jìn)行消化，切出包含EF-1啟動(dòng)子及其第一內(nèi)含子的區(qū)域，將其用T4DNA聚合酶進(jìn)行平端化處理。將pC1-neo (英杰公司)用Bgl II和EcoR I進(jìn)行消化，切除包含CMV的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和內(nèi)含子的區(qū)域后，用T4DNA聚合酶進(jìn)行平端化處理。向其中插入上述的包含EF-1a啟動(dòng)子及其第一內(nèi)含子的區(qū)域，構(gòu)筑pE-neo載體(圖1-1和圖1_2)。將pE-neo載體用Sfi I和BstX I進(jìn)行消化，切除包含新霉素抗性基因的約Ikbp的區(qū)域(圖2-1)。將pcDNA3.1/Hygro (+)(英杰公司)作為模板用引物Hyg-Sfi5’(5’-gaggccgcctcggcctctga-3，，序列編號(hào) 7)和引物 Hyg-Bst X 3，(5，_aaccatcgtgatgggtgctattcctttgc-3’，序列編號(hào)8)，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增潮霉素基因(圖2-2)。將擴(kuò)增得到的潮霉素基因用Sfi I和Bst XI進(jìn)行消化,插入上述的pE-neo載體中，構(gòu)建pE_hygr載體(圖2_3)。[pE-1RES-GS-puro 的構(gòu)建]將表達(dá)載體pPGKIH (Miyahara M.等，J.Biol.Chem.275，613-618 (2000))用限制酶(Xho I和BamH I )進(jìn)行消 化，切出包含來源于小鼠腦心肌炎病毒(EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、潮霉素抗性基因(Hygr基因)和小鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的聚腺苷酸化區(qū)域(mPGKpA)的喊基序列 IRES-Hygr-mPGKpA (5’-CTCGAGgaattcactccttcaggtgcaggcttgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaactggctcacaaataccactgagatcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcCGCCCCCCCCCCCTC TCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttcatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacgtggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagTCGA·GaaattgatgatctattaagcaataaagacgtccactaaaatggaagtttttcctgtcatactttgttaagaagggtgagaacagagtacctacattttgaatggaaggattggagctacgggggtgggggtggggtgggattagataaatgcctgctctttactgaaggctctttactattgctttatgataatgtttcatagttggatatcataatttaaacaagcaaaaccaaattaagggccagctcattcctccactcacgatctatagatccactagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcGGATCC-3’，序列編號(hào)9 ;5’端的以大寫字母表不的序列CTCGAG為“Xho I位點(diǎn)”，其后由以大寫字母表示的自CGC開始的序列及接著該序列的3個(gè)小寫字母(atg)形成的區(qū)域?yàn)椤鞍瑏碓从谛∈竽X心肌炎病毒的5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的堿基序列”，自該atg開始以小寫字母表示的區(qū)域?yàn)椤熬幋a潮霉素抗性基因的堿基序列”，其后的以小寫字母表示的自aaa開始的區(qū)域?yàn)椤鞍∈罅姿岣视退峒っ?mPGK)的聚腺苷酸化區(qū)域的堿基序列”，以及3’端的以大寫字母表示的序列GGATCC為“BamH I位點(diǎn)”的DNA片段(與Hygr基因?qū)?yīng)的氨基酸序列以序列編號(hào)10表示)。將該DNA片段插A pBluescript SK (-)(斯垂塔基因公司(Stratagene社))的Xho I和BamH I之間，將其記作 pBSK(IRES-Hygr-m PGKpA)(圖 3-1)。將pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)作為模板用引物 IRES5’(5’_caactcgagcggccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttact-3，，序列編號(hào) 11)和引物 IRES3，(5J-caagaagcttccagaggaactg-3’，序列編號(hào)12)通過PCR使包含EMCV的IRES的一部分的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA 片段用限制酶(Xho I 和 Hind III)進(jìn)行消化，插入 pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)的 Xho I和 Hind III之間，將其記作 pBSK(Notl-1RES-Hygr-mPGKpA)(圖 3_2)。將pBSK(Notl-1RES-Hygr-mPGKpA)用限制酶(Not I 和 BamH I )進(jìn)行消化，插入pE-hygr載體的Not I和BamH I之間，將其記作質(zhì)粒pE-1RES-Hygr (圖3-3)。將表達(dá)載體pPGKIH 作為模板用引物 mPGKP5’(5’-gcgagatcttaccgggtaggggaggcgctt-3’，序列編號(hào) 13)和引物mPGKP3’(5’-gaggaattcgatgatcggtcgaaaggcccg_3，，序列編號(hào)14)通過PCR使包含mPGK的啟動(dòng)子區(qū)域(mPGKp)的堿基序列(5’-GCGagatctTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCgatcatcGAATTCctc-3’，序列編號(hào) 15 ;自 5’末端起最初以小寫字母表示的序列agatct為“Bgl II位點(diǎn)”，接在其后的以大寫字母表示的自TAC開始的序列為“包含小鼠磷酸甘油酸激酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列”，以及其后以大寫字母表示的序列GAATTC為“EcoR I位點(diǎn)”)的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Bgl II和EcoR I )進(jìn)行消化，插入pC1-neo (普洛麥格公司(Promega社))的Bgl II和EcoR I之間，將其記作pPGK-neo (圖3-4)。將pE-1RES-Hygr用限制酶(Not I和BamH I )進(jìn)行消化而切出DNA片段(IRES-Hygr)，插入 pPGK-neo 的 Not I 和 BamH I 之間，將其記作 pPGK-1RES-Hygr (圖 3-5)。由CHO-Kl 細(xì)胞制備 cDNA,將其作為模板用引物GS5’(5’_aatatggccacaaccatggcgacctcagcaagttcc-3’，序列編號(hào) 16)和引物 GS3’(5’-ggaggatccctcgagttagtttttgtattggaagggct-3’，序列編號(hào)17)通過PCR使包含GS基因的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Bal I和BamH I )進(jìn)行消化，插入pPGK-1RES-Hygr的Bal I和BamH I之間，將其記作pPGK-1RES-GS-ApolyA(圖 3-6)。將pCAGIPuro (Miyahara Μ.等，J.Biol.Chem.275，613-618 (2000))作為模板用引物 puro5’(5’-gcttaagatgaccgagtacaagcccacg_3，，序列編號(hào) 18)和引物 puro3’(5’_cccatcgtgatggtcaggcaccgggcttgc-3’，序列編號(hào)19)通過PCR使包含嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的堿基序列(5’-GcttaagATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAccatcacgatggG-3’，序列編號(hào)20 ;自5’端起最初以小寫字母表不的序列cttaag為“Afl II位點(diǎn)”，接在其 后的以大寫字母表示的自ATG開始的序列為“編碼嘌呤霉素抗性基因(pur ο基因)的堿基序列”，其后以小寫字母表示的序列為“Bst XI位點(diǎn)”)的DNA片段擴(kuò)增(與puro基因?qū)?yīng)的氨基酸序列以序列編號(hào)21表示)。將該DNA片段用限制酶(Afl II和Bst XI)進(jìn)行消化,插入表達(dá)載體pE-neo的Afl II和Bst XI之間,將其記作pE-puro (圖3-7)。將pE-puro 作為模板用引物 SV40polyA5’(5，-caacaagcggccgccctcgagttccctttagtgagggttaatgc-3，，序列編號(hào) 22)和引物 SV40polyA3，(5，-cccctgaacctgaaacataaaatg_3’，序列編號(hào)23)通過PCR使包含SV40后期聚腺苷酸化區(qū)域的D NA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Not I和Hpa I )進(jìn)行消化,插入表達(dá)載體pE-puro的Not I和Hpa I之間，將其記作 pE-puro (Xho I )(圖 3-8)。將pPGK-1RES-GS- Δ polyA用限制酶(Not I和Xho I )進(jìn)行消化，切出包含IRES-GS區(qū)域的DNA片段，將其插入表達(dá)載體pE-puro (Xho I )的Not I和Xho I之間，將其記作 pE-1RES-GS-puro (圖 3_9)。[pE-mlRES-GS-puro 的構(gòu)建]
將表達(dá)載體pE-1RES-GS-puro 作為模板用引物 mIRES_GS5’(5’_acacgatgataagcttgccacaacc-3’，序列編號(hào) 24)和引物 mIRES_GS3’(5’-ctccacgatatccctgccata_3，，序列編號(hào)25)通過PCR使EMCV的自IRES至GS的區(qū)域擴(kuò)增，使在EMCV的位于自IRES的5’側(cè)第2個(gè)的起始密碼子(ATG)加入突變而破壞的DNA片段擴(kuò)增。將表達(dá)載體pE-1RES-GS-puro作為模板，使用該DNA片段和上述的引物IRES5’通過PCR使包括自IRES至GS區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Not I和Pst I )進(jìn)行消化，將所切出的DNA片段插入表達(dá)載體 pE-1RES-GS-puro 的 Not I 和 Pst I 之間，將其記作 pE-mlRES-GS-puro (圖 4)。[pE-mlRES-GS 的構(gòu)建]將表達(dá)載體pE-neo 作為模板用引物 SV40polyA5’(5’ -actaactcgagttccctttagtg-3，,序列編號(hào) 26)和引物 SV40polyA3’ (5，-aacggatccttatcggattttaccac-3’，序列編號(hào)27)通過PCR使包含SV40polyA區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Xho I和BamH I )進(jìn)行消化，插入pE-mlRES-GS-puro的Xho I和BamH I之間,將其記作pE-mlRES-GS(圖 5)。[人葡糖腦苷脂酶(hGBA)表達(dá)載體的構(gòu)建]將人肝臟快速克隆(Quick Clone) cDNA(克隆泰克公司(Clontecl^J;))作為模板用引物 hGBA5，(5，-gcaatacgcgtccgccaccatggagttttcaagtccttccagagagg-3，，序列編號(hào)28)和引物 hGBA3’(5，-ggacgcggccgcgagctctcactggcgacgccacaggtagg-3’，序列編號(hào) 29)通過PCR使包含人葡糖腦苷脂酶基因(hGBA基因)的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Mlu I 和 Not I )進(jìn)行消化，插入 pE-1RES-G S-puro、pE-mIRES_GS 和 pE-mlRES-GS-puro的 Mlu I 和 Not I 之間，分別記作 GBA 表達(dá)載體 pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mIRES_GS (GBA)和 pE-mIRES-GS-pur o(GBA)。[人紅細(xì)胞生成素(hEPO)表達(dá)載體的構(gòu)建]
將pC1-neo (EPO)作為模板用引物 hEP05’(5，-aagacgcgtcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgc-3，，序列編號(hào) 30)和引物 hEP03，(5，-aagagcggccgctcatctgtcccctgtcctgcagg_3’，序列編號(hào)31)通過PCR使包含hEPO基因的DNA片段擴(kuò)增。將該DNA片段用限制酶(Mlu I 和 Not I )進(jìn)行消化，插入 pE-1RES-GS-puro 和 P E-mlRES-GS-puro 的 Mlu I 和Not I 之間，分別記作 hEPO 表達(dá)載體 pE-1RES-GS -puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (EPO)。[hGBA表達(dá)細(xì)胞和hEPO表達(dá)細(xì)胞的制備]向來源于中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢的CHO-Kl細(xì)胞中使用Lipof ectamine2000試劑(英杰公司(Invitrogen 社))分別導(dǎo)入 pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mlRES-GS(GBA)、pE-mlRES-GS-puro (GBA)、pE-1RES_GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (EPO)。將這些細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得hGBA表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和hEPO表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這時(shí)，導(dǎo)入了pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mlRES-GS-puro (GBA)、pE-1RES-GS-puro (EPO)和pE-mlRES-GS-puro (EPO)的細(xì)胞的篩選培養(yǎng)中使用含蛋氨酸磺酸鹽(西格瑪公司(SIGMA社))和嘌呤霉素(西格瑪公司)的CD Opti CHO培養(yǎng)基(英杰公司)作為篩選培養(yǎng)基，導(dǎo)入了 pE-mlRES-GS (GBA)的細(xì)胞的篩選培養(yǎng)中使用含蛋氨酸磺酸鹽(西格瑪公司)的CD Opti CHO培養(yǎng)基(英杰公司)作為篩選培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)時(shí)，使蛋氨酸磺酸鹽和嘌呤霉素的濃度分階段上升，最終使蛋氨酸磺酸鹽的濃度為300 μ Μ,嘌呤霉素的濃度為10 μ g/mL,使呈現(xiàn)耐藥性的細(xì)胞選擇性增殖。通過該篩選培養(yǎng)獲得3種hGBA表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和2種hEPO表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。[hGBA表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞密度的測(cè)定]將篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以2 X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞密度用含300 μ M蛋氨酸磺酸鹽和10 μ g/mL嘌呤霉素的5mL⑶Opti CHO培養(yǎng)基在5% CO2存在下培養(yǎng)12天。培養(yǎng)溫度自培養(yǎng)開始至第3天為止設(shè)定為37°C，然后設(shè)定為30°C。在培養(yǎng)的第4、7、10和12天對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行采樣，測(cè)定細(xì)胞密度。其中，導(dǎo)入pE-mlRES-GS(GBA)得到的hGBA表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)使用含300 μ M蛋氨酸磺酸鹽的5mL⑶Opti CHO培養(yǎng)基進(jìn)行。[hEPO表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞密度的測(cè)定]將篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以2 X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞密度用含300 μ M蛋氨酸磺酸鹽和10 μ g/mL嘌呤霉素的5mL⑶Opti CHO培養(yǎng)基在5% CO2存在下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)溫度自培養(yǎng)開始至第3天為止設(shè)定為37°C，然后設(shè)定為30°C。在培養(yǎng)的第7天對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行采樣，測(cè)定細(xì)胞密度。[hGBA的活性測(cè)定]GBA活性測(cè)定將 Pasmanik-Chor M.等，Biochem J317, 81-88 (1996)中記載的方法作為參考實(shí)施。將磷酸-4-甲基傘形酮酯(4-MUF,西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical C0.)制)溶解于稀釋用緩沖液(含0.125%?；悄懰徕c、0.15% Triton Χ_100、0.1%牛血清白蛋白的IOOmM磷酸鉀緩沖液(ρΗ5.96))后，進(jìn)行梯度稀釋，制成200、100、50、25、12.5、6.25和3.125mM濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將4-甲基傘形酮-β-D-吡喃葡糖苷(西格瑪化學(xué)公司制)按照4mM的濃度溶解于稀釋用緩沖液，將其作為底物溶液。檢測(cè)樣本根據(jù)需要在測(cè)定前用稀釋用緩沖液稀釋。向Fluoroplate F96中分別加入10 μ L4MUF標(biāo)準(zhǔn)溶液或檢測(cè)標(biāo)本后，加入70 μ L底物溶液混合。在37 V反應(yīng)I小時(shí)后，向各孔中分別加入200 μ L作為反應(yīng)終止液的50mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH10.6)后，用Fluoroplate讀板機(jī)以激發(fā)波長(zhǎng)355nm、檢測(cè)波長(zhǎng)460nm的條件測(cè)定熒光強(qiáng)度。根據(jù)4-MUF標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度繪制校正曲線，將各檢測(cè)樣本的突光強(qiáng)度內(nèi)插至校正曲線中，算出活性(nmol/h/mL)。[采用ELISA法的hEPO的定量]由用重組體hEPO免疫了的兔的血液通過常規(guī)方法獲得兔抗hEPO抗體溶液。重組體hEPO將國(guó)際公開公報(bào)(W02008/068879)中所記載的方法作為參考制成。將兔抗hEPO抗體溶液以每孔100 μ L加入96孔板,在4°C靜置I小時(shí)使抗體固定于板。棄去液體后，將含
0.075% 吐溫 20 的 1% BSA/TBS-T 溶液(Tris:0.005M, NaCl:0.138M, KC1:0.0027M，ρΗ8.0)以每孔100 μ L加入板中，在4°C靜置I小時(shí)對(duì)板進(jìn)行封閉。棄去液體，將板用含0.075%吐溫20的TBS-T溶液清洗3次后，將稀釋至適當(dāng)濃度的檢測(cè)標(biāo)本以每孔100 μ L加入板中，在37°C靜置I小時(shí)。這時(shí)，將通過Lowry法定量的自制的hEPO稀釋至I 16ng/mL的濃度的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，與檢測(cè)標(biāo)本同樣加入板中靜置。棄去液體，與上述同樣清洗板后，將HRP標(biāo)記的小鼠抗hEPO單克隆抗體(安迪生物科技公司(R&D社)制)作為二次抗體以每孔100 μ L加入板中，在37°C靜置I小時(shí)。與上述同樣清洗板后，加入HRP底物(普洛麥格公司(:/ 口 ^力'社))，在37°C靜置15分鐘后，加入鹽酸停止反應(yīng)。通過微孔板閱讀儀測(cè)定450nm的吸光度，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度的比較求出檢測(cè)標(biāo)本的hEPO濃度。[結(jié)果] 如上所述，將導(dǎo)入了作為依次整合有作為基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的延伸因子Ia啟動(dòng)子(EF-lp)、作為編碼蛋白質(zhì)的基因的人葡糖腦苷脂酶(hGBA)基因、作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的含示于序列編號(hào)4的堿基序列的來源于突變型小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV-mlRES)和編碼谷氨酰胺合成酶的基因(GS基因)的表達(dá)載體的pE-mlRES-GS (GBA)的CHO細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基中的hGBA的活性，并測(cè)定細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行4次(細(xì)胞團(tuán)I 4)。細(xì)胞密度在4次中都在培養(yǎng)第7天達(dá)到約2.5 X IO6個(gè)/mL(圖6_1)。另一方面，對(duì)于培養(yǎng)基中的hGBA活性，可知細(xì)胞團(tuán)2在培養(yǎng)第10天達(dá)到30 μ mol/h/mL(圖6_2)，使用pE_mIRES-GS (GBA)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，從而獲得以高水平表達(dá)hGBA的細(xì)胞。但是，細(xì)胞團(tuán)I和3中，培養(yǎng)基中的hGBA的活性極低，提示使用pE-mIRES-GS (GBA)的情況下，用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞中以相當(dāng)大的比例包含hGBA的表達(dá)量低的細(xì)胞。接著，將導(dǎo)入了作為依次整合有作為基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的EF-lp、作為編碼蛋白質(zhì)的基因的hGBA基因、作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的含示于序列編號(hào)I的堿基序列的來源于野生型小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV-1RES)和GS基因以及作為耐藥性基因的嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的表達(dá)載體的pE-1RES-GS-puro (GBA)的CHO細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基中的hGBA的活性，并測(cè)定細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次(細(xì)胞團(tuán)I 3)。細(xì)胞密度在3次中都在培養(yǎng)第7天達(dá)到約3 4X IO6個(gè)/mL，特別是細(xì)胞團(tuán)3超過了 4X106個(gè)/mL(圖7_1右側(cè))。另一方面，對(duì)于培養(yǎng)基中的hGBA活性，可知3次都在培養(yǎng)第10天達(dá)到5 10 μ mol/h/mL (圖7_2右側(cè))，使用pE-1RES-GS-puro (GBA)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，從而獲得以高水平表達(dá)hGBA的細(xì)胞。接著，將導(dǎo)入了作為依次整合有作為基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的EF-lp、作為編碼蛋白質(zhì)的基因的hGBA基因、作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的EMCV-mlRES和GS基因以及作為耐藥性基因的puro基因的表達(dá)載體的pE-mlRES-GS-puro (GBA)的CHO細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基中的hGBA的活性，并測(cè)定細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次(細(xì)胞團(tuán)I 3)。細(xì)胞密度在3次中都在培養(yǎng)第7天達(dá)到約2 3X IO6個(gè)/mL(圖7_1左側(cè))。另一方面，對(duì)于培養(yǎng)基中的hGBA活性，可知3次都在培養(yǎng)第10天達(dá)到15 25 μ mol/h/mL (圖7_2左側(cè))，其表達(dá)量與使用pE-1RES-GS-puro (GBA)轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞的hGBA的表達(dá)量相比也明顯更高，通過使用pE-mlRES-GS-pu ro (GBA)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，可獲得以極高水平表達(dá)hGBA的細(xì)胞。特別是細(xì)胞團(tuán)3，在培養(yǎng)第12天hGBA的活性超過35 μ mol/h/mL,呈現(xiàn)極高水平的hGBA的表達(dá)。接著，將導(dǎo)入了作為依次整合有作為基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的EF-lp、作為編碼蛋白質(zhì)的基因的人紅細(xì)胞生成素(hEPO基因)、作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的EMCV-1RES和GS基因以及作為耐藥性基因的puro基因的表達(dá)載體的pE-1RES-GS-puro (EPO)的CHO細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基中的hEPO的濃度，并測(cè)定細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行2次(細(xì)胞團(tuán)I 2)。細(xì)胞密度在2次中都在培養(yǎng)第7天達(dá)到約2 3X IO6個(gè)/mL(圖8_1右側(cè))。另一方面，對(duì)于培養(yǎng)基中的hEPO濃度，可知在培養(yǎng)第7天hEPO的活性達(dá)到8 18 μ g/mL (圖8-2右側(cè))，使用pE-1RES-GS-puro (EPO)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，從而獲得以高水平表達(dá)hEPO的細(xì)胞。接著，將導(dǎo)入了作為依次整合有作為基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的EF-lp、作為編碼蛋白質(zhì)的基因的hEPO基因、作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的EMCV-mlRES和GS基因以及作為耐藥性基因的puro基因的表達(dá)載體的pE-mlRES-GS-puro (EPO)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基中的hEPO的濃度，并測(cè)定細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行2次(細(xì)胞團(tuán)I 2)。細(xì)胞密度在2次中都在培養(yǎng)第7天達(dá)到約2.5 3X IO6個(gè)/mL(圖8_1左側(cè))。另一方面，對(duì)于培養(yǎng)基中的hGBA濃度，可知2次都在培養(yǎng)第7天hEPO的活性達(dá)到約63 μ g/mL (圖8_2左側(cè))，其表達(dá)量與使用pE-1RES-GS-puro (EPO)轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞的hGBA的表達(dá)量相比也明顯更高，通過使用pE-mlRES-GS-puro (EPO)轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，可獲得以極高水平表達(dá)hEPO的細(xì)胞。這些結(jié)果表示依次在基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的下游整合有編碼所需蛋白質(zhì)的基因、具有序列編號(hào)I或4的堿基序列的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、谷氨酰胺合成酶的表達(dá)載體或者依次在基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的下游整合有編碼所需蛋白質(zhì)的基因、具有序列編號(hào)I或4的堿基序列的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、谷氨酰胺合成酶以及耐藥性基因的表達(dá)載體為使編碼這些蛋白質(zhì)的基因以高水平表達(dá)的表達(dá)載體。特別是表示依次在延伸因子Ia啟動(dòng)子的下游整合有編碼蛋白質(zhì)的基因、具有序列編號(hào)4的堿基序列的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、谷氨酰胺合成酶以及作為耐藥性基因的嘌呤霉素抗性基因的表達(dá)載體為使編碼該蛋白質(zhì)的該基因以高水平表達(dá)的表達(dá)載體。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如果采用本發(fā)明，則可使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞使重組體蛋白質(zhì)以高水平表達(dá)，所以，例如可大幅降低含重組體蛋白質(zhì)的醫(yī)療用醫(yī)藥品的制造成本。符號(hào)的說明I LacZ 啟動(dòng)子2 mPGK 啟動(dòng)子3含示 于序列編號(hào)I的堿基序列的來源于野生型小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV-1RES)3a 含示于序列編號(hào)4的堿基序列的來源于突變型小鼠腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV-mlRES)4 mPGK的聚腺苷酸化區(qū)域(mPGKpA)5 含EF-1p和第一內(nèi)含子的堿基序列6 SV40后期聚聚腺苷酸化區(qū)域7 含SV40初期啟動(dòng)子的區(qū)域8 合成聚聚腺苷酸化區(qū)域9 含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的區(qū)域10 谷氨酰胺合成酶基因
權(quán)利要求
1.表達(dá)載體，它是用于使蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)載體，其特征在于，包括基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)以及位于其下游的編碼該蛋白質(zhì)的基因、進(jìn)一步位于下游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和進(jìn)一步位于下游的編碼谷氨酰胺合成酶的基因。
2.如權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其特征在于，該基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)選自來源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子、SV40初期啟動(dòng)子、延伸因子I啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于選自微小核糖核酸病毒科的病毒、口 蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸道病毒、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒、柯薩奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白基因、果蠅觸角足基因、果蠅超雙胸基因的病毒或基因的5’非翻譯區(qū)。
4.如權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻譯區(qū)。
5.如權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來源于小鼠腦心肌炎病毒的5’非翻譯區(qū)。
6.如權(quán)利要求1 5中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體,其特征在于,該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)是在野生型的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的堿基序列中加入了 I個(gè)或2個(gè)以上的突變的位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其特征在于，在該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)存在多個(gè)起始密碼子，其中的一部分被破壞。
8.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)I的堿基序列。
9.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)2的堿基序列。
10.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)3的堿基序列。
11.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)4的堿基序列。
12.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)5的堿基序列。
13.如權(quán)利要求5的·表達(dá)載體，其特征在于，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)包含序列編號(hào)6的堿基序列。
14.如權(quán)利要求1 13中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于，在編碼蛋白質(zhì)的該基因與該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)之間的區(qū)域或編碼谷氨酰胺合成酶的該基因的下游區(qū)域，除該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)之外，還包含其它內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)及位于其下游的耐藥性基因。
15.如權(quán)利要求1 13中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于，除該基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)之夕卜，還包含其它基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)及位于其下游的耐藥性基因。
16.如權(quán)利要求14或15的表達(dá)載體，其特征在于，該耐藥性基因?yàn)猷堰拭顾乜剐曰蚧蛐旅顾乜剐曰颉?br> 17.如權(quán)利要求1 16中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于，編碼蛋白質(zhì)的該基因?yàn)閬碓从谌说幕颉?br> 18.如權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其特征在于，來源于人的該基因選自編碼溶酶體酶、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子、紅細(xì)胞生成素、干擾素、血栓調(diào)節(jié)蛋白、卵泡刺激素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和抗體的基因。
19.如權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其特征在于，來源于人的該基因?yàn)榫幋a溶酶體酶的基因。
20.如權(quán)利要求19的表達(dá)載體，其特征在于，該溶酶體酶選自0-半乳糖苷酶々、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖腦苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶。
21.如權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其特征在于，來源于人的該基因?yàn)榫幋a紅細(xì)胞生成素的基因。
22.哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于，通過權(quán)利要求1 21中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
23.如權(quán)利要求22的細(xì)胞，其特征在于，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
24.使編碼蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制造方法，其特征在于，包括:將上述[1] [21]中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟；將導(dǎo)入了該表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在谷氨酰胺合成酶抑制劑的存在下或者谷氨酰胺合成酶抑制劑和與耐藥性基因?qū)?yīng)的藥劑的存在下進(jìn)行篩選培養(yǎng)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明揭示了用于使重組體蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)的新表達(dá)載體、通過該載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞及該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制造方法。該表達(dá)載體包括基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)以及位于其下游的編碼該蛋白質(zhì)的基因、進(jìn)一步位于下游的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和進(jìn)一步位于下游的編碼谷氨酰胺合成酶的基因。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103201382SQ20118005365
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者高橋健一 申請(qǐng)人:日本化學(xué)研究株式會(huì)社