專(zhuān)利名稱(chēng)：控制細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合的方法
控制細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)細(xì)胞黏附基質(zhì)的方法，所述基質(zhì)對(duì)于這些細(xì)胞通常無(wú)親和性或僅有低親和性。本發(fā)明還涉及使用非肌肉型肌球蛋白II抑制劑布雷他汀(Blebbistatin)和至少一個(gè)表面包被有與所述表面無(wú)親和性或僅低親和性的細(xì)胞的裝置?，F(xiàn)有摶術(shù)目前使用的大部分治療型細(xì)胞(包括成人干細(xì)胞)以錨定/附著依賴(lài)性方式增殖，這也適用于可能的替代方式，例如胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)。但是，所述增殖方式與規(guī)模和經(jīng)濟(jì)上的嚴(yán)重限制有內(nèi)在關(guān)聯(lián)。對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)增而言，細(xì)胞通常被接種至平面上，它們?cè)跀?shù)小時(shí)內(nèi)附著于所述平面，增殖，并通過(guò)蛋白水解酶和/或移除鈣來(lái)收獲。附著不是均一過(guò)程，而是出現(xiàn)在特定的區(qū)域，即所謂黏著斑區(qū)域。一旦附著，細(xì)胞便通過(guò)內(nèi)部馬達(dá)蛋白施加張力。從而，細(xì)胞骨架變得有序且在多種過(guò)程中行使功能，包括運(yùn)輸、支架和細(xì)胞存活。細(xì)胞脫落后，這些隨著馬達(dá)蛋白建立的內(nèi)部張力變化而快速收縮，而先前有序的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(細(xì)胞骨架和其它)則受到擾亂。若無(wú)法再附著至表面，所述細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)稱(chēng)為附著依賴(lài)性凋亡/失巢凋亡的細(xì)胞死亡程序。US-A-20100009442 描述了 Rho相關(guān)卷曲激酶(ROCK)的抑制劑(例如Y-27632、H-1152或法舒地爾(Fasudil)),其是Rho GTP酶的效應(yīng)分子且已知控制血管收縮和神經(jīng)軸突延伸，可以用作凋亡/失巢凋亡抑制劑，從而促進(jìn)多能干細(xì)胞，特別是胚胎干細(xì)胞的存活和/或增殖速率。ROCK抑制劑存在時(shí)，干細(xì)胞能在亞克隆或傳代之前和/或之后培養(yǎng)而不添加飼養(yǎng)細(xì)胞和/或血清。負(fù)責(zé)產(chǎn)生細(xì)胞張力的主要細(xì)胞骨架馬達(dá)蛋白是非肌肉型肌球蛋白II (稱(chēng)為肌球蛋白II)。Straight等(2003)鑒定了非肌肉型肌球蛋白II的特定小分子抑制劑，以試圖詳細(xì)分析胞漿移動(dòng)。該高度活性的小分子抑制細(xì)胞起泡，稱(chēng)作“布雷他汀(Blebbistatin) ”。該化合物可透過(guò)細(xì)胞，良性，并且重要的是容易可逆。Walker等(2010)公開(kāi)了布雷他汀用于增強(qiáng)人多能干細(xì)胞(包括人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)存活的應(yīng)用。用布雷他汀處理提高人多能干細(xì)胞在克隆密度和懸浮條件下的存活率。此外，布雷他汀與合成基質(zhì)聯(lián)用可支持所述干細(xì)胞自我更新的確定環(huán)境。US-A-20100216181描述使用布雷他汀或ROCK抑制劑作為存活因子，在不含血清和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞。這里，通過(guò)在旋轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)生成大量細(xì)胞。大量的附著依賴(lài)性細(xì)胞可以在生物反應(yīng)器內(nèi)或微載體(例如，珠)上產(chǎn)生，當(dāng)所述細(xì)胞在懸浮條件下培養(yǎng)時(shí)，所述微載體可增加能使細(xì)胞得以生長(zhǎng)的表面積。例如，從US-A-20100093083已知用于大量生產(chǎn)干細(xì)胞(包括多能和胚胎干細(xì)胞)的方法。本文中，所述細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)含多種微載體的無(wú)血清培養(yǎng)基中。所述細(xì)胞能夠附著至所述微載體，并在控制條件下于生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)增。所述培養(yǎng)基可額外補(bǔ)充有促進(jìn)所述干細(xì)胞增殖和存活或防止分化的成分，例如，GSK3酶或MEK酶抑制劑。擴(kuò)增后，使用酶促或非酶促細(xì)胞解離試劑從所述微載體上分離所述細(xì)胞。但是，該方法的缺點(diǎn)在于，只能使用對(duì)細(xì)胞具有充足親和性的微載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于，提供用于促進(jìn)細(xì)胞黏附基質(zhì)的方法，這些細(xì)胞對(duì)所述基質(zhì)通常無(wú)親和性或僅有低親和性。該目標(biāo)通過(guò)一種方法解決，其中，由向所述細(xì)胞供給所述非肌肉型肌球蛋白II抑制劑布雷他汀來(lái)促進(jìn)所述細(xì)胞對(duì)所述基質(zhì)的黏附，從而使所述細(xì)胞能夠附著對(duì)其不具足夠親和性的表面。令人吃驚的是，向所述細(xì)胞供給所述抑制劑可增強(qiáng)這些細(xì)胞附著通常對(duì)其無(wú)親和性或僅有低親和性的表面的能力。因此，可以以有利的方式將布雷他汀作為一種增強(qiáng)劑使用，所述增強(qiáng)劑使用戶(hù)能夠促進(jìn)細(xì)胞附著特定基質(zhì)，例如用于懸浮培養(yǎng)的微載體或覆蓋例如Teflon &的表面。因此，布雷他汀是拓寬用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適基質(zhì)選擇的有用工具，從而能優(yōu)化并因此大幅改進(jìn)依賴(lài)于細(xì)胞對(duì)微載體附著的細(xì)胞的培養(yǎng)方法。由于在待培養(yǎng)細(xì)胞能夠附著的基質(zhì)方面存在多許多的選擇，這促進(jìn)了培養(yǎng)條件的改進(jìn)和優(yōu)化。此外，可以通過(guò)向所述細(xì)胞添加布雷他汀來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)用于其它需求但通常不適用于活細(xì)胞的合適基質(zhì)(例如，一些醫(yī)療裝置的表面)優(yōu)化的定居表面。因此，用所述抑制劑處理所述細(xì)胞使這些細(xì)胞有能力在不適于培養(yǎng)這些細(xì)胞的表面上附著和增殖。通過(guò)本發(fā)明所述的方法，大幅拓寬了適用于培養(yǎng)和/或擴(kuò)增細(xì)胞的基質(zhì)(例如，微載體或醫(yī)療裝置的)選擇。布雷他汀是在施加至細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)使由缺少附著而引起的細(xì)胞死亡最小化并促進(jìn)單細(xì)胞培養(yǎng)的小分子。對(duì)比ROCK抑制劑，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其不干擾復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)，而是直接靶向非肌肉型肌球蛋白II和其通過(guò)結(jié)合肌球蛋白-ADP-Pi復(fù)合物與肌動(dòng)蛋白的相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易調(diào)整且易可逆(良性)抑制劑。布雷他汀增強(qiáng)細(xì)胞尤其是附著依賴(lài)性細(xì)胞附著對(duì)其不具有足夠親和性的表面的能力。因此，布雷他汀能用作控制細(xì)胞附著可能特定基質(zhì)的黏附觸發(fā)齊U。此外，布雷他汀大大增強(qiáng)嚴(yán)格依賴(lài)黏附的細(xì)胞的懸浮存活。所述物質(zhì)可在需要時(shí)簡(jiǎn)易地添加至培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基質(zhì)是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。所述非粘性材料可包括聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont):Teflonw )、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化鈦復(fù)合物或包含二氧化鈦的組合物，或其任何組合。優(yōu)選地，所述基質(zhì)是醫(yī)療裝置的表面，所述醫(yī)療裝置優(yōu)選是支架、貼片或人造血管或器官。例如為了避免血細(xì)胞、蛋白或類(lèi)似物的不需要附著，所述裝置通常由不適于細(xì)胞培養(yǎng)的材料制成或包被，所以通常難以使細(xì)胞定居所述裝置。但是，有些時(shí)候希望用活細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞)覆蓋所述裝置，從而其可用作移植物、取代組織、修補(bǔ)探針等。并且，通過(guò)用自體同源的細(xì)胞覆蓋移植物可以有效抑制免疫系統(tǒng)對(duì)所述移植物的排斥。如本發(fā)明所述，通過(guò)向細(xì)胞提供布雷他汀可有利地使細(xì)胞能夠在醫(yī)療裝置上定居，從而準(zhǔn)備并改進(jìn)這些裝置用于若干醫(yī)療應(yīng)用。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基質(zhì)是多種微載體，從而使所附著所述基質(zhì)的細(xì)胞能夠在懸浮條件下培養(yǎng)。在該實(shí)施方式中，增加細(xì)胞得以生長(zhǎng)的表面積，從而細(xì)胞在懸浮條件下(優(yōu)選在合適的生物反應(yīng)器中)培養(yǎng)時(shí)能在微載體(優(yōu)選合適的珠)上大量生產(chǎn)。如本發(fā)明所述，可以使用市售可得的微載體諸如Cytodex (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare)，GB)、Hillex(索羅希爾公司(SoloHill),美國(guó))或類(lèi)似物,包括但不限于通過(guò)改變溫度優(yōu)選通過(guò)降低溫度移出細(xì)胞的溫控微載體。對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)增，可向現(xiàn)有培養(yǎng)物添加額外微載體，從而提供額外的附著區(qū)域以增加細(xì)胞數(shù)量。因此，僅通過(guò)添加更多微載體來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)增。對(duì)于具體應(yīng)用而言，使用不同尺寸微載體可能是有益的。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選是間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，本發(fā)明所述的方法包括能由布雷他汀增強(qiáng)基質(zhì)親和性的所有細(xì)胞類(lèi)型。由于布雷他汀增強(qiáng)細(xì)胞存活并且降低懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞集聚，所述細(xì)胞可在懸浮培養(yǎng)條件下(如上所述優(yōu)選固定在微載體上)容易地?cái)U(kuò)增。對(duì)于一些應(yīng)用而言，若所述細(xì)胞懸浮在血清減少或無(wú)血清的培養(yǎng)基中，則可能是有利的。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在布雷他汀存在下被冰凍和/或解凍，然后使所述細(xì)胞接觸所述基質(zhì)。在該情況下，布雷他汀有利地穩(wěn)定所述細(xì)胞，并因而在冰凍和/或解凍所述細(xì)胞時(shí)對(duì)所述細(xì)胞起到保護(hù)作用。即，布雷他汀增加細(xì)胞的凍存恢復(fù)，并且，在冷凍前添加布雷他汀有利于細(xì)胞凍存。因此，本發(fā)明的一個(gè)重要方面是使用布雷他汀來(lái)促進(jìn)細(xì)胞附著對(duì)其不具足夠親和性的基質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是使用布雷他汀,用對(duì)醫(yī)療裝置的表面無(wú)親和性或僅有低親和性的細(xì)胞來(lái)包被該表面，所述醫(yī)療裝置優(yōu)選是支架、貼片或人造血管或器官。本發(fā)明的又一個(gè)重要方面涉及具有被細(xì)胞覆蓋的至少一個(gè)表面的裝置，所述細(xì)胞對(duì)該表面通常無(wú)親和性或僅有低親和性。所述表面可包括非粘性材料，優(yōu)選聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont): Teflon )、聚氟乙烯(PFE)、全氟燒氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化鈦復(fù)合物或包含二氧化鈦的組合物，或其任何組合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述裝置的表面由附著依賴(lài)性細(xì)胞覆蓋，所述附著依賴(lài)性細(xì)胞特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述裝置是醫(yī)療裝置，優(yōu)選是支架、貼片或人造血管或器官?；径?，本發(fā)明所述的概念涉及有利使用布雷他汀來(lái)促進(jìn)細(xì)胞附著對(duì)其不具足夠親和性的基質(zhì)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入懸浮培養(yǎng)過(guò)程中防止/減少細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，允許細(xì)胞重定位至原本不合適的表面，并最終加強(qiáng)細(xì)胞增殖，優(yōu)選附著依賴(lài)性細(xì)胞。受益于培養(yǎng)中使用布雷他汀的細(xì)胞類(lèi)型的范圍很大，其包括已知治療上有用的細(xì)胞以及目前正在開(kāi)發(fā)的候選物，例如人胚胎干細(xì)胞(HES)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)。HES細(xì)胞通常以聚集形式生長(zhǎng)，并需要頻繁酶促分離來(lái)得以擴(kuò)增。但是，該方法常引起細(xì)胞死亡/損失，因而可以充分得益于使用布雷他汀，而且，實(shí)際上，使用布雷他汀可以是完全懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增HES細(xì)胞中的一個(gè)步驟。雖然在平面上培養(yǎng)成人干細(xì)胞和iPS細(xì)胞更加穩(wěn)固，但是在傳代以及尤其是完全懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增成人細(xì)胞的步驟過(guò)程中，使用布雷他汀也是有利的。雖然對(duì)多能成人干細(xì)胞的擴(kuò)增尤為感興趣，用于此概念的細(xì)胞類(lèi)型不應(yīng)限定于干細(xì)胞，而是包括所有附著依賴(lài)性細(xì)胞類(lèi)型。本文所用的“非肌肉型肌球蛋白II抑制劑”或“肌球蛋白II抑制劑”指通過(guò)直接靶向肌球蛋白II而抑制非肌肉型肌球蛋白II的一種分子或多種分子。因此，本發(fā)明的概念包括直接影響非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑。布雷他汀或其任何類(lèi)似物或衍生物，是所述抑制劑的一個(gè)例子。然而，本發(fā)明不限于該示例，而是可以包括對(duì)非肌肉型肌球蛋白II具有相似作用的其它抑制劑。本文所用的“附著依賴(lài)性細(xì)胞”指懸浮在流體中時(shí)通常無(wú)活性的，必須黏附至固體表面以存活和生長(zhǎng)的細(xì)胞。本文所用的“成人干細(xì)胞”也稱(chēng)為“體干細(xì)胞”，指能夠自我更新并且能夠產(chǎn)生多種不同細(xì)胞類(lèi)型后代，尤其是來(lái)自其來(lái)源組織或器官的所有細(xì)胞類(lèi)型的多能細(xì)胞。“成人干細(xì)胞”包括但不限于，間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞及其修飾。本文所用的“成人干細(xì)胞”不包括誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”(iPS細(xì)胞)指源自非多能體細(xì)胞的多能細(xì)胞，所述非多能體細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子而重編程。在多能性方面，iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似。本文所用的“胚胎干細(xì)胞”指能夠向所有三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化的多能細(xì)胞和種系細(xì)胞。參考附圖，進(jìn)一步示例性地詳細(xì)描述本發(fā)明。

圖1顯示布雷他汀對(duì)源自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)的細(xì)胞積聚(A:顯微照片)、細(xì)胞存活(B:柱形圖)和凋亡(C:柱形圖)的作用。有或沒(méi)有不同濃度的布雷他汀時(shí)檢測(cè)細(xì)胞積聚(A)、細(xì)胞存活(B)和凋亡(C)多至七天。使用ROCK抑制劑(Y-27532)作為陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞加至不支持附著生長(zhǎng)的深孔。在懸液(深孔，130RPM)和附著(六孔)培養(yǎng)中對(duì)BM-MSC測(cè)試不同濃度的布雷他汀和Y-27632 (培養(yǎng)基含有10%FBS)。顯然布雷他汀防止或至少明顯減少細(xì)胞積 聚，使細(xì)胞能夠存活，并且減少間充質(zhì)干細(xì)胞深孔培養(yǎng)中的凋亡。A:采用10 μ M布雷他汀的處理防止細(xì)胞成團(tuán)，然而細(xì)胞對(duì)照(DMS0、PBS)和用少于10 μ M布雷他汀處理的細(xì)胞形成單聚集體。B:用染料排除分析(碘化丙錠)通過(guò)FACS來(lái)定量活細(xì)胞。與對(duì)照培養(yǎng)物(DMS0、PBS)相反，用大于5μ M布雷他汀處理的細(xì)胞顯示與平面培養(yǎng)細(xì)胞相似的活力程度(約90%)。布雷他汀的促存活作用顯示為濃度依賴(lài)性,其在10 μ M達(dá)到峰值，而在較高和較低的布雷他汀濃度都有所降低。C:用膜聯(lián)蛋白V分析(碘化丙錠)通過(guò)FACS來(lái)定量凋亡細(xì)胞。與對(duì)照培養(yǎng)物(DMS0、PBS)相反，用10 μ M布雷他汀處理的細(xì)胞受到抗凋亡保護(hù)。圖2顯示由膜聯(lián)蛋白V染色和后續(xù)FACS分析所示，用不同抑制劑濃度處理并在黏附/靜態(tài)條件下(A)或懸浮/振蕩條件下(B)培養(yǎng)的BM-MSC的凋亡水平。在此，顯然布雷他汀消除懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞死亡，并且顯示與Υ-27632相當(dāng)或更強(qiáng)的抗凋亡作用。5μΜ以下的布雷他汀僅有有限的效果，其中，在10 μ M時(shí)達(dá)到最高效果。圖3顯示由碘化丙錠染色和后續(xù)FACS分析所示，用不同抑制劑濃度處理并在黏附/靜態(tài)條件下(A)或懸浮/振蕩條件下(B)培養(yǎng)的BM-MSC的細(xì)胞死亡率。該分析顯示，布雷他汀顯著消減細(xì)胞死亡，特別是在10-50 μ M濃度，最佳在10 μ M濃度。圖4.1 4.3顯示由丙錠濃度揭示并在懸浮/振蕩條件下于深孔中培養(yǎng)的細(xì)胞周期概況(G1/G0和G2)。使BM-MSC培養(yǎng)物持續(xù)納入BrdU，并在不同時(shí)間點(diǎn)(至多3天)取樣。大多數(shù)細(xì)胞在G1/G0期(高密度培養(yǎng))，但仍有一些G2期細(xì)胞出現(xiàn)。無(wú)MN細(xì)胞(未檢測(cè)到多核細(xì)胞)。因此，布雷他汀對(duì)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。圖5.1 5.3顯示由碘化丙啶和后續(xù)FACS分析所示，用不同抑制劑濃度處理并在靜態(tài)條件下于六孔中培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞周期概況(G1/G0和G2)。使BM-MSC培養(yǎng)物持續(xù)納入BrdU,并在不同時(shí)間點(diǎn)(至多3天)取樣。大多數(shù)細(xì)胞在G1/G0期(高密度培養(yǎng))，但仍有一些G2期細(xì)胞出現(xiàn)。無(wú)MN細(xì)胞(未檢測(cè)到多核細(xì)胞)。在持續(xù)處理過(guò)程中觀察到黏附T培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物(G2/M)略微減慢細(xì)胞周期。圖6顯示在Lumox-biofoil袋疏水側(cè)培養(yǎng)的未經(jīng)布雷他汀處理的BM-MSC (對(duì)照)。顯示用〈0.1%DMS0處理48h之后觀察到的細(xì)胞菌落和附著細(xì)胞。沒(méi)有觀察到顯著的細(xì)胞附著。圖7顯示在Lumox-biofoil袋疏水側(cè)培養(yǎng)的BM-MSC。顯示用10 μ M布雷他汀處理48h之后觀察到的細(xì)胞菌落和附著細(xì)胞。大量細(xì)胞附著至所述疏水表面。因此，若與圖6 (對(duì)照)相比，布雷他汀處理使BM-MSC對(duì)該表面的親和性增加。圖8顯示的柱狀圖反映布雷他汀和Y-27632對(duì)來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)而同時(shí)移位所述細(xì)胞的影響。亞融合BM-MSC接受4h預(yù)處理(10μΜ布雷他汀或10μΜY-27632對(duì)比對(duì)照)，并隨后使用胰蛋白酶/EDTA在37C°孵育3min。在使細(xì)胞從無(wú)特殊包被的組織培養(yǎng)瓶表面移位后確定細(xì)胞計(jì)數(shù)(A)。與對(duì)照條件(無(wú)布雷他汀)相比，在肌球蛋白II抑制存在下的細(xì)胞移位更少。在藥物處理?xiàng)l件下，移位細(xì)胞無(wú)聚集體。因此，布雷他汀和Y-27632都顯示抗細(xì)胞移位和聚集的保護(hù)作用，即，所述細(xì)胞保持穩(wěn)定附著所述基質(zhì)，并且無(wú)法輕易洗去。再接種細(xì)胞(所有條件按相同密度:5000細(xì)胞/cm2)并在不含藥物的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7天。測(cè)定7天后細(xì)胞計(jì)數(shù)⑶和活力(C)。若BM-MEC從基質(zhì)移位并再接種用于進(jìn)一步培養(yǎng)，布雷他汀對(duì)所述細(xì)胞有顯著保護(hù)作用，使7天培養(yǎng)后的增殖和活性增強(qiáng)。在后續(xù)無(wú)藥物傳代(第7天) 的移位之前用布雷他汀和Y-27632處理觀察到細(xì)胞增殖(產(chǎn)量和活力)增加，其中Y-27632引起的增加較少。圖9顯示附著微載體的來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)的葡萄糖消耗㈧、乳酸鹽生產(chǎn)(B)和細(xì)胞數(shù)量(C)的柱狀圖。BM-MSC接種在微載體上，用于有或沒(méi)有10 μ M布雷他汀時(shí)的懸浮培養(yǎng)，并使之增殖6天。無(wú)攪拌孵育24h后，對(duì)所述培養(yǎng)物取樣，以測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)、葡萄糖消耗和細(xì)胞接種。攪拌情況下再孵育5天之后，再次測(cè)定葡萄糖消耗(A)、乳酸鹽生產(chǎn)(B)、細(xì)胞計(jì)數(shù)(C)和載體上的細(xì)胞接種(圖11，載體上DAPI染色細(xì)胞)。24h之后，布雷他汀存在下的細(xì)胞接種相較對(duì)照顯著增加。雖然布雷他汀似乎對(duì)6天后BM-MSC的葡萄糖消耗和乳酸鹽生產(chǎn)沒(méi)有影響，但是在使用所述抑制劑處理后，細(xì)胞數(shù)量顯著增加。因此，布雷他汀對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，使在微載體上生長(zhǎng)6天后的增殖增強(qiáng)。圖10顯示根據(jù)圖9在孵育6天后微載體的顯微照片(載體上的DAPI染色BM-MSC)。這里清楚顯示，布雷他汀存在時(shí)(B)附著所述微載體的細(xì)胞比所述抑制劑不存在時(shí)(A，對(duì)照)多許多。圖11顯示經(jīng)包被培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞(hESC)的顯微照片。在包被有Matrigelw的培養(yǎng)皿上于不含血清或動(dòng)物來(lái)源成分的X-VIVO確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。A:不用抑制劑處理(對(duì)照)，B:用10 μ M布雷他汀短暫處理(左側(cè)顯微照片:4倍放大倍數(shù)，右側(cè)顯微照片:10倍放大倍數(shù))，C:在撤去布雷他汀后培養(yǎng)I天。hESC在X-VIVO中的分裂后附著性低(A:5 15%)。當(dāng)所述培養(yǎng)物分裂時(shí)(EDTA傳代)，向所述培養(yǎng)基補(bǔ)充10 μ M布雷他汀。與X-VIVO中不含布雷他汀的hESC培養(yǎng)物分裂后附著性相比，這顯著增加了 hESC附著(B:80 95%)。實(shí)際上，甚至個(gè)體化的hESC都極好地附著。在24h后用不含布雷他汀的X-VIVO替代所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，以觀察在無(wú)布雷他汀時(shí)細(xì)胞如何保持附著和增殖。在此，無(wú)法觀察到顯著變化(C)。圖12顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，㈠對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)的影響。在排斥性Teflonκ箔上用10 μ M Bb培養(yǎng)MSC4天，在第4天計(jì)數(shù)附著所述箔的細(xì)胞。棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMSO或PBS中的BM-MSC，無(wú)抑制劑。觀察到肌球蛋白抑制下的細(xì)胞產(chǎn)量相較對(duì)照顯著增加。因此，BM-MSC在Teflon 箔上附著
并增殖。圖13顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，㈠對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)來(lái)自臍帶血的干細(xì)胞(CB-USSC)的影響。在排斥性Teflor^'箔上用10 μ M Bb培養(yǎng)USSC4天，在第4天計(jì)數(shù)附著所述箔的細(xì)胞。棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMSO或PBS中的CB-USSC，無(wú)抑制劑。觀察到肌球蛋白抑制下的細(xì)胞產(chǎn)量相較對(duì)照極顯著增加。因此，CB-USSC在Tef]cmK'箔上附著
并增殖。圖14顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，㈠對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干
細(xì)胞(BM-MSC)的影響。在排斥性Teflo,'箔上用10 μ M Bb培養(yǎng)MSC直至達(dá)到融合，在細(xì)
胞接種后的第6天計(jì)數(shù)附著所述箔的細(xì)胞。棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMSO或PBS
中的BM-MSC，無(wú)抑制劑。BM-MSC在Teflonκ箔上不形成完全融合層。肌球蛋白抑制下的細(xì)
胞產(chǎn)量相較對(duì)照沒(méi)有差異，與4天實(shí)驗(yàn)的明顯不一致可能歸因于較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間(6天相比4天)和/或增加的初始細(xì)胞數(shù)量(在分泌ECM以接種于上方面，雙倍量的細(xì)胞附著可能更加有效)。圖15顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，㈠對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)來(lái)自臍帶血的干細(xì)胞(CB-USSC)的影響。在排斥性Teflon"箔上用10 μ M Bb培養(yǎng)USSC直至達(dá)到融合，在細(xì)胞接種后的第6天計(jì)數(shù)附著所述箔的細(xì)胞。棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMS0或PBS中的CB-USSC，無(wú)抑制劑。USSC在肌球蛋白抑制下于Teflon'箔上形成融合層，觀察到肌球蛋白抑制下的細(xì)胞產(chǎn)量相較對(duì)照培養(yǎng)物顯著增加。圖16顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，(-)對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)低血清EGM2+Dex培養(yǎng)基中(3%血清)培養(yǎng)的來(lái)自臍帶血的干細(xì)胞(CB-USSC)的影響。USSC用10 μ M Bb在排
斥性Teflor^箔皿上培養(yǎng)，并在細(xì)胞接種后的第4天計(jì)數(shù)。棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMS0或PBS中的CB-USSC，無(wú)抑制劑。USSC顯示在肌球蛋白抑制下的增殖顯著增強(qiáng)。在Teflon 箔上血清減少(EGM2)培養(yǎng)基中的USSC附著和增殖通過(guò)抑制肌球蛋白而增強(qiáng)。圖17顯示的柱狀圖反映布雷他汀(Bb，(-)對(duì)映異構(gòu)體)對(duì)無(wú)血清MSCGM-⑶培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自臍帶血的干細(xì)胞(CB-USSC)的影響。USSC用10 μ M Bb在排斥性Teflon"'箔皿上培養(yǎng)，并在細(xì)胞接種后的第4天計(jì)數(shù)。 棒代表每孔細(xì)胞數(shù)。對(duì)照培養(yǎng)物:DMSO或PBS中的CB-USSC，無(wú)抑制劑。在無(wú)關(guān)肌球蛋白抑制的無(wú)血清培養(yǎng)基中，USSC附著在TefloiP箔
上，但沒(méi)有顯著增殖?？梢杂^察到肌球蛋白抑制下的細(xì)胞產(chǎn)量相較對(duì)照無(wú)明顯增長(zhǎng)。圖18顯示來(lái)自臍帶血的染色干細(xì)胞(CB-USSC)在PTFE血管上的照片(PTFE=聚
四氟乙烯(polytetrafIuoroethylene),商品名(DuPont): Teflon..、)。A) DMSO 對(duì)照，B) PBS 對(duì)照，C) 10 μ M (-)布雷他汀。與對(duì)照培養(yǎng)物相比，在排斥性PTFE-血管材料上用10 μ M Bb培養(yǎng)USSC3天。與對(duì)照相比，在肌球蛋白抑制下觀察到顯著增強(qiáng)的細(xì)胞擴(kuò)散，但沒(méi)有聚集體形成。圖19顯示人胚胎干細(xì)胞(hEST)在有或沒(méi)有肌球蛋白抑制的凍存之前和之后的活細(xì)胞密度(柱形)和恢復(fù)(三角形)(BB=布雷他汀)。圖20顯示在凍存細(xì)胞解凍后兩天和四天的平均人胚胎干細(xì)胞(hEST)總數(shù)的柱狀圖。通常僅能凍存細(xì)胞團(tuán)，而非個(gè)體ES細(xì)胞。該圖顯示，抑制肌球蛋白顯著增強(qiáng)個(gè)體細(xì)胞在凍存后的存活?？偠灾?，圖19和圖20顯示，布雷他汀使個(gè)體hESC的凍存恢復(fù)增加至與hESC團(tuán)相當(dāng)?shù)乃?。而且，在冷凍前添加布雷他汀有利于個(gè)體hESC的凍存。根據(jù)上文所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯然非肌肉型肌球蛋白II的直接抑制劑例如布雷他汀，對(duì)細(xì)胞團(tuán)尤其是 附著依賴(lài)性細(xì)胞團(tuán)有一些積極作用。例如，肌球蛋白II直接抑制劑-增強(qiáng)細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的存活，-降低細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的積聚，-促進(jìn)在不適于細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)上附著和增殖，-提供用于控制細(xì)胞與特定基質(zhì)附著的工具，-在細(xì)胞移位過(guò)程中起保護(hù)作用，-在細(xì)胞的冷凍和/或解凍時(shí)對(duì)其有保護(hù)作用，-在細(xì)胞分選(例如FACS)過(guò)程中起保護(hù)作用，-促進(jìn)來(lái)自臍帶血和骨髓MNC-分離物(初生組織)的初始細(xì)胞附著，-肌球蛋白抑制弓I起B(yǎng)M-MSC接種的適度增強(qiáng)和CB-USSC在Teflonx箔上附著的有力增強(qiáng)，-肌球蛋白抑制引起CB-USSC在Teflon1〈上的融合生長(zhǎng)。-肌球蛋白抑制正面影響MSC-GM(無(wú)血清培養(yǎng)基)中無(wú)血清條件下的接種，和-肌球蛋白抑制正面影響EGM2-MV中血清減少條件下的接種和增殖。本發(fā)明的另一方面是提供用于控制細(xì)胞，尤其是附著依賴(lài)性細(xì)胞粘附基質(zhì)的方法，所述方法允許選擇用于細(xì)胞的高產(chǎn)率生產(chǎn)和低損傷分離的合適基質(zhì)。特定提供一種方法，其中，通過(guò)向細(xì)胞提供直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子來(lái)控制細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的附著。向所述細(xì)胞提供所述抑制劑可增強(qiáng)這些細(xì)胞附著至原本對(duì)其沒(méi)有足夠親和性的表面的能力。因此，可以有利方式應(yīng)用所述直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子作為一種觸發(fā)劑，所述觸發(fā)劑使用戶(hù)能夠控制細(xì)胞附著特定基質(zhì)，例如用于懸浮培養(yǎng)的微載體。此外，本發(fā)明所述的抑制劑是拓寬用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適基質(zhì)選擇的有用工具，從而能優(yōu)化并因此大大改進(jìn)依賴(lài)于細(xì)胞對(duì)微載體附著的細(xì)胞培養(yǎng)方法。優(yōu)選地，通過(guò)向所述細(xì)胞提供所述抑制劑分子而促進(jìn)所述細(xì)胞對(duì)所述基質(zhì)的附著。用所述抑制劑處理所述細(xì)胞使這些細(xì)胞有能力在不適于培養(yǎng)這些細(xì)胞的表面上附著和增殖。即，本發(fā)明所述的方法大幅拓寬了適用于培養(yǎng)和/或擴(kuò)增細(xì)胞的基質(zhì)(例如，微載體)選擇。因此，由于在待培養(yǎng)細(xì)胞能夠黏附的基質(zhì)方面存在多得多的選擇，這促進(jìn)了培養(yǎng)條件的改進(jìn)和優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述基質(zhì)是多種微載體，并且附著所述載體的細(xì)胞在懸浮條件下培養(yǎng)。在該實(shí)施方式中，增加細(xì)胞得以生長(zhǎng)的表面積，從而細(xì)胞在懸浮條件下(優(yōu)選在合適的生物反應(yīng)器中)培養(yǎng)時(shí)能在微載體(優(yōu)選合適的珠)上大量產(chǎn)出。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選是間充質(zhì)干細(xì)胞。但是，如本發(fā)明所述的方法包括通過(guò)直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑能夠影響細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的親和力的所有細(xì)胞類(lèi)型。本發(fā)明的一個(gè)重要方面在于使用布雷他汀控制細(xì)胞對(duì)上述表面的黏附。本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)面中提供用于擴(kuò)增細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)懸浮所述細(xì)胞，(b)使所述細(xì)胞附著多種微載體的表面，以及(C)在懸浮條件下培養(yǎng)附著微載體的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，在步驟(a)中懸浮所述細(xì)胞之前和/或當(dāng)時(shí)，用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子處理所述細(xì)胞。在該方法中，大幅增加細(xì)胞得以生長(zhǎng)的表面積，從而細(xì)胞在懸浮條件下(優(yōu)選在合適的生物反應(yīng)器中)培養(yǎng)時(shí)能在微載體(優(yōu)選合適的珠)上大量產(chǎn)出。所述抑制劑促進(jìn)所述細(xì)胞對(duì)所述微載體的黏附，并增強(qiáng)細(xì)胞優(yōu)選附著依賴(lài)性細(xì)胞粘附對(duì)其沒(méi)有親和性或親和性不足的表面的能力。在一些方面中，所述細(xì)胞在步驟(a)和(b)中至少一個(gè)之前經(jīng)冷凍和解凍。令人吃驚的是，在本發(fā)明所述的方法過(guò)程中冷凍和解凍所述細(xì)胞使得所述細(xì)胞在擴(kuò)增過(guò)程中的黏附和存活有所改善，從而能夠顯著增加細(xì)胞產(chǎn)量。在此，肌球蛋白II抑制劑還在細(xì)胞冷凍和解凍時(shí)對(duì)其起保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述細(xì)胞是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選是間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，本發(fā)明所述的方法包括在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑存在時(shí)能夠有效擴(kuò)增的所有細(xì)胞類(lèi)型。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面在于，應(yīng)用布雷他汀來(lái)擴(kuò)增附著多種微載體的細(xì)胞，其中，附著所述微載體的所述細(xì)胞在懸浮條件下培養(yǎng)。本發(fā)明的另一方面中提供一種用于從組織分離細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子存在下解離所述組織，和(b)從解離自所述組織的細(xì)胞中分離感興趣的細(xì)胞。令人吃驚地顯示本發(fā)明所述的抑制劑顯著改善了來(lái)自原代分離物的細(xì)胞的存活和恢復(fù)。因此，本發(fā)明所述方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于:細(xì)胞從組織包埋狀態(tài)到懸浮狀態(tài)的轉(zhuǎn)換得到了改善。因此，在分離細(xì)胞時(shí)用所述抑制劑分子處理所述細(xì)胞產(chǎn)生較高產(chǎn)率，并且偶爾還能從組織鑒定出新細(xì)胞類(lèi)型。在分離感興趣的細(xì)胞之后，這些細(xì)胞可在懸浮培養(yǎng)條件下擴(kuò)增，以產(chǎn)出更高數(shù)量的細(xì)胞用于進(jìn)一步應(yīng)用。優(yōu)選地，在直接抑制非肌 肉型肌球蛋白II的抑制劑分子存在下擴(kuò)增所述感興趣的細(xì)胞。所述感興趣的細(xì)胞可以是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選是間充質(zhì)干細(xì)胞。若附著依賴(lài)性細(xì)胞已經(jīng)分離，則在不含所述抑制劑分子的附著依賴(lài)性細(xì)胞培養(yǎng)條件下擴(kuò)增所述細(xì)胞可能是合適的。所述抑制劑分子可以是布雷他汀。布雷他汀是在施加至細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)使由缺少附著而引起的細(xì)胞死亡最小化并促進(jìn)單細(xì)胞培養(yǎng)的小分子。與ROCK抑制劑相反，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。布雷他汀不干擾復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，而是以非肌肉型肌球蛋白II為直接目標(biāo)，并且，其通過(guò)結(jié)合肌球蛋白-ADP-Pi復(fù)合物與肌動(dòng)蛋白相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易調(diào)整且易可逆(良性)抑制劑。布雷他汀大大增強(qiáng)原本絕對(duì)依賴(lài)黏附的細(xì)胞的懸浮存活。可在需要時(shí)向培養(yǎng)基簡(jiǎn)易添加所述基質(zhì)，而且其作用通過(guò)移除所述基質(zhì)是直接且立即完全可逆的。所述分子是至關(guān)重要的工具，在向懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)換方面，所述分子在懸液初期過(guò)程中最小化細(xì)胞死亡，在從組織鑒定出新細(xì)胞方面，所述分子在細(xì)胞提取(即，從組織包埋狀態(tài)或生境轉(zhuǎn)換為懸浮狀態(tài))過(guò)程中最小化細(xì)胞死亡。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是可以利用布雷他汀來(lái)分離附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是在附著依賴(lài)性細(xì)胞從組織包埋狀態(tài)向懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中增加所述細(xì)胞的產(chǎn)量。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是使用布雷他汀來(lái)增強(qiáng)生長(zhǎng)因子對(duì)附著依賴(lài)性細(xì)胞的作用，所述附著依賴(lài)性細(xì)胞優(yōu)選是成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是在無(wú)血清培養(yǎng)附著依賴(lài)性細(xì)胞過(guò)程中使用布雷他汀來(lái)替代結(jié)合因子，所述細(xì)胞優(yōu)選是成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞。用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子(優(yōu)選布雷他汀)處理細(xì)胞，從本質(zhì)上影響所述細(xì)胞的特性，使得經(jīng)處理的細(xì)胞顯示新特性和不同于那些未處理細(xì)胞的能力。因此，用肌球蛋白II抑制劑處理的細(xì)胞是，至少在一定程度上是，具有不同形態(tài)和生物成分的新型細(xì)胞。因此，本發(fā)明還包 括如本發(fā)明所述方法擴(kuò)增或分離的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞。即，本發(fā)明涉及在存在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子存在時(shí)培養(yǎng)或分離的所有細(xì)胞，所述抑制劑分子優(yōu)選布雷他汀。此外，獨(dú)立于本發(fā)明所述的方法，本發(fā)明包括用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制劑分子處理或在所述抑制劑分子存在下培養(yǎng)的任何細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞，所述抑制劑分子優(yōu)選布雷他汀。本發(fā)明還包括一種組合物，所述組合物包括至少一個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞，如本發(fā)明所述。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物可以包含細(xì)胞培養(yǎng)基或合適于保證所述細(xì)胞活力的其它溶液。然而，本發(fā)明不限于這類(lèi)組合物。例如，如本發(fā)明所述的組合物可以可選地包括懸浮在合適保護(hù)性基質(zhì)中冷凍的細(xì)胞。本發(fā)明還包括一種包含至少一個(gè)細(xì)胞和至少一種抑制劑分子的組合物，所述細(xì)胞優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選成人干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞，所述抑制劑分子直接抑制非肌肉型肌球蛋白II，優(yōu)選是布雷他汀。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的組合物中的至少一種基本不含血清。例如，所述組合物可以在包含布雷他汀的無(wú)血清培養(yǎng)基中包含間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。如本發(fā)明所述的細(xì)胞和/或組合物可以包括在非醫(yī)療性實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒內(nèi)，或作為藥物制備物的部分。文獻(xiàn):Straight 等，Science, 2003，299，1743-1747.Walker, A., Su, H., Conti, M.A., Harb, N., Adelstein, R.S., Sato, N.:Nature Communications, 2010, DC1 :10.1038, ncommsl 074.
權(quán)利要求
1.用于促進(jìn)細(xì)胞黏附基質(zhì)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附由向所述細(xì)胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制劑布雷他汀來(lái)促進(jìn)，從而使所述細(xì)胞能夠附著對(duì)所述細(xì)胞不具足夠親和性的表面。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。
3.如權(quán)利要求2所述的方法 ，其特征在于，所述非粘性材料包括聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化鈦復(fù)合物或包含二氧化鈦的組合物，或其任何組合。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)是醫(yī)療裝置的表面，所述醫(yī)療裝置優(yōu)選是支架、貼片或人造血管或器官。
5.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)是多種微載體。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下擴(kuò)士豳>曰ο
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞懸浮在血清減少或無(wú)血清培養(yǎng)基中。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞在布雷他汀存在下被冷凍和/或解凍，然后使所述細(xì)胞接觸所述基質(zhì)。
10.布雷他汀用于促進(jìn)細(xì)胞黏附對(duì)所述細(xì)胞不具足夠親和性的基質(zhì)的應(yīng)用。
11.布雷他汀用于使對(duì)醫(yī)療裝置的表面無(wú)親和性或僅有低親和性的細(xì)胞包被所述表面的應(yīng)用，所述醫(yī)療裝置優(yōu)選是支架、貼片或人造血管或器官。
12.具有由細(xì)胞包被的至少一個(gè)表面的裝置，所述細(xì)胞通常對(duì)該表面無(wú)親和性或僅有低親和性。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，所述表面包括非粘性材料，優(yōu)選是聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化鈦復(fù)合物或包含二氧化鈦的組合物，或其任何組合。
14.如權(quán)利要求12或13所述的裝置，其特征在于，所述細(xì)胞是附著依賴(lài)性細(xì)胞，特別是成人干細(xì)胞，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求12 14中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置是醫(yī)療裝置，優(yōu)選支架、貼片或人造血管或器官。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)細(xì)胞黏附通常對(duì)其無(wú)親和性或僅有低親和性的基質(zhì)的方法，其中，由向所述細(xì)胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制劑布雷他汀(Blebbistatin)來(lái)促進(jìn)所述細(xì)胞對(duì)所述基質(zhì)的黏附，從而使所述細(xì)胞能夠附著在對(duì)其不具有足夠親和性的表面。令人吃驚的是，向所述細(xì)胞供給所述抑制劑增強(qiáng)這些細(xì)胞附著通常對(duì)其無(wú)親和力或僅有低親和力的表面(例如PTFE())的能力。本發(fā)明還涉及非肌肉型肌球蛋白II抑制劑布雷他汀和至少一個(gè)表面包被有與所述表面無(wú)親和性或僅低親和性的細(xì)胞的裝置的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103201377SQ201180053932
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者J·塞恩克, C·范登博斯, C·羅森鮑姆, 聶穎 申請(qǐng)人:隆薩科隆有限公司