制造d型乳酸的耐熱凝結芽孢桿菌的基因工程的制作方法
【專利摘要】提供一種在溫度處于30℃至55℃之間的條件下、具有制造D型（左旋）乳酸能力的基因改造微生物。在多種實施例中，微生物可能具有被失活的染色體乳酸脫氫酶（ldh）基因和/或染色體乙酰乳酸合成酶（alsS）基因。所公開的方法中所用的范例微生物為芽孢桿菌，例如凝結芽孢桿菌。
【專利說明】制造D型乳酸的耐熱凝結芽孢桿菌的基因工程
[0001]相關申請的前后參照
本申請要求2010年11月22日提出的美國臨時專利申請序號第61/416002號的權利，特此將該專利的公開內容，以數(shù)據(jù)參照的方式完整加入本申請中，包括所有附圖、表格與核酸序列。
[0002]政府支持
本發(fā)明受政府支持而成，能源部補助金編號第DE-FG36-04G014019號。政府在本發(fā)明中擁有特定權利。
【背景技術】
[0003]石油不僅是主要的燃料來源，也是制造塑料工業(yè)使用的多種聚合物的原料。由于石油的儲藏量是有限的，加上使用石油對環(huán)境所造成的負面影響，使人們將注意力逐漸轉向具有替代性、可再生的燃料來源及化合物上，希望能夠取代石油(23)。碳水化合物的發(fā)酵已被證明可制造出多種短鏈氫氧基酸，以及其它可被聚合并用以制造多種具有不同物理與化學特性塑料的其它化學物質。在這些發(fā)酵產品中，乳酸因其可做為制造可生物分解及可再生塑料的起始原料的主要化學物質，且因二氧化碳零排放而給環(huán)境帶來影響最小而受矚目。利用糖類發(fā)酵成乳酸可追溯至史前時代，而早在1895年(3)時，就已經開始使用純細菌培養(yǎng)來生產商品化的乳酸。雖然乳酸主要用于食品和藥品產業(yè)，但如果乳酸基聚合物的生產成本與石油衍生聚合物的生產成本相似，可預期乳酸衍生的生物聚合物的用途會超過上述的產業(yè)(8，14，18)。
[0004]乳酸被濃縮成減水乳酸，接著純化并聚合成聚乳酸(PLA)，聚乳酸為一種熱塑性塑料(18，22)。通過平均混合D型(左旋)和L型(右旋)乳酸，可以制造出具多種不同物理及熱化學特性的聚合物。雖然乳酸可以用石油人造合成出來，但所生產的東西是兩種同質異構物的混合物，不適合用于PLA的制造。制造PLA所需的純D型和純L型乳酸只能通過微生物發(fā)酵而產生(14)。各種乳酸細菌，例如乳酸菌、乳酸球菌等等，會生產出大量的L型乳酸，并從如葡萄糖和蔗糖之類的可發(fā)酵糖類滴定出來(6，14)。它們的營養(yǎng)需求很復雜，而它們的生長溫度范圍處于30°C到35°C之間。制造D型乳酸做為主要發(fā)酵產物的微生物，已經被描述且目前業(yè)界正使用中(23，34，36) (12)。目前通過這些微生物性生物催化劑進行乳酸發(fā)酵的溫度條件為30°C至37°C之間，預期把生長和發(fā)酵的溫度提高至50°C至55°C，可將大量工業(yè)發(fā)酵所產生的污染減至最低(I)。為了降低乳酸的生產成本，也為了減少使用可食用碳水化合物做為乳酸生產的原料，替代性的可發(fā)酵糖源和微生物性生物催化劑目前正在開發(fā)中。木質纖維素生物量是一種具吸引力的糖類來源，例如葡萄糖或木糖等。然而，雖然曾數(shù)度試圖改進這些乳酸細菌的木糖發(fā)酵特性，產業(yè)界所使用的乳酸細菌仍缺乏有效將五碳糖發(fā)酵成乳酸的能力(25，31)。
[0005]凝結芽孢桿菌是一種產孢子乳酸細菌，生長在50°C到55°C且pH 5.0的環(huán)境中，且會發(fā)酵五碳糖和六碳糖(10，27)。該細菌已被證明會在以葡萄糖和木糖進行分批補料發(fā)酵條件下，產生濃度高達180克/升的L型乳酸，該細菌同時也是一個讓纖維素同步醣化和發(fā)酵成純D型和純L型乳酸的絕佳選擇(26)。一般而言，凝結芽孢桿菌會抵抗基因工程，所以需要有制造純乳酸的方法，特別是使用經過基因工程但不含外源核酸序列的微生物。本發(fā)明的一個形態(tài)是公開了對該種頑抗基因工程的細菌進行基因工程的一種常規(guī)方法。使用公開的辦法和以生長為基礎的篩選，凝結芽孢桿菌菌株P4-102B的發(fā)酵產物會從L型乳酸變?yōu)镈型乳酸。工程化的生物催化劑在48小時以內，在50°C的溫度條件下，產生出濃度約達90克/升的D型乳酸。

【發(fā)明內容】

[0006]提供一種基因改造微生物，其可在處于30°C至55°C的溫度條件下產生D型乳酸。在各種實施例中，微生物可能具有失活的染色體乳酸脫氫酶(7過)基因和/或失活染色體乙酰乳酸合成酶基因。所公開的方法中，利用芽孢桿菌屬做為示范微生物，例如凝結芽孢桿菌。如本公開內容所產生的微生物，其可在培養(yǎng)基中產生濃度至少60克/升的D型乳酸產物，即可至少為70克/升、80克/升、90克/升或100克/升。本發(fā)明也提供了一種制造和使用所公開的基因改造微生物的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1A-1B為凝結芽孢桿菌菌株QZ4 (Aldh)在pH 5.0 (圖1A)和pH 7.0 (圖1B)環(huán)境下的發(fā)酵圖。在小型發(fā)酵槽中，以葡萄糖在具有酸堿值控制的LB培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。PH 5.0那組的初始葡萄糖濃度為30克/升；pH 7.0那組的初始葡萄糖濃度為50克/升。
[0008]圖2A-B為凝結芽孢桿菌菌株QZ5 (Aldh，AalsS)在pH 5.0 (圖2A)和pH 7.0 (圖2B)環(huán)境下的發(fā)酵圖。在小型發(fā)酵槽中，以濃度30克/升的葡萄糖在LB培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，以自動添加KOH的方式來控制酸堿值。
[0009]圖3是在小型發(fā)酵槽內，以濃度30克/升的葡萄糖在LB培養(yǎng)基pH 5.0的環(huán)境條件下，利用凝結芽孢桿菌菌株QZ5進行以生長為基礎的篩選，以得到菌株QZ13。
[0010]圖4是在小型發(fā)酵槽內，以濃度50克/升的葡萄糖在LB培養(yǎng)基pH 7.0的環(huán)境條件下，利用凝結芽孢桿菌菌株QZ13進行以生長為基礎的篩選，以得到菌株QZ14。
[0011]圖5是在小型發(fā)酵槽內，以持續(xù)增加濃度的葡萄糖于LB培養(yǎng)基在pH 7.0的環(huán)境條件下，利用凝結芽孢桿菌菌株QZ14進行以生長為基礎的篩選，以得到菌株QZ15。培養(yǎng)基也含20克/升的碳酸鈣。初始葡萄糖濃度為50克/升。在第三次移轉后，葡萄糖濃度增加為60克/升。在第五次移轉后，葡萄糖濃度增加為100克/升。
[0012]圖6為凝結芽孢桿菌菌株QZ19在pH 7.0環(huán)境下，在含有葡萄糖及20克/升碳酸鈣的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵圖。發(fā)酵液中偵測不到L型乳酸或甲酸鹽。
[0013]圖7生產可制造D型乳酸的細菌菌株的范例示意圖。通常，目標菌株/細胞經基因改造，使右旋-乳酸脫氫酶和乙酰乳酸合成酶活性失活，以在丙酮酸節(jié)點處競爭反應。接著將細胞培養(yǎng)于PH值處于4.5至5.5之間的限氧環(huán)境下。選擇和親代菌株相比，具有較高的細胞產量且/或乳酸產量的細胞以進行進一步培育。接著培養(yǎng)所選細胞在PH值處于6.5至7.5之間的限氧/厭氧環(huán)境下。選擇和原選菌株相比，具有較高細胞產量且/或乳酸產量的細胞以進行進一步培育或用于制造D型乳酸。在本發(fā)明的特定較佳形態(tài)中，用以制造D型乳酸的細胞，每公升培養(yǎng)基至少生產60克的乳酸(最優(yōu)選為約48小時之內)。[0014]基因序列的簡要描述
序列I為編碼凝結芽孢桿菌P4-102B的乳酸脫氫酶基因。
[0015]序列2為編碼凝結芽孢桿菌P4-102B的乙酰乳酸合成酶基因。
[0016]序列3為編碼凝結芽孢桿菌P4-102B的丙酮酸甲酸裂合酶基因。
【具體實施方式】
[0017]本申請的其中一個形態(tài)是提出一種具有產生D型乳酸的能力的基因改造微生物。在該形態(tài)的各個發(fā)明實施例中，微生物可能具有染色體乳酸脫氫酶基因(7過)、染色體丙酮酸甲酸裂解酶沒)基因、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/7J)、α -乙酰乳酸脫羧酶(a7i)和/或染色體乙酰乳酸合成酶(ahS)基因的失活，而所述的微生物可為一種芽孢桿菌，例如凝結芽孢桿菌。如本公開內容所述而制造出的微生物每公升培養(yǎng)基可生產至少有60克的D型乳酸，即濃度至少為70克/升、80克/升、90克/升或100克/升。在本發(fā)明的特定形態(tài)中，有染色體乳酸脫氫酶(7過)基因、染色體丙酮酸甲酸裂解酶基因和經失活的染色體乙酰乳酸合成酶(ahS)基因。本發(fā)明的另一形態(tài)是提出一種微生物，其具有染色體乳酸脫氫酶(7過)基因和染色體乙酰乳酸合成酶基因失活。根據(jù)本發(fā)明的其它形態(tài)，提出一種微生物，其具有不同失活的酶活性的多種組合(請見下列討論)。
[0018]“基因” 一詞包括結構性基因和具有特定調控作用的區(qū)域，例如啟動子和操作子?！盎颉币辉~包括基因的開放讀碼框還有上游與下游調控序列。上游調控區(qū)也被稱為是基因的啟動子區(qū)。下游調控區(qū)也 被稱為終止子序列區(qū)。可通過符合下列狀況的染色體DNA中核苷酸序列的缺失，來造成和的失活:(I)包含啟動子、操作子或如瓜/7/招、alsD和/或基因轉錄調控的染色體DNA中核苷酸序列；(2)引入一個移碼，使乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶、α -乙酰乳酸脫羧酶和/或乙酰乳酸合成酶無法被表達成具有活性的蛋白質；或(3)編碼乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶、α -乙酰乳酸脫羧酶和/或乙酰乳酸合成酶的整個結構基因或其部分已被刪除。在一個優(yōu)選實施例中，提出一種微生物，其中整個編碼乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶、α -乙酰乳酸脫羧酶和/或乙酰乳酸合成酶的基因已被刪除。乳酸脫氫酶基因及乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶的范例序列分別提供于序列識別號:1及2。丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶活化酶的編碼序列提供于序列識別號:3。
[0019]“部分結構基因”或“整個結構基因或其部分”等用語，可指結構基因部分中的單一核苷酸缺失。缺失優(yōu)選為結構基因中有5到10個核苷酸缺失，更優(yōu)選為10到50個核苷酸，而最優(yōu)選為50至100個核苷酸。在本發(fā)明的某些形態(tài)中，結構基因可能被整個刪除。在本發(fā)明的其它形態(tài)，提供了乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(pflA)、α -乙酰乳酸脫羧酶(Wi)和/或乙酰乳酸合成酶的缺失。編碼上述酶的基因的開放讀碼框記載在序列表上。如下文所述，A* ^XlkpfM、pflB、alsS取alsD的任意組合可以被刪除。
[0020]在本發(fā)明的一個形態(tài)中，無需從外部來源引入基因或其部分，即可達成在微生物染色體中的基因突變。另一形態(tài)則提出通過引入一或多個點突變，或通過將一或多個終止密碼子引入在正被改造的內源基因的開放讀碼框中，來造成內源基因的突變。在另一形態(tài)，則可將內源基因的開放讀碼框從染色體DNA中刪除。
[0021]在某些形態(tài)，可引入一外源核苷酸序列以使一目標基因失活，以便選擇具有一目標表現(xiàn)型突變基因的細菌菌株。之后可無縫地將被引入微生物基因組的外源核苷酸序列移除，不會留下任何的外源核苷酸序列。
[0022]在一個實施例中，根據(jù)其產生高效價、高產量及高單位體積產率的D型乳酸的能力，選出生物催化劑。在一個實施例中，提出一種生物催化劑，其每消耗一摩爾的碳源(例如葡萄糖)，即能產生至少0.5摩爾的D型乳酸。該類生物催化劑可選擇性地利用以生長為基礎的篩選而選出。
[0023]“效價”一詞指發(fā)酵液中特定化合物的摩爾濃度。因此在制造D型乳酸的發(fā)酵過程中，100毫摩爾濃度的效價是指在測量時，每公升發(fā)酵液中含有100毫摩爾的乳酸。
[0024]“產量” 一詞意指在發(fā)酵過程期間，消耗每摩爾原料所產生的特定化合物摩爾數(shù)。因此在使用葡萄糖做為原料，制造D型乳酸的發(fā)酵過程中，產量一詞代表消耗每摩爾葡萄糖所產生的D型乳酸摩爾數(shù)。
[0025]“單位體積產率”一詞意指每單位時間每單位體積所產生的特定化合物的公克量。因此就0.9克/升.小時的D型乳酸單位體積產率而言，是指在一小時的生長期間，一公升的發(fā)酵液中累積了 0.9公克的D型乳酸。本文所公開的基因改造微生物的單位體積產率范圍可高達4克/升.小時。舉例而言，QZ19的單位體積產率可以達到超過3克/升.小時。
[0026]本公開內容中使用的詞，如“效價”、“產量”和“單位體積產率”等，也包含“標準化效價”、“標準化產量”和“標準化單位體積產率”。在標準化效價、標準化產量和標準化單位體積產率的測定中，還需要考慮為了維持生長培養(yǎng)基酸堿值而在發(fā)酵容器中加入的中和用試劑量。
[0027]“w/v” 一詞意指每公升中含有的物質量(以公克為單位)，單位為克/升。
[0028]本公開內容中使用的“基因工程”或“基因改造”等詞，是指通過操縱微生物的基因組脫氧核糖核酸(DNA)，以改變微生物中一或多個酶的表達的方法。在本公開范圍中，可互換使用“基因改造微生物”、“基因改造菌株(GMBS)”和“生物催化劑”三詞。在特定實施例中，多種芽孢桿菌都屬可以接受基因改造，例如凝結芽孢桿菌菌株、地衣芽孢桿菌菌株、枯草芽孢桿菌菌株、液化淀粉芽孢桿菌菌株、巨大芽孢桿菌菌株、浸麻類芽孢桿菌菌株、類芽孢屬菌株，或是像嗜熱桿菌芽孢菌株這種嗜熱菌屬也可以接受基因改造。其它的芽孢桿菌菌株可通過菌種中心取得，例如美國標準菌種中心(American Type Culture Collection,ATCC)，且可根據(jù)本公開內容中所述進行基因工程，使芽孢桿菌菌株可產生D型乳酸。在本發(fā)明某些實施例中，凝結芽孢桿菌菌株Suy27-13和/或含有在Suy27_13中找到的點突變的凝結芽孢桿菌菌株，可以特別地排除在申請專利范圍的適用范圍以外。
[0029]因此，在本公開內容的一個形態(tài)中，提出一種方法，通過基因改造菌株從碳化合物中量產出大量乳酸。如本文所公開，適合制造D型乳酸的微生物，可用這里所公開的一或兩步驟的方法培養(yǎng)。針對任何一項方法步驟，可將基因改造微生物維持在處于約30°C至65°C之間。多個不同的實施例都嘗試在約30°C、37°C或55°C的溫度下培養(yǎng)微生物。其它實施例則嘗試在處于約37°C至約65°C之間、約37°C至約55°C之間、約45°C至約60°C之間或約45°C至50°C之間的溫度培養(yǎng)微生物。
[0030]“突變”或“失活”是指對基因進行基因改造，包括開放讀碼框、上游調控區(qū)和下游調控區(qū)。基因突變會導致負調控或完全抑制基因開放讀碼框(ORF)的轉錄?；蛲蛔兛赏ㄟ^下列方法而造成，通過刪除全部的基因編碼區(qū)(ORF)或編碼核苷酸序列(ORF)的一部分、通過在編碼區(qū)內引入一個移碼突變、通過引入一個錯義突變、插入破壞基因所編碼的蛋白質活性的序列以及通過引入一終止密碼子或前述基因突變的任何組合。
[0031]本公開內容中所用的”外源”一詞，是表示衍生自細胞外的一個分子或一個活動被引入宿主微生物內。例如將外源核酸分子引入微生物細胞中，被引入的核酸能以一個獨立的質粒存在，或被合并入宿主染色體DNA里。在某些實施例中，本文所公開的生物催化劑中，并未找到編碼蛋白質的外源核苷酸。其它實施例則允許生物催化劑包含外源基因。外源基因(核酸序列)可以帶有本身的調節(jié)序列，例如啟動子和終止子序列，的可表達形式，而被引入微生物細胞中。另一種做法則是把外源核酸分子合并入宿主的染色體DNA中，并受宿主的調控序列所調控。
[0032]“內源”一詞是指自然(天生)出現(xiàn)在宿主細胞中的分子和活動。當用于指一個生物合成活動時，”外源”一詞是指被引入宿主參照有機體中的一活動。舉例而言，來源可以是一個同源或異源編碼核酸，可表達出引入宿主細菌有機體后的參照活動。若編碼一個蛋白質的核酸，從同屬的微生物有機體樣本取得，即稱為同源DNA。若核酸是衍生自不同屬的微生物樣本，則稱為異源DNA。不管DNA的性質如何，無論是同源或異源，在被引入宿主細胞時，DNA和衍生自引入DNA的活動都屬于外源。因此，編碼核酸的外源表達，可以利用同源或異源編碼的核酸其中之一或兩者都用。
[0033]一個形態(tài)提出在D型乳酸的生產上，表露出明顯效價、高產量和顯著單位體積產率的基因改造菌株。本發(fā)明所公開的微生物可用于利用多種不同的糖類生產D型乳酸的制造過程。在一個實施例中，基因改造僅涉及操縱微生物原有基因組內的基因。在該實施例中，并沒有像帶有抗藥基因的質?；蛉魏纹渌幋a特定酶蛋白質的外源核苷酸序列的外源基因材料，出現(xiàn)在生產D型乳酸的菌株中。
[0034]本發(fā)明結合特定基因的改造技術以及利用生長為基礎的篩選過程，來取得對D型乳酸具有高產量、高效價和高單位體積產率的菌株。以本公開方法制造出來的基因改造微生物菌株，接著可讓其在例如低酸堿值等多種不同條件下生長數(shù)代，并選擇D型乳酸生產力比原始親代菌株要高的菌株，和/或與親菌株相比具有較高細胞產量的。圖7表示該形態(tài)的范例圖解。這種以生長程度做為選擇具最佳表達的菌株篩選標準的過程，被稱為生長為基礎的篩選。
[0035]在進行生長為基礎的篩選期間，反復將基因改造菌株移至新鮮的培養(yǎng)基中一段時間，以顯現(xiàn)細菌生長快速/較多、迅速消耗不同碳源、具同時使用多種糖類的能力、耐受碳源中有毒化學物的能力、以及對目標有機酸具有高產量與產率而對其他有機酸低產量的菌株。進行生長為基礎的篩選期間，需注意選擇具有上述的目標表現(xiàn)型的菌株。若篩選程序選出的菌株展現(xiàn)出非常良好的生長率，但在目標有機酸的產量上并無增長，則其并非我們所要的菌株。在公開方法的實際操作中，選擇開始時是將改造菌株在有氧環(huán)境下進行培養(yǎng)、并按順序將菌株于培養(yǎng)菌系統(tǒng)(例如發(fā)酵槽)中的限氧環(huán)境下進行傳代。選出能在限氧環(huán)境下生長的基因改造微生物，且繼續(xù)傳代，直到達成微嗜氧或厭氧條件為止。接著以厭氧方式，在增加酸堿值的環(huán)境條件下培養(yǎng)微生物，并以微生物在培養(yǎng)環(huán)境下的D型乳酸產量為基準來篩選微生物。針對任何一項方法步驟，可把基因改造微生物維持在處于約30°C和約65°C之間的溫度下。若干不同的實施例嘗試在約30°C、37°C或55°C的溫度條件下培養(yǎng)微生物。其它實施例則嘗試在處于約37 °C和約65 °C之間、處于約37 °C和約55 °C之間、處于約45 °C和約60°C之間或處于約45°C和約50°C之間的溫度下培養(yǎng)微生物。
[0036]基因操作可伴隨著在基因操作階段之間的生長為基礎的篩選，而完成于數(shù)個不同的階段中?；虿僮靼淖儍仍碊NA序列及/或從基因組DNA中完全移除特定的DNA序列。基因操作也可能包含在微生物的基因組DNA中插入一個外來DNA序列。某些實施例中，是通過將特定DNA序列從微生物基因組DNA中移除，且不引入任何外來DNA，以達成基因操作的目的。某些使編碼特定蛋白質的基因表達失活是必須的基因操作，需要將一個外來DNA序列插入微生物的基因組中，以選出具有目標基因改造的菌株。舉例而言，外源抗生素標記基因可被用來插入并使內源基因失活，并選出具有目標基因型的菌株。在本發(fā)明的一實施例中，被引入的外源DNA序列最后被從微生物的基因組DNA中移除，以致基因工程程序結束時，有機體的結果基因組DNA中，只有少數(shù)或完全沒有外源DNA，尤其是沒有外源DNA基因(或其部分)。本領域的技術人員已經知道完成本發(fā)明優(yōu)選實施例的目的所需的各式基因工程技術，包括在溫度升高情形下使用具有不穩(wěn)定性的質粒(舉例而言，請見本發(fā)明范例中所討論的原料和方法)。本發(fā)明以參考數(shù)據(jù)的方式，完整并入任何引用的科學刊物和專利文件，以求提供對本發(fā)明而言屬有用的任何基因工程技術的必要信息。
[0037]在本發(fā)明的一個實施例中，可透過上述的一種或多種基因操作或基因工程技術，對已知可作用于發(fā)酵途徑中之一或多種編碼蛋白質的基因進行失活?？赡鼙皇Щ畹幕蚝兔赴ǎ樗崦摎涿窶RalsS,乙酰乳酸合成酶。
[0038]因此，提出下列的非限定實施例:
1.一種細菌細胞， 包含針對下列物質引起酶活性失活的基因改造:
a)乳酸脫氫酶以及非必要的乙酰乳酸合成酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶；
b)乳酸脫氫酶和乙酰乳酸合成酶；
c)乳酸脫氫酶、乙酰乳酸合成酶和丙酮酸甲酸裂解酶；或
d)下列任何酶活性的組合:乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶；乳酸脫氫酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+乙酰乳酸合成酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶。
[0039]2.如第I實施例的細菌細胞，進一步包含引起目標酶活性失活的基因改造。
[0040]3.如第I或第2實施例的細菌細胞，進一步包含將外源基因引入該細菌細胞中的基因改造。
[0041]4.如第I或第2實施例的細菌細胞，其中該基因改造包含編碼乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/7沒)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/7J)、α -乙酰乳酸脫羧酶(a7i)和/或乙酰乳酸合成酶的基因的突變，或編碼乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/73)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/7J)、α -乙酰乳酸脫羧酶(a7i)和/或乙酰乳酸合成酶的基因的全部或部分缺失。
[0042]5.如第4實施例的細菌細胞，該等基因的突變包含引入一或多個點突變，或是在基因開放讀碼框中引入一個或多個終止密碼子。
[0043]6.如第I至第3項實施例的細菌細胞，其中該基因改造包含乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/7沒)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/?)、α -乙酰乳酸脫羧酶(a7i)和/或乙酰乳酸合成酶(<37.5^)的編碼序列/開放讀碼框中的一點突變或一缺失，或是在乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/7沒)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/7J)、α -乙酰乳酸脫羧酶(Wi)和/或乙酰乳酸合成酶(Md)的編碼區(qū)域/開放讀碼框中插入一外源序列。
[0044]7.如第1、第2、第4、第5或第6實施例中任一項的細菌細胞，其中該細菌細胞不含外源基因或其部分。
[0045]8.如第1、第2、第4、第5或第6實施例中任何一項所述的細菌細胞，其中可選擇使用對溫度敏感的質粒，使L型乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶和/或乙酰乳酸合成酶的酶活性因同源重組而失活。
[0046]9.如第8實施例的細菌細胞，其中該基因改造包含編碼乙酰乳酸合成酶、乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的核苷酸的完全或部分缺失。
[0047]10.如第I至第9實施例中任一項的細菌細胞，其中:
a)該細菌為芽孢桿菌屬，例如凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、環(huán) 狀芽孢桿菌或解硫胺素芽孢桿菌；且
b)其中，可將凝結芽孢桿菌Suy27-13選擇性地排除在申請專利范圍的適用范圍外。
[0048]11.一種如第I至第10實施例中任一項的基因改造細菌細胞，其中該基因改造細菌細胞為QZ15或QZ19。
[0049]12.一種制造D型乳酸的方法，包含在允許產生D型乳酸的環(huán)境中，在含有碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)第I至第11實施例中任一項的基因改造細胞。
[0050]13.如第12實施例的方法，進一步包含分離或純化D型乳酸。
[0051]14.如第13實施例的方法,其中在厭氧環(huán)境培養(yǎng)該菌株。
[0052]15.如第12至第14實施例的方法，其中該培養(yǎng)基包含處于2%至20% (w/v)之間的碳源。
[0053]16.一種制造產生D型乳酸的基因改造細菌細胞的方法，其包含:
a)使該細菌細胞中的乳酸脫氫酶和乙酰乳酸合成酶活性的失活；
b)在有氧和/或氧氣有限的環(huán)境下，酸堿值處于3.0至6.0且含有一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細菌細胞；
c)選擇與親代菌株相比,展現(xiàn)出細胞產量增加且/或D型乳酸產量增加的細菌細胞；
d)在厭氧環(huán)境下，酸堿值處于6.5至8.0且含有一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選的細菌細胞；且
e)選擇與親代細菌細胞或步驟d)中所選的細菌細胞相比,展現(xiàn)出細胞量增加且/或D型乳酸產量增加的細菌細胞。[0054]17.如第16實施例所述的方法，其中執(zhí)行步驟b)的酸堿值條件:
a)約為4.5或5.5 ;或
b)約為5.0。
[0055]18.如第16實施例所述的方法，其中執(zhí)行步驟d)的酸堿值條件:
a)約為6.5至約為7.5 ;或
b)約為7.0。
[0056]19.如第16至第18實施例的方法，其中在含有持續(xù)增加的碳源的培養(yǎng)基中重復執(zhí)行步驟d)和步驟e)。
[0057]20.如第16至第18實施例的方法，其中在含有持續(xù)增加的碳源的培養(yǎng)基中重復執(zhí)行步驟b)和步驟C)。
[0058]21.如第16至第18實施例的方法，其中在含有持續(xù)增加的碳源的培養(yǎng)基中重復執(zhí)行步驟b)至步驟e)。
[0059]22.如第12至第21實施例的方法，其中碳源為葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纖維雙醣、半纖維素、纖維素、甘油或相關組合。
[0060]23.如第12至第15實施例的方法，其中該發(fā)酵是在酸堿值為下列數(shù)值的厭氧環(huán)境中所進行的:
a)約為6.5至約為7.5 ;或
b)約為7.0。
[0061]24.如第12至第22實施例的方法，其中該基因改造細菌細胞在發(fā)酵開始后的48小時內，每公升發(fā)酵培養(yǎng)基至少產生60克的乳酸、每公升發(fā)酵培養(yǎng)基至少產生80克的乳酸或每公升發(fā)酵培養(yǎng)基至少產生90克的乳酸。
[0062]25.如第12至第24實施例的方法，其中用來培養(yǎng)該基因改造細菌細胞的培養(yǎng)基的酸堿值，以自動加酸或加堿來維持。
[0063]26.如第16至第23實施例的方法，其中該基因改造細菌細胞剛開始時培養(yǎng)于有氧環(huán)境下，且在氧氣量逐漸減少的環(huán)境條件下，持續(xù)傳代于培養(yǎng)系統(tǒng)中，直到達成微嗜氧或厭氧條件為止。
[0064]27.如第16至第23實施例或第26實施例的方法，其中細菌細胞為芽孢桿菌屬，例如凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌或解硫胺素芽孢桿菌；其中可選擇性排除凝結芽孢桿菌Suy27-13。
[0065]28.如第I至第10實施例和第12至第27實施例中任一項的細菌細胞或方法，其中細菌細胞具有下列其中一種基因失活的組合-.1dh—pflB -Jdh+pflA -Jdh+pflA+pflB ；Idh+alsS \ldh—alsD -,Idh+alsS+alsD \ldh +pflB+alsS \ldh +pflB+alsD \ldh +pflA +alsS ;Idh +pflA +aIsD ；Idh +pflA +pflB+alsS -,Idh+pflA+pflB+alsD -,Idh+pflA+alsD+alsS ；Idh +pflB+alsD+alsS -,Idhj^pfIA +pflB+alsD+alsS ;或具有下列其中一種酶活性失活的組合:乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶；乳酸脫氫酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+乙酰乳酸合成酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶；乳酸脫氫酶+丙酮酸甲酸裂解酶活化酶+丙酮酸甲酸裂解酶+ α -乙酰乳酸脫羧酶+乙酰乳酸合成酶。
[0066]29.如第I至第11實施例或第28實施例中任一項的細菌細胞，其中細菌細胞產生D型乳酸的溫度條件處于約30°C和65°C之間；處于約37°C和約65°C之間；處于約37°C和約55°C之間；處于約45°C和約60°C之間；處于約45°C和約50°C之間；或是溫度條件為約300C ;約 37°C ;或約 55°C。
[0067]30.如第12至第28實施例中任何一項的方法，其中方法包含培養(yǎng)細菌細胞的溫度條件處于約30°C和65°C之間；處于約37°C和約65°C之間；處于約37°C和約55°C之間；處于約45°C和約60°C之間；處于約45°C和約50°C之間；或是溫度條件為約30°C ;約37°C ；或約55 °C。
[0068]微生物寄存于美國農業(yè)研究培養(yǎng)中心，地址為美國61604伊利諾伊州沛歐瑞亞市北大學街1815號(表5)。這些培養(yǎng)菌寄存在確保本專利申請未定期間能取得及使用培養(yǎng)菌的環(huán)境條件下，一直到經37 CFR 1.14和35 USC 122相關法規(guī)授權的專利商標委員會裁定出申請結果為止。若本申請副本或其分案提出專利申請的海外國家的專利法有所要求時，所寄存的培養(yǎng)菌系可取得。然而，應該明白存放培養(yǎng)菌的可取得性，并非準許毀損政府法令授予的專利權而實行本發(fā)明。
[0069]另外，主要培養(yǎng)菌的寄存將根據(jù)布達佩斯條約關于微生物寄存的條款規(guī)定，進行貯存并可為公眾所取得 。即，其將以所有必要的謹慎，在完成最近一次提供寄存物樣本的要求后，使寄存物存活且不受污染達至少五年的時間；無論如何，要求自存放當日起后至少30 (三十)年，或在任何可能公開此寄存物的專利的可實施有效期內，使寄存物存活且不受污染。若保管者在接獲要求提供寄存物，但因寄存物的狀況而無法提供樣品時，寄存者了解其有更換寄存物的責任。所有針對主要培養(yǎng)菌寄存物的公眾可得性限制，將在公開這些寄存物的專利核準后，不可撤銷地移除。
[0070]為說明本發(fā)明因此提出下列實施例。這些發(fā)明并非以任何方式局限本發(fā)明的適用范圍。微生物領域的技術人員能夠在不違反本發(fā)明精神的情況下，以數(shù)種不同實施例實現(xiàn)本發(fā)明。
[0071]本發(fā)明提及或引用的所有專利、專利申請、臨時專利申請和刊物，是參考其整體數(shù)據(jù)而合并于本文件中，包括所有圖形和圖表，其公開范圍與本說明書的詳細描述沒有不同。
[0072]以下為說明本發(fā)明實施過程的范例。不應將這些實施例解讀為限制。所有百分比都按重量計，除非另行注明，否則所有溶液混合物比例都按體積計。
[0073]實施例1 -構建產生D型乳酸且耐熱的凝結芽孢桿菌 原料與方法
菌株與質粒
現(xiàn)有技術已針對凝結芽孢桿菌野生型菌株P4-102B進行描述(27)。在構建本研究所使用的各種質粒期間，使用大腸桿菌菌株ToplO (Invitrogen公司)和枯草桿菌菌株HB1000(11)做為宿主。質粒PGK12帶有氯霉素和紅霉素耐抗基因，并在數(shù)種革蘭式陽性細菌和大腸桿菌(17，21)中進行復制。雖然本質粒具有廣泛的宿主范圍，但其復制天生受限于(42°C的溫度條件。由于質粒PGK12復制體在50°C復制的對溫度敏感的天性，因此，提供一個機會去篩選可在50°C至55°C溫度范圍生長的具有染色體DNA嵌入的凝結芽孢桿菌。質粒pGK12和其衍生物在37°C被保存于枯草芽孢桿菌菌株HBlOOO中。當轉化成凝結芽孢桿菌時，選出轉化株并保存于37°C的溫度條件下。表1列出了構建突變株所使用的質粒和凝結芽孢桿菌突變菌株。
[0074]培養(yǎng)基和生長條件
按需要使用L-broth (簡稱LB)培養(yǎng)基做為在pH 5.0或7.0條件下進行細菌培養(yǎng)的富培養(yǎng)基。分開消毒葡萄糖，并在接種前按指定濃度加入培養(yǎng)基中。在需要時，把氯霉素、紅霉素和青霉素分別按7.5暈克/升、5暈克/升和100暈克/升的濃度比例加入LB培養(yǎng)基中。如先前所述(30)，用2.5毫升的碳酸鈣瓊脂(懸浮于水中的固態(tài)碳酸鈣(1% w/v)與1.5%的瓊脂)覆蓋以葡萄糖做為營養(yǎng)補充(2% w/v)的LB-瓊脂培養(yǎng)基，制作碳酸鈣培養(yǎng)基。
[0075]在200 rpm的 振蕩器中培養(yǎng)好氧菌生長。用小型訂制發(fā)酵槽(2)或2.5公升發(fā)酵槽(新布倫斯維克科學公司Bioflo 110)進行發(fā)酵。利用自動添加2N或6N氫氧化鉀(KOH)將培養(yǎng)菌的酸堿值維持在設定值。除非另行指定，否則在發(fā)酵開始時，按需要加入固態(tài)碳酸鈣(費舍爾科技公司，匹茲堡，賓夕法尼亞)至濃度為2.0%(w/v)。在相同培養(yǎng)基中以有氧條件培養(yǎng)這些培養(yǎng)菌的接種過夜，溫度條件為50°C，并用1% (v/v)的接種開始進行發(fā)酵。定時取出樣本，以定量發(fā)酵產物和殘留糖的濃度。
[0076]構建凝結芽孢桿菌的缺失突變體
按上述方法分離凝結芽孢桿菌的缺失突變體，利用單一重組，在合適的DNA序列同源目標處，將含有目標基因兩端的質粒DNA嵌入染色體。這種具有合適的抗生素抗性的重組菌株，可以利用條件復制質粒，在限制溫度下，將完整質粒從細胞質中排除，而輕易被辨識出來(13)。接著，通過被引入的質粒DNA和合適染色體DNA進行單一同源重組，將質粒DNA和相關的抗生素抗性基因從染色體中移除，而留下缺失的目標基因。在構建凝結芽孢桿菌細h基因缺失過程中，一開始使用的是無法在凝結芽孢桿菌中進行復制的質粒載體。然而，使用該質粒無法偵測到被引入的質粒DNA的染色體嵌入。這可能是因為凝結芽孢桿菌菌株P4-102B的質粒轉化效率，低于即將嵌入染色體的質粒的可能重組頻率(29)。為了克服這些低頻率狀況，質粒PGK12被用以作為將DNA移轉至供缺失構建用的凝結芽孢桿菌的主要載體。質粒PGKl2于37°C時，在凝結芽孢桿菌中呈穩(wěn)定狀態(tài)，而非50°C。當溫度為37°C時，群體(IO9CFU/毫升)中的每個細胞中都有質粒出現(xiàn)，有助于克服質粒DNA進入該細菌的低轉化效率。具有質粒DNA的大量細胞群體，讓我們能夠在質粒DNA和染色體的同源區(qū)之間選出罕見的重組結果。在具有被嵌入染色體里的質粒DNA (包含抗生素抗性基因)的細胞群體中，質粒DNA在細胞培養(yǎng)于溫度50°C至55°C后而被排除時，這些稀有的重組體可以立即被辨識出來。
[0077]Zlldh突變菌株的分離
為構建7過缺失衍生物，使用兩組引物引物9 (BsaAI)UO (EcoRI)和11 (EcoRI)、12(StuI)(請見表2)，利用凝結芽孢細胞菌株P4-102B基因組DNA作為模板、分別放大Mh基因的5’端和3’端。這些引物在5’端處具有特殊核酸內切酶辨識序列。利用EcoRI來水解兩個被放大的片段并接合在一起。使用接合產物做為模板(引物9和12)，以產生一個無啟動子的Idh基因片段，從來自Idh基因的“ATG”中的“A”開始算431 bp處，在Idh基因中間缺少100 bp的區(qū)域。利用BsaAI和StuI水解此片段，接著和相似的經水解的質粒pGK12 (質粒pQZ44)接合。通過測序確認該質粒中的嵌入物。質粒pQZ44被轉化進入菌株P4-102B，并在溫度37°C下選出具紅霉素抗性的菌株。以50°C的溫度培養(yǎng)其中一株轉化株，并選出也是L-LDH-缺陷型(約1%)的抗紅霉素衍生物(菌株QZ3)。通過合適引物進行聚合酶連鎖反應(PCR)以放大基因組DNA并將放大產物進行測序，確定質粒DNA存在于菌株QZ3染色體中的Idh基因中。在無紅霉素的培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)期間，發(fā)現(xiàn)菌株QZ3的Idh-缺陷型特性不穩(wěn)定，并容易分離出Idh+回復突變體。因此，將菌株QZ3每天連續(xù)移入55°C且無紅霉素的新鮮培養(yǎng)基(1% v/v接種體)中，連續(xù)培養(yǎng)10天。最后的培養(yǎng)菌株被稀釋并平鋪在LB瓊脂培養(yǎng)基上。以50°C的溫度下培養(yǎng)過夜后，以影印培養(yǎng)法將菌落移往LB瓊脂、LB瓊脂+紅霉素和碳酸鈣培養(yǎng)基(用葡萄糖和CaCO3 (30)補充養(yǎng)分的LB瓊脂)。在LB瓊脂上生長、而不在LB瓊脂+紅霉素上生長、且根據(jù)碳酸鈣培養(yǎng)基透明的程度而被判斷未產乳酸的菌落，被挑選后在液態(tài)培養(yǎng)中進行進一步乳酸生產的測試。預期第二次重組會產生對紅霉素敏感但缺乏L-LDH活性的衍生物，因為其7過基因中有100 bp的缺失。在這些實驗中，的頻率為每5000個紅霉素敏感菌落出現(xiàn)I個。在這些突變體中，選出一株菌株QZ4以供進一步研究用。
[0078]運用類似方法，無法利用氯霉素抗性做為遴選標記來分離出」7過突變體。不論質粒骨架是什么，當抗氯霉素基因出現(xiàn)時，質粒DNA會對準并插入染色體中的獨特位置，而此染色體中的獨特位置與質粒中的凝結芽孢桿菌染色體DNA無關(Su和Rhee，未公開資料)。這些結果顯示，抗氯霉素基因不適合用于凝結芽孢桿菌菌株中進行突變株的構建。
[0079]Aals突變體的構建
缺乏乙酰乳酸合成酶活性的菌株QZ4突變株衍生物，并不被預期會產生凝結芽孢桿菌mdh突變株所產生的發(fā)酵產物(30)，如乙酰甲基甲醇和丁二醇。構建該雙重突變Aals)的第一步驟，是利 用引物17與21，并通過聚合酶連鎖反應(PCR)及菌株P4-102B基因的基因組DNA將(α-乙酰乳酸脫羧酶)和(乙酰乳酸合成酶)序列進行放大。將該PCR片段利用Τ4聚核苷酸磷酸酶處理后，與HincII水解后的質粒載體pUC19接合，以形成質粒PQZ45。通過合適的引物進行測序,來驗證插入質粒pQZ45中的DNA。通過聚合酶連鎖反應并使用引物18和22，從僅含Wl5lSZ?編碼區(qū)(無啟動子)的質粒pQZ45，放大含2，380 bp的DNA。把放大的DNA克隆在質粒pUC19的HincII區(qū)位內，產生質粒pQZ45_l。在AfeI和HincII進行水解后，<37^^中596 bp長的區(qū)域從質粒pQZ45_l中被移除，并在該位置處插入紅霉素抗性基因片段。這個新質粒PQZ54作為模板(引物18和22)，用來放大帶有在alsS中具有一個596 bp缺失的alsSD基因和編碼紅霉素抗性的基因的具有alsSD基因的一個片段。將聚合酶連鎖反應產物通過聚核苷酸磷酸酶磷酸化，并與利用BsaAI和AfeI水解后的質粒pGK12接合。接著通過電穿孔法將所產生的質粒pQZ64轉化進入凝結芽孢桿菌菌株QZ4，并在37°C的溫度條件下篩選出抗紅霉素的菌落。使用上述構建」7過的步驟，將ZlWsS突變引入菌株QZ4。通過該方法產生若干種在好氧和厭氧環(huán)境下具有不同生長率的突變體。選擇其中具有最高生長率的一個突變體(菌株QZ5)供進一步研究用。
[0080]大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌的轉化根據(jù)現(xiàn)有的標準技術進行大腸桿菌的轉化。按照Boylan和其它人(4)所說明的步驟加上一些變化，進行枯草桿菌菌株HBlOOO的轉化。將在LB培養(yǎng)基中處穩(wěn)定生長階段中的隔夜培養(yǎng)菌的細菌細胞，接種(10% v/v)入10毫升新鮮配制的修正感受態(tài)培養(yǎng)基(29)，置于125毫升的錐形燒瓶中，其中含有100 mM的磷酸緩沖液(pH 7.0),3 mM的三檸檬酸鈉、3mM的硫酸鎂、2%的葡萄糖、22微克/毫升的檸檬酸鐵胺、0.1%的酪蛋白水解產物和0.2%的谷胺酸鉀，并在37°C的溫度條件下加上搖動進行培養(yǎng)三小時。當0D600 nm達到約0.6時，將0.6毫升的培養(yǎng)菌移到一只13 X 100 mm的試管中，并把DNA加入細菌細胞。這個帶有DNA的細菌細胞被放置在一個旋轉裝置中，在37°C的溫度條件進行培養(yǎng)2.5小時。以離心法在室溫下收集細胞，再讓細胞懸浮于0.1毫升的LB培養(yǎng)基中，并平鋪在具有合適抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。并將瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 °C的溫度下，并在隔天選出轉化株。
[0081]為了野生型凝結芽孢桿菌P4-102B的轉化，將在50°C (OD420 ? 0.3)溫度條件下，生長于125毫升的燒瓶的10毫升的LB培養(yǎng)基中的細菌細胞，接種(10% v/v)入I公升燒瓶中的100毫升的LB培養(yǎng)基中。將細菌細胞以震蕩(200RPM)培養(yǎng)在50°C下約3至4小時，直到420 nm的吸光值達到約0.3至0.5為止。將細菌細胞以離心法(溫度4°C ；4300 xg;10分鐘)收集，并用30、25和15毫升的冰冷的SG培養(yǎng)基(0.5 M蔗糖，10%甘油)清洗三次。立即使用這些電轉感受態(tài)細胞。將75 μ I的細胞懸浮物混合0.1 μ g的質粒DNA，把混合物移到冷凍的細胞電穿孔專用管中(間隙I mm)。將電穿孔條件(Bio-Rad電穿孔機)設為1.75 KV的方波電擊5 ms。完成電穿孔后，把細菌細胞移到2毫升的預先溫熱過(37°C或500C )的RG培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基加0.5 M的蔗糖、55.6 mM的葡萄糖和20 mM的氯化鎂)中。在平板接種入選擇性抗生素培養(yǎng)基之前，將這些細菌細胞移到13 X 100 mm大的螺蓋試管里，再放入旋口試管中在溫度50°C下培養(yǎng)3小時。針對轉化溫度敏感型質粒，再生溫度為370C，并將培養(yǎng)菌培養(yǎng)隔夜。針對轉化突變體QZ4，將DNA的濃度增加成I μ g的質粒DNA，并將電穿孔條件改成1.5 KV,25 μ F和600 ohms，且時間常數(shù)為10 ms。
[0082]針對具目標表現(xiàn)型自發(fā)性突變體的生長為基礎的篩選 由于每種微生物培養(yǎng)菌都會有特定數(shù)量的自發(fā)性隨機突變，可以通過提供優(yōu)先支持特定突變體生長的生長條件，對具有目標表現(xiàn)型的突變體進行分離。由于」7過突變體菌株QZ5在pH 5.0的細菌培養(yǎng)中表現(xiàn)出厭氧生長缺陷，預期通過開辟新的發(fā)酵路徑(舉例而言，生產D型乳酸)而增加厭氧生長的突變，能具有超出其它親代全體的生長優(yōu)勢。想要達到更高的厭氧生長率，可能需要一個以上的突變(以開辟發(fā)酵路徑或者可以通過增加酶濃度以提高該路徑的新陳代謝流量等)?？梢酝ㄟ^進行一系列的培養(yǎng)轉移，直到單一細胞里的預期突變量累積足夠并顯現(xiàn)出可辨認的表現(xiàn)型時，即達成對生長率和/或產物的生產上具有增值增長效益的各種有益突變的累積。由于菌株QZ5屬于厭氧生長缺陷，因此培養(yǎng)開始時是在小型的酸堿值控制發(fā)酵槽(發(fā)酵物250毫升在500毫升容器中)中以空氣作為氣相進行培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)菌開始生長，嚴格的氧量限制會局限住生長與細菌細胞的產量。想要進一步增加細胞密度，需要依靠細胞發(fā)酵出現(xiàn)在培養(yǎng)基中的糖類的能力。想要分離可厭氧生長的QZ5菌株的突變體衍生物，需要在使用小型酸堿值控制發(fā)酵槽的指定條件下，對發(fā)酵槽培養(yǎng)菌進行傳代培養(yǎng)。將轉移的條件調整為不同時間與接種份量。平均而言，在培養(yǎng)菌適應増量糖濃度期間，在以2%的接種并生長經過兩或三天后進行轉移。
[0083]信使核糖核酸(mRNA)的定量為定量凝結芽孢桿菌中的信使核糖核酸(mRNA)，以離心法(16000 x g;30秒，室溫)收集在不同條件下生長的細菌細胞。按之前所說明的酸酚萃取法來分離核糖核酸(30)。以260 nm時的吸光值來定量核醣核酸濃度(GE公司NanoVue微型光度計)。以針對所選基因的特定引物，利用Superscript III反轉錄酶(Invitrogen公司)來制備互補脫氧核糖核酸(cDNA)復本。通過使用基因特定引物和含有聚合酶連鎖反應混合物(伯樂實驗室，?？肆λ梗永Ｄ醽?的SYBR-green來定量cDNA (mRNA)濃度。定量含有不同濃度cDNA的每一聚合酶連鎖反應的閾值循環(huán)數(shù)，并與同時反應的標準DNA模板相比較(16)。從這些結果中計算出試樣中出現(xiàn)的特定基因的mRNA濃度比例。報告的結果為至少三次實驗的平均值。RT-PCR所使用的引物列于表2中'Idh引物-引物23和引物2Α,ρ--引物-引物25和引物26，W (.El a )弓丨物-引物27和引物Hldh弓丨物-引物29和引物?>Q，als弓丨物-引物31和引物32，用來做為內部對照組的質粒-引物33和引物34。
[0084]酶分析
為判定PDH和LDH的活性，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌細胞，直到培養(yǎng)菌達到生長的對數(shù)期至后對數(shù)期。以離心法(10000 X g，10分鐘；室溫)收集細胞，用10毫升的磷酸鹽緩沖液(50 mM,pH 7.0)清洗一次，并懸浮于5.0毫升的相同磷酸鹽緩沖液中。將細菌細胞通過高壓細胞均質機(20000 PSI)以破碎細胞。該步驟之后的所有操作都在4°C下進行。將細胞萃取物以12000 X g離心30分鐘，以移除細胞碎片，并將上清液再次以100000 X g(貝克曼離心機)離心一小時，以移除大型微粒和膜泡。使用上清液進行酶分析。按現(xiàn)有技術(33)，在波長340 nm ( ε = 6220 M 1On O，以丙酮酸依賴的煙堿酰胺腺二核苷酸氧化態(tài)(MD+)的減少，作為PDH活性分析的依據(jù)。每I毫升反應混合物含磷酸鉀緩沖液(50mM ；pH 7.5)、焦磷酸硫胺素(0.4 mM)、輔酶A(0.13 mM)、六水合氯化鎂(2 mM)、二硫蘇糖醇(2.6 mM)、NAD+ (0.75 mM)和未經加工的萃取物。因加入丙酮酸(5 mM)而啟動反應。按現(xiàn)有技術(35)，在丙酮酸存在下煙堿酰胺腺二核苷酸還原態(tài)(NADH)的氧化現(xiàn)象，對LDH活性進行分析。每I毫升的反應混合物含磷酸鉀緩沖液(50 mM；pH 7.5)、煙堿酰胺腺二核苷酸還原態(tài)(NADH，0.1 mM)和未經加工的萃取物。因加入丙酮酸(25 mM)而啟動反應。通過布拉德福德法，并以牛血清白蛋白為標準品(5 )來定量蛋白質濃度。
[0085]分析法
根據(jù)現(xiàn)有技術，通過高效液相層析法(HPLC)以Aminex HPX 87H離子排除層析管柱來進行葡萄糖和發(fā)酵物的測定(32)。通過高效液相層析法并以光學異構體管柱Chirex 312(D)-青霉胺管柱(150 X 4.6 mm，5微米)(菲羅門公司)，加以2 mM的硫酸銅(CuSO4)作為洗脫液，以定量D型和L型乳酸的光學異構體。還用D型-乳酸脫氫酶的酶法來分析D型乳酸(西格瑪化學公司，圣路易斯，密蘇里)。
[0086]材料
生物化學物質來自西格瑪化學公司(圣路易斯，密蘇里)，有機與無機化學物質來自費舍爾科技公司(匹茲堡，賓夕法尼亞)。分子生物試劑和耗材來自新英格蘭生物實驗室(伊普斯維奇，馬薩諸塞)、Invitrogen或伯樂實驗室。
[0087]結果與討論
如凝結芽孢桿菌的產孢子的乳酸菌，不管其碳源(葡萄糖、木糖、纖維雙醣等)是什么，都可產生L型乳酸作為其主要發(fā)酵物(10，27，28)。其證據(jù)有:不管生長酸堿值或生長階段如何，在丙酮酸節(jié)點處編碼蛋白質的基因之間，編碼7過基因的mRNA呈現(xiàn)最高表達量(表3 )(30)。從凝結芽孢桿菌中找出編碼D型乳酸脫氫酶(7?/Μ)的基因，以活性態(tài)克隆并表達在大腸桿菌中。然而，凝結芽孢桿菌發(fā)酵液中的D型乳酸量從不超過所產乳酸總量的5%，而且大部分的發(fā)酵液確實缺少可檢測的D型乳酸(27)。細菌細胞里IdhA mRNA的量低于IdhmRNA 量的 5% (表 3)。
[0088]糖發(fā)酵期間，凝結芽孢桿菌也產生了少量的醋酸鹽、乙醇和甲酸鹽，尤其是五碳糖發(fā)酵期間，例如木糖，表示存在有具活性的丙酮酸甲酸裂解酶(27)。雖然編碼丁二醇路徑中的酶的基因出現(xiàn)在凝結芽孢桿菌的經測序的基因組里，但不管生長酸堿值如何，野生型凝結芽孢桿菌的發(fā)酵液中并沒有檢測到丁二醇。很明顯這是操縱子在野生型中表達不良的結果(表3)，或是對乳酸的通量高到足以消耗完丙酮酸。為了構建能產生D型乳酸做為主要發(fā)酵物的凝結芽孢桿菌衍生物，由L-LDH (A*)進行催化的L型乳酸主要發(fā)酵途徑需要被去除，而編碼D-LDH的IdhA表達量則需要被提升。
[0089]構建」突變體
如之前所述(30)，缺乏L-LDH活性的凝結芽孢桿菌突變體，產生醋酸鹽、乙醇、甲酸鹽和丁二醇做為發(fā)酵產物，但無D型乳酸。mdh突變體Suy27-13在7過基因中帶有單一堿基變化，并在厭氧生長期間發(fā)生回復突變，尤其是在PH 5.0環(huán)境下生長的期間。為了克服菌株Suy27-13中Idh突變的高回復突變率，因此將Idh基因刪除。
[0090]現(xiàn)有若干種可在細菌內構建基因刪除的方法，其中多數(shù)都利用帶有正向篩選基因的合適線型DNA，正向篩選基因例如被對應目標基因(7、20、24)的短DNA序列包夾的抗生素抗性基因。然而，試圖利用線型DNA在凝結芽孢桿菌構建」7過突變體并未成功?？赡苁且驗槟Y芽孢桿菌的低轉化效率，加上需要由進入的DNA去重組產生可選擇的轉化體的原因。為了克服該限制，使用已經被證明在刪除基因上有用的替代方法(13)。構建具有合適目標7過基因序列和紅霉素抗性基因的溫度敏感質粒(質粒PQZ44)。在利用電穿孔法讓凝結芽孢桿菌菌株P4-1 02B轉化后，在有助于質粒的穩(wěn)定維持的37°C條件下，選出含質粒PQZ44的轉化體。持續(xù)培養(yǎng)該含質粒的衍生物，預期可通過在7過基因處的單一重組，將質粒移動到部分群體的染色體上。在溫度50°C條件下生長的期間，因為質粒無法在此溫度點進行復制的原因，質粒會被從細胞中剔除，而在50°C時出現(xiàn)的抗紅霉素菌落，被預期會在染色體7過基因處具有質粒DNA。將這些衍生物進一步培養(yǎng)，將會導致誘使目標基因Idh刪除的DNA重新排列。該突變體其中之一的菌株QZ4，因喪失對紅霉素的抗性且缺乏作為發(fā)酵產物的乳酸而被辨識出來(表3及4)。符合先前對Idh突變體(30)的報導，甚至是在pH
5.0且使用葡萄糖的富培養(yǎng)基中，菌株QZ4的厭氧生長都非常小。
[0091 ] Aldh菌株QZ4的特性
在pH 7.0環(huán)境下進行培養(yǎng)時，Idh突變體菌株QZ4會產生乙醇作為主要發(fā)酵產物，而在pH 5.0環(huán)境下生長及發(fā)酵時，會產生丁二醇(表4;圖1)作為主要產物。PFL和PDH都在pH 7.0時提供乙酰輔酶A以利于乙醇的制造，而根據(jù)發(fā)酵液中的甲酸鹽量，計算由TOH所產生的乙醇約為80%。在支持PDH為主(PDH-based)的乙醇制造中，于生長對數(shù)期間在pH7.0發(fā)酵環(huán)境中生長的突變體，其PDH活性約高出兩倍(表2)。然而，隨著培養(yǎng)菌進入靜止期，PDH活性產生減退跡象，相反地，親代菌株在相同生長階段時的活性是增長的。在5.0環(huán)境下，無法檢測到突變體的厭氧生長，隨著氣相中的空氣而開始(限氧環(huán)境)的酸堿值控制發(fā)酵確實能讓突變體生長。然而，隨著細胞密度的增加、氧氣變得非常有限，生長因而停止，且PH 5.0發(fā)酵培養(yǎng)菌的最后細胞產量只有親代菌株培養(yǎng)菌的約1/2。與pH 7.0的發(fā)酵相t匕，在這類限氧發(fā)酵中Idh突變體制造出的乙醇的量非常少。在pH 5.0時培養(yǎng)菌的大部分產物為丁二醇(表4;圖1)。
[0092]在pH 5.0的培養(yǎng)菌中，/7/73基因的表達量相對較低，且在限氧發(fā)酵中甲酸鹽量低(表3及4 ;圖1)，這也就暗示了在酸堿值pH 5.0時，Idh突變體為表現(xiàn)型為LDH和PFL陰性。先前已報導過大腸桿菌的雙重突變體為厭氧陰性(15)，而相同特性同樣被帶到凝結芽孢桿菌上。雖然7過突變體在pH 5.0的條件下產生丁二醇做為主要發(fā)酵產物，但其無法利用這種發(fā)酵途徑在厭氧環(huán)境下生長。顯然是因為由于引入少量氧氣到PH 5.0發(fā)酵反應中，確實支持更多的丁二醇產生及相關的生長，而導致氧化還原反應不平衡的原因。甚至在pH 7.0環(huán)境下生長的期間，丁二醇也是Idh突變體的重要發(fā)酵產物，因而構建出缺乏L-LDH和ALS的雙重突變體菌株QZ5。
[0093]凝結芽孢桿菌Aals雙重突變體
菌株QZ5為」雙重突變體，在pH 5.0與7.0環(huán)境條件下好氧生長。只有在PH 7.0時，才檢測得到雙重突變體在以有氧方式開始的酸堿控制發(fā)酵環(huán)境中厭氧生長，其為雙重突變體和親代菌株QZ4共有的一個特性(圖2)。在pH 7.0發(fā)酵的主要產物為乙醇、甲酸鹽、丙酮酸和醋酸鹽。雙重突變體的PH 7.0培養(yǎng)菌發(fā)酵液中有大量的丙酮酸，表示結合TOH和PFL仍無法符合通過糖解反應把葡萄糖轉換成丙酮酸的速率。不管是單一或雙重突變物，都無法產生具可偵測量的L型乳酸。
[0094]由于雙重突變體產生大量的甲酸鹽和其它PFL活性的產物，從而構建出缺乏PFL活性的三重突變體。然而，這個缺乏L-LDH、ALS和PFL的三重突變體無法在所有測試條件下厭氧生長，而不再拿來做進一步的使用。
[0095]用以制造D型 乳酸的生長為基礎的篩選
雙重突變體所產生的少量乳酸為D型乳酸(表4)。預期增加D型乳酸的產量可支持雙重突變體的厭氧生長，就如同野生型菌株可以厭氧生長并以L型乳酸為主要發(fā)酵產物。無論培養(yǎng)菌的酸堿值如何，和野生型相比，突變體菌株確實制造出較多的A/M mRNA (表
3)。突變體在pH5.0環(huán)境下生長的期間，表現(xiàn)出非常低的PFL活性(根據(jù)甲酸鹽產量)(表
4)和/7/7沒的低表達(表3)，這也就表示培養(yǎng)菌酸堿值在PFL控制中扮演角色。勸IdhA的表達量增加和/或D-LDH的活性超過PFL的活性，為了增加pH 5.0發(fā)酵環(huán)境中的厭氧生長率和細菌細胞產量，所以執(zhí)行以生長為基礎的篩選。相對地，在具有較高PFL活性的pH
7.0環(huán)境進行類似的雙重突變體的生長為基礎的篩選，其可誘生出具有提高活性的PFL而非D-LDH的衍生物。
[0096]以厭氧生長依賴篩選選出的菌株QZ5于pH 5.0的條件下，在使用葡萄糖發(fā)酵的LB培養(yǎng)基中經過約120天后產出一種衍生物(圖3)。QZ13這個菌株在pH 5.0發(fā)酵中的細胞產量，比起始菌株QZ5要高。雖然菌株QZ13與其起始親代菌株QZ5的細胞產量和葡萄糖消耗量，在pH 7.0的發(fā)酵中大致相同，但菌株QZ13在pH 7.0發(fā)酵中的D型乳酸產量，比QZ5菌株在相同酸堿值發(fā)酵中的乳酸產量要高出約10倍(表4)。由TOH/PFL產生的發(fā)酵產物，也從菌株QZ5所消耗葡萄糖的0.85到降低至大約0.4。
[0097]由于菌株QZ13于pH 7.0發(fā)酵中增加D型乳酸的產量并伴隨減少PFL/PDH的衍生產物，因此于pH 7.0環(huán)境下，在使用葡萄糖發(fā)酵的LB培養(yǎng)基中進行進一步篩選，以求能有更好的生長和更高的細菌產量。菌株QZ14是在pH 7.0環(huán)境下連續(xù)篩選并添加養(yǎng)分約40天后衍生出來的(圖4)。菌株QZ14的乳酸產量約為被發(fā)酵葡萄糖的0.8，而PFL/PDH貢獻量也減少至約7%的葡萄糖衍生產物(表4)。菌株QZ14的發(fā)酵液依然含有可測得量的丙酮酸，暗示細胞中的D-LDH活性并不符合通過糖解作用的葡萄糖通量。下一組篩選著重于增加乳酸的效價，以分離出能將LDH活性有效耦合至葡萄糖的糖酵解通量的突變衍生物。在通過增加葡萄糖濃度進行額外60天的序列轉移和篩選后，分離出菌株QZ15 (圖5)。菌株QZ15在pH 7.0的葡萄糖發(fā)酵中的D型乳酸效價超過80克/升。菌株QZ15不斷的進化，引發(fā)葡萄糖對乳酸的通量進一步增加，在PH 7.0環(huán)境發(fā)酵48小時以內可達到約90克/升(菌株QZ19;表4;圖6)。這些具有高乳酸效價的衍生物中，并沒有檢測到甲酸鹽的存在。這些培養(yǎng)菌所產生的少量乙醇和醋酸鹽，可能是衍生于PDH產生的乙酰輔酶A (15)。
[0098]結果顯示，通過刪除Idh和alsS基因并結合根據(jù)丙酮酸節(jié)點對該物種的生理理解，以進行篩選合適的突變的厭氧生長為基礎的篩選，能夠使凝結芽孢桿菌主要發(fā)酵產物由L型乳酸改變?yōu)镈型乳酸。.Ρ?1ΑΒ基因在最后的衍生物中依然完好，但通過D-LDH增加了對D型乳酸的新陳代謝通量，實質上是通過PFL中和了到乙酰輔酶A的任何丙酮酸通量。為了找出使菌株QZ19中D-LDH活性提高的突變，已進行進一步的研究(研究結果已公開在名為“來自甘油脫氫酶的D型乳酸脫氫酶活性的進化，及其以纖維素產生D型乳酸的利用性”的論文中，王與其它人.Jroc.Natl.Acad.5bi，美國，2011，在線發(fā)表2011年11月7日；doi 10.1073/pnas.1111085108，特別在此以參考數(shù)據(jù)方式將其完整并入)。
[0099]結論
使用本發(fā)明提供的方法來刪除難以接受基因改造的凝結芽孢桿菌中的特定基因，編碼L-LDH的Idh基因被刪除掉。盡管pH 7.0對其生長無重大影響，但」7過突變體無法在pH5.0的環(huán)境下厭氧生長。PFL 、PDH和丁二醇途徑支持pH 7.0環(huán)境中的發(fā)酵生長。雖然編碼D-LDH (IdhA)的基因出現(xiàn)在染色體中，但刪除ldh、alsS取pflB剔除了突變體的厭氧生長。根據(jù)對凝結芽孢細胞在各種酸堿值生長環(huán)境下的生理機能特性以及此細菌厭氧生長過程期間丙酮酸節(jié)點處的碳流的了解，以Idh、雙重突變體開始進行的生長為基礎的篩選，產出了一個突變體，具有提高D型乳酸產量到與野生型產生的L型乳酸產量與效價相同的能力?？深A期當進一步增加乳酸生產率，可以消除發(fā)酵液中出現(xiàn)的少量副產物，如乙醇和醋酸。此為嗜熱乳酸菌的第一份報告，當中僅利用細菌的原生基因(無外來基因)，把主要發(fā)酵產物從L型乳酸更改為D型乳酸。這是根據(jù)選擇性突變以及根據(jù)細菌的生理機能作用而成的適當?shù)念~外策略。50-55°C時可產生光學純度的D型或L型乳酸的耐熱凝結芽孢桿菌菌株的可取得性，預期可通過減少會降低乳酸光學純度的潛在污染物，而有助于降低乳酸做為制造具不同熱化學特性的生物基聚乳酸塑料原料的成本。
[0100]表1本研究所使用的細菌菌株、質粒和引物。
【權利要求】
1.一種分離的基因改造細菌細胞，其特征在于，所述的細菌細胞包含: (i) L型乳酸脫氫酶基因的失活或缺失 '及 (?)乙酰乳酸合成酶基因的失活或缺失。
2.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的細菌細胞進一步包含選自丙酮酸甲酸裂解酶基因、編碼丙酮酸甲酸裂解酶活化酶基因、α -乙酰乳酸脫羧酶基因、丙酮酸脫氫酶基因及乙醇脫氫酶基因所組成的群組中的一個或多個基因的失活或缺失。
3.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的細菌細胞進一步包含將若干外源基因引入該細菌細胞的基因改造。
4.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的基因改造包含編碼乳酸脫氫酶(Α*)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/7沒)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(/7/7J)、α -乙酰乳酸脫羧酶UlsDm /或乙酰乳酸合成酶(WM)其中一個基因的突變，或是編碼乳酸脫氫酶(7過)、丙酮酸甲酸裂解酶(/7/7沒)、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(pflA)、α -乙酰乳酸脫羧酶(a7i)和/或乙酰乳酸合成酶其中一個基因的全部或部分缺失。
5.如權利要求4所述的細菌細胞，其特征在于，所述基因的突變包含引入一或多個點突變，或是在基因的開放讀碼框中引入一或多個終止密碼子。
6.如權利要求3所述的細菌細胞，其特征在于，所述的基因改造包含乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶和/或乙酰乳酸合成酶編碼序列中的點突變或缺失，和/或是將外源序列插入乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶和/或乙酰乳酸合成酶編碼區(qū)域。
7.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的細菌細胞不含外源基因或其部分。
8.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的細菌細胞通過選擇性使用對溫度敏感的質粒進行同源重組，使該細菌細胞的乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶和/或乙酰乳酸合成酶的酶活性失活。
9.如權利要求8所述的細菌細胞，其特征在于，所述的基因改造包含編碼乙酰乳酸合成酶基因的完整或部分缺失。
10.如權利要求1所述的細菌細胞，其特征在于，所述的細菌為芽孢桿菌，或是選自凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌及解硫胺素芽孢桿菌所組成群組的細菌。
11.一種如權利要求1所述的基因改造細菌細胞，其特征在于，所述的基因改造細菌細胞為 QZ4、QZ5、QZ13、QZ14、QZ15 或 QZ19。
12.—種制造D型乳酸的方法，其特征在于，所述的方法包含在含有一碳源的培養(yǎng)基中，在允許D型乳酸產生的環(huán)境條件下，培養(yǎng)一基因改造細菌細胞，其中該基因改造細菌細胞選自: a)—基因改造細菌細胞，其包含(i)L型乳酸脫氫酶基因的失活或缺失；和(ii)乙酰乳酸合成酶基因的失活或缺失；或
b)QZ4、QZ5、QZ13、QZ14、QZ15 或 QZ19。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法進一步包含分離或純化D型乳酸。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述的菌株培養(yǎng)于厭氧環(huán)境中。
15.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基包含重量百分比處于2%至20% (w/v )之間的所述碳源。
16.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的碳源為葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纖維雙醣、半纖維素、纖維素、甘油或其組合。
17.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵在厭氧環(huán)境下進行，酸堿值為: a)約5.0至約7.5 ;或 b)約7.0 ;或
c)約5.0。
18.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的基因改造細菌細胞在開始發(fā)酵后的48小時內，每公升發(fā)酵培養(yǎng)基產出至少60克乳酸。
19.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法用來培養(yǎng)該基因改造細菌細胞的所述培養(yǎng)基的酸堿值利用自動加酸或堿維持。
20.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法包含在一溫度條件下培養(yǎng)該細菌細胞，該溫度條件處于約30°C到約65°C之間；處于約37°C到約65°C之間；處于37°C到約55°C之間；處于約45°C到約60°C之間；處于約45°C到約50°C之間；或一個溫度，該溫度為約30°C ;約37°C ;或約55° C。
【文檔編號】C12N15/74GK103547671SQ201180056044
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2011年11月22日 優(yōu)先權日:2010年11月22日
【發(fā)明者】王慶昭, 基爾納升·T·尚穆根, 朗尼·歐尼爾·英格拉姆 申請人:美國佛羅里達大學研究基金會公司