H4-ii-e大鼠細(xì)胞中低巖藻糖抗體的生產(chǎn)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。其特別是涉及大鼠肝癌細(xì)胞、優(yōu)選H4-II-E大鼠肝癌細(xì)胞，該細(xì)胞帶有編碼抗體或Fc-融合蛋白的DNA且具有低巖藻糖基化活性，該活性用于將巖藻糖添加至諸如雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖(例如N-乙酰葡糖胺)等糖苷結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明另外涉及在大鼠肝癌細(xì)胞中、優(yōu)選在H4-II-E大鼠肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生低巖藻糖糖蛋白、尤其是抗體或Fc-融合蛋白的方法。其進(jìn)一步涉及新宿主細(xì)胞系的鑒別及生成，所述細(xì)胞系能夠合成具有有益性質(zhì)的糖蛋白，其產(chǎn)物相比于來(lái)自常用宿主細(xì)胞系的產(chǎn)物改善了治療效果和/或血清半衰期。
【專(zhuān)利說(shuō)明】H4-1 1-E大鼠細(xì)胞中低巖藻糖抗體的生產(chǎn)
[0001]發(fā)明背景【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。其涉及在H4-11-E大鼠肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生低巖藻糖糖蛋白、尤其是抗體及Fe-融合蛋白的方法。其涉及新宿主細(xì)胞系的鑒別及生成，所述細(xì)胞系能夠合成具有有益性質(zhì)的糖蛋白，相對(duì)于來(lái)自常用宿主細(xì)胞系的產(chǎn)物改善了治療效果和/或血清半衰期。本發(fā)明涉及這些細(xì)胞系、尤其是大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E用于表達(dá)重組蛋白的用途及優(yōu)化，及其作為高活性生物藥物治療劑的應(yīng)用。
[0003]背景
[0004]供人類(lèi)療法使用的生物藥物市場(chǎng)持續(xù)高速增長(zhǎng)，其中在臨床研究中已評(píng)估270種新生物藥物且估計(jì)2003年的銷(xiāo)售額為300億(Werner，2004)?？勺圆煌拗骷?xì)胞系統(tǒng)(包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及源自人類(lèi)的細(xì)胞系)產(chǎn)生生物藥物。當(dāng)前，由于真核細(xì)胞能夠正確加工并翻譯后修飾重組人類(lèi)蛋白，因此越來(lái)越多的生物藥物由其產(chǎn)生。因此，影響對(duì)用于制造過(guò)程的細(xì)胞系進(jìn)行選擇的關(guān)鍵問(wèn)題是，以均一翻譯后修飾模式一致地產(chǎn)生產(chǎn)物的能力(產(chǎn)生高生物活性、穩(wěn)定性及批次間一致性)。
[0005]當(dāng)前經(jīng)許可用于治療應(yīng)用的最大部分抗體為在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系中制造的。其它生產(chǎn)系統(tǒng)是鼠類(lèi)淋巴樣細(xì)胞(包括NSO及Sp2/0-Agl4)。這些親本細(xì)胞系也是在臨床試驗(yàn)中最常用于產(chǎn)生抗體者。另外，使用鼠類(lèi)及諸如人類(lèi)細(xì)胞系PER.C6等其它細(xì)胞系O
[0006]單克隆抗體的療法已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的主要焦點(diǎn)之一。盡管到目前為止已存在經(jīng)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)的有效單克隆抗體,但仍需要甚至更有效且更兼容的藥物來(lái)不僅降低制造成本，而且有助于應(yīng)用于更多患者。此外，可減少優(yōu)化治療劑的應(yīng)用劑量，由此產(chǎn)生較高耐受及較低不良效應(yīng)。
[0007]在5種哺乳動(dòng)物抗體類(lèi)別IgA、IgD、IgE、IgG及IgM中，IgG類(lèi)別主要用于治療、預(yù)防及診斷各種疾病。此歸因于其有利的功能特性(例如在血液中的長(zhǎng)半衰期)及各種效應(yīng)子功能(例如抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)及補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC))。在人類(lèi)IgG類(lèi)別中，亞類(lèi)(同種型)IgGl及IgG3具有最高ADCC及⑶C活性，但與半衰期長(zhǎng)達(dá)21天的IgGl相比，IgG3僅為7至8天。鑒于上文，若出于最優(yōu)選治療功效而需要高活性效應(yīng)子功能來(lái)去除在表面上帶有抗原的細(xì)胞，則主要使用人類(lèi)IgGl亞類(lèi)抗體。
[0008]翻譯后修飾不僅對(duì)于正確的蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、溶解性及穩(wěn)定性至關(guān)重要，而且對(duì)于分泌蛋白的生物活性及免疫原性具有重要的功能影響。在生物藥物蛋白(例如治療性抗體)中，翻譯后修飾對(duì)產(chǎn)品的治療效能、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)及免疫原性具有特定影響。
[0009]糖基化代表在天然分泌蛋白以及經(jīng)批準(zhǔn)的生物藥物中發(fā)現(xiàn)的最廣泛的翻譯后修飾。幾乎50%人類(lèi)蛋白經(jīng)糖基化。天冬酰氨(N)-及絲氨酸(O)-連接聚糖是在源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌糖蛋白上形成的兩種主要聚糖類(lèi)別。糖結(jié)構(gòu)至分泌蛋白的轉(zhuǎn)化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)及高爾基體中，且代表由眾多基因的活性調(diào)節(jié)的復(fù)雜酶促過(guò)程。糖基化途徑所涉及許多基因的缺陷會(huì)引起具有嚴(yán)重醫(yī)學(xué)后果的先天性病癥，此證實(shí)正確糖基化的重要性。
[0010]在真核生物中，N-連接聚糖以預(yù)合成寡糖形式附著至ER腔中的蛋白上，所述預(yù)合成寡糖由具分支寡糖單元(由3個(gè)葡萄糖(Glc)、9個(gè)甘露糖(Man)及2個(gè)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)構(gòu)成)組成。所述核心聚糖(Glc3Man9GlcNAc2)經(jīng)由脂質(zhì)載體(ER膜中的多萜醇-焦磷酸酯)轉(zhuǎn)移至移位于ER腔中的分泌蛋白上。將聚糖轉(zhuǎn)移至適當(dāng)序列(即Asn-X-Ser/Thr)上，其中X為初生糖蛋白中除脯氨酸外的任一氨基酸。正確折疊的糖蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體中，其中其N(xiāo)-聚糖由葡糖苷酶、甘露糖苷酶及糖基轉(zhuǎn)移酶修飾以產(chǎn)生含有唾液酸、巖藻糖及半乳糖的復(fù)合結(jié)構(gòu)。葡糖苷酶及甘露糖苷酶在N-聚糖加工的最早階段自聚糖去除葡萄糖(Glc)及甘露糖單糖(Man)。然后，N-乙?；咸前访复呋瘜-乙酰葡糖胺(GlcNAc)添加至附著至N-聚糖的保守核心結(jié)構(gòu)上的甘露糖上，此對(duì)聚糖上形成的分支或觸角結(jié)構(gòu)的數(shù)量具有決定作用。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶將巖藻糖添加至靠近蛋白的N-乙酰葡糖胺上，且半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶分別將半乳糖及唾液酸添加至N-聚糖分支的末端上。所述酶的反應(yīng)通常是不可逆的，從而生成穩(wěn)定的N-糖基化蛋白。
[0011]經(jīng)由生成核心寡糖并對(duì)其實(shí)施差式修飾且可變地添加外臂糖，蛋白糖基化可引入顯著異質(zhì)性。
[0012]已證明不正確糖基化或非糖基化抗體展示不受控制的功能。因此，選擇能夠一致地生成具有所期望翻譯后修飾模式的產(chǎn)物的適當(dāng)生產(chǎn)系統(tǒng)對(duì)于成功的藥物制造及應(yīng)用而言至關(guān)重要。糖蛋白的糖型特征及因此帶來(lái)的功能活性可根據(jù)生產(chǎn)系統(tǒng)而顯著不同。原核生產(chǎn)系統(tǒng)(例如大腸桿菌(Escherichia coli))中的生物藥物蛋白的產(chǎn)生可獲得非糖基化蛋白產(chǎn)物，其在活體外必須以經(jīng)溶解并再折疊的包涵體形式回收。相比之下，酵母表達(dá)系統(tǒng)添加高甘露糖含量的糖側(cè)鏈，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生后獲得的糖基化模式亦與特征性哺乳動(dòng)物模式顯著不同。植物可將蛋白差式糖基化，但一致地添加經(jīng)報(bào)導(dǎo)在人類(lèi)中具有免疫原性或過(guò)敏原性的α 1, 3-巖藻糖及β I, 3-木糖。
[0013]多種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞能夠進(jìn)行差式N-聚糖加工。對(duì)所產(chǎn)生糖蛋白的分析顯示異質(zhì)糖型，此根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞(production cell)所源自的組織或物種而定。因此，重要的是，確保產(chǎn)生用于臨床應(yīng)用的糖蛋白產(chǎn)物的糖基化模式在整個(gè)產(chǎn)生批次中及批次之間是均一的,且亦確保保持抗體有利的活體內(nèi)性質(zhì)。
[0014]機(jī)體內(nèi)的天然(固有)抗體以及由重組DNA技術(shù)在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗體二者皆經(jīng)由IgG-Fc區(qū)內(nèi)CH2結(jié)構(gòu)域中在進(jìn)化上保守的Asn297處共價(jià)附著寡糖來(lái)糖基化。該寡糖為IgG-Fc結(jié)構(gòu)的整體部分且系效應(yīng)子功能所絕對(duì)需要的。IgG-Fc上用于效應(yīng)子配體(例如Fcy R1、Fe Y RH、Fe Y RIII及Clq)的相互作用位點(diǎn)由蛋白質(zhì)部分構(gòu)成；然而，基本IgG-Fc蛋白構(gòu)象的生成取決于寡糖的存在及化學(xué)組成。因此，經(jīng)由效應(yīng)子配體的接合介導(dǎo)的效應(yīng)子機(jī)制(清除機(jī)制，例如吞噬作用、抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)及補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC))會(huì)因不正確糖基化或非糖基化IgG而嚴(yán)重受損或去除。
[0015]人類(lèi)？(^1?111&受體具有多態(tài)性且已顯示？(^1?111&-158￥(纈氨酸)形式與IgGl-Fc的親和力高于Fcy RIIIa-158F(苯丙氨酸)形式。經(jīng)活體外證實(shí)，IgGl抗體經(jīng)由帶有純合Fe YRIIIa-158V的細(xì)胞比純合Fe Y RIIIa_158F或雜合Fe Y RIIIa_158V/Fe Y RIIIa-158F細(xì)胞更有效地介導(dǎo)ADCC。[0016]正常多克隆人類(lèi)IgG-Fc的典型寡糖結(jié)構(gòu)系復(fù)合雙觸角結(jié)構(gòu)類(lèi)型。當(dāng)糖蛋白經(jīng)過(guò)在核心(巖藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc))(或外臂(半乳糖(Gal)及N-乙?；窠?jīng)氨酸(Neu5Ac))處具有額外糖殘基的高爾基體時(shí)，雙觸角結(jié)構(gòu)核心七糖受到可變修飾(由(Walsh 及 Jefferis, 2006)綜述)。
[0017]來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的血清IgG抗體共同具有基本雙觸角結(jié)構(gòu)Fe糖結(jié)構(gòu)，但糖鏈的周?chē)鷧^(qū)域的結(jié)構(gòu)及組成有所不同(Hamako等人，1993)。可變性最可能歸因于存在于不同物種的B-淋巴細(xì)胞中的糖基轉(zhuǎn)移酶的不同活性和/或每一 IgG對(duì)于所述轉(zhuǎn)移酶的可及性。若使用重組DNA技術(shù)來(lái)在不天然分泌IgG的宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)IgG，則糖基化模式同樣由存在于該細(xì)胞系中的糖基轉(zhuǎn)移酶或聚糖修飾酶的活性所確定。因此，在替代性生產(chǎn)細(xì)胞系中產(chǎn)生的重組蛋白的糖基化模式具有細(xì)胞型_、組織-及物種特異性且可顯著不同(Raju等人，2000)。在CH0、Y0骨髓瘤及NSO細(xì)胞中產(chǎn)生相同IgGl抗體可產(chǎn)生三種不同產(chǎn)物，其在糖基化模式及生物活性上不同(Lifely等人，1995)。因此，已充分確定，效應(yīng)子功能的活化強(qiáng)烈地取決于抗體分子的寡糖組成，且若存在某些糖基化模式，則某些效應(yīng)子功能的活化將更為有效。
[0018]采用具有修飾的糖基化模式的治療性抗體的研究表明，缺乏α 1，6-連接的核心巖藻糖可提高IgGl抗體與FcYRIIIa受體的結(jié)合親和力，且因此由天然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效果提高高達(dá)100倍。[0019]由于補(bǔ)體系統(tǒng)組份與半乳糖基化Fe-聚糖的高結(jié)合親和力，因此Fe聚糖的半乳糖基化經(jīng)提高的抗體可活化補(bǔ)體系統(tǒng)且補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)比具有低半乳糖基化或非半乳糖基化糖型的抗體更有效。
[0020]治療性抗體可具有不同的作用方法。一些抗體、抗體片段或Fe-融合蛋白經(jīng)設(shè)計(jì)以在活體內(nèi)中和生物分子(例如細(xì)胞因子)。相比之下，癌癥療法中的重組抗體經(jīng)常識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的蛋白，且其功效明確地依賴(lài)于敏化效應(yīng)子細(xì)胞以供隨后通過(guò)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)機(jī)制實(shí)施殺傷。然而，對(duì)于其它基于抗體的療法而言，活化炎性級(jí)聯(lián)可能有害，其會(huì)產(chǎn)生不期望的副作用。
[0021]因此，常用的生產(chǎn)細(xì)胞系(例如CH0、NS0及SP2/0)中產(chǎn)生的抗體不顯示最佳的Fe糖基化模式，這是一種挑戰(zhàn)。
[0022]CHO、NSO或人類(lèi)細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗體顯示主要(約95%)由雙觸角結(jié)構(gòu)核心七糖結(jié)構(gòu)構(gòu)成的Fe糖基化特征,該雙觸角結(jié)構(gòu)核心七糖結(jié)構(gòu)在中心GlcNAc處帶有α 1，6連接
巖藻糖殘基。
[0023]已充分確定，在Fe聚糖中的雙觸角結(jié)構(gòu)碳水化合物核心結(jié)構(gòu)內(nèi)存在α I, 6_連接的巖藻糖會(huì)顯著損害抗體活化效應(yīng)子功能(例如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC))的潛力。已證實(shí)另一效應(yīng)子功能(補(bǔ)體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC))具有半乳糖基化依賴(lài)性，其中較高半乳糖含量可使CDC活性增強(qiáng)。因此，具有巖藻糖基化聚糖及低度半乳糖的單克隆抗體在治療實(shí)體腫瘤或非實(shí)體腫瘤上尤其有效，這是因?yàn)榭贵w療法的治療效果在此情形下主要取決于抗體在募集并活化腫瘤攻擊免疫細(xì)胞、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)或ADCC或CDC活化上的效能。因此，CHO中產(chǎn)生的抗體在癌癥療法上的益處有限，且為了克服其低活性，必須以高劑量給予患者。相比之下，具有經(jīng)改變的糖基化模式(例如，缺乏α 1，6_連接的核心巖藻糖)的抗體應(yīng)具有顯著增強(qiáng)的治療效果。[0024]盡管存在以下事實(shí):多數(shù)經(jīng)許可治療的抗體在CH0、NS0或Sp2/0細(xì)胞中產(chǎn)生，但已知在非最佳條件下，所述細(xì)胞可產(chǎn)生許多缺乏效能或潛在免疫原性的異常糖基化產(chǎn)物。除不正確加工寡糖外，亦已知鼠類(lèi)細(xì)胞添加通常不會(huì)在人類(lèi)IgG上發(fā)現(xiàn)的糖殘基。此結(jié)構(gòu)(例如Gal-1, 3-Gal及N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc))可觸發(fā)免疫原性或過(guò)敏性反應(yīng)，其對(duì)于擬活體內(nèi)遞送至人類(lèi)患者的治療劑而言是不可接受的。
[0025]迄今為止，獲得能夠產(chǎn)生具有有利糖基化模式的蛋白的細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)方法集中于對(duì)編碼糖基化機(jī)器的酶的基因的遺傳操作，從而以人工方式改變現(xiàn)有產(chǎn)生宿主細(xì)胞系中糖基化途徑的性質(zhì)(遺傳失活或失調(diào))。由此方法產(chǎn)生的抗體可顯示某些糖結(jié)構(gòu)或連接的含量降低或完全缺乏。這些經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞系可經(jīng)篩選以獲得能夠合成某些期望糖基化模式的突變體。
[0026]編碼糖基轉(zhuǎn)移酶GntIII的基因在CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞能夠生成具有經(jīng)改變的糖基化模式的抗體產(chǎn)物及具有減少巖藻糖基化的最終產(chǎn)物，從而在活化ADCC上比具有未修飾聚糖的抗體強(qiáng)20至100倍(Umana等人，1999)。然而，應(yīng)考慮，這些經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞系需要主動(dòng)選擇來(lái)穩(wěn)定遺傳改變的效應(yīng)，此外，遺傳改造可具有不期望的副作用，此會(huì)增加工業(yè)產(chǎn)生過(guò)程的調(diào)節(jié)負(fù)擔(dān)。
[0027]耐凝集素CHO突變細(xì)胞系Lecl3 (Ripka等人，1986)因遺傳缺陷而缺乏將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖的酶。若細(xì)胞不能代謝來(lái)自替代(例如外部)來(lái)源的巖藻糖，則可使用所述細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生巖藻糖基化降低且ADCC活性提高的產(chǎn)物(Shields等人，2002)。然而，在用小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin) (LCA)連續(xù)選擇后僅維持Lecl3細(xì)胞在其基因組中含有的突變。然而，就調(diào)節(jié)角度而言，在大規(guī)模產(chǎn)生過(guò)程中添加凝集素或其它選擇物質(zhì)系是常令人懷疑的。此外，已知Lecl3細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量較低，且?guī)r藻糖含量?jī)H部分降低，但高度可變(Kanda等人,2006 ；Shields等人,2002)。
[0028]發(fā)明概述
`[0029]本發(fā)明令人驚奇地證實(shí)大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E是高活性生物藥物糖蛋白(例如抗體、尤其是性治療性抗體及Fe-融合蛋白)的具有改良糖基化性質(zhì)的極佳生產(chǎn)細(xì)胞系。
[0030]本發(fā)明還闡述對(duì)所選代表各種物種、組織、細(xì)胞類(lèi)型及分化/腫瘤發(fā)生階段的非改造細(xì)胞作為宿主細(xì)胞系的適用性的分析，所述宿主細(xì)胞系用于產(chǎn)生具有有利糖基化模式及因此增進(jìn)效應(yīng)子功能的生物藥物。
[0031]令人驚奇地，大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E是若干大鼠和/或肝源性細(xì)胞系中唯一組合眾多用于治療糖蛋白的增進(jìn)功效的有利糖性質(zhì)的細(xì)胞系。
[0032]本發(fā)明還首次闡述，H4-11-E大鼠肝癌細(xì)胞系可用作產(chǎn)生重組糖蛋白(例如抗體或Fe-融合蛋白)的宿主細(xì)胞系。本發(fā)明證實(shí)，H4-11-E大鼠肝癌細(xì)胞可經(jīng)編碼抗體或Fe-融合蛋白的輕鏈及重鏈的遺傳組件穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且所得產(chǎn)生細(xì)胞將高活性功能抗體分子分泌至細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中，自該上清液可對(duì)其實(shí)施純化。H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的重組抗體因細(xì)胞糖基化能力而在質(zhì)量及活性上優(yōu)于以常規(guī)方式產(chǎn)生的治療性抗體。
[0033]本發(fā)明的H4-11-E細(xì)胞系已于2011年6月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapesttreaty)以保藏號(hào)DSM ACC3129 (H4-11-E)保藏于德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse7B，D-38124Braunschweig, Germany。[0034]H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體、尤其是IgGl抗體的糖模式顯示復(fù)合雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖，其主要不含巖藻糖且同時(shí)半乳糖基化高于通常于CHO中產(chǎn)生的抗體。從而，H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的生物治療性抗體具有劇烈地且有效地活化抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(例如ADCC及OTC)的高潛力。
[0035]本發(fā)明還闡述，H4-11-E大鼠肝癌細(xì)胞系可在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，此在所述細(xì)胞系用作生物治療劑的生產(chǎn)細(xì)胞系時(shí)是強(qiáng)制性的。令人驚奇地，在使H4-11-E細(xì)胞適應(yīng)于在無(wú)動(dòng)物組份且無(wú)鈣離子的化學(xué)限定培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)后，與含血清培養(yǎng)基中H4-11-E細(xì)胞呈貼壁細(xì)胞層的常用培養(yǎng)模式相比，生長(zhǎng)、活力及加倍時(shí)間未受影響。在含血清貼壁培養(yǎng)物中以及在適應(yīng)于無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物組份且無(wú)鈣離子的培養(yǎng)基后，在適應(yīng)階段期間，H4-11-E細(xì)胞培養(yǎng)物的加倍時(shí)間在24小時(shí)至32小時(shí)的范圍內(nèi)或在32小時(shí)至60小時(shí)的范圍內(nèi)。群加倍時(shí)間為24小時(shí)至32小時(shí)的H4-11-E細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵方面是使用無(wú)鈣培養(yǎng)基。與此相比，在化學(xué)限定培養(yǎng)基中無(wú)血清培育H4-11-E細(xì)胞先前已闡述于文獻(xiàn)中，但群加倍時(shí)間為68.5小時(shí)(Miyazaki等人，1991)或4天(Niwa等人，1980),此過(guò)慢而不能滿足對(duì)生物藥物的生產(chǎn)細(xì)胞系的需求。
[0036]適應(yīng)于在闡述于本發(fā)明中的無(wú)血清無(wú)Ca2+培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞系已于2011年6月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM ACC3130 (H4-1I_Es)保藏于德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0037]本發(fā)明首次闡述對(duì)源自不同物種及組織的細(xì)胞系的選擇，所述細(xì)胞系經(jīng)分析與其用于產(chǎn)生具有有利糖基化模式(降低的巖藻糖基化、存在末端NeuAc-殘基)的重組蛋白的適宜性有關(guān)。分析顯示，僅大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E能夠產(chǎn)生若干有益糖基化模式，此可顯著增進(jìn)治療蛋白、尤其是糖蛋白(例如抗體)的活性、功效及穩(wěn)定性。
[0038]H4-11-E細(xì)胞最初源自大鼠肝細(xì)胞癌(REUBER，1961)且作為適應(yīng)肝的活體內(nèi)模型來(lái)分析。與此相比，本發(fā)明首次闡述H4-11-E細(xì)胞作為高活性治療蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)的用途。源自大鼠肝的H4-11-E細(xì)胞不會(huì)天然產(chǎn)生抗體，且H4-11-E細(xì)胞先前尚未用于重組蛋白產(chǎn)生。H4-11-E細(xì)胞源自大鼠肝細(xì)胞癌(ΡΙΤ0Τ等人，1964 ;REUBER，1961)且專(zhuān)門(mén)用于毒性學(xué)分析且用作模型系統(tǒng)來(lái)研究細(xì)胞壓力(stress)反應(yīng)(例如(Horikoshi等人，1988 ；Houser等人，1992)) ο
[0039]極令人驚奇地，特別是大鼠細(xì)胞且尤其是H4-11-E細(xì)胞產(chǎn)生具有低巖藻糖含量的糖蛋白或糖基化。與其它物種(例如兔或貓)相比，來(lái)自正常大鼠血液血清的抗體為顯著巖藻糖基化的(Raju等人,2000)。Hamako及同事分析了來(lái)自不同物種的血清IgG抗體的糖組成且發(fā)現(xiàn)來(lái)自大鼠血液血清的內(nèi)源性抗體的92.8%是巖藻糖基化的，此比例高于多數(shù)其它物種的血清IgG (Hamako等人，1993)。
[0040]因此，預(yù)計(jì)大鼠H4-11-E細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有高巖藻糖含量而非低巖藻糖含量的糖蛋白或糖基化。
[0041]但意想不到的是，大鼠肝癌細(xì)胞H4-11-E細(xì)胞的情形正好相反。本發(fā)明顯示，源自大鼠肝的H4-11-E細(xì)胞系(例如以保藏號(hào)DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ的細(xì)胞及以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ的細(xì)胞)可通過(guò)其在產(chǎn)生巖藻糖含量顯著低于任一其它細(xì)胞系的抗體的能力上令人驚奇地與源自不同物種的許多其它細(xì)胞系區(qū)別開(kāi)來(lái)。
[0042]Shinkawa及同事闡述大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0用于抗體產(chǎn)生的用途(Shinkawa等人，2003)。YB2/0細(xì)胞是天然生成巖藻糖基化降低34-91%的Fe糖結(jié)構(gòu)、從而在ADCC分析中產(chǎn)生提高最多50倍的活性的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。因此，YB2/0細(xì)胞與H4-11-E細(xì)胞(已知的產(chǎn)生者細(xì)胞)不同。然而，作為骨髓瘤細(xì)胞系，YB2/0細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡相當(dāng)敏感，且對(duì)細(xì)胞壓力顯示低穩(wěn)健性，從而使得此細(xì)胞系不適于工業(yè)產(chǎn)生過(guò)程。如所報(bào)導(dǎo)，YB2/0細(xì)胞中的巖藻糖基化更為高度可變，從而使得難以將巖藻糖基化控制并維持在某些閾值內(nèi)。相比之下，闡述于本發(fā)明中的H4-11-E細(xì)胞令人驚奇地顯示，去巖藻糖基化程度及一致性高于針對(duì)YB2/0細(xì)胞所報(bào)導(dǎo)的。此外，H4-11-E細(xì)胞是穩(wěn)健的且對(duì)壓力或其它細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)刺激物不敏感，如通常使用H4-11-E細(xì)胞作為模型系統(tǒng)的許多毒性研究中所顯示。直接比較H4-11-E細(xì)胞及YB2/0細(xì)胞對(duì)不同細(xì)胞壓力(滲透壓力、溫度壓力、機(jī)械壓力、化學(xué)壓力)的敏感性顯示，H4-11-E細(xì)胞在各方面皆優(yōu)于YB2/0細(xì)胞。因此H4-11-E細(xì)胞比YB2/0細(xì)胞意想不到地更適于用作工業(yè)產(chǎn)生過(guò)程的宿主細(xì)胞系。
[0043]用于獲得具有非巖藻糖基化糖結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的另一先前方法是使CHO中編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8(Fut8)的基因靶向失活，此可導(dǎo)致分泌蛋白(例如抗體產(chǎn)物)的聚糖中完全損失α 1,6-巖藻糖基化(Yamane-Ohnuki等人,2004)。應(yīng)用siRNA敲弱(knockdown)技術(shù)來(lái)削弱Fut8基因活性的替代性方法允許產(chǎn)生部分去巖藻糖基化抗體(Mori等人，2004)。這些抗體顯示強(qiáng)50至100倍的ADCC活化。然而，所述與使用H4-11-E細(xì)胞作為產(chǎn)生細(xì)胞不同的策略的缺陷在于，對(duì)現(xiàn)有宿主細(xì)胞系實(shí)施遺傳改造一定會(huì)比僅僅對(duì)所關(guān)注分泌蛋白實(shí)施糖基化影響更多細(xì)胞過(guò)程。除期望的突變效應(yīng)外，與H4-11-E細(xì)胞不同的經(jīng)遺傳改造的宿主細(xì)胞系亦可顯示一些變化，例如在(例如)產(chǎn)生過(guò)程發(fā)展之后期階段出現(xiàn)的產(chǎn)量降低或不穩(wěn)定性或不可預(yù)測(cè)的問(wèn)題。此外，經(jīng)遺傳改造的細(xì)胞系經(jīng)常需要主動(dòng)選擇以穩(wěn)定遺傳改變的效應(yīng)，從而增加工業(yè)產(chǎn)生過(guò)程的調(diào)節(jié)負(fù)擔(dān)。
[0044]除顯示降低的巖藻糖基化外，H4-11-E細(xì)胞亦顯示在FutS缺乏的CHO細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)的其他有益性質(zhì)，例如半乳糖基化及唾液酸化增加。
[0045]優(yōu)點(diǎn)
[0046]本領(lǐng)域認(rèn)為候選細(xì)胞系的以下性質(zhì)相對(duì)于現(xiàn)有的生產(chǎn)細(xì)胞系而言是有利的:
[0047]細(xì)胞系應(yīng)為未經(jīng)遺傳改造的天然(幼稚)宿主細(xì)胞系。
[0048]細(xì)胞系應(yīng)能夠產(chǎn)生具有有利糖基化模式的蛋白。
[0049]細(xì)胞系應(yīng)穩(wěn)定顯示期望糖模式而無(wú)需選擇(例如凝集素抗性)。
[0050]這些細(xì)胞系可在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。
[0051]這些細(xì)胞系的特征在于對(duì)壓力或細(xì)胞凋亡刺激物的高穩(wěn)健性及低敏感性。
[0052]闡述于本發(fā)明中的大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E組合多數(shù)所述有利屬性。
[0053]與用于獲得巖藻糖基化經(jīng)降低的抗體的先前方法(其主要基于對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)細(xì)胞系的遺傳改造)不同，H4-11-E細(xì)胞天然地(即，無(wú)遺傳操作、誘變或選擇)適合用于產(chǎn)生具有有利糖基化模式的重組蛋白及其治療應(yīng)用。[0054]與當(dāng)前使用的產(chǎn)生宿主細(xì)胞系中制造的蛋白不同，H4-11-E中產(chǎn)生的抗體顯示不同有益糖基化性質(zhì)的組合，從而顯著增進(jìn)產(chǎn)生質(zhì)量:
[0055]-低巖藻糖基化或缺乏巖藻糖:>80%非巖藻糖基化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖
[0056]—提高活化效應(yīng)子功能(例如ADCC)的潛力
[0057]-高半乳糖基化:>40%半乳糖基化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖[0058]—提高活化效應(yīng)子功能(例如CDC)的潛力
[0059]H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體從而具有活化抗體依賴(lài)性效應(yīng)子功能(例如ADCC及CDC)的高潛力。此活化與抗體與不同F(xiàn)e受體的結(jié)合相關(guān)聯(lián)。除對(duì)FcgRIIIa的較高活化外，H4-11-E中產(chǎn)生的抗體亦具有較低程度地活化抑制性受體Fe Y RIIb的潛力。此有益效應(yīng)使H4-11-E中產(chǎn)生的抗體能夠增強(qiáng)由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這是因尤其中性粒細(xì)胞亦表達(dá)抑制受體。因此，H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的治療性抗體尤其對(duì)腫瘤靶標(biāo)且亦對(duì)其他適應(yīng)癥在其治療效率上優(yōu)于以常規(guī)方式產(chǎn)生的抗體。
[0060]-不存在免疫原性殘基:缺乏Gal-α I, 3-Gal-連接及NeuGc-殘基
[0061]—無(wú)過(guò)敏或免疫原性反應(yīng)
[0062]缺乏潛在免疫原性糖結(jié)構(gòu)(例如Gal- α I, 3-Gal-連接糖或NeuGc-殘基)是H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的糖蛋白(例如抗體或Fe-融合蛋白)的另一優(yōu)點(diǎn)?？稍谛∈蠊撬枇黾?xì)胞系NSO或SP2/0中產(chǎn)生的抗體中發(fā)現(xiàn) 這些結(jié)構(gòu)，若將其施加于敏感患者，可誘導(dǎo)不期望的炎性反應(yīng)或免疫原性排斥。
[0063]-唾液酸化:末端α2，3或α 2，6_連接的NeuAc-殘基
[0064]—提高的血清穩(wěn)定性(血清半衰期)
[0065]Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞中所產(chǎn)生抗體的聚糖的末端唾液酸化對(duì)治療性抗體的血清穩(wěn)定性及分解代謝半衰期具有額外積極效應(yīng)。
[0066]Η4-ΙΙ-Ε大鼠肝癌未經(jīng)遺傳改造且無(wú)需在凝集素存在下進(jìn)行選擇或培養(yǎng)以維持其產(chǎn)生有益糖基化模式的能力的細(xì)胞。
[0067]此外，Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞系可在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。即使Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞(例如以保藏號(hào)DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ的細(xì)胞)通常使用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)(其亦由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC,保藏編號(hào) CRL-1548)或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)(ECACC，保藏編號(hào)87031301)所推薦)，亦可在本發(fā)明中證實(shí)，與在含血清培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)物的生長(zhǎng)相比，H4-11-E細(xì)胞可成功地適應(yīng)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)而不會(huì)損害24至32小時(shí)的群加倍時(shí)間(例如以保藏號(hào)DSM ACC3130 (H4-11-E)保藏于DSMZ的細(xì)胞)。
[0068]H4-11-E細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的加倍時(shí)間是24至32小時(shí)。達(dá)成Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮恒定生長(zhǎng)及這些有利加倍時(shí)間的關(guān)鍵因素是在培養(yǎng)基中去掉鈣。若在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在鈣，則Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞不會(huì)懸浮生長(zhǎng)且加倍時(shí)間更長(zhǎng)，此使得按照商業(yè)規(guī)模應(yīng)用于生物藥物生產(chǎn)不具吸引力。
[0069]Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞在生物藥物生產(chǎn)過(guò)程中用作宿主細(xì)胞的另一優(yōu)點(diǎn)為其高穩(wěn)健性及低壓力敏感性或低細(xì)胞凋亡敏感性。其它生產(chǎn)細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系ΥΒ2/0)亦顯示出有益糖模式，但同時(shí)對(duì)任一種類(lèi)的壓力皆極敏感且因此不適于在大規(guī)模產(chǎn)生過(guò)程中培養(yǎng)。
[0070]除先前提及的優(yōu)點(diǎn)外，Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞中產(chǎn)生的治療性蛋白亦具有以下額外有益性質(zhì):
[0071]較高有效性及穩(wěn)定性=降低的所需劑量
[0072]提聞的患者便利性(減小的治療(輸注)頻率)
[0073]經(jīng)由降低的循環(huán)劑量所達(dá)成降低的副作用風(fēng)險(xiǎn)
[0074]用于供應(yīng)臨床及市售材料的縮短的時(shí)間線及降低的成本[0075]—總之:降低的治療成本。
[0076]適用性
[0077]H4-11-E大鼠細(xì)胞可用于工業(yè)生產(chǎn)在治療上具有高活性的蛋白、優(yōu)選抗體或Fe-融合蛋白，從而在給予患者后可有效活化效應(yīng)子功能。
[0078]具有顯著降低的核心巖藻糖含量，H4-11-E產(chǎn)生的抗體或Fe-融合蛋白對(duì)多態(tài)性受體Fe Y RIII (CD16-F158，CD16-V158)顯示較高的親和力且較低程度地活化抑制受體Fe YRIIb。從而，與巖藻糖基化CHO產(chǎn)生的抗體不同，H4-11-E產(chǎn)生的抗體不僅可快速且有效地募集并活化CD16陽(yáng)性細(xì)胞，而且亦可募集并活化巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞以活化免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性功能。顯示半乳糖基化高于以常規(guī)方式產(chǎn)生的抗體，H4-11-E細(xì)胞中修飾并分泌的產(chǎn)物可另外更有效地結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的組份(即Clq)且從而活化可最終殺傷靶細(xì)胞的另一級(jí)聯(lián)。
[0079]出于多種原因(參見(jiàn)上述優(yōu)點(diǎn))，H4-11-E細(xì)胞是所選用于產(chǎn)生抗體或Fe-融合蛋白、尤其是那些識(shí)別腫瘤靶標(biāo)者的細(xì)胞系。通過(guò)H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體或Fe-融合蛋白對(duì)效應(yīng)子功能ADCC及CDC實(shí)施的增進(jìn)活化，亦使得在抗體治療后對(duì)不受患者免疫系統(tǒng)有效攻擊的實(shí)體腫瘤實(shí)施有效治療。
[0080]H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體的經(jīng)增進(jìn)血清穩(wěn)定性在許多治療領(lǐng)域、尤其是在當(dāng)前必須將治療物質(zhì)頻繁地且重復(fù)地遞送至患者的慢性疾病中有益。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0081]圖1:不同細(xì) 胞系中所產(chǎn)生糖蛋白上糖結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)性相對(duì)含量。
[0082]分析源自不同物種及所述物種內(nèi)不同組織的已建立細(xì)胞系的糖性質(zhì)。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞中的酶促活性及分析細(xì)胞表面上的結(jié)構(gòu)來(lái)估計(jì)所述細(xì)胞系中所產(chǎn)生蛋白上巖藻糖、α -2，6唾液酸化結(jié)構(gòu)、N-乙?；窠?jīng)氨酸(NeuAc)、半乳糖-1, 3_半乳糖(Gal_l, 3-Gal)及N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的相對(duì)含量。將所獲得值標(biāo)準(zhǔn)化為在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)中獲得的結(jié)果且繪制為各別糖結(jié)構(gòu)的經(jīng)預(yù)測(cè)相對(duì)含量的曲線。
[0083]縮寫(xiě):ha,倉(cāng)鼠；mo,小鼠；gp,豚鼠；rab,兔；go,山羊；sh,綿羊；hu,人類(lèi)；ch,雞；du,鴨；te,睪丸；ov,卵巢；pa,胰腺；ki,腎；Ii,肝；carc,肝癌/瘤；eo,食管；Iu,肺；br.canc,乳癌；c0.carc,結(jié)腸癌；my,骨髓瘤；pr.1y,初代淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞；pr.b.m,骨髓干細(xì)胞；emb.fib,胚胎纖維母細(xì)胞。
[0084]圖2:CH0、Lecl3、YB2/0及Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞中產(chǎn)生的IgGl抗體在其糖基化模式的不
同:巖藻糖基化。
[0085]分析CH0-DG44細(xì)胞、CHO-Lec13突變體、ΥΒ2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌細(xì)胞中所產(chǎn)生IgGl抗體的Fe聚糖的結(jié)構(gòu)及組成。在通過(guò)用PNGase F實(shí)施酶促消化還原后自純化抗體釋放聚糖。將聚糖純化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)進(jìn)行熒光標(biāo)記且在用外切糖苷酶α -巖藻糖苷酶或其它外切糖苷酶處理之前及之后，在HPLC柱上進(jìn)行分級(jí)分離。大多數(shù)糖結(jié)構(gòu)是非唾液酸化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖。自外切糖苷消化之前及之后的色譜峰面積比來(lái)計(jì)算巖藻糖基化及非巖藻糖基化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖及其它糖苷結(jié)構(gòu)(唾液酸化聚糖、高甘露糖結(jié)構(gòu)或雜合聚糖)的比例。
[0086]圖3 =CHO及Η4-ΙΙ-Ε中所產(chǎn)生IgGl抗體的糖模式:半乳糖基化[0087]分析CH0-DG44細(xì)胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌細(xì)胞中所產(chǎn)生IgGl抗體的Fe聚糖的結(jié)構(gòu)及組成。在通過(guò)用PNGase F實(shí)施酶促消化還原后自純化抗體釋放聚糖。將聚糖純化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)進(jìn)行熒光標(biāo)記且在用外切糖苷酶半乳糖苷酶或其它外切糖苷酶處理之前及之后，在HPLC柱上進(jìn)行分級(jí)分離。自外切糖苷消化之前及之后的色譜峰面積比率來(lái)計(jì)算半乳糖基化對(duì)非半乳糖基化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖的百分比。
[0088]圖4 =CHO及Η4-ΙΙ-Ε中產(chǎn)生的IgGl抗體的糖模式:唾液酸化
[0089]分析CH0-DG44細(xì)胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌細(xì)胞中所產(chǎn)生IgGl抗體的Fe聚糖的結(jié)構(gòu)及組成。在通過(guò)用PNGase F實(shí)施酶促消化還原后自純化抗體釋放聚糖。將聚糖純化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)進(jìn)行熒光標(biāo)記且在用外切糖苷酶神經(jīng)氨酸酶或其它外切糖苷酶處理之前及之后，在HPLC柱上進(jìn)行分級(jí)分離。自外切糖苷消化之前及之后的色譜峰面積比率來(lái)計(jì)算唾液酸化雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖的百分比。
[0090]圖5:使Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞適應(yīng)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)
[0091](Α)Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞在含有10%FcS的MEMalpha培養(yǎng)基中的貼壁生長(zhǎng)。(B)H4-1I_E細(xì)胞在適應(yīng)于振蕩燒瓶中的無(wú)血清無(wú)Ca培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后的懸浮培養(yǎng)物。(C)以兩種不同接種物細(xì)胞密度接種的BI SFM培養(yǎng)基中的H4-11-E培養(yǎng)物的生長(zhǎng)曲線。在37° (:、5%0)2及120rpm下在振蕩燒瓶中培育培養(yǎng)物。在所示時(shí)間點(diǎn)測(cè)量活細(xì)胞濃度。
[0092]縮寫(xiě):BI_SFM, Boehringer Ingelheim無(wú)血清無(wú)鈣培養(yǎng)基；FcS,胎牛血清；VCC,活細(xì)胞濃度；4*105個(gè)細(xì)胞/ml=400，000個(gè)細(xì)胞/ml ;6*105個(gè)細(xì)胞/ml=600，000個(gè)細(xì)胞/ml。
[0093]圖6:H4-11-E細(xì)胞 對(duì)細(xì)胞凋亡的低敏感性及對(duì)細(xì)胞壓力的高穩(wěn)健性
[0094](A)在將含有等細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮物加熱至42° C并維持2小時(shí)且隨后在37° C、5%C02下培育22小時(shí)后，H4-11-E細(xì)胞(黑色條形圖)及YB2/0細(xì)胞(灰色條形圖)的相對(duì)活細(xì)胞密度及活力。將對(duì)照細(xì)胞在37° C、5%C02下培養(yǎng)24小時(shí)。在熱壓力后，H4-11-E細(xì)胞顯示顯著較高的活細(xì)胞密度及活力。(B)在37° (:、5%0)2下在用去礦質(zhì)水(低離子強(qiáng)度)或10XPBS(高離子強(qiáng)度)稀釋的培養(yǎng)基中培育24小時(shí)后，H4-11-E細(xì)胞及YB2/0細(xì)胞的相對(duì)活細(xì)胞密度及活力。在未稀釋培養(yǎng)基中培養(yǎng)對(duì)照細(xì)胞。在低或高滲透性下培育后，H4-11-E細(xì)胞顯示顯著較高的活細(xì)胞密度及活力。(C)在37° C、5%C02下用2μ g/ml或5 μ g/ml嘌呤霉素將含有等細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮物處理48小時(shí)后，H4-11-E細(xì)胞及YB2/0細(xì)胞的相對(duì)活細(xì)胞密度及活力。在37° C、5%C02下在無(wú)嘌呤霉素培養(yǎng)基中將對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。在藥物處理后H4-11-E細(xì)胞顯示顯著較高的活細(xì)胞密度及活力。
[0095]圖7:單細(xì)胞懸浮培育H4-11-E細(xì)胞對(duì)Ca2+減少或無(wú)Ca2+培養(yǎng)基的需要。
[0096](A)使用Hitachi917 (Roche)來(lái)分析兩種適于懸浮培育Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞的培養(yǎng)基的Ca含量。含有極低Ca濃度的AEM培養(yǎng)基及BI專(zhuān)利培養(yǎng)基的無(wú)Ca形式，二者皆適于單細(xì)胞懸浮培育Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞(B、D)。(B)-(E)以3*105個(gè)細(xì)胞/ml=300，000個(gè)細(xì)胞/ml的密度將適應(yīng)于在AEM中或在BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞接種于存于12孔板中的添加或不添加CaCl2的所示培養(yǎng)基中。接種后3天對(duì)生長(zhǎng)形態(tài)及細(xì)胞聚集進(jìn)行顯微分析。(B)H4-11-E細(xì)胞在AEM培養(yǎng)基中以單細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)。(C)H4-1I_E細(xì)胞在補(bǔ)充有l(wèi)mM=lmMol/L CaCl2的AEM中形成大聚集體。(D)H4-1I_E細(xì)胞在無(wú)Ca BI專(zhuān)利培養(yǎng)基中以單細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)。(E)H4-11-E細(xì)胞在BI培養(yǎng)基(根據(jù)(A)中的分析，含有1.38mM=l.38mMol/L Ca)中形成大聚集體。(F)以3*105個(gè)細(xì)胞/ml=300，000個(gè)細(xì)胞/ml的密度將適應(yīng)于在BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞接種于存于12孔板中的BI培養(yǎng)基(含有Ca)中并將所示量的EDTA添加至培養(yǎng)物中。接種后3天對(duì)生長(zhǎng)形態(tài)及細(xì)胞聚集進(jìn)行顯微分析。應(yīng)注意，培養(yǎng)基中游離Ca2+的劑量依賴(lài)性、EDTA介導(dǎo)的消耗可減少細(xì)胞聚集并提高懸浮單細(xì)胞的比例。
[0097]圖8:經(jīng)懸浮H4-11-E細(xì)胞的Ca2+濃度依賴(lài)性及Mg2+非依賴(lài)性聚集。
[0098](A)以4*105個(gè)細(xì)胞/ml=400，000個(gè)細(xì)胞/ml的密度將適應(yīng)于在BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞接種于存于12孔板中的BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中并將所示量的CaCl2添加至培養(yǎng)物中。接種后2天對(duì)生長(zhǎng)形態(tài)及細(xì)胞聚集進(jìn)行顯微分析。注意經(jīng)懸浮H4-11-E細(xì)胞的濃度依賴(lài)性、Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞聚集。(B)以4*105個(gè)細(xì)胞/ml=400，000個(gè)細(xì)胞/ml的密度將適應(yīng)于在BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞接種于存于12孔板中的BI (無(wú)Ca)培養(yǎng)基中并將所示量的MgCl2添加至培養(yǎng)物中。接種后2天對(duì)生長(zhǎng)形態(tài)及細(xì)胞聚集進(jìn)行顯微分析。應(yīng)注意細(xì)胞獨(dú)立于Mg2+濃度以單細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)。(C)以3*105個(gè)細(xì)胞/ml=300，000個(gè)細(xì)胞/ml的密度將適應(yīng)于在AEM培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞接種于存于振蕩燒瓶中的AEM培養(yǎng)基中且將所示量的CaCl2或MgCl2添加至培養(yǎng)物中。在37° C、5%C02及120rpm下培育培養(yǎng)物。利用CEDEX細(xì)胞量化系統(tǒng)(Innovatis)來(lái)分析活細(xì)胞密度及細(xì)胞聚集率。應(yīng)注意，若培養(yǎng)基中的CaCl2濃度高于100 μ M，則培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度顯著下降。相比之下，增加MgCl2的濃度對(duì)活細(xì)胞密度無(wú)影響。此外，應(yīng)注意，細(xì)胞聚集率隨著CaCl2濃度增加而增加且在CaCl2濃度>250 μ M時(shí)達(dá)到飽和。相比之下，增加MgCl2的濃度對(duì)Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的聚集率無(wú)影響。
[0099]圖9:CH0及Η4-ΙΙ-Ε中所產(chǎn)生IgGl與Fe YRIIIa的結(jié)合親和力。
[0100]如下使用BIAcore TlOO 儀器及 CM5 傳感器芯片(BIACORE, Uppsala, Sweden)來(lái)測(cè)量不同細(xì)胞系中產(chǎn)生的IgGl與Fe Y RIIIa的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。將可溶性重組Fe y RIIIa固定至BIAcore傳感器芯片上。以6種不同濃度(自4.17nM至133.3nM)將經(jīng)純化的IgGl稀釋于 HBS-EP 緩沖液(0.01M HEPES,0.15M NaCl, 3mM EDTA，0.005%Surfactant Ρ20，ρΗ7.4)中，且以5mL/分鐘的流速將每一經(jīng)稀釋的IgGl注射于受體捕獲傳感器表面上。在25° C利用HBS-EP作為運(yùn)行緩沖液來(lái)實(shí)施所述實(shí)驗(yàn)。將無(wú)試樣IgGl的緩沖溶液注射于受體捕獲傳感器表面上作為空白對(duì)照。通過(guò)以IOmL/分鐘的流速將7.5mM HCl注射30秒來(lái)去除結(jié)合至傳感器表面的可溶性Fe Y RIIIb及IgGl。在數(shù)據(jù)分析前針對(duì)空白對(duì)照校正由注射IgGl獲得的數(shù)據(jù)。通過(guò)穩(wěn)態(tài)分析使用BIAcore TlOO動(dòng)力學(xué)評(píng)估軟件(BIACORE)來(lái)計(jì)算對(duì)FcYRIIIa的親和力(KD)。應(yīng)注意，H4-11-E細(xì)胞系中產(chǎn)生的IgGl與受體的結(jié)合親和力高于CHO中產(chǎn)生的IgGl。
[0101]圖10:CH0及H4-11-E中產(chǎn)生的IgGl的效應(yīng)子功能:ADCC。
[0102]通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析來(lái)實(shí)施ADCC分析，其中使用通過(guò)Lymphoprep (AXIS SHIELD, Dundee, UK) 自健康供體制備的人類(lèi)外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)作為效應(yīng)子細(xì)胞。將靶腫瘤細(xì)胞(表達(dá)人類(lèi)CD20的人類(lèi)伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系Ramos)的等分試樣分配至96孔U形底板(存于50 μ I/孔中的10，000個(gè)細(xì)胞)中且在PBMC (100 μ L)存在下以20/1的Ε/Τ比率與抗體的連續(xù)稀釋液(50 μ L) 一起培育。在37° C培育4小時(shí)后，使用非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒(Promega，Madison，WI)測(cè)量上清液LDH活性。根據(jù)下式自試樣活性計(jì)算特異性細(xì)胞溶解百分比:特異性溶解[%]=100X (E-Se-St)/(M-St)。FU代表熒光單位。
[0103]應(yīng)注意，與CHO中產(chǎn)生的IgGl相比，H4-11-E中產(chǎn)生的IgGl具有更強(qiáng)ADCC活化。
[0104]圖11:CH0及H4-11-E中所產(chǎn)生IgGl與FcRn的結(jié)合親和力。
[0105]使用BIAcore TlOO儀器及CM5傳感器芯片來(lái)測(cè)量人類(lèi)IgGl-FcRn相互作用的動(dòng)力學(xué)。使用胺偶合試劑盒(BIACORE)將抗人類(lèi)b2-微球蛋白單克隆抗體(Abeam, Cambridge, UK)固定至芯片上。通過(guò)以5mL/分鐘的流速注射可溶性FcRn_b2微球蛋白復(fù)合物，通過(guò)經(jīng)固定的抗b2-微球蛋白抗體來(lái)捕獲該復(fù)合物。將無(wú)該復(fù)合物的緩沖溶液注射于抗體捕獲傳感器表面上作為空白對(duì)照。以5種不同濃度(自4.17nM至66.7nM)將每一經(jīng)純化的IgG稀釋于pH調(diào)節(jié)至6.0的HBS-EP+緩沖液(0.01M HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA, 0.05%Surfactant P20)中，且以5mL/分鐘的流速將每一經(jīng)稀釋的IgGl注射于捕獲復(fù)合物的傳感器的表面或空白上。通過(guò)以60mL/分鐘的流速將7.5mM HCl注射I分鐘來(lái)去除結(jié)合至傳感器表面上的可溶性FcRn及IgGl。在25° C利用HBS-EP+作為運(yùn)行緩沖液來(lái)實(shí)施所述實(shí)驗(yàn)。使用通過(guò)減去空白獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用BIAcore TlOO評(píng)估軟件通過(guò)二元擬合模型來(lái)計(jì)算表觀締合速率常數(shù)(ka)、解離速率常數(shù)(kd)及結(jié)合親和力(KD)。應(yīng)注意，H4-11-E中產(chǎn)生的抗體結(jié)合FcRn的程度與CHO中產(chǎn)生的抗體相當(dāng)。
[0106]序列表說(shuō)明
[0107]SEQ ID NOl:0_連接糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列
[0108]SEQ ID N02:抗CD20IgGlmAb重鏈的氨基酸序列
[0109]SEQ ID N03:抗CD20IgGlmAb輕鏈的氨基酸序列
[0110]SEQ ID N04:抗CD20IgG4mAb重鏈的氨基酸序列
`[0111]SEQ ID N05:抗CD20IgG4mAb輕鏈的氨基酸序列
[0112]SEQ ID N06:MCP1-Fc融合蛋白的氨基酸序列
[0113]SEQ ID N07:EP0-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
[0114]發(fā)明詳述
[0115]已知翻譯后蛋白修飾對(duì)蛋白的生物活性、穩(wěn)定性及免疫原性具有關(guān)鍵效應(yīng)。分泌蛋白的最常見(jiàn)翻譯后修飾是糖基化且所有主要的經(jīng)批準(zhǔn)的治療性生物藥物(包括重組抗體或重組Fe-融合蛋白)均為糖蛋白。
[0116]由于正確糖基化模式對(duì)于治療活性及特異性是不可缺少的，因此多數(shù)糖蛋白治療劑在能夠生成糖基化模式的復(fù)雜光譜的真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。當(dāng)前，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞已成為用于產(chǎn)生重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。然而，已知不同真核生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生不同F(xiàn)e糖基化模式且從而對(duì)治療性抗體的生物活性具有重要影響。此外，已知某些確定的糖結(jié)構(gòu)在活化具體下游效應(yīng)子機(jī)制上比其它更有效。帶有多數(shù)人類(lèi)樣糖基化模式的治療性抗體在活化抗腫瘤效應(yīng)子機(jī)制上并不尤其有效，但同時(shí)，這些抗體不太可能引起患者的不期望的過(guò)敏性或免疫原性排斥反應(yīng)且因此視為完全的。為增進(jìn)(例如)由抗癌癥抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷活性，期望產(chǎn)生不同糖基化模式。同樣，經(jīng)改變的糖基化模式可增進(jìn)其它抗體依賴(lài)性效應(yīng)子功能或其可改變血清半衰期，而不會(huì)損害治療產(chǎn)品本身的安全性或穩(wěn)定性。
[0117]在本發(fā)明中，具體選擇并分析源自多種物種、組織及細(xì)胞譜系的不同細(xì)胞系。對(duì)暴露于細(xì)胞表面上的聚糖以及在細(xì)胞內(nèi)的酶促活性進(jìn)行了檢驗(yàn)(圖1)。從而，可賦予每一細(xì)胞系合成某些糖基化模式的能力。選擇及分析顯示細(xì)胞系在其糖基化能力上明顯有差異，此根據(jù)其所源自的物種與組織或細(xì)胞譜系二者而定。僅少數(shù)細(xì)胞系天然顯示低巖藻糖基化能力，此糖基化特性對(duì)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性途徑(ADCC)的活化具有積極影響。一些細(xì)胞系能夠生成可增進(jìn)治療蛋白的血清穩(wěn)定性的唾液酸化結(jié)構(gòu)。一些細(xì)胞系產(chǎn)生免疫原性糖結(jié)構(gòu)(例如Gal-1，3-Gal及NeuGc)，從而引起人類(lèi)的炎性反應(yīng)。對(duì)本發(fā)明的分析顯示，單獨(dú)給定細(xì)胞系的物種來(lái)源或組織、器官或細(xì)胞譜系皆不能單獨(dú)確定細(xì)胞的糖基化能力。因此，遺傳及后生因素影響細(xì)胞合成某些糖基化模式的能力。因此，本發(fā)明數(shù)據(jù)證實(shí)，僅僅基于對(duì)源自相同組織和/或物種的另一細(xì)胞系中獲得的糖模式的了解，不可能預(yù)測(cè)細(xì)胞系的糖基化性質(zhì)(圖1)。
[0118]顯示若干性質(zhì)(例如降低的巖藻糖基化、缺乏免疫原性殘基及存在α _2，6連接的唾液酸)的唯一細(xì)胞系系大鼠肝癌細(xì)胞系Η4-ΙΙ-Ε。所述性質(zhì)積極影響重組生物治療劑、尤其是抗體或Fe-融合蛋白的活性及穩(wěn)定性。所選細(xì)胞系Η4-ΙΙ-Ε是所有所分析細(xì)胞系在此分析中唯一未顯示可檢測(cè)的巖藻糖基化跡象者。此令人感到驚奇，這是因其它大鼠細(xì)胞系及其它肝細(xì)胞系具有不同性質(zhì)。此外，據(jù)闡述，大鼠血液血清抗體為顯著巖藻糖基化的，而根據(jù)文獻(xiàn)，其它物種(例如兔或貓)在血清抗體上具有低于大鼠的巖藻糖含量(Raju等人，2000)。
[0119]糖結(jié)構(gòu)(例如Gal-1，3-Gal及NeuGc)具有潛在免疫原性。H4-11-E大鼠細(xì)胞不顯示這些潛在免疫原性糖結(jié)構(gòu)。H4-11-E大鼠細(xì)胞另外不產(chǎn)生具有這些潛在免疫原性糖結(jié)構(gòu)的抗體或Fe-融合蛋白。實(shí)際上，具有潛在免疫原性的諸如Gal-1，3-Gal及NeuGc等的糖結(jié)構(gòu)在所選人類(lèi)或大鼠細(xì)胞系中皆未出現(xiàn)，而源自小鼠、兔及其它物種的細(xì)胞系則一致地產(chǎn)生這些可誘導(dǎo)人類(lèi)的免疫原性反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所述潛在免疫原性糖結(jié)構(gòu)由細(xì)胞以物種依賴(lài)性方式附著至分泌糖蛋白。
[0120]為驗(yàn)證H4-11-E細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有預(yù)測(cè)糖基化性質(zhì)的分泌糖蛋白，通過(guò)對(duì)相應(yīng)DNA構(gòu)建體實(shí)施轉(zhuǎn)染并隨后選擇穩(wěn)定整合產(chǎn)物基因及抗生素抗性標(biāo)記物的細(xì)胞來(lái)生成產(chǎn)生穩(wěn)定重組抗體的H4-11-E細(xì)胞。獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞群并將其作為貼壁細(xì)胞層培養(yǎng)。H4-11-E細(xì)胞另外適應(yīng)于懸浮生長(zhǎng)且可在無(wú)血清化學(xué)限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖5)。通過(guò)蛋白質(zhì)A色譜自細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化抗體。分析Fe糖基化并將其與在CH0-DG44、CH0-Lecl3突變體及YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體上獲得的模式進(jìn)行比較。雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖占所有4種IgGl制劑中的最大部分。在雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖的比例內(nèi)，CH0-DG44細(xì)胞如先前所報(bào)導(dǎo)主要(約95%)產(chǎn)生巖藻糖基化形式。相比之下，H4-11-E細(xì)胞中表達(dá)的IgGl中的80%以上含有無(wú)巖藻糖的雙觸角結(jié)構(gòu)聚糖，此比例顯著高于在細(xì)胞系YB2/0或CHO突變體Lecl3中產(chǎn)生抗體(圖2)。對(duì)H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體上糖基化模式的詳細(xì)分析亦顯示，>40%聚糖是半乳糖基化的，此比例高于在CH0-DG44中產(chǎn)生抗體時(shí)所獲得的比例，而該CH0-DG44宿主細(xì)胞系通常用于生物藥物蛋白的產(chǎn)生(圖3)。此外，H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生的約8%抗體帶有末端唾液酸殘基，若在CH0-DG44細(xì)胞中產(chǎn)生重組抗體，則通常不會(huì)發(fā)現(xiàn)所述末端唾液酸 殘基(圖4)。末端唾液酸殘基可對(duì)修飾抗體的活性及穩(wěn)定性具有不同影響。最近出版物顯示唾液酸可抑制抗體的炎性活性(Burton及Dwek, 2006 ;Scallon等人,2007)。其它數(shù)據(jù)顯示，不存在唾液酸可提高小鼠肝的代謝速率，從而表明通過(guò)基于肝的受體的清除(Wright等人，2000)。發(fā)現(xiàn)唾液酸衍生物(例如N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc))在人類(lèi)中具有免疫原性(Noguchi等人，1995)。然而,不能檢測(cè)出H4-11-E細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白上NeuGc修飾的證據(jù)(圖1)?？傊?，H4-11-E源的抗體缺乏潛在免疫原性殘基。
[0121]所述表達(dá)數(shù)據(jù)證實(shí)了對(duì)有利糖基化模式的預(yù)測(cè)分析中獲得的結(jié)果(圖1)?？傊?，大鼠肝癌細(xì)胞系H4-11-E本身因能生成若干種有益糖基化模式而與其它細(xì)胞系區(qū)別開(kāi)來(lái)。H4-11-E細(xì)胞中在抗體產(chǎn)生后獲得的所述糖基化模式可表 達(dá)為在ADCC分析中抗體與FcyRIII受體的經(jīng)增進(jìn)結(jié)合親和力及極佳活性、在CDC分析中與補(bǔ)體系統(tǒng)組份的較強(qiáng)結(jié)合及增強(qiáng)的活性、與新生兒Fe受體FcRn的較強(qiáng)結(jié)合(對(duì)抗體穩(wěn)定性及血清半衰期具有積極效應(yīng))。
[0122]除產(chǎn)生有益糖性質(zhì)外，H4-11-E細(xì)胞的特征亦在于對(duì)壓力或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)刺激物的高穩(wěn)健性及低敏感性。據(jù)此，H4-11-E細(xì)胞可適應(yīng)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)。H4-11-E細(xì)胞在不同培育模式下生長(zhǎng)良好且可在進(jìn)料分批過(guò)程中以高活力懸浮培養(yǎng)10天以上?？傊?，H4-11-E細(xì)胞可對(duì)于大規(guī)模工業(yè)產(chǎn)生效應(yīng)子活性突出且血清半衰期延長(zhǎng)的生物治療劑帶來(lái)極佳質(zhì)量。
[0123]定義
[0124]一般實(shí)施方案“包含”或“包括”涵蓋更具體的實(shí)施方案“由…組成”。此外，單數(shù)及復(fù)數(shù)形式并不以限定方式使用。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有以下含義。
[0125]本發(fā)明涉及所有源自“Reuber H-35肝癌”的大鼠肝癌細(xì)胞系((REUBER，1961)及1964 (ΡΙΤ0Τ等人，1964))。"Reuber H-35肝癌”是在AxC大鼠中通過(guò)化學(xué)致癌作用所誘導(dǎo)。源自這些“Reuber H_35肝癌”的細(xì)胞系包括(例如)H4-11-E及H4-11-E-C3細(xì)胞系及其衍生物或子代。
[0126]更特別是，“H4-11-E細(xì)胞”意指源自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，目錄編號(hào)87031301)或美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，保藏編號(hào)CRL-1548)或源自于1961年(REUBER, 1961)及1964年(ΡΙΤ0Τ等人，1964)分離且首先闡述于文獻(xiàn)中的大鼠肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞。特別是，H4-11-E細(xì)胞是具有ECACC目錄編號(hào)87031301或ATCC編號(hào)CRL-1548的細(xì)胞。
[0127]術(shù)語(yǔ)“H4-11-E細(xì)胞”另外意指H4-11-E-C3細(xì)胞系(CRL-1600或HPACC編號(hào)85061112) ;H4II細(xì)胞系(HPACC編號(hào)89042702)，其亦源自“Reuber H35肝癌”且與H4-11-E-C3 (ECACC 目錄編號(hào) 85061112)相同；H4_TG 細(xì)胞系(CRL-1578)，其為具有 HPRT 缺陷且恒定表達(dá)苯丙氨酸羥化酶的CRL-1600衍生物；H5細(xì)胞系(HPACC，編號(hào)94101905)，其也是H4-11-E-C3 (CRL-1600)的亞純系；及H4-S細(xì)胞系(HPACC編號(hào)89102001)，其為經(jīng)VS病毒感染的大鼠肝癌細(xì)胞。
[0128]術(shù)語(yǔ)“H4-11-E細(xì)胞”亦包含源自最初經(jīng)保藏的Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞的細(xì)胞，以及最初保藏Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的子代或源自最初經(jīng)保藏的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的細(xì)胞。
[0129]因此，術(shù)語(yǔ)“Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞”包含Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞的未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的后代/形式。Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的這些未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的后代/形式亦稱(chēng)作最初保藏的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的“衍生物或子代”。
[0130]Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的未經(jīng)修飾形式是構(gòu)成Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的未經(jīng)修飾功能亞單位的所產(chǎn)生的全部細(xì)胞。一些實(shí)例包括:未經(jīng)修飾細(xì)胞系的亞純系、其經(jīng)純化或分級(jí)分離亞群。
[0131]Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的經(jīng)修飾形式(或衍生物或子代)是經(jīng)由引入功能DNA序列、尤其是那些賦予各別起始細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白、尤其是糖蛋白(包括抗體或Fe-融合蛋白)的潛力者自親本H4-11-E細(xì)胞生成的全部細(xì)胞。
[0132]H4-11-E細(xì)胞的修飾形式(或衍生物或子代)是經(jīng)由誘變或靶向基因修飾或基因整合自親本H4-11-E細(xì)胞生成的全部細(xì)胞。這些經(jīng)修飾的H4-11-E細(xì)胞系經(jīng)遺傳改造的H4-11-E細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因(例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白CERT，亦稱(chēng)為Goodpasture抗原結(jié)合蛋白)、轉(zhuǎn)錄因子(例如上游結(jié)合因子UBF)或編碼Sec-1/MunclS蛋白家族成員的基因。
[0133]經(jīng)修飾的H4-11-E細(xì)胞的其它實(shí)例是敲除或敲弱一或多種基因(例如DHFR(二氫葉酸脫氫酶)、GS (谷氨酰氨合成酶)、TIP-5或SNF2H)的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞。尤其敲除DHFR或GS的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞在重組蛋白表達(dá)的情形下因有利選擇選項(xiàng)而可用于生物藥物生產(chǎn)。
[0134]這些敲除或敲弱DHFR或GS的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞的實(shí)例。敲除或敲弱DHFR的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞是次黃嘌呤(H)及胸苷(T)營(yíng)養(yǎng)缺陷型。敲除或敲弱GS的Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞是谷氨酰氨營(yíng)養(yǎng)缺陷型。但存在本領(lǐng)域技術(shù)人員可生成的其它營(yíng)養(yǎng)缺陷型Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞。
[0135]Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞的經(jīng)修飾形式(或衍生物或子代)另外意指經(jīng)由對(duì)特殊培養(yǎng)基、生長(zhǎng)、培養(yǎng)模式或選擇物質(zhì)的適應(yīng)自親本Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞生成的任一細(xì)胞。
[0136]特別是，術(shù)語(yǔ)Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞涉及兩種保藏細(xì)胞系。本發(fā)明的Η4_ΙΙ_Ε細(xì)胞系已于2011年6月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM ACC3129 (Η4-ΙΙ-Ε)保藏于德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0137]適應(yīng)于在闡述于本發(fā)明中的無(wú)血清無(wú)Ca2+培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的H4-11-E細(xì)胞系已于2011年6月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM ACC3130 (H4-1I_Es)保藏于德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0138]本文所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”及“細(xì)胞系”尤其是指表達(dá)細(xì)胞/表達(dá)細(xì)胞系及宿主細(xì)胞/宿主細(xì)胞系。
[0139]術(shù)語(yǔ)鈣減少或優(yōu)選無(wú)鈣的培養(yǎng)基意指限定含有I μ mol/L-500 μ mol/L Ca2+離子的培養(yǎng)基，更優(yōu)選地鈣減少的培養(yǎng)基含有I μ mol/L-250 μ mol/L Ca2+離子且甚至更優(yōu)選地鈣減少或無(wú) Ca 培養(yǎng)基含有 O μ mol/L-100 μ mol/L 或 0.5 μ mol/L-100 μ mol/L Ca2+離子。在AEM培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)3天后添加250 μ M/L CaCl2或更高CaCl2濃度會(huì)顯著損害Η4-ΙΙ-Ε細(xì)胞生長(zhǎng)。在補(bǔ)充有250yM/L CaCl2或更高CaCl2濃度的AEM培養(yǎng)基中，80%以上的細(xì)胞形成緊密聚集體。亦可經(jīng)由將EDTA添加至最初含有鈣的培養(yǎng)基中，從而通過(guò)與EDTA形成絡(luò)合物以降低培養(yǎng)基游離鈣離子的濃度來(lái)獲得鈣減少的培養(yǎng)基。優(yōu)選以介于400 μ mol/L-1200 μ mol/L 或 600 μ mol/L-1000 μ mol/L 或 700 μ mol/L-900 μ mol/L 之間的濃度添加EDTA。優(yōu)選以800 μ mol/L左右的濃度添加EDTA。
[0140]市售無(wú)鈣培養(yǎng)基的實(shí)例是MEM Joklik Modification(Sigma)或 MEM SpinnerModification(Sigma)。用于在血清存在下貼壁培育H4-11-E細(xì)胞的典型含鈣培養(yǎng)基是含有 1360 μ mol/L Ca2+離子的鷹氏最低必需培養(yǎng)基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(Sigma)。用于懸浮培育H4-11-E細(xì)胞的無(wú)血清鈣減少的培養(yǎng)基是AEM(Invitrogen)。
[0141]與鈣離子不同，鎂離子對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞/H4-11-E細(xì)胞的聚集率無(wú)影響。因此，大鼠肝癌細(xì)胞/H4-11-E細(xì)胞聚集具有鎂(Mg2+)離子非依賴(lài)性，但具有鈣(Ca2+)離子依賴(lài)性。
[0142]“糖基化位點(diǎn)”是指由真核細(xì)胞識(shí)別為糖殘基附著位置的氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“糖苷結(jié)構(gòu)”或“聚糖”是指附著至糖基化位點(diǎn)的糖殘基。附著碳水化合物(例如寡糖)的氨基酸通常為天冬酰氨(N-連接)、絲氨酸(O-連接)及蘇氨酸(O-連接)殘基。具體附著位點(diǎn)通常由本文稱(chēng)作“糖基化位點(diǎn)序列”的氨基酸序列界定。
[0143]用于N-連接糖基化的糖基化位點(diǎn)序列是-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-,其中X可為常規(guī)氨基酸中除脯氨酸外的任一者。用于O-連接糖基化的主要糖基化位點(diǎn)為-(Thr或Ser)-X-X-Pro-(SEQ ID N01)，其中X為任一常規(guī)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“N-連接”及“O-連接”是指在糖分子與氨基酸殘基之間用作附著位點(diǎn)的化學(xué)基團(tuán)。N-連接的糖經(jīng)由氨基附著；0-連接的糖經(jīng)由羥基附著。然而，并非蛋白中的所有糖基化位點(diǎn)序列皆必須經(jīng)糖基化。一些蛋白為以糖基化形式與非糖基化形式二者分泌，而其它蛋白則在一個(gè)糖基化位點(diǎn)序列處經(jīng)完全糖基化，但含有另一未糖基化的糖基化位點(diǎn)序列。因此，并非多肽中存在的所有糖基化位點(diǎn)序列皆必須為實(shí)際附著糖的糖基化位點(diǎn)。在生物合成期間初始N-糖基化插入“核心碳水化合物”或“核心寡糖”。
[0144]在N-連接糖基化中，碳水化合物部分經(jīng)由GIcNAc附著至多肽鏈中的天冬酰氨殘基。N-連接碳水化合物具有不同結(jié)構(gòu)，但全部含有共同核心結(jié)構(gòu)，其中結(jié)合天冬酰氨的末端GlcNAc稱(chēng)為還原端且相反側(cè)稱(chēng)為非還原端:
【權(quán)利要求】
1.一種包含編碼抗體或Fe-融合蛋白的核酸序列的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該核酸序列可操作地連接至至少一種允許表達(dá)該編碼抗體或Fe-融合蛋白的核酸序列的調(diào)節(jié)序列。
2.權(quán)利要求1的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該細(xì)胞為H4-11-E細(xì)胞。
3.權(quán)利要求或2的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該細(xì)胞為: a)源自選自以下細(xì)胞的細(xì)胞:歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，目錄編號(hào)87031301)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，保藏編號(hào)CRL-1548)、H4-11-E-C3細(xì)胞系(CRL-1600或HPACC 編號(hào) 85061112 或 ECACC 目錄編號(hào) 85061112)、H4II 細(xì)胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 細(xì)胞系(CRL-1578)、H5 細(xì)胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 細(xì)胞系(HPACCNr.89102001)，或 b)以編號(hào)ECACC目錄編號(hào)87031301保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心或以保藏編號(hào)CRL-1548保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC的細(xì)胞，或 c)以保藏號(hào)DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 d)以保藏號(hào)DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 e)a)或b)或c)或d)中任 一細(xì)胞的衍生物或子代。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該細(xì)胞是以保藏號(hào)DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞或其中該細(xì)胞是以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其特征還在于 a)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有巖藻糖的程度小于20%、10% 或 5%,或 b)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有巖藻糖的程度在介于0% 至 20%、0% 至 10%、0% 至 5%、0.5% 至 20%、0.5% 至 10%、0.5% 至 5%、1% 至 20%、1% 至 10% 或1%至5%之間的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其特征還在于 a)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有至少一個(gè)半乳糖殘基的程度超過(guò)40%、45%或50%，或 b)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有至少一個(gè)半乳糖殘基的程度在介于 40%至 100%、45%至 100%、50%至 100%、51%至 100%、40%至 99.5%、45%至 99.5%、50% 至 99.5% 或 51% 至 99.5%,40% 至 99%、45% 至 99%、50% 至 99% 或 51% 至 99% 之間的范圍內(nèi)， 其中所述糖苷結(jié)構(gòu)優(yōu)選含有一或兩個(gè)優(yōu)選與所述糖苷結(jié)構(gòu)的末端非還原端處的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)連接的半乳糖殘基(Gl或G2)。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其特征還在于 a)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有末端唾液酸或神經(jīng)氨酸殘基的程度超過(guò)5%或超過(guò)10%，或 b)由該細(xì)胞表達(dá)的該抗體或Fe-融合蛋白中所含糖苷結(jié)構(gòu)含有末端唾液酸或神經(jīng)氨酸殘基的程度在介于O至8%、1%至8%、5%至10%、10%至50%或10%至45%之間的范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其特征還在于其帶有選擇標(biāo)記物基因，例如新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT);針對(duì)嘌呤霉素、潮霉素或Zeocin的抗性基因；或可擴(kuò)增選擇標(biāo)記物基因，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)或谷氨酰氨合成酶(GS)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該允許表達(dá)該編碼抗體或Fe-融合蛋白的核酸序列的調(diào)節(jié)序列是 a)啟動(dòng)子，或 b)增強(qiáng)子，或
c)5’-UTR 序列。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該抗體或Fe融合蛋白含有連接至N-天冬酰氨(N-Asn)殘基的糖苷結(jié)構(gòu)，其中該糖苷結(jié)構(gòu)包含以下糖鏈:
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該抗體或Fe融合蛋白含有連接至N-天冬酰氨(N-Asn)殘基的糖苷結(jié)構(gòu)，其中該糖苷結(jié)構(gòu)包含以下糖鏈:
12.權(quán)利要求10或11的大鼠肝癌細(xì)胞，其中根據(jù)KabatEU命名法，該N-Asn優(yōu)選為N-Asn(297)。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中使該細(xì)胞適應(yīng)于在無(wú)血清且鈣減少或優(yōu)選無(wú)鈣的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中使該細(xì)胞適應(yīng)于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞，其中該細(xì)胞與YB2/0細(xì)胞相比對(duì)細(xì)胞凋亡具有低敏感性和/或?qū)?xì)胞壓力具有高穩(wěn)健性。
16.一種產(chǎn)生所關(guān)注糖蛋白的方法，其特征在于以下步驟: a)提供大鼠肝癌細(xì)胞， b)任選使該步驟a)的細(xì)胞適應(yīng)于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)， c)任選使該步驟a)和/或步驟b)的細(xì)胞適應(yīng)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， d)任選使該步驟a)和/或步驟b)和/或步驟c)的細(xì)胞在鈣減少或無(wú)鈣的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， e)用編碼所關(guān)注重組糖蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)染此任選經(jīng)適應(yīng)的大鼠肝癌細(xì)胞， f)在允許表達(dá)該所關(guān)注糖蛋白的條件下培育該步驟e)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞， g)任選分離并純化該所關(guān)注糖蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該大鼠肝癌細(xì)胞是H4-11-E細(xì)胞，優(yōu)選地，該細(xì)胞為: a)源自選自以下細(xì)胞的細(xì)胞:歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，目錄編號(hào)87031301)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，保藏編號(hào)CRL-1548)、H4-11-E-C3細(xì)胞系(CRL-1600或HPACC 編號(hào) 85061112 或 ECACC 目錄編號(hào) 85061112)、H4II 細(xì)胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 細(xì)胞系(CRL-1578)、H5 細(xì)胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 細(xì)胞系(HPACCNr.89102001)，或 b)以編號(hào)ECACC目錄編號(hào)87031301保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心或以保藏編號(hào)CRL-1548保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC的細(xì)胞，或 c)以保藏號(hào)DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 d)以保藏號(hào)DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 e)a)或b)或c)或d)中任一細(xì)胞的衍生物或子代， 最優(yōu)選地，該細(xì)胞是以保藏號(hào)DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中該步驟b)、c)和/或d)的培養(yǎng)基另外不含任一動(dòng)物來(lái)源蛋白/肽。
19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的方法，其中該轉(zhuǎn)染步驟e)進(jìn)一步包括將包含編碼該所關(guān)注糖蛋白的核酸序列的表達(dá)載體引入該大鼠肝癌細(xì)胞中，該核酸序列可操作地連接至至少一種允許表達(dá)該編碼所關(guān)注糖蛋白的核酸序列的調(diào)節(jié)序列。
20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的方法，其中該所關(guān)注糖蛋白是抗體或Fe-融合蛋白，優(yōu)選具有以下的抗體或Fe-融合蛋白 a)Fe yRIIIa結(jié)合活性且優(yōu)選ADCC，或 b)補(bǔ)體結(jié)合活性且優(yōu)選CDC，或 c)與新生兒Fe受體FcRn的結(jié)合活性且優(yōu)選血清穩(wěn)定性。
21.一種產(chǎn)生(重組)抗體或Fe-融合蛋白的方法，該(重組)抗體或Fe-融合蛋白具有 &奸(^1?111&結(jié)合活性和/或 b)補(bǔ)體結(jié)合活性和/或 c)與新生兒Fe受體FcRn的結(jié)合活性， 該方法包括在大鼠肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生該抗體或Fe融合蛋白， 其中該大鼠肝癌細(xì)胞優(yōu)選為H4-11-E細(xì)胞，更優(yōu)選地，該細(xì)胞為: i)源自選自以下細(xì)胞的細(xì)胞:歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，目錄編號(hào)87031301)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，保藏編號(hào)CRL-1548)、H4-11-E-C3細(xì)胞系(CRL-1600或HPACC 編號(hào) 85061112 或 ECACC 目錄編號(hào) 85061112)、H4II 細(xì)胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 細(xì)胞系(CRL-1578)、H5 細(xì)胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 細(xì)胞系(HPACCNr.89102001)，或 ?)以編號(hào)ECACC目錄編號(hào)87031301保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心或以保藏編號(hào)CRL-1548保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC的細(xì)胞，或 iii)以保藏號(hào)DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 iv)以保藏號(hào)DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 v)i)或ii)或iii)或iv)中任一細(xì)胞的衍生物或子代， 最優(yōu)選地，該細(xì)胞是以保藏號(hào)DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中 i)如權(quán)利要求21 a)所述的抗體或Fe融合蛋白具有抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)或 ?)如權(quán)利要求21b)所述的抗體或Fe融合蛋白具有補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)或 iii)如權(quán)利要求21c)所述的抗體或Fe融合蛋白具有血清穩(wěn)定性。
23.一種生成用于生產(chǎn)重組糖蛋白的宿主細(xì)胞的方法，其包括: a)提供大鼠肝癌細(xì)胞， b)使該步驟a)的大鼠肝癌細(xì)胞適應(yīng)于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，及 c)使該步驟a)的大鼠肝癌細(xì)胞適應(yīng)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，及 d)使該步驟a)的大鼠肝癌細(xì)胞適應(yīng)于在鈣減少或無(wú)鈣的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，及 e)任選使該步驟a)的大鼠肝癌細(xì)胞適應(yīng)于在不含任一動(dòng)物來(lái)源蛋白/肽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，及 f)任選選擇單細(xì)胞純系， g)獲得宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該大鼠肝癌細(xì)胞是H4-11-E細(xì)胞，優(yōu)選地，該細(xì)胞為: i)源自選自以下細(xì)胞的細(xì)胞:歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，目錄編號(hào)87031301)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，保藏編號(hào)CRL-1548)、H4-11-E-C3細(xì)胞系(CRL-1600或HPACC 編號(hào) 85061112 或 ECACC 目錄編號(hào) 85061112)、H4II 細(xì)胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 細(xì)胞系(CRL-1578)、H5 細(xì)胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 細(xì)胞系(HPACCNr.89102001)，或 ?)以編號(hào)ECACC目錄編號(hào)87031301保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心或以保藏編號(hào)CRL-1548保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC的細(xì)胞，或 iii)以保藏號(hào)DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 iv)以保藏號(hào)DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或 v)i)或ii)或iii)或iv)中任一細(xì)胞的衍生物或子代，最優(yōu)選地，該細(xì)胞是以保藏號(hào)DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞，或以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其進(jìn)一步包含 h)用編碼所關(guān)注糖蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)染該如權(quán)利要求23的步驟g)的所獲得宿主細(xì)胞，及 i)任選在允許表達(dá)該所關(guān)注糖蛋白的條件下培育該步驟h)所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 其中該所關(guān)注糖蛋白優(yōu)選為抗體或Fe融合蛋白、最優(yōu)選具有ADCC和/或CDC和/或血清穩(wěn)定性的抗體或Fe融合蛋白。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法生成的細(xì)胞。
27.—種以保藏號(hào)DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的(大鼠肝癌)細(xì)胞。
28.一種權(quán)利要求1至15或26-27中任一項(xiàng)的大鼠肝癌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞用于生物藥物生產(chǎn)的用途 。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103534347SQ201180056942
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2010年9月27日
【發(fā)明者】K.埃爾萬(wàn)格, L.弗洛林, H.考夫曼 申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆國(guó)際有限公司