腫瘤特異的抗體和其用途
【專利摘要】所提供的是分離的抗體、其片段和衍生物，其結(jié)合腫瘤抗原。還提供的是組合物和輸試劑，其包括所公開的抗體和其片段和衍生物；細胞，其生產(chǎn)所公開的抗體和其片段和衍生物；方法，其用于生產(chǎn)所公開的抗體和其片段和衍生物；方法，其使用所公開的抗體和其片段和衍生物檢測、靶向和/或治療腫瘤和/或源自其中的轉(zhuǎn)移性細胞，和/或腫瘤干細胞；和方法，其用于在對象中預測癌癥的復發(fā)。
【專利說明】腫瘤特異的抗體和其用途
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]此申請為提交于2010年10月8日的美國專利申請系列號12/924，952的部分繼續(xù)申請，其本身要求提交于2009年10月8日的美國臨時專利申請系列號61/249，634的權(quán)益。這些申請的每個公開通過引用以其整體并入本文。
[0003]涉及序列表
[0004]與本公開相關的序列表以創(chuàng)建于2011年5月25日并命名為〃1276_5PCT_ST25.txt"的21千字節(jié)的ASCII文本文件電子提交至作為國際受理局的美國專利及商標局。通過EFS-網(wǎng)提交的序列表通過引用以其整體并入本文。
發(fā)明領域
[0005]本文公開的主題涉及結(jié)合存在于腫瘤中的抗原非人分離的抗體或其片段或衍生物，和其使用方法。在一些實施方案中，本文公開的主題涉及分離的抗體或其片段或衍生物(其結(jié)合上皮粘蛋白家族成員MUC1)，并涉及用于使用所述抗體或其片段或衍生物檢測、靶向和治療腫瘤和腫瘤細胞的方法，所述細胞包括但不限于，循環(huán)腫瘤細胞(CTC)和癌癥干細胞(CSC)。
[0006]發(fā)明背景
[0007]胰腺癌分別為男性和女性癌癥相關死亡的第四和第五主導誘因，在男性中排在肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌之后，在女性中排在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌之后?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為晚期疾病，令治療困難。手術(shù)是唯一的治愈性治療，而在超過80%的患者中發(fā)生伴有或不伴有散播至遠端器官的局部疾病復發(fā)。試圖以更好的方式治療是必要的，其為了改善此疾病的結(jié)果。
[0008]通常，致瘤性轉(zhuǎn)化導致在腫瘤細胞中不同的多肽表達改變。例如，某些粘蛋白和突變形式的K-ras原癌基因多肽在90%的胰腺導管腺癌(以下稱為"PDA")中過表達，并已成為治療干預的靶標。然而，至今靶向這些多肽的疫苗仍未特別成功地臨床應用。疫苗無法產(chǎn)生長期免疫記憶，可能至少部分是由于腫瘤適應，使得它們逃避免疫識別和殺傷。已臨床測試了若干可調(diào)節(jié)免疫耐受的藥劑，但僅具有中度應答，可能是由于藥劑的量不足夠到達腫瘤位點和/或因為藥劑本身涉及(例如可源自它們與正常細胞的結(jié)合)不需要的副作用。
[0009]另外，在腫瘤學中不僅治療患者的原發(fā)疾病，而且預防發(fā)生轉(zhuǎn)移是主要的挑戰(zhàn)。目前相信，轉(zhuǎn)移性疾病可源自成瘤細胞(通常稱為腫瘤干細胞或癌癥干細胞)從原發(fā)腫瘤位點向其它位點的遷移，在那里它們可浸潤所述位點并形成新的腫瘤(見，例如，Bonne和Dick, 1997 ；Reya 等人，2001 ；A1-Hajj 等人，2003 ；Pardal 等人，2003 ；Dontu 等人，2004 ；Singh等人，2004 ;Brabletz等人，2005)。因此，當它們存在于患者中時能夠鑒定并消滅這些細胞將是有益的。
[0010]因此，需要新的用于檢測、靶向和治療腫瘤和由其衍生的細胞的化合物和方法。
[0011]發(fā)明概述[0012]本概述列出本文公開的主題的若干實施方案，并且在許多情況下列出這些實施方案的變化和排列。本概述僅為大量和不同的實施方案的示例。提及的給定實施方案的一或多個代表性的特征同樣也是示例性的。這樣的實施方案一般可具有或不具有提及的特征；同樣，那些特征可應用于本文公開的主題的其它實施方案，不論是否在本概述中列出。為了避免過多重復，本概述不列出這樣的特征全部可能的組合。
[0013]在不同的實施方案中，本文公開的主題提供下列:
[0014]分離的抗體，以及其片段和衍生物，其特異性地結(jié)合存在于上皮性腫瘤中的粘蛋白-1 (MUCl)和/或突變的K-ras原癌基因多肽。
[0015]分離的核酸，其編碼本文公開的主題的分離的抗體和/或其子序列。
[0016]抗體，例如單克隆抗體、和/或肽、片段、和/或其衍生物，其特異性結(jié)合腫瘤，例如上皮腫瘤，包括胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、和源自它們的轉(zhuǎn)移病灶。
[0017]抗體，以及其片段和衍生物，其特異性結(jié)合存在于MUCl多肽和/或突變體K-raf多肽中的表位，在某些實施方案中結(jié)合存在于人MUCl多肽中的表位。在一些實施方案中，表位存在于SEQ ID NO: 1-3任一中。
[0018]抗體，以及其片段和衍生物，其特異性結(jié)合使用來自小鼠模型的蛋白裂解物產(chǎn)生的MUCl (在一些實施方案中為人MUC1)和突變的K-rasG12D，所述小鼠模型將MUCl和突變的K-rasG12D作為腫瘤相關的抗原呈遞。
[0019]包含抗體的嵌合分子，以及其片段和衍生物，其連接于效應子和/或免疫調(diào)節(jié)劑，其中抗體(或其片段或衍生物)特異地結(jié)合在MUCl多肽和/或突變的K-ras多肽中存在的表位。在一些實施方案中，效應子選自:表位標簽、第二抗體(或其片段或衍生物)、標記、細胞毒素、脂質(zhì)體、放射性核素、藥物、前藥(prodrug)和螯合物，并且其中免疫調(diào)節(jié)劑選自，例如表3中列出的物質(zhì)。`
[0020]抗體，以及其片段和衍生物，其偶聯(lián)于免疫調(diào)節(jié)劑；例如，表3中列出的免疫調(diào)節(jié)劑。
[0021]抗體，以及其片段和衍生物，其偶聯(lián)于診斷劑。
[0022]抗體，以及其片段和衍生物，其被制備于包含一或多種藥物學可接受的載體和/或賦形劑的組合物中。
[0023]用于誘導免疫應答的方法，其在一些實施方案中包括將本文公開的抗體，其片段和/或衍生物，和/或組合物引入至對象，例如但不限于，人。
[0024]用于檢測癌性細胞的方法，其包括將偶聯(lián)于可檢測的標記的抗體或其片段或衍生物引入到對象(例如但不限于人)中，所述抗體或其片段或衍生物可特異性結(jié)合MUCl多肽和/或突變的K-ras多肽。
[0025]雜交瘤細胞，其產(chǎn)生本文公開的主題的抗體、片段和/或衍生物，例如但不限于單克隆抗體，其可特異性結(jié)合MUCl多肽、突變的K-raf多肽或兩者。
[0026]針對上皮癌癥的疫苗，其包含本文公開的主題的抗體、片段和/或衍生物，以及一或多種藥物學可接受的載體和/或賦形劑，任選地另外包含一或多種免疫調(diào)節(jié)劑。
[0027]更具體地，在一些實施方案中，本文公開的主題提供了分離的抗體或其片段或衍生物，其包含TAB-004單克隆抗體的互補決定區(qū)(⑶R)。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段或衍生物為多克隆的。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段或衍生物為單克隆的。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段或衍生物為人的或人源化的。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段或衍生物選自(a)由2010年12月16日以登錄號PTA-11550保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), 10801University Boulevard,Manassas, Virginia,20110-2209, United States of America的雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體；(b)嵌合抗體，或其片段或衍生物；(c)人源化抗體，或其片段或衍生物；(d)人抗體，或其片段或衍生物；(e)單鏈抗體，或其片段或衍生物；和(f)Fab片段；其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的CDR。在分離的抗體或其片段或衍生物的一些實施方案中，所述⑶R包括下述的一或多種:(i)包含SEQ ID N0:8的重鏈 CDRl ； (ii)包含 SEQ ID NO:9 的重鏈 CDR2 ；(iii)包含 SEQ ID NO: 10 的重鏈 CDR3 ；iv)包含 SEQ ID NO: 11 的輕鏈 CDRl ；v)包含 SEQ ID NO: 12 的輕鏈 CDR2 ;和(vi)包含 SEQ IDNO: 13的輕鏈CDR3 ;在分離的抗體或其片段或衍生物的一些實施方案中，重鏈可變區(qū)域包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；和/或輕鏈可變區(qū)域包含SEQ IDNO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子編碼。
[0028]本文公開的主題還提供了包含本文公開的抗體或其片段或衍生物以及一或多種藥物學可接受的載體和/或賦形劑的組合物。在一些實施方案中，一或多種藥物學可接受的載體和/或賦形劑對在人中使用是可接受的。
[0029]本文公開的主題還提供了包含本文公開的與活性劑綴合的抗體或其片段或衍生物的組合物。在一些實施方案中，活性劑選自放射性分子、放射性核素、敏化劑分子、成像劑、放射性同位素、毒素、細胞毒素、抗生血管劑、抗腫瘤劑、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、報告基團和它們的組合。在一些實施方案中，放射性同位素選自kK211A^212PIk212BI125K1311、35S和3H。在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑選自吲哚胺_2，3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，任選地1-甲基-DL-色氨酸(IMT) ;EP2/EP4受體拮抗劑；環(huán)氧合酶抑制劑，任選地吲哚美辛(indomethacin);和樹突狀細胞活化劑,任選地CpG寡脫氧核苷(CpG 0DN)。
[0030]本文公開的主題還提供了包含本文公開的抗體或其片段或衍生物的試劑盒。在一些實施方案中，本文公開的試劑盒包括本文公開的抗體或其片段或衍生物的使用說明書。
[0031]本文公開的主題還提供了用于將活性劑靶向輸送到腫瘤細胞的輸送載體(vehicle)。在一些實施方案中,本文公開的輸送載體包括一或多種祀向劑,其包含本文公開的抗體或其片段或衍生物。在一些實施方案中，活性劑包括放射性分子、放射性核素、敏化劑分子、成像劑、放射性同位素、毒素、細胞毒素、抗生血管劑、抗腫瘤劑、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、報告基團和它們的組合。
[0032]本文公開的主題還提供了可產(chǎn)生本文公開的抗體或其片段或衍生物的分離的細胞。在一些實施方案中，分離的細胞為可產(chǎn)生本文公開的抗體的雜交瘤細胞。在一些實施方案中，雜交瘤為在布達佩斯條約的條款下在2010年12月16日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), 10801Uni versity Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, UnitedStates of America的ATCC登錄號為PTA-11550的雜交瘤細胞系。
[0033]本文公開的主題還提供了用于檢測生物學樣品中單克隆抗體TB-004所結(jié)合的表位的存在的方法。在一些實施方案中，所述方法包括:使生物學樣品與一或多個本文公開的分離的抗體或其片段或衍生物接觸；和檢測生物學樣品中單克隆抗體TAB-004所結(jié)合的表位的存在。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段或衍生物可與存在于粘蛋白(MUCl)多肽中的表位和/或存在于K-ras多肽，任選地突變體K-ras多肽中的表位相結(jié)合。
[0034]本文公開的主題還提供了用于制備抗體或其片段或衍生物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在所述抗體，其片段或衍生物表達的條件下培養(yǎng)本文公開的主題的分離的細胞或本文公開的主題的雜交瘤；和從所述細胞或雜交瘤和/或從所述細胞或雜交瘤生長的環(huán)境中回收所述抗體或其片段或衍生物。
[0035]本文公開的主題還提供了用于檢測對象中的腫瘤和/或癌細胞方法。在一些實施方案中，所述方法包括在足以使本文公開的抗體或其片段或衍生物結(jié)合生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌細胞上的表位的條件下，使對象中的或分離自對象的生物學樣品與包含本文公開的抗體或其片段或衍生物的組合物接觸；和檢測本文公開的抗體或其片段或衍生物與表位的結(jié)合，其中檢出結(jié)合表明在對象中存在腫瘤和/或癌細胞。在一些實施方案中，腫瘤和/或癌細胞為胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、結(jié)腸腫瘤或直腸腫瘤，和/或源自其中的轉(zhuǎn)移性細胞，其任選地表達MUC1、突變體K-ras或兩者。在一些實施方案中，本文公開的抗體或其片段或衍生物與可檢測的標記綴合，所述標記包含成像劑，其在一些實施方案中選自順磁性、放射性和熒光離子。在一些實施方案中，放射性成像劑選自伽馬發(fā)射體、正電子發(fā)射體和X射線發(fā)射體。在一些實施方案中，放射性成像劑選自43K、52Fe,57C0、67Cu、67Ga、68Ga、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、99MTC、mIn、113In、1231、1251、127Cs、129Cs、1311、1321、197Hg、2°3Pb和2tl6Bi。在一些實施方案中，生物學樣品為血液樣品或源自其中的級分。
[0036]本文公開的主題還提供了用于治療對象中的腫瘤的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向?qū)ο笫┯冒c活性劑綴合的本文公開的抗體或其片段或衍生物的組合物，由此所述活性劑與腫瘤接觸，從而治療腫瘤。在一些實施方案中，活性劑包含治療劑，任選地為化療劑、毒素、放療劑或其組合。在一些實施方案中，化療劑選自抗腫瘤藥物、細胞因子、抗代謝物、烷化劑、激素、氨甲喋呤、多柔比星、柔紅霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、環(huán)磷酰胺、順鉬、長春地辛、長春花生物堿、絲裂霉素、博萊霉素、嘌呤硫素、巨毛霉素、1，4-苯醌衍生物、三亞胺醌、類固醇、氨基蝶呤、蒽環(huán)類抗生素、秋水仙胺、依托泊苷、光輝霉素、多柔比星、柔紅霉素、長春新堿、新制癌菌素、巨毛霉素、a -鵝膏蕈堿、及它們的組合。在一些實施方案中，毒素選自拉塞爾氏蝰蛇毒、活化的因子IX、活化的因子X、凝血酶、磷脂酶C、眼鏡蛇毒因子、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、假單胞菌外毒素、白喉毒素、牛胰核糖核酸酶、美洲商陸抗病毒蛋白、相思子毒素、相思子毒素A鏈、白樹毒素、皂草素、蒴蓮根毒素、槲寄生凝集素、蒴蓮素、和它們的組合。在一些實施方案中，放療試劑選自 47SC、67Cu、9°Y、1(l9Pd、1231、1251、1311、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、212B1、32P、33P、71Ge、77As、ici3PtKici5RKmAgj19SlK121SrK 131Cs,143Pr^161Tb,177Lu^191Os,193MPt 和 197Hg。
[0037]本文公開的主題還提供了用于在對象中抑制腫瘤生長的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向攜帶有腫瘤的對象施用包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)域(CDR)的分離的抗體或其片段或衍生物。在一些實施方案中，腫瘤為胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、結(jié)腸腫瘤或直腸腫瘤，和/或源自其中的轉(zhuǎn)移性細胞，其任選地表達MUC1、突變體K-ras或兩者。在一些實施方案中，TAB-004的⑶R包括下述的一或多種:包含SEQ IDNO:8的重鏈CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11 的輕鏈 CDRl ;包含 SEQ ID NO: 12 的輕鏈 CDR2 ;和 / 或包含 SEQ ID NO: 13 的輕鏈⑶R3。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；和/或輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子編碼。
[0038]對本文公開的治療方法而言，在一些實施方案中，所述方法還包括向?qū)ο笫┯靡换蚨喾N常規(guī)抗腫瘤治療。在一些實施方案中，所述一或多種抗腫瘤治療選自放療、化療、另外的免疫療法、抗炎癥治療，和它們的組合。在一些實施方案中，抗炎癥治療包括向?qū)ο笫┯铆h(huán)加氧酶抑制劑，任選地為環(huán)加氧酶-2特異的抑制劑。一或多種另外的抗腫瘤治療包括向?qū)ο笫┯眉魉麨I(4-氨基-1-[2_脫氧-2，2 二氟-0 -D-赤式-戍呋喃糖基)口密P定-2 (IH)-酮-2’, 2’ - 二氟-2’ -脫氧胞苷))和塞來昔布(4-[5- (4-甲基苯基)-3- ( 二氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺)，或其任一或兩者的藥物學可接受的鹽。
[0039]本文公開的主題還提供了用于純化癌癥干細胞的方法。在一些實施方案中，所述方法包括提供疑似包含癌癥干細胞的細胞群；鑒定結(jié)合包含單克隆抗體TAB-004的CDR的抗體或其片段或衍生物的細胞亞群；和純化所述亞群。在一些實施方案中，所述細胞群包括分離自具有腫瘤和/或癌癥的對象的循環(huán)細胞。在一些實施方案中，本文公開的方法還包括在鑒定步驟之前和/或純化步驟之后從細胞群中移除譜系陽性(Iin+)細胞。
[0040]本文公開的主題還提供了在對象中用于將活性劑靶向至循環(huán)癌癥干細胞的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使循環(huán)癌癥干細胞與包含本文公開的抗體或其片段或衍生物和一或多種活性劑的組合物相接觸，所述抗體或其片段或衍生物包含單克隆抗體TAB-004的CDR，任選地其中所述一或多種活性劑包含治療劑，任選地為化療劑、毒素、放療劑或其組合。在一些實施方案中，所述治療劑包括免疫調(diào)節(jié)劑，任選地其中的免疫調(diào)節(jié)劑選自吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，任選地1-甲基-DL-色氨酸(IMT) ;EP2/EP4受體拮抗劑；和樹突狀細胞活化劑，任選地CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0DN)。
[0041]本文公開的主題還提供了用于預后之前治療過癌癥的對象中的癌癥復發(fā)的方法。在一些實施方案中，所述方法包括分離來自患有癌癥的對象的包含循環(huán)細胞的生物學樣品；在足以使本文公開的抗體或其片段或衍生物結(jié)合生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌細胞上的表位的條件下，使所述生物學樣品與本文公開的抗體或其片段或衍生物相接觸；和鑒定生物學樣品中結(jié)合所述抗體或其片段或衍生物的一或多種循環(huán)細胞，從而在對象中預后癌癥的復發(fā)。在一些實施方案中，生物學樣品包括血樣、淋巴樣品或其級分。在一些實施方案中，癌癥為胰腺癌或乳腺癌。在一些實施方案中，抗體或其片段或衍生物選自由在布達佩斯條約的條款下于2010年12月16日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard, Manassas, Virginia,20110-2209, United Statesof America保藏為登錄號PTA-11550的雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體；嵌合抗體，或其片段或衍生物；人源化抗體，或其片段或衍生物；人抗體，或其片段或衍生物；單鏈抗體，或其片段或衍生物；和Fab片段，以及其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)CDR。在一些實施方案中，單克隆抗體TAB-004的⑶R包括下述的氨基酸序列:包含SEQ ID NO: 8的重鏈⑶Rl ;包含SEQ IDNO:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈⑶R2 ;和包含SEQ ID NO: 13的輕鏈⑶R3。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；和/或輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子編碼。[0042]本文公開的主題還提供了用于在對象中預后癌癥進展的方法。在一些實施方案中，所述方法包括分離來自患有癌癥的對象的包含循環(huán)細胞的生物學樣品；在足以使本文公開的抗體或其片段或衍生物結(jié)合生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌細胞上的表位的條件下，使所述生物學樣品與本文公開的主題的抗體或其片段或衍生物相接觸；和鑒定生物學樣品中結(jié)合所述抗體或其片段或衍生物的一或多種循環(huán)細胞，從而在對象中預后癌癥進展。在一些實施方案中，生物學樣品包括血樣、淋巴樣品或其級分。在一些實施方案中，癌癥為胰腺癌或乳腺癌。在一些實施方案中，抗體或其片段或衍生物選自由根據(jù)布達佩斯條約的條款于2010年12月16日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas， Virginia，20110-2209， United States ofAmerica保藏為登錄號PTA-11550的雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體；嵌合抗體，或其片段或衍生物；人源化抗體，或其片段或衍生物；人抗體，或其片段或衍生物；單鏈抗體，或其片段或衍生物；和Fab片段，以及其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)CDR。在一些實施方案中，單克隆抗體TAB-004的⑶R包括下述的氨基酸序列:包含SEQ ID NO: 8的重鏈⑶Rl ;包含SEQ IDNO:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈⑶R2 ;和包含SEQ ID NO: 13的輕鏈⑶R3。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；和/或輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子編碼。在一些實施方案中，癌癥進展包括癌癥在對象中轉(zhuǎn)移。
[0043]本文公開的主題還提供了核酸分子，其包含SEQ ID N0:4和6中的何一，和/或編碼SEQ ID N0:5和7-13中的任一。在一些實施方案中，分離的核酸分子存在于載體中，其在一些實施方案中為表達載體。在一些實施方案中，分離的核酸分子存在于可操作地連接于一或多種另外編碼抗體分子子序列的核苷酸序列的表達載體中，從而在將表達載體引入適當?shù)乃拗鲀?nèi)時，宿主細胞表達完整的包含SEQ ID NO:5和7-13的一或多個的重組抗體，或其片段或衍生物。
[0044]因此，本文公開的`主題的目的是提供結(jié)合存在于腫瘤中的抗原的分離的抗體、和其片段和衍生物。
[0045]上文陳述了本文公開的主題的目的，其通過本文公開的組合物和方法完整或部分地實現(xiàn)，當結(jié)合本文下述最佳描述的附圖，隨著描述進行，其它目的將變得明顯。
[0046]附圖簡述
[0047]圖1A和IB為描繪了本文公開的主題的示例性抗體與人或鼠的胰腺腫瘤特異性結(jié)合的一系列顯微照片。畫欄(panel)中深色染色表明示例性抗體與樣品中存在的細胞的陽
性結(jié)合。
[0048]圖1A為描繪了示例性抗體與0期(作為陰性對照的正常胰腺組織)和2-4期的人腫瘤結(jié)合的一系列顯微照片。
[0049]圖1B為描繪了本文公開的主題的示例性抗體與攜帶了人MUCl轉(zhuǎn)基因和K-rasG12D突變的6、16、26和34周大的轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺中存在的自發(fā)性腫瘤結(jié)合的一系列顯微照片。
[0050]圖2A-2C為描繪了本文公開的主題的示例性抗體與人乳腺腫瘤組織(圖2A和2B)特異性結(jié)合但不與毗鄰的正常乳腺組織結(jié)合(圖2C)的一系列顯微照片。
[0051]圖3為顯示了創(chuàng)建在胰腺中表達Cre重組酶、突變體K-ras原癌基因多肽和人MUCl多肽的三轉(zhuǎn)基因鼠株系的途徑原理圖(左上欄)。此鼠發(fā)展出胰腺癌，其細胞用于產(chǎn)生原代腫瘤細胞系KCM(下欄)。KCm細胞系用于測試本文公開的主題的單獨或綴合CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0DN)的示例性抗體(圖中表示為“TAB”并在本公開中為“TAB-004”)的結(jié)合。確定未綴合的和綴合的抗體以相等親和力結(jié)合KCM胰腺細胞系(右上欄)。
[0052]圖4A和4B為顯示了本文公開的主題的示例性抗體(TAB-004)增強了天然殺傷細胞(NK)的細胞毒性以殺傷靶標腫瘤細胞。抗體與CpG ODN的綴合也增強了此效果，從而證明示例性抗體能夠在體內(nèi)增強抗腫瘤免疫應答。
[0053]圖4A為線圖，顯示了示例性TAB-004抗體相對于陰性對照(無TAB-004抗體)，以不同的效應子(NK細胞)與靶的比值(E:T比值)增強了 KCM腫瘤細胞特異性裂解。
[0054]圖4B為柱狀圖，顯示了相對于未綴合的抗體，示例性TAB-004抗體與CpG ODN的綴合以不同E:T比值進一步增強了腫瘤細胞特異性裂解。
[0055]圖5A和5B展示了為測試本文公開的主題的示例性抗體(TAB-004)和其綴合物在MUCl轉(zhuǎn)基因(MUClTg)小鼠中降低所建立的KCM腫瘤的腫瘤體積的能力而設計的實驗的結(jié)果。
[0056]圖5A為線圖，其顯示了在用磷酸鹽緩沖液(PBS)單獨處理(陰性對照；實心方塊)、CpG ODN單獨處理(X)，未綴合的TAB-004抗體(空心圓圈)，或TAB-004-CpG ODN綴合物(實心圓圈)處理的小鼠中所測量的腫瘤體積(用游標卡尺測量的毫米)。
[0057]圖5B為柱狀圖，其 顯不了在施用最終處理后19和27天小鼠中腫瘤體積的變化。值得注意的是，當與對照小鼠(即PBS單獨，CpG單獨，或TAB-004單獨處理)相比時，觀察到在處理后19和27天，用TAB-004-CpG ODN處理的小鼠中的腫瘤體積沒有增加。*:p〈0.5。PBS單獨(陰性對照；白色柱)；CpG ODN單獨(陰影柱)；未綴合的TAB-004抗體(黑色柱);TAB-004-CpG ODN綴合物(交叉陰影柱)。
[0058]圖6為本文公開的主題的示例性組合物和其示例性用途的原理圖。ADCC-抗體依賴性細胞介導的細胞毒性；CDC-補體依賴性細胞毒性；ADEPT-抗體導向的酶前藥療法。
[0059]圖7A和7B為CD133+ (圖7A)比對CD24+/CD44+/EpCAM+ (圖7B)細胞的熒光激活細胞分選(FACS)分離物和本文公開的TAB-004抗體與這些群體結(jié)合的程度的直方圖。每欄左側(cè)的線對應用陰性對照抗體分選，而每欄右側(cè)的線對應用TAB-004抗體分選。
[0060]圖8A-8D為FACS散點圖，顯示了 TAB-004抗體與胰腺腫瘤(“腫瘤I ”)和毗鄰的正常組織(“正常”)的結(jié)合，其使用TAB-004抗體和直接針對CXC趨化因子受體4(CXCR4)的抗體。MUCl:TAB-004抗體；CXCR4:抗-CXCR4抗體；FL1_H:熒光染色I度(熒光-FITC)；FL2-H:熒光染色2度(藻紅蛋白-PE) ；SSC-H:側(cè)向散射度；FSC_H:前向散射度；FL4_H:熒光染色4度(藻藍蛋白-APC)。
[0061]圖8A為散點圖，其顯示了在缺乏任一抗體下的細胞的分布。圖8B為散點圖，其顯示了用同種型對照染色的細胞的分布。圖8C為一系列散點圖，其顯示了在正常組織中用TAB-004抗體與CXCR4抗體染色的細胞分布的比對。圖8D為一系列散點圖，其顯示了在胰腺癌組織中用TAB-004抗體與CXCR4抗體染色的細胞分布的比對。
[0062]圖9A-9C為一系列FACS點圖，其顯示了本文公開的主題的TAB-004抗體在胰腺癌患者中檢測循環(huán)腫瘤細胞優(yōu)于標準EpCAM抗體。未染色的細胞(最左側(cè)黑色線)；EpCAM-PE (0.lmg/ml)染色的細胞(深灰色線)；TAB-004_PE (0.lmg/ml)染色的細胞(最右側(cè)黑線)；TAB-004-PE(0.02mg/ml)染色的細胞(淺灰色線)；TAB-004_PE (0.004mg/ml)染色的細胞(中等灰色線)。“-PE”表示為了分選的目的，抗體標記有藻紅蛋白。
[0063]在圖9A中，TAB-004-PE抗體檢測到PANCl胰腺癌細胞系細胞。在圖9B和9C中，TAB-004-PE抗體在來自2個患者(分別為患者號I和患者號2)的血液中(見圖9B中最右側(cè)黑色線和圖9C中最右側(cè)的黑色和淺灰色線)檢測到循環(huán)腫瘤細胞存在，但目前使用的EpCAM-PE抗體(見圖9B和9C中淺灰色線)檢測不到。
[0064]圖10為酶免疫測定(EIA)中CA15-3抗原特異的抗體與TAB-004在血漿中檢測癌癥細胞表現(xiàn)的比較柱狀圖。白色框:TAB-004抗體。黑色框:CA15-3。虛線:TAB-004正常閾值；點線:CA15-3正常閾值。
[0065]圖11與基于CA15-3的EIA相比，TAB-004用于檢測胰腺癌患者血漿中作為分期的函數(shù)的釋放的(shed)MUCl水平的酶免疫測定中的表現(xiàn)的柱狀圖。白色框:TAB_004抗體。黑色框:CA15-3。
[0066]序列表簡述
[0067]SEQ ID NO:1為人MUCl基因產(chǎn)物的氨基酸序列。它對應于GENBANK?登錄號 AAA60019。
[0068]SEQ ID NO: 2為人K-ras原癌基因產(chǎn)物的氨基酸序列。它對應于GENBANKf)登錄號 NP_004976。
[0069]SEQ ID NO: 3為本文公開的TAB-004抗體在ELISA測定中可結(jié)合的肽的氨基酸序列。因此所述肽包括TAB-004抗體特異性結(jié)合的表位。
[0070]SEQ ID NO:4和5分別為本文公開的TAB-004抗體的重鏈的核苷酸和所編碼的氨
基酸序列。
[0071]SEQ ID N0:6和7分別為本文公開的TAB-004抗體的輕鏈的核苷酸和所編碼的氨
基酸序列。
[0072]SEQ ID N0:8-10分別為本文公開的TAB-004抗體的重鏈的CDR1、CDR2和CDR3氨
基酸序列。
[0073]SEQ ID勵:11-13分別為本文公開的了48-004抗體的輕鏈的0)1?1、0)1?2和0)1?3氨基酸序列。
[0074]發(fā)明詳述
[0075]現(xiàn)在將通過參考所附附圖和實施例更完整地在下文描述本文公開的主題，其中顯示了本文公開的主題的代表性的實施方案。然而，本文公開的主題可以以不同的形式實施，并不應該被解釋為局限于本文列出的實施方案內(nèi)。相反，提供這些實施方案使得這項公開是徹底的和完整的，也能向本領域的技術(shù)人員完全傳達本文公開的主題的范圍。
[0076]1.定義
[0077]本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方案的目的，并不是為了限制本文公開的主題。
[0078]可相信下述術(shù)語將被本領域普通技術(shù)人員很好地理解，列出下述定義以便于解釋本文公開的主題。
[0079]除非下文另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語應當具有如本領域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。提及引用本文所采用的技術(shù)意指如本領域通常所理解的，其包括對本領域技術(shù)人員將是顯而易見的這些技術(shù)的變化或等效的替代技術(shù)?？上嘈畔率鲂g(shù)語將被本領域普通技術(shù)人員很好地理解，列出下述定義以便于解釋本文公開的主題。
[0080]為了描述本文公開的主題，應理解將公開許多技術(shù)和步驟。這些技術(shù)中每種都具有各自的益處并每種還可與一或多種，或在一些情況下，全部其它公開的技術(shù)聯(lián)合使用。
[0081]因此，為了清楚起見，本說明書將避免以不必要的方式重復單個步驟的每個可能的組合。然而，應以理解這樣的組合完全在本文公開的領域和主張的主題的范圍內(nèi)的方式閱讀本說明書和權(quán)利要求書。
[0082]遵循長期以來的專利法慣例，當在本申請中，包括權(quán)利要求中使用時，術(shù)語“a”、“an”和“the”指“一或多個”。例如，短語“抗體”指一或多個抗體，包括相同抗體的復數(shù)形式。相似地，當本文采用短語“至少一個”指代實體時，意指，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多該實體，包括但不限于1-100之間和大于100的
所有數(shù)字值。
[0083]除非另有說明，在本說明書和權(quán)利要求書中所使用的所有表達成分量、反應條件等的數(shù)字在所有情況下應被理解為被術(shù)語“大約”所修飾。如本文中所用，當指可測量的值例如質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分比的量的時候，術(shù)語“大約”意指涵蓋對特定數(shù)值的在一些實施方案中±20%,在一些實施方案中±10%,在一些實施方案中國±5%、在一些實施方案中±1%，在一些實施方案中±0.5%和在一些實施方案中±0.1%的變化，因為這樣的變化是適合于進行公開的方法和 /或采用公開的組合物。因此，除非有相反表示，說明書和所附權(quán)利要求書中表述的數(shù)字參數(shù)均為近似值，其可能有所不同，取決于本文公開的主題試圖獲取的所需特性。
[0084]如本文中所用，當用于一系列實體的上下文中時，術(shù)語“和/或”意指單獨地或組合地表示的實體。因此，例如，短語“A、B、C和/或D”，單獨地包括A、B、C和D，但還包括A、B、C和D的任何和全部組合和亞組合。
[0085]術(shù)語“包含(comprising)”,與“包括(including) ”、“含有(containing) ” 或“特征在于”是同義的，其為包含性或開放式的，并不排除另外的、未例舉的元素和/或方法步驟?！鞍?comprising)”為專用術(shù)語，意指存在所述的元素和/或步驟，但還可添加其它元素和/或步驟，并仍落入相關主題的范圍中。
[0086]如本文中所用，短語“由……組成”排除了任何沒有特別引用的元素、步驟或成分。應注意，當短語“由……組成”出現(xiàn)于權(quán)利要求的主體的從句而不是立即在前導語(preamble)之后時，它僅限制該從句中所列出的元素；其它元素不從所述權(quán)利要求整體中排除。
[0087]如本文中所用，短語“基本上由……組成”將相關公開或權(quán)利要求的范圍限制為特定的物質(zhì)和/或步驟，加上那些不對本公開和/或權(quán)利要求主題的基本的和新穎的特征構(gòu)成實質(zhì)影響的物質(zhì)和/或步驟。例如，藥物學組合物可“基本上由”藥物學活性劑或多種藥物學活性劑組成，其指所記載的藥物學活性劑為存在于所述藥物學組合物中僅有的藥物學活性劑。然而，應注意載體、賦形劑和/或其他非活性試劑可能并很可能存在于這樣的藥物學組合物中。
[0088]考慮到術(shù)語“包括”、“由……組成”和“基本由……組成”，這3個術(shù)語中的一個在本文使用時，本文公開和所要求的主題可包括另外2個術(shù)語中任一的使用。例如，在一些實施方案中，本文公開的主題涉及包含抗體的組合物。本領域普通技術(shù)人員在瀏覽本公開后應理解，本文公開的主題因此涵蓋基本由本文公開的主題的抗體組成的組合物，以及由本文公開的主題的抗體組成的組合物。
[0089]如本文中所用，術(shù)語“對象”指任何無脊椎動物或脊椎動物物種的成員。因此，在一些實施方案中，術(shù)語“對象”旨在涵蓋動物界(Kingdom Animalia)的任何成員，包括但不限于，脊索動物門(例如，硬骨魚綱(Osteichythyes)(硬骨魚)、爬行綱(Reptilia)(爬行類)、鳥綱(Aves)(鳥)和哺乳綱(Mammalia)(哺乳動物)的成員)和其中涵蓋的所有目和科。
[0090]本文公開的主題的組合物和方法對溫血脊椎動物是特別有用的。因此，在一些實施方案中，本文公開的主題涉及哺乳動物和鳥類。更具體提供的是組合物和方法，其源自和/或用于哺乳動物例如人和其它靈長類，以及對人類是由于受到威脅而重要的(例如西伯利亞虎)、具有經(jīng)濟重要性的(農(nóng)場飼養(yǎng)的用于人類消費的動物)和/或具有社會重要性的(作為寵物或在動物園中的動物)那些哺乳動物，例如人類之外的其它肉食動物(例如貓和狗)、豬(豬、家豬和野豬)、反會動物(例如牛、公牛、羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)、嚙齒動物(例如小鼠、大鼠和兔子)、有袋類動物和馬。還提供的是所公開的方法和組合物用于鳥的用途，其包括那些危險的、存于動物園的鳥，以及飛禽，和更特別馴化的飛禽，例如，家禽，如火雞，雞，鴨，鵝，珍珠雞等，因為它們是對人類也具有經(jīng)濟重要性。因此，還提供的是所公開的方法和組合物用于家畜的用途，其包括但不限于馴化的豬(豬和家豬)、反芻動物、馬、家禽等等。
[0091]相似的，本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物旨在對應來自任何物種的同系物和/或同源物，對于所 述同系物和/或同源物本文公開的其它方法是可用的。因此，所述術(shù)語包括但不限于，來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應理解，除非上下文清楚地表示，當來自特定物種的基因或基因產(chǎn)物被公開時，此公開僅是為了示例性的，并不被解釋為限制。因此，例如對于GENBANK g'登錄號:AAA60019和NP_004976代表的基因，公開的人
氨基酸序列旨在涵蓋來自其他動物，包括但不限于其它哺乳動物、魚、兩棲動物、爬行動物和鳥的同源基因和基因產(chǎn)物。還涵蓋的是任何和所有編碼了所公開的氨基酸序列的核苷酸序列，包括但不限于那些公開于相應的GENBANK⑩條目的那些(即分別為J05582.1和NM_004985)。
[0092]術(shù)語“癌癥”和“腫瘤”在本文中可互換地使用，并指對象中任何組織的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性實體腫瘤和癌，包括但不限于，乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸；泌尿道包括腎臟、膀胱和尿道上皮；女性生殖道包括子宮頸、子宮、卵巢(例如，絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)細胞疾病)；男性生殖道包括前列腺、儲精囊、睪丸和精子細胞腫瘤；內(nèi)分泌腺包括甲狀腺、腎上腺和垂體；皮膚(例如，血管瘤和黑色素瘤)、骨或軟組織；血管(例如，卡波濟氏肉瘤)；大腦、神經(jīng)、眼睛和腦膜(例如，星形細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤)。如本文中所用，術(shù)語“癌癥”和“腫瘤”還指多細胞腫瘤以及單個新生物(neoplastic)細胞或前新生物(pre-neoplastic)細胞。在一些實施方案中，癌癥或腫瘤包括上皮組織癌癥或腫瘤例如但不限于癌。在一些實施方案中，腫瘤為腺癌，其在一些實施方案中為胰腺、乳腺、卵巢、直腸或結(jié)腸腺癌，和/或源自它們的轉(zhuǎn)移性細胞。
[0093]如本文中在分子的上下文中所用，術(shù)語“效應子”指任何分子或分子的組合，期望其活性能輸送進入和/或定位于細胞。效應子包括但不限于，標記、細胞毒素、酶、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、藥物等。
[0094]如本文中在免疫系統(tǒng)的細胞上下文中所用，術(shù)語“效應子”指免疫系統(tǒng)細胞，其可被誘導以實現(xiàn)與對刺激的免疫應答相關的特定功能。示例性的效應子細胞包括但不限于，天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞(TC細胞)。
[0095]如本文中所用，術(shù)語“表達載體”指DNA序列，其能夠在適當?shù)乃拗骷毎兄笇囟ê塑账嵝蛄械谋磉_，其包括可操作地與感興趣的核酸序列連接的啟動子，所述序列可操作地連接于終止信號。通常它還包括核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包括感興趣的核苷酸序列的構(gòu)建體可為嵌合體。構(gòu)建體還可為天然存在的，但以可用于異源表達的重組形式獲得。在一些實施方案中，表達載體包括本文公開的主題的分離的核酸分子，其在一些實施方案中包括SEQ ID N0:4和6的任何一個，或編碼SEQ ID NO: 5和7_13的任何一個。在一些實施方案中，分離的核酸分子存在于可操作地連接于一或多種另外編碼抗體分子子序列的核苷酸序列的表達載體中，從而在將表達載體引入適當?shù)乃拗鲀?nèi)時,宿主細胞會表達完整的包含SEQ ID NO: 5和7-13的一或多個的重組抗體，或其片段或衍生物。
[0096]如本文中所用，術(shù)語“雜交瘤”指在實驗室中由融合產(chǎn)抗體淋巴細胞和不產(chǎn)抗體癌細胞而產(chǎn)生的細胞或細胞系(通常為骨髓瘤或淋巴瘤細胞)。如本領域普通技術(shù)人員所知的，雜交瘤可增殖并持續(xù)供應產(chǎn)生特定單克隆抗體。用于產(chǎn)生雜交瘤的方法為本領域已知的(見例如，Harlow&Lane, 1988)。
[0097]如本文中所用，術(shù)語“可操作`地連接”和“可操作的連接”指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如但不限于，啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等)以核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄被所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制和調(diào)節(jié)的方式與核酸序列(例如，編碼序列或開放讀碼框)連接。相似地，將核苷酸序列稱為在它所可操作地連接的啟動子的“轉(zhuǎn)錄控制”下。用于將啟動子區(qū)域可操作地連接于核酸分子的技術(shù)為本領域已知的。
[0098]如本文中所用，術(shù)語“前藥”指藥物(例如，細胞毒性劑)的類似物和/或前體，其基本上缺乏所述藥物(例如，細胞毒活性)的生物學活性，直至經(jīng)歷活化步驟。活化步驟可包括酶切割、化學活化步驟例如暴露于還原劑，和/或物理活化步驟例如光解。在一些實施方案中，活化在對象身體中體內(nèi)發(fā)生。
[0099]I1.抗體和其片段和衍生物，以及其產(chǎn)生方法
[0100]I1.A.概述
[0101]在一些實施方案中，本文公開的主題提供了分離的抗體，以及其片段和衍生物，其與存在于腫瘤中的抗原結(jié)合，例如但不限于存在于MUCl多肽中的抗原。
[0102]如本文中所用，術(shù)語“抗體(antibody) ”和“抗體(antibodies) ”指蛋白質(zhì),其包含基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼的一或多種多肽。免疫球蛋白基因通常包括卡帕U)、蘭不達(λ)、阿爾法(α)、伽馬U)、德爾塔(δ)、宇普西隆(ε)和繆(U)恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為K或X。在哺乳動物中，重鏈分類為Y、U、a、S或e ,其反過來定義了免疫球蛋白型別,分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。其它物種具有其它輕鏈和重鏈基因(例如，某些鳥類產(chǎn)生的稱為IgY的，其為母雞在它們的蛋的卵黃質(zhì)中存儲的免疫球蛋白類型)，其相似地由本文公開的主題所涵蓋。在一些實施方案中，術(shù)語“抗體”指特異性結(jié)合表位的抗體，所述表位存在于腫瘤抗原上，所述腫瘤抗原包括但不限于MUCl多肽和/或突變體K-ras多肽。在一些實施方案中，術(shù)語“抗體”指特異性結(jié)合SEQ ID NO: 1-3任一中存在的表位的抗體。
[0103] 已知典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。每個四聚體由2對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(平均分子質(zhì)量約25千道爾頓(kDa))和一條“重”鏈(平均分子量約50-70kDa)。兩對相同的多肽鏈以二聚體形式通過存在于重鏈區(qū)的二硫鍵保持在一起。每條鏈的N端定義了約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負責抗原識別(有時稱為“互補位”)。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕和重鏈。
[0104]抗體通常以完整的免疫球蛋白或可由不同的肽酶消化產(chǎn)生的大量良好表征的片段存在。例如，用木瓜蛋白酶消化抗體分子在二硫鍵的N端位置切割抗體。這產(chǎn)生了 3個片段:2個相同的“Fab”片段，其具有輕鏈和重鏈的N末端，和“Fe”片段，其包括由二硫鍵保持在一起的重鏈的C末端。另一方面，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵的C末端消化抗體，產(chǎn)生稱為“F(ab)’ 2”的片段，其為由二硫鍵連接的Fab片段的二聚體?？稍跍睾偷臈l件下還原F(ab) ’ 2片段以打破鉸鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F(ab) ’ 2 二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)?個“Fab’ ”單體。Fab’單體基本上為Fab片段，伴有部分鉸鏈區(qū)(見例如，Paul, 1993中對其它抗體片段更詳細的描述)。對于這些不同片段，F(xiàn)ab、F(ab’)2和Fab’片段包括至少一個完整的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(互補位)，并因此能夠結(jié)合抗原。
[0105]盡管根據(jù)完整抗體的消化定義出不同的抗體片段，技術(shù)人員將理解，可通過化學或利用重組DNA方法體外合成各種的這些片段(包括但不限于Fab’片段)。因此，如本文中所用，術(shù)語“抗體”還包括由修飾整個抗體和/或使用重組DNA方法體外合成而產(chǎn)生的抗體片段。在一些實施方案中，術(shù)語“抗體”包括具有至少一個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(互補位)的片段。
[0106]抗體可為多克隆的和單克隆的。如本文中所用，術(shù)語“多克隆”指共同存在于給定的抗體集合中的抗體，并源自不同的產(chǎn)抗體細胞(例如B細胞)。示例性的多克隆抗體包括但不限于，結(jié)合特定抗原的抗體以及在動物對抗原產(chǎn)生免疫應答后發(fā)現(xiàn)于所述動物血液中的抗體。然而，應理解還可通過混合不相同的至少2種抗體人工制備多克隆抗體制備物。因此，多克隆抗體一般包括不同的抗體，其針對(即，結(jié)合)任何給定抗原的相同和/或不同表位(有時指“抗原決定簇”或僅“決定簇”)。
[0107]如本文中所用，術(shù)語“單克隆”指單個抗體種類和/或單個抗體種類的基本上均質(zhì)的群體。換句話說，“單克隆”指單種抗體或單種抗體的群體，其中抗體在特異性和親和性上是相同的，除了可能自然發(fā)生的可少量存在的突變。一般地，單克隆抗體OnAb或moAb)通過單個B細胞或其后代細胞產(chǎn)生(盡管本文公開的主題也涵蓋如本文描述的通過分子生物學技術(shù)產(chǎn)生的“單克隆”抗體)。單克隆抗體OnAb或moAb)通常是高度特異地針對單個抗原性位點的。另外，與多克隆抗體制備物相反，給定的mAb通常是針對抗原上的單個表位。
[0108]除了它們的特異性，mAb還對一些目的是有利的，其中它們可合成而不被其它抗體污染。然而，修飾語“單克隆”不應被解釋為要求抗體由任何特定的方法所產(chǎn)生。例如，在一些實施方案中，使用首次由Kohler等人，1975描述的雜交瘤方法制備本文公開的主題mAb,而在一些實施方案中，在原核或真核細胞中使用重組DNA方法制造(見例如，美國專利號4，816，567，其整體內(nèi)容通過引用并入本文)。還可使用例如描述于Clackson等人，1991和Marks等人,1991的技術(shù)從曬菌體抗體庫分離mAb。
[0109]本文公開的主題的抗體、片段和衍生物還可包括嵌合抗體。如本文中所用，在抗體的上下文中，術(shù)語“嵌合”和其語法變形指抗體衍生物，其具有基本上或完全來自一個物種恒定區(qū)的恒定區(qū)，和基本上或完全來自另一物種可變區(qū)序列的可變區(qū)。
[0110]可變區(qū)允許抗體選擇性地識別和特異性地結(jié)合抗原上的表位。這就是說，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域，或這些可變結(jié)構(gòu)域中互補決定區(qū)(OTR)的子集相組合形成定義了三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。此四元抗體結(jié)構(gòu)形成了存在于抗體的每個臂末端的抗原結(jié)合位點。更具體的，抗原結(jié)合位點由在VH和VL鏈每個上面的3個CDR所定義。在一些例子中(例如，源自駱駝科物種或基于駱駝科免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子)，完整的免疫球蛋白分子可無輕鏈而僅由重鏈組成(見例如，Hamers-Casterman等人，1993)。
[0111]在天然存在的抗體中，在每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在有6個CDR，其為短的、非連續(xù)的氨基酸序列，被特異地定位以在抗體采用其在水性環(huán)境中的三維構(gòu)型時形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中剩下的氨基酸稱為“框架”區(qū)，顯示較少的分子間可變性?？蚣軈^(qū)多數(shù)采用β折疊構(gòu)象，并且⑶R形成連接β折疊結(jié)構(gòu)，并在一些情況下形成β折疊結(jié)構(gòu)的部分的環(huán)。因此，框架區(qū)作用是形成腳手架，其通過鏈間非共價相互作用使得⑶R以正確方向定位。由定位的CDR形成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定義出與免疫反應性抗原上的表位互補的表面。這個互補表面促進了抗體與其同源表位的非共價結(jié)合。對任何給定的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含CDR和框架區(qū)的氨基酸分別可容易地由本領域普通技術(shù)人員鑒定，因為他們已被準確地定義(見例如，Chothia和Lesk, 1987;Kabat等人，1991 ；Martin, 1996 ；Johnson 和 Wu,2000)。
`[0112]特定種類的嵌合抗體為“人源化”抗體，其中抗體通過例如用鼠抗體的CDR取代人抗體的⑶R產(chǎn)生(見例如，PCT國際專利申請出版號W01992/22653)。因此，在一些實施方案中，人源化抗體具有除了基本或完全來自人抗體相應區(qū)域的CDR之外的恒定區(qū)和可變區(qū)，和基本或完全來自除了人之外的哺乳動物的CDR。
[0113]本文公開的主題抗體、片段和衍生物還可為單鏈抗體和單鏈抗體片段。單鏈抗體片段包含具有本文描述的完整抗體的至少一個可變區(qū)和/或CDR的氨基酸序列，但缺乏那些抗體的恒定結(jié)構(gòu)域的一些或全部。這些恒定結(jié)構(gòu)域?qū)乖Y(jié)合是非必須的，但構(gòu)成完整抗體結(jié)構(gòu)的主要部分。
[0114]單鏈抗體片段可克服一些與使用包含部分或全部恒定結(jié)構(gòu)域的抗體相關的問題。例如，單鏈抗體片段傾向于沒有不想要的生物學分子和重鏈恒定區(qū)間的相互作用和其它不想要的生物學活性。另外，單鏈抗體片段遠小于完整抗體并因此具有比整個抗體更高的毛細血管通透性的特征，其允許單鏈抗體片段更有效地定位和結(jié)合靶抗原結(jié)合位點。另外，抗體片段可在原核細胞中相對大規(guī)模地生產(chǎn)，從而便于它們的生產(chǎn)。另外，相對小的單鏈抗體片段使它們比完整抗體更不可能在受體中激起免疫應答。本文公開的主題的單鏈抗體片段包括但不限于，單鏈可變區(qū)(scFv)抗體和其衍生物，例如但不限于，串聯(lián)二 scFv、串聯(lián)三scFv、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體和微體。
[0115]Fv片段對應于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的N端可變片段。Fv片段的兩條鏈似乎比Fab片段具有更低的相互作用能能量。為了穩(wěn)定VH和VL結(jié)構(gòu)域的關聯(lián)，可用肽(見例如，Bird 等人，1988 ；Huston 等人，1988)、二硫橋(見例如，Glockshuber 等人，1990)和 / 或“knob in hole”突變體(見例如,Zhu等人，1997)連接它們?？赏ㄟ^本領域技術(shù)人員公知的方法生產(chǎn)ScFv片段(見例如，Whitlow等人，1991 ；Huston等人，1993)。
[0116]可在細菌細胞如大腸桿菌或在真核細胞中生產(chǎn)scFv。scFv的一個潛在的不利是產(chǎn)物的單價性(其妨礙由于多價結(jié)合而提高親和力)和它們的短半衰期。克服這些問題的嘗試包括通過化學偶聯(lián)從包含另外的C端半胱氨酸的scFv產(chǎn)生二價(scFv’)2(見例如，Adams等人，1993 ；McCartney等人，1995),或通過包含未配對的C端半胱氨酸殘基的scFv自發(fā)的位點特異性二聚化產(chǎn)生二價(scFv’)2(見例如，Kipriyanov等人，1995)。
[0117]另外，可通過縮短肽接頭至3-12殘基強制scFv形成多聚體而形成“雙抗體”(見例如，Holliger等人，1993)?？s減接頭還另外可獲得scFv三聚體(“三抗體”;見例如Kortt等人，1997)和四聚體(“四抗體”;見例如Le Gall等人，1999)。還可通過與蛋白質(zhì)二聚化基序遺傳融合形成“微抗體”(見例如，Pack等人，1992)和“微體”(見例如，Hu等人，1996)來實現(xiàn)二價scFv分子的構(gòu)建。可通過第三肽接頭連接兩個scFv單元產(chǎn)生scFv-scFv串聯(lián)((ScFv)2)(見例如，Kurucz 等人，1995)。
[0118]雙特異性雙抗體可以通過2個單鏈融合產(chǎn)物的非共價連接產(chǎn)生，所述單鏈融合產(chǎn)物由通過短接頭與另一個抗體的VL結(jié)構(gòu)域相連接的來自一個抗體的VH結(jié)構(gòu)域組成(見例如，Kipriyanov等人，1998)。這樣的雙特異性雙抗體的穩(wěn)定性可通過如上文描述地引入二硫橋或“knob in hole”突變,或通過形成單鏈雙抗體(scDb)(其中通過肽接頭連接2個雜交scFv片段)來增強(見例如，Kontermann等人，1999)。
[0119]可產(chǎn)生四價雙特異性分子，例如通過將scFv片段融合至IgG分子的CH3結(jié)構(gòu)域或融合至通過鉸鏈區(qū)Fab片段(見例如，Coloma等人，1997)。或者，通過融合雙特異性單鏈雙抗體創(chuàng)建四價雙特異性分子(見例如，Alt等人，1999)。還可通過用包含螺旋-環(huán)-螺旋基序的接頭二聚化scFv-scFv串聯(lián)體(DiBi微抗體；見例如Muller等人，1998),或以阻止分子內(nèi)配對的順序包含四個抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH和VL)的單鏈分子(串聯(lián)雙抗體；見例如，Kipriyanov等人，1999)形成更小的四價雙特異性分子。
[0120]可通過Fab’片段的化學偶聯(lián)或通過亮氨酸拉鏈的異源二聚化創(chuàng)建雙特異性F(ab’)2片段(見例如，Shalaby等人，1992 ;Kostelny等人，1992)。還可用的是分離的VH和VL結(jié)構(gòu)域(見例如，美國專利號6，172，197,6, 248，516和6，291，158)。
[0121]本文公開的主題還包括本文公開的主題的抗體的功能性等效物。如本文中所用，短語“功能性等效物”指抗體，其指具有與給定抗體相當?shù)慕Y(jié)合特性的分子。在一些實施方案中，將嵌合抗體、人源化抗體和單鏈抗體，以及其片段認為是其所基于的對應抗體的功能性等效物。在一些實施方案中，本文公開的主題提供本文公開的TAB-004mAb的功能性等效物。
[0122]功能性等效物還包括具有與本文公開的主題的抗體的可變或超變區(qū)氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。如本文中所用，對核酸和/或氨基酸序列，短語“基本上相同”指生物序列與另一個核酸和/或氨基酸序列具有在一些實施方案中至少80%，在一些實施方案中至少85%，在一些實施方案中至少90%，在一些實施方案中至少91%，在一些實施方案中至少92%，在一些實施方案中至少93%，在一些實施方案中至少94%，在一些實施方案中至少95%，在一些實施方案中至少96%，在一些實施方案中至少97%，在一些實施方案中至少98%,在一些實施方案中至少99%的序列相同性,如參考Pearson和Lipman, 1988,通過FASTA搜索方法所確定的。在一些實施方案中，對本文公開的主題抗體的核酸和/或氨基酸序列全長計算相同性百分比。
[0123]在一些實施方案中，核苷酸序列的功能性等效物為編碼相同氨基酸序列的序列(即包括一或多個功能性等效密碼子)。功能性等效密碼子的列表示于表1。
[0124]表1
[0125]功能性等效密碼子
【權(quán)利要求】
1.分離的抗體或其片段或衍生物，其包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)(CDR)。
2.權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物，其中所述分離的抗體或其片段或衍生物為多克隆的。
3.權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物，其中所述分離的抗體或其片段或衍生物為單克隆的。
4.權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物，其中所述分離的抗體或其片段或衍生物為人的或人源化的。
5.權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物，其選自由雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體，所述細胞系在2010年12月16日以登錄號PTA-11550保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);嵌合抗體，或其片段或衍生物；人源化抗體，或其片段或衍生物；人抗體，或其片段或衍生物；單鏈抗體，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的CDR。
6.權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物，其中所述單克隆抗體TAB-004的CDR包括包含SEQ ID NO:8的重鏈CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈CDR2 ;和包含SEQID NO: 13 的輕鏈 CDR3。
7.權(quán)利要求6的分離的抗體或其片段或衍生物，其中所述抗體或其片段或衍生物的重鏈包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ IDNO:4的核酸分子編碼；所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子編碼。
8.組合物，其包含權(quán)利要求1 的抗體或其片段或衍生物和藥物學可接受的載體，任選地其中所述藥物學可接受的載體對于在人中使用是可接受的。
9.組合物，其包含綴合于活性劑的權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述活性劑選自放射性分子、放射性核素、敏化劑分子，成像劑、放射性同位素、毒素、細胞毒素、抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、報告基團、和它們的組合。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述放射性同位素選自1QB、211At、212Pb、212B1、1251、m1、35S 和 3H。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，任選地為1-甲基-DL-色氨酸(IMT)) ;EP2/EP4受體拮抗劑；環(huán)氧合酶抑制劑，任選地為吲哚美辛；和樹突狀細胞活化劑，任選地為CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0ND)。
13.試劑盒，其包含權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物，以及其使用說明書。
14.輸送載體，其用于將活性劑靶向輸送至腫瘤細胞，所述輸送載體包含靶向劑，其包含權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物。
15.權(quán)利要求14的輸送載體,其中所述活性劑選自放射性分子、放射性核素,敏化劑分子，成像劑、放射性同位素、毒素、細胞毒素、抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、報告基團、和它們的組合。
16.分離的細胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物。
17.產(chǎn)生權(quán)利要求1的抗體的雜交瘤，任選地其中所述雜交瘤為在2010年12月16日在布達佩斯條約的條款下保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的雜交瘤細胞系ATCC登錄號PTA-11550。
18.方法，其用于檢測生物學樣品中單克隆抗體TAB-004結(jié)合的表位的存在，所述方法包括: (a)使所述生物學樣品與權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物相接觸；和 (b)檢測所述生物學樣品中單克隆抗體TAB-004結(jié)合的表位的存在。
19.權(quán)利要求18的方法，其中權(quán)利要求1的分離的抗體或其片段或衍生物結(jié)合存在于粘蛋白(MUCl)多肽或K-ras多肽上的表位，任選地突變體K-ras多肽上的表位。
20.方法，其用于制備抗體或其片段或衍生物，所述方法包括: (a)在使得所述抗體或其片段或衍生物表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16的分離的細胞或權(quán)利要求17的雜交瘤；和 (b)從所述細胞或雜交瘤和/或從所述細胞或雜交瘤生長的環(huán)境中回收所述抗體或其片段或衍生物。
21.方法，其用于檢測對象中的腫瘤和/或癌癥細胞，所述方法包括: (a)在足以使權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物與生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌癥細胞上的表位結(jié)合的條件下，使對象中的或分離自對象的生物學樣品與包含權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物的組合物相接觸；和 (b)檢測權(quán)利要求1的抗體或其片 段或衍生物與所述表位的結(jié)合， 其中檢出代表對象中存在腫瘤和/或癌癥細胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述腫瘤和/或癌癥細胞為胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、結(jié)腸腫瘤或直腸腫瘤，和/或源自其中的轉(zhuǎn)移性細胞，其任選地表達MUCl、突變體K-ras或兩者。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物與可檢測的標記綴合，所述可檢測的標記包含選自順磁性、放射性和熒光離子的成像劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述放射性成像劑選自Y-發(fā)射體、正電子發(fā)射體和X射線發(fā)射體。
25.權(quán)利要求24的方法，其中放射性的成像劑選自43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、77Br81Rb/81MKr,87MSr,99mTc,111In,113In, 1231 , 1251 , 127Cs,129Cs, 1311 , 1321 , 197Hg^203Pb 和 206Bio
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物學樣品為血液樣品或源自其中的級分。
27.方法，其用于治療對象中的腫瘤，所述方法包括向所述對象施用包含與活性劑綴合的權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物的組合物，由此所述活性劑與腫瘤接觸從而治療所述腫瘤。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述活性劑包含治療劑，任選地為化療劑、毒素、放療劑、或它們的組合。
29.權(quán)利要求28的方法，其中化療劑選自抗腫瘤藥物、細胞因子、抗代謝物、烷化劑、激素、氨甲喋呤、多柔比星、柔紅霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧唳、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、環(huán)磷酰胺、順鉬、長春地辛、長春花生物堿、絲裂霉素、博萊霉素、嘌呤硫素、巨毛霉素、1，4-苯醌衍生物、三亞胺醌、類固醇、氨基蝶呤、蒽環(huán)類抗生素、秋水仙胺、依托泊苷、光輝霉素、多柔比星、柔紅霉素、長春新堿、新制癌菌素、巨毛霉素、a -鵝膏蕈堿、及它們的組合。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述毒素選自拉塞爾氏蝰蛇毒、活化的因子IX、活化的因子X、凝血酶、磷脂酶C、眼鏡蛇毒因子、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、假單胞菌外毒素、白喉毒素、牛胰核糖核酸酶、美洲商陸抗病毒蛋白、相思子毒素、相思子毒素A鏈、白樹毒素、皂草素、蒴蓮根毒素、槲寄生凝集素、蒴蓮素、和它們的組合。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述放療劑選自41、6701、9°￥、，(1、1231、1251、1311、1861、188Re,199Au,211At,212Pb,212Bi,32P^33PJ1Ge,77As,103Pb,105Rh,111Ag^119Sb,121Sn^131Cs,143Pr,161Tb,177Liu 191Os、193MPt 和 197Hg。
32.方法，其用于在對象中抑制腫瘤生長，所述方法包括向攜帶腫瘤的對象施用有效量的包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)(CDR)的分離的抗體或其片段或衍生物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤為胰腺腫瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、結(jié)腸腫瘤或直腸腫瘤，和/或源自其中的轉(zhuǎn)移性細胞，其任選地表達MUC1、突變體K-ras或兩者。
34.權(quán)利要求27-33任一項的方法，其還包括向所述對象施用一或多種另外的抗腫瘤治療。
35.權(quán)利要求34的方法，其中一或多種另外的抗腫瘤治療選自放療、化療、另外的免疫療法、抗炎癥治療、和它們的組合。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述抗炎癥治療包括向所述對象施用環(huán)加氧酶抑制劑，任選地為環(huán)加氧酶-2特異的抑制劑。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述一或多種另外的抗腫瘤療法包括向?qū)ο笫┯眉魉麨I(4-氨基-1- (2-脫氧-2，2- 二氟-P -D-赤式-戊呋喃糖基)嘧啶-2 (IH)-酮-2’，2’ - 二氟-2’-去氧胞苷)和塞來昔布(4-[5-(4_甲基苯基)-3-(三氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺)，或其任一或兩者的藥物學可接受的鹽。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述單克隆抗體TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重鏈CDRl ;包含SEQ ID N0:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的輕鏈CDR3。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子編碼。
40.方法，其用于純化癌癥干細胞，所述方法包括: (a)提供疑似包含癌癥干細胞的細胞群； (b)鑒定所述細胞的亞群，其結(jié)合包含單克隆抗體TAB-004的CDR的抗體或其片段或衍生物；和 (c)純化所述亞群。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞群包含分離自患有腫瘤和/或癌癥的對象的循環(huán)細胞。
42.權(quán)利要求40的方法，其另外包括在鑒定步驟之前和/或在純化步驟之后從所述細胞群中移除譜系陽性(Iin+)細胞。
43.方法，其用于將活性劑靶向至對象中的循環(huán)癌癥干細胞，所述方法包括使所述循環(huán)癌癥干細胞與包含抗體或其片段或衍生物和活性劑的組合物相接觸，所述抗體或其片段或衍生物包含單克隆抗體TAB-004的⑶R，任選地其中所述活性劑包含治療劑，任選地為化療劑、毒素、放療劑、或它們的組合。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述治療劑包含免疫調(diào)節(jié)劑，任選地其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，任選地為1-甲基-DL-色氨酸(IMT)) ；EP2/EP4受體拮抗劑；樹突狀細胞活化劑，任選地為CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0ND)。
45.方法，其用于預后之前治療過癌癥的對象中的癌癥復發(fā)，所述方法包括: (a)從患有癌癥的對象中分離包含循環(huán)細胞的生物學樣品； (b)在足以使權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物與生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌癥細胞上的表位結(jié)合的條件下，使所述生物學樣品與權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物相接觸；和 (c)在生物學樣品中鑒定一或多種結(jié)合權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物的循環(huán)細胞， 從而預后所述對象中癌癥的復發(fā)。
46.權(quán)利要求45的方法,其中生物學樣品包括血液樣品、淋巴樣品，或其級分。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述癌癥為胰腺癌或乳腺癌。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物選自由雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體，所述細胞系在2010年12月16日以登錄號PTA-11550保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);嵌合抗體，或其片段或衍生物；人源化抗體，或其片段或衍生物；人抗體，或其片段或衍生物；單鏈抗體，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人`抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的CDR,并進一步其中所述嵌合抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)(OTR)。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述單克隆抗體TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重鏈CDRl ;包含SEQ ID N0:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的輕鏈CDR3。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子編碼。
51.方法，其用于預后對象中的癌癥進展，其包括: (a)從患有癌癥的對象中分離包含循環(huán)細胞的生物學樣品； (b)在足以使權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物與生物學樣品中，如果存在，存在于腫瘤和/或癌癥細胞上的表位結(jié)合的條件下，使所述生物學樣品與權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物相接觸；和 (C)在生物學樣品中鑒定一或多種結(jié)合權(quán)利要求1的抗體或其片段或衍生物的循環(huán)細胞， 從而預后對象中的癌癥進展。
52.權(quán)利要求51的方法,其中生物學樣品包括血液樣品、淋巴樣品,或其級分。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述癌癥為胰腺癌或乳腺癌。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物選自由雜交瘤細胞系TAB-004產(chǎn)生的單克隆抗體，所述細胞系在2010年12月16日以登錄號PTA-11550保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);嵌合抗體，或其片段或衍生物；人源化抗體，或其片段或衍生物；人抗體，或其片段或衍生物；單鏈抗體，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的CDR,并進一步其中所述嵌合抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體或Fab片段包含單克隆抗體TAB-004的互補決定區(qū)(OTR)。
55.權(quán)利要求54的方法，其中單克隆抗體TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重鏈CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重鏈CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的輕鏈CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的輕鏈CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的輕鏈CDR3。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子編碼；所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子編碼。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述癌癥的進展包含所述癌癥在對象中的轉(zhuǎn)移。
58.分離的核酸分子，其包含SEQID N0:4和6中的任何一個，或編碼SEQ ID NO:5和7-13中的任一個。
59.權(quán)利要求58的分尚的核酸分子,其中分尚的核酸分子存在于載體中，任選地存在于表達載體中。
60.權(quán)利要求59的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子存在于表達載體中，其可操作地連接于一或多個另外的編碼抗體分子子序列的核苷酸序列，從而在將所述表達載體引入適當?shù)乃拗鲀?nèi)時，宿主細胞表達包含SEQ ID NO:5和7-13中的一或多個的完整重組抗體或其片段或衍生物。
【文檔編號】C12P21/08GK103492417SQ201180059040
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月8日
【發(fā)明者】P·慕克吉 申請人:北卡羅來納大學夏洛特分校