用于原位檢測(cè)核酸的超靈敏方法
【專利摘要】本文公開了基于方法和常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組合的用于原位檢測(cè)一種或多種目標(biāo)核酸的方法。這種新方法產(chǎn)生了高信號(hào)強(qiáng)度并同時(shí)保持了信號(hào)放大的低背景噪聲?？梢砸恢碌刂貜?fù)產(chǎn)生結(jié)果并且所述方法能夠容易地用于常規(guī)臨床診斷使用。此外，本發(fā)明涉及用于一種或多種目標(biāo)核酸的靈敏檢測(cè)的試劑盒，其包含測(cè)定和通用ISH信號(hào)放大測(cè)定的組分。
【專利說明】用于原位檢測(cè)核酸的超靈敏方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2010年10月21日提交的代理人卷號(hào)n0.12790-021-888的標(biāo)題為“用于原位檢測(cè)核酸的超靈敏方法(ULTRA SENSITIVE METHOD FOR IN SITU DETECTION OFNUCLEIC ACIDS)”的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/405，503號(hào)(Wu等人)和2010年11月10日提交的代理人卷號(hào)n0.12790-022-888的標(biāo)題為“用于原位檢測(cè)核酸的超靈敏方法(ULTRASENSITIVE METHOD FOR IN SITU DETECTION OF NUCLEIC ACIDS)” 的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/412，276號(hào)(Wu等人)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益。這些申請(qǐng)中的每一個(gè)均出于各種目的以其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明總體上涉及核酸化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定。更具體地，本發(fā)明涉及用于原位檢測(cè)樣品中核酸分析物的方法。 【背景技術(shù)】
[0004]原位雜交(ISH)是一種允許檢測(cè)和定位保存形態(tài)的單個(gè)細(xì)胞、組織學(xué)組織切片或染色體制備中的特定核酸分子的技術(shù)。在1969年首次描述了這種技術(shù)，并且該技術(shù)基于核苷酸探針與細(xì)胞中DNA或RNA的特異性目標(biāo)序列的互補(bǔ)雜交。其可以是內(nèi)源DNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或細(xì)菌序列。用報(bào)告分子標(biāo)記所加入的探針，并且通過熒光(熒光原位雜交，F(xiàn)ISH)或顯色(顯色原位雜交，CISH)使結(jié)合位點(diǎn)可見。
[0005]在人類全基因組測(cè)序完成后，近年來在公共數(shù)據(jù)庫和非公共數(shù)據(jù)庫中已注釋了成千上萬個(gè)新的人基因序列。由于它相對(duì)容易、快速并且廉價(jià)地設(shè)計(jì)并合成了用于檢測(cè)細(xì)胞中任何新基因的特定序列的反義探針，因此這為ISH打開了新的大門。通過ISH可以獲得基因的組織特異性和細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式以及表達(dá)水平，這將為分析基因功能提供有價(jià)值的信息。
[0006]然而，由于ISH技術(shù)的靈敏度和特異性較差而不能檢測(cè)細(xì)胞中低拷貝數(shù)的DNA或RNA靶標(biāo)，這會(huì)限制它們的應(yīng)用。將ISH應(yīng)用于臨床標(biāo)準(zhǔn)是特別困難的，其中使用福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)來保存臨床組織樣品是世界上最常使用的方法。FFPE法良好地保存了組織形態(tài)，但是通過甲醛的交聯(lián)固定會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)序列與檢測(cè)探針的可接近性較差，探針分子與其他分子或結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)或物理相互作用較差，以及對(duì)核酸(尤其是mRNA)的損傷。
[0007]為了克服ISH的限制并擴(kuò)展它在診斷病理學(xué)中的應(yīng)用，已開發(fā)了幾種策略以改善ISH 的靈敏度。最近，Advanced Cell Diagnostics, Inc.開發(fā)出了稱為RNAscope.^l;的新
型ISH信號(hào)放大方法(美國專利第7，709，198號(hào))。這種測(cè)定包括獨(dú)特設(shè)計(jì)的低聚捕獲探針以及由預(yù)擴(kuò)增子(preamplifier)、擴(kuò)增子(amplifier)和標(biāo)記探針組成的信號(hào)放大系統(tǒng)，從而使得能夠在不放大背景信號(hào)的情況下顯著放大信號(hào)，并能夠?qū)缀跞魏位蜻M(jìn)行單個(gè)RNA分子檢測(cè)。在圖1中示意地說明了RNAscope?技術(shù)的示例性實(shí)施方式并且將在本申請(qǐng)的第二部分中詳細(xì)說明。
[0008]在用于檢測(cè)目標(biāo)核酸的典型RNAscope?測(cè)定中，待檢測(cè)其表達(dá)的目標(biāo)mRNA從
細(xì)胞中釋放并被到固體表面(例如，微量滴定板的孔)上。還提供了一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針和信號(hào)產(chǎn)生多聚體。所述捕獲探針與目標(biāo)核酸和信號(hào)產(chǎn)生多聚體兩者雜交，并因此將信號(hào)產(chǎn)生多聚體捕獲至目標(biāo)核酸。所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針(LP)。但是更通常地，除標(biāo)記探針外，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含預(yù)擴(kuò)增子和/或擴(kuò)增子。所述標(biāo)記探針能夠結(jié)合至提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記顆粒或分子。標(biāo)記探針具有使得能夠連接多個(gè)標(biāo)記顆粒或分子
的較大分子結(jié)構(gòu)，其提供了比單個(gè)標(biāo)記顆?；蚍肿痈鼜?qiáng)的信號(hào)。因此，RNAscope?改善
了核酸檢測(cè)的靈敏度和特異性。
[0009]然而，單獨(dú)利用RNAscope?仍不能可靠地檢測(cè)以往的其中RNA被顯著降解
的福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的組織切片中的一些低拷貝基因。另外，使用當(dāng)前的
RNAscope?技術(shù)不能使單個(gè)RNA分子以40X放大顯象。期望進(jìn)一步增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)以使
得能夠更穩(wěn)健地檢測(cè)任何RNA分子，包括顯著降解的RNA分子，并允許對(duì)所檢測(cè)的RNA信號(hào)以IOX放大容易地顯像。
[0010]在本申請(qǐng)中，我們描述了新型ISH信號(hào)放大測(cè)定以通過將兩種信號(hào)放大方法合并到一個(gè)系統(tǒng)中來擴(kuò)展ISH在診斷病理學(xué)中的應(yīng)用。該系統(tǒng)具有三種形式:(1)RNAscope?與生物素-(抗生蛋白鏈菌素)抗生物素蛋白組合，(2) RNAscope?
與抗體組合，(3) RNAscope?與酪胺信號(hào)放大(TSA)組合。所有這些方法能夠利用
RNAscope'?.技術(shù)優(yōu)越 的特異性和三種放大方法的放大能力。我們出人意料地發(fā)現(xiàn)上述
三種組合信號(hào)放大方法能夠顯著放大與樣品中目標(biāo)核酸的存在有關(guān)的信號(hào)并同時(shí)具有優(yōu)異的信噪比。
[0011]基于兩種分子對(duì)彼此具有非常高的親合力，并且一個(gè)抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子可以結(jié)合四個(gè)生物素分子這一事實(shí)，生物素-抗生物素蛋白(或生物素-抗生蛋白鏈菌素)是一種公知的信號(hào)放大系統(tǒng)?？贵w在免疫組織化學(xué)和ISH中被廣泛用于信號(hào)放大。TSA基于通過過氧化物酶活性的多個(gè)半抗原酪胺分子的沉積。酪胺是酚類化合物。在存在少量過氧化氫的情況下，固定化辣根過氧化物酶(HRP)將標(biāo)記的底物轉(zhuǎn)化為存活期短的(short-lived)、反應(yīng)性極強(qiáng)的中間體。然后，在過氧化物酶結(jié)合位點(diǎn)處或附近，活化的底物分子極快速地與蛋白質(zhì)的富電子部分(如酪氨酸)反應(yīng)并與其共價(jià)結(jié)合。以這種方式，能夠在雜交位點(diǎn)原位引入結(jié)合至酪胺的大量額外的半抗原分子。隨后，可以直接或間接地使沉積的酪胺-半抗原分子顯象。
[0012]已在ISH中使用了所有這些信號(hào)放大方法并獲得了不同程度的成功，但是通常對(duì)于日常診斷病理學(xué)而言，信號(hào)強(qiáng)度和/或信噪比還不夠好。就TSA而言，具體地，當(dāng)在ISH中單獨(dú)使用時(shí)，產(chǎn)生了大量的背景噪聲。每一天和每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的一致性還達(dá)不到所期望的要求。
[0013]考慮到上述情況，需要以高強(qiáng)度個(gè)高特異性地放大核酸的方法。對(duì)于這種方法，還需要其具有高度的一致性。本發(fā)明提供了這些和其他特征，可通過閱讀以下內(nèi)容顯而易見。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]本發(fā)明將_ RNAscope?的信號(hào)放大方法與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法組合為超敏感方法以檢測(cè)、定量和鑒別樣品中的一種或多種目標(biāo)核酸。由于其獨(dú)特的成對(duì)捕獲探針設(shè)計(jì)，RNAscope'?測(cè)定提供了優(yōu)越的特異性。通過將常規(guī)ISH信號(hào)放大方法(例如基于TSA的
信號(hào)放大)添加至RNAscope?測(cè)定，該組合方法實(shí)現(xiàn)了高信號(hào)強(qiáng)度和低背景值。本發(fā)明
所公開的信號(hào)放大方法和系統(tǒng)相對(duì)易于使用并且產(chǎn)生一致的結(jié)果。所要求保護(hù)的方法能夠容易地適合于在常規(guī)臨床診斷程序中使用。
[0015]在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，平衡了所公開的信號(hào)放大方法的特異性和靈敏
性。通過適度減小RNAscope?中信號(hào)放大的倍數(shù)實(shí)現(xiàn)了這種平衡。在本發(fā)明的一種實(shí)施
方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增 子被設(shè)計(jì)為結(jié)合I至16個(gè)擴(kuò)增子。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增子被設(shè)計(jì)為結(jié)合2至10個(gè)擴(kuò)增子。在另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增子被設(shè)計(jì)為結(jié)合2至5個(gè)擴(kuò)增子。
[0016]在檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸的優(yōu)選實(shí)施方式中，首先提供包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸的樣品，以及能夠與所述目標(biāo)核酸雜交的至少一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針、能夠雜交至該兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的信號(hào)產(chǎn)生多聚體(其中所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針)、和能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號(hào)放大探針(其中所述信號(hào)放大探針包含標(biāo)記物)。在所述方法中，首先將目標(biāo)核酸雜交至兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組，然后將所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體捕獲至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組，并借此將所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體捕獲至所述目標(biāo)核酸。然后，將所述信號(hào)放大探針捕獲至所述標(biāo)記探針，并借此捕獲至所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體。在最后一步中，檢測(cè)信號(hào)放大探針中標(biāo)記物的存在、不存在或量。
[0017]在一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的生物素分子，能夠結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，以及結(jié)合至辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合至抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子的另外的生物素分子。
[0018]在另一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、AP、二硝基苯基(DNP)或熒光團(tuán)分子，能夠結(jié)合至所述HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的一種或多種第一抗體，以及結(jié)合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合所述一種或多種第一抗體的一種或多種第二抗體。
[0019]在另一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、多個(gè)能夠與所述HRP分子反應(yīng)的酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、以及能夠可見地檢測(cè)所述酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子的檢測(cè)標(biāo)記物。所述檢測(cè)標(biāo)記物是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯色底物的組合。所述顯色底物選自:二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和固紅。
[0020]在一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含能夠雜交至兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的標(biāo)記探針。在另一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針和雜交至所述標(biāo)記探針的擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針、雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子和雜交至一種或多種擴(kuò)增子的預(yù)擴(kuò)增子。所述預(yù)擴(kuò)增子能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組。
[0021]所述目標(biāo)核酸可以是任何類型的，例如，DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA
和/或等等。
[0022]在一種實(shí)施方式中，可以在進(jìn)行雜交之前在固體載體上發(fā)生放大。
[0023]本發(fā)明的方法還提供了多重檢測(cè)(mutiplex)兩種或更多種目標(biāo)核酸的多種方式。例如，所述樣品可以包含細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或懷疑包含兩種或更多種不同的目標(biāo)核酸。所述樣品還可以包含兩種或更多種不同的細(xì)胞，所述細(xì)胞中的每一種包含或懷疑包含不同的目標(biāo)核酸。
[0024]可以使用雙色顯色原位雜交(CISH)或雙色熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)核酸。在一種實(shí)施方式中，使用兩種不同的信號(hào)放大探針進(jìn)行所述雙色CISH，其中第一信號(hào)放大探針包含:酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和DAB，而第二信號(hào)放大探針包含:抗-DNP-AP和固紅。
[0025]本發(fā)明包括試劑盒以實(shí)施本發(fā)明的方法。所述試劑盒可以包含試劑以進(jìn)行核酸檢測(cè)并提供實(shí)施本發(fā)明方法所必需的條件。所述試劑盒包括，例如，這樣的試劑盒，其包含:目標(biāo)核酸、能夠與所述目標(biāo)核酸雜交的一組的兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針、能夠雜交至兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的信號(hào)產(chǎn)生多聚體，其中所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針，和能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號(hào)放大探針，其中所述信號(hào)放大探針包含標(biāo)記物。
[0026]在一種類型的所述 試劑盒中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的生物素分子，能夠結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，以及結(jié)合至HRP、AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合至抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子的另外的生物素分子。
[0027]在另一種類型的試劑盒中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子，能夠結(jié)合至所述HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的一種或多種第一抗體，以及結(jié)合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合所述一種或多種第一抗體的一種或多種第二抗體。
[0028]在另一種類型的試劑盒中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、能夠與所述HRP分子反應(yīng)的多個(gè)酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、以及能夠可見地檢測(cè)所述酪胺-生物素分子的檢測(cè)標(biāo)記物。所述檢測(cè)標(biāo)記物可以是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯色底物的組合。所述顯色底物可以選自:DAB和固紅。
[0029]在一種試劑盒中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含能夠雜交至兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的標(biāo)記探針。在另一種試劑盒中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針和雜交至所述標(biāo)記探針的擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組。在一種優(yōu)選的試劑盒中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針、雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子和雜交至一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增子的預(yù)擴(kuò)增子。
[0030]所述試劑盒中預(yù)擴(kuò)增子:擴(kuò)增子之比可以為1-16之間，或者優(yōu)選地為2-10之間或2-5之間。
[0031]本發(fā)明所述的試劑盒能夠在多個(gè)核酸放大的多重檢測(cè)中起作用。所述試劑盒可以用于檢測(cè)兩種或更多種不同細(xì)胞中的核酸靶標(biāo)，所述細(xì)胞中的每一種包含或懷疑包含不同的目標(biāo)核酸，或者檢測(cè)一種細(xì)胞中的兩種或更多種核酸靶標(biāo)。所述試劑盒中的信號(hào)放大探針可以是雙色顯色原位雜交(CISH)探針或雙色熒光原位雜交(FISH)探針。在使用雙色CISH探針的情況下，第一信號(hào)放大探針包含:酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和DAB，而第二信號(hào)放大探針包含:抗-DNP-AP和固紅。
[0032]定義
[0033]除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員一般所理解的相同的含義。以下定義補(bǔ)充了本發(fā)明中的那些定義并且涉及當(dāng)前的發(fā)明申請(qǐng)，并且不轉(zhuǎn)嫁給任何相關(guān)或非相關(guān)的情況，例如，任何共同擁有的專利或?qū)＠暾?qǐng)。盡管可以在用于本發(fā)明測(cè)試的實(shí)踐中使用與本文所述那些相似或等同的任何方法和材料，但是在本文中描述了優(yōu)選的材料和方法。因此，本文所使用的術(shù)語僅出于描述【具體實(shí)施方式】的目的，而不是意欲限制。
[0034]術(shù)語“核酸”(和等同術(shù)語“多核苷酸”)涵蓋了可以對(duì)應(yīng)于一列核苷酸的單體單元的任何物理列，其包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA或RNA聚合物)、肽核酸(PNA)Jf飾的寡核苷酸(例如，包含對(duì)生物RNA或DNA是非典型的核苷酸的寡核苷酸，如2’ -0-甲基化寡核苷酸)等。多核苷酸的核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物，可以是天然的或非天然的，并且可以是未取代的、未修飾的、取代的或修飾的。所述核苷酸可以通過磷酸二酯鍵或通過硫代磷酯鍵、膦酸甲酯鍵、硼烷磷酸酯鍵等連接。所述多核苷酸另外可以包含非核苷酸成份，如標(biāo)記物、猝滅劑、保護(hù)基團(tuán)等。所述多核苷酸可以是(例如)單鏈的或雙鏈的。
[0035]“核酸靶標(biāo)”或“目標(biāo)核酸”是指要檢測(cè)的核酸，或任選地它的區(qū)域。
[0036]根據(jù)上下文，“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸等)或表示核苷酸聚合物的字符序列。根據(jù)任何所指明的多核苷酸序列，可以確定給定的核酸或互補(bǔ)多核苷酸序列(例如，互補(bǔ)核酸)。
[0037]廣義地使用術(shù)語“基因”以表示與生物學(xué)功能有關(guān)的任何核酸?；蛲ǔ０ň幋a序列和/或表達(dá)這些編碼序列所需的調(diào)控序列。術(shù)語基因可以適用于具體的基因組序列和該基因組序列所編碼的cDNA或mRNA。
[0038]在本文中廣義地使用了術(shù)語“抗體”并且它包括完整組裝的抗體、保留了特異性結(jié)合抗原(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fv和其他片段)的能力的抗體片段、單鏈抗體、雙體抗體、抗體嵌合體、雜交抗體、雙重特異性抗體、人源化抗體等。術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體兩者。
[0039]如本文所使用的術(shù)語“生物樣品”或“組織樣品”是指獲自生物受試者的樣品，其包括體內(nèi)或原位獲得、觸及或收集的生物組織或液體來源的樣品。生物樣品還包括來自具有癌前或癌細(xì)胞或組織的生物受試者的區(qū)域的樣品。這些樣品可以是，但不限于，分離自哺乳動(dòng)物的器官、組織、部份和細(xì)胞。示例性生物樣品包括，但不限于，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、組織、器官、細(xì)胞器、生物液體等。優(yōu)選的生物樣品包括，但不限于，皮膚樣品、組織活檢樣品等。
[0040]術(shù)語“標(biāo)記探針”是指直接或間接與目標(biāo)分子結(jié)合并且使得所述目標(biāo)能夠通過(例如)讀數(shù)儀器檢測(cè)的實(shí)體。標(biāo)記探針(或“LP”)通常是包含一個(gè)或多個(gè)直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物的單鏈多核苷酸。所述標(biāo)記物可以共價(jià)連接到所述多核苷酸，或可以配置所述多核苷酸以結(jié)合所述標(biāo)記物(例如，生物素化的多核苷酸可以結(jié)合抗生蛋白鏈菌素相關(guān)標(biāo)記物)。所述標(biāo)記探針可以(例如)直接雜交至目標(biāo)核酸，或者它可以雜交至核酸，所述核酸反過來雜交至所述目標(biāo)核酸或雜交至已雜交至所述核酸的一個(gè)或多個(gè)其它核酸。因此，所述標(biāo)記探針可以包含與所述目標(biāo)核酸的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列，或它可以包含與捕獲探針、擴(kuò)增子等中的多核苷酸序列互補(bǔ)的至少一種多核苷酸序列。
[0041]“標(biāo)記物”是有利于分子檢測(cè)的部分。在本發(fā)明的背景中，常規(guī)的標(biāo)記物包括熒光、發(fā)光、光散射和/或比色標(biāo)記物。適合的標(biāo)記物包括酶和熒光部分以及放射性核素、底物、輔因子、抑制劑、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。示例性標(biāo)記物包括:辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、熒光團(tuán)、二硝基苯基(DNP)等。教導(dǎo)這些標(biāo)記物的使用的專利包括美國專利 N0.3，817，837 ;3，850，752 ;3，939，350 ;3，996，345 ;4，277，437 ;4，275，149 和4，366，241。多種標(biāo)記物是可商購的并且可以在本發(fā)明的背景中使用。
[0042]“捕獲探針”是能夠雜交至目標(biāo)核酸并且將標(biāo)記探針捕獲至該目標(biāo)核酸的多核苷酸。所述目標(biāo)探針可以直 接雜交至所述標(biāo)記探針，或它可以雜交至一種或多種核酸，所述核酸反過來雜交至所述標(biāo)記探針；例如，目標(biāo)探針可以雜交至擴(kuò)增子或預(yù)擴(kuò)增子。因此，所述目標(biāo)探針包含與所述目標(biāo)核酸的多核苷酸序列互補(bǔ)的第一多核苷酸序列和與所述標(biāo)記探針、擴(kuò)增子、預(yù)擴(kuò)增子等的多核苷酸序列互補(bǔ)的第二多核苷酸序列。優(yōu)選地，所述目標(biāo)探針是單鏈的。
[0043]“擴(kuò)增子(amplifier)”是能夠雜交至多個(gè)標(biāo)記探針的分子，通常是多核苷酸。通常，所述擴(kuò)增子雜交至多個(gè)相同的標(biāo)記探針。所述擴(kuò)增子還雜交至至少一個(gè)目標(biāo)探針或雜交至與目標(biāo)探針結(jié)合的核酸。例如，所述擴(kuò)增子可以雜交至至少一個(gè)目標(biāo)探針和多個(gè)標(biāo)記探針，或結(jié)合至預(yù)擴(kuò)增子和多個(gè)標(biāo)記探針。所述擴(kuò)增子可以是(例如)線性、分叉、梳狀或分枝核酸。如對(duì)所有多核苷酸所提及的，所述擴(kuò)增子可以包括修飾的核苷酸和/或非標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸間鍵以及標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯鍵。在(例如)USPN5, 635，352、USPN5, 124，246、USPN5, 710，264 和 USPN5, 849，481 中描述了適合的擴(kuò)增子。
[0044]“預(yù)擴(kuò)增子(preamp I i f i er ) ”是起到一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)探針和擴(kuò)增子之間的中間體作用的分子，通常是多核苷酸。通常，預(yù)擴(kuò)增子同時(shí)雜交至一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)探針和多個(gè)擴(kuò)增子。在(例如)USPN5, 635，352和USPN5, 681，697中描述了示例性預(yù)擴(kuò)增子。
[0045]“ ISH”或“原位雜交”是指使用標(biāo)記的互補(bǔ)DNA或RNA鏈(即探針)來(原位)定位組織的部分或切片中的特異性DNA或RNA序列的一類雜交。探針的類型為雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈 DNA (ssDNA)、單鏈互補(bǔ) RNA (sscRNA)、信使 RNA (mRNA)、微小 RNA (miRNA)和合成寡核苷酸。
[0046]“FISH”或“熒光原位雜交”是指使用熒光標(biāo)記物的一類ISH。
[0047]“CISH”或“顯色原位雜交”是指使用顯色標(biāo)記物的一類ISH。
[0048]“通用ISH信號(hào)放大”測(cè)定或系統(tǒng)是指可以通過所述方法放大所靶向的特定DNA或RNA序列的任何ISH基原位雜交測(cè)定或系統(tǒng)。它包括，但不限于，在本發(fā)明中公開的三種示例性常規(guī)ISH信號(hào)放大系統(tǒng)(即，生物素基ISH、抗體基ISH和TSA基ISH)?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0049]圖1示出了 RNAscope?測(cè)定的原理。目標(biāo)核酸(如mRNA)與捕獲探針組雜交。
每組捕獲探針包含兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針。所述捕獲探針組與預(yù)擴(kuò)增子雜交。每個(gè)預(yù)擴(kuò)增子進(jìn)一步與多個(gè)擴(kuò)增子雜交。通過將擴(kuò)增子與多個(gè)標(biāo)記探針雜交進(jìn)一步放大信號(hào)每個(gè)標(biāo)記探針結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物，如熒光團(tuán)或酶。使用標(biāo)準(zhǔn)明視野或落射熒光顯微鏡檢測(cè)信號(hào)。
[0050]圖2示出了RNAscope?+生物素/ (抗生蛋白鏈菌素)抗生物素蛋白放
大的原理。RNAscope?中的標(biāo)記探針與生物素分子結(jié)合并進(jìn)一步與抗生物素蛋白/抗生
蛋白鏈菌素結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素具有結(jié)合最多4個(gè)生物素分子的能力，所述生物素分子結(jié)合至酶或熒光標(biāo)記物，如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)或熒光團(tuán)，從而導(dǎo)致每個(gè)標(biāo)記探針的信號(hào)增加4倍。
[0051]圖3示出了 RNAscope?+抗體放大的原理。RNAscope?中的標(biāo)記探針結(jié)合
至HRP、AP、DNO或熒光團(tuán)分子并被抗HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的抗體(在A動(dòng)物種中產(chǎn)生，如山羊)所識(shí)別。然后，可以通過抗A種第一抗體的HRP、聚合物-HRP、AP或聚合物-AP結(jié)合的第二抗體識(shí)別第一抗體，從而導(dǎo)致RNAscope信號(hào)的進(jìn)一步信號(hào)放大。
[0052]圖4示出了 RNAscope?+TSA放大的原理。RNAscope? ’中的標(biāo)記探針結(jié)合
至HRP。HRP結(jié)合的標(biāo)記探針促使酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)的多個(gè)拷貝共價(jià)結(jié)合至鄰近LP-HRP結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的富電子部分。隨后，通過抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈 菌素-AP以及對(duì)HRP或AP顯色的底物(如DAB和固紅)檢測(cè)酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)。由于酪胺-生物素的多個(gè)拷貝可以沉積在每個(gè)LP-HRP結(jié)合位點(diǎn)的周圍，因此顯著提高了作為RNAscope放大和TSA放大之和的最終信號(hào)的強(qiáng)度。
[0053]圖5示出了使用RNAscope和RNAscope+TSA程序的人乳腺癌FFPE切片中低拷貝基因HPRTl的mRNA的檢測(cè)。通過RNAscope+TSA所獲得的信號(hào)(右側(cè))顯著強(qiáng)于僅通過RNAscope所獲得的信號(hào)(左側(cè))。
【具體實(shí)施方式】
[0054]本發(fā)明提供了以改善的靈敏度和特異性用于檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸的存在性的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明將RNAscope?:方法與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法(如基于TSA的信號(hào)放大方法、基于抗體的信號(hào)放大方法或基于生物素-抗生物素蛋白的信號(hào)放大方法)相結(jié)合。RNAscope?方法以其檢測(cè)目標(biāo)核酸的高特異性而著名。換言之，在RNAscope?測(cè)定中
可以以高信噪比檢測(cè)目標(biāo)核酸。如將在以下第2部分中解釋的，這種高特異性來源于“雙Z”探針設(shè)計(jì)和預(yù)擴(kuò)增子-擴(kuò)增子-標(biāo)記探針信號(hào)級(jí)聯(lián)設(shè)計(jì)。常規(guī)ISH信號(hào)放大方法以其促進(jìn)核酸分子的信號(hào)放大的能力而著名。然而，ISH信號(hào)放大方法還以其在放大測(cè)定中的高信噪比和缺乏一致性而著名。
[0055]本發(fā)明將RNAscope?方法與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法相結(jié)合并進(jìn)一步調(diào)節(jié)RNAscope?’中擴(kuò)增子和預(yù)擴(kuò)增子的放大率(amplification ratio)。除了益處之外，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)克服了以上所提及的常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的缺點(diǎn)，同時(shí)保持了RNAscope?中背景噪聲降低的獨(dú)特機(jī)制。因此，本發(fā)明能夠以高靈敏度和特異性可靠地
檢測(cè)核酸靶標(biāo)。這種加強(qiáng)將核酸檢測(cè)結(jié)果中的一致性提高到可以在診斷測(cè)定中實(shí)施的水平。
[0056]1.通過RNAscope?和常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組合的目標(biāo)核酸的檢測(cè)
[0057]本發(fā)明描述了用于檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸的新型、簡(jiǎn)單并且超靈敏的原位雜交方法。該方法可以在熒光ISH (FISH)和顯色I(xiàn)SH (CISH)測(cè)定中使用。該方法能夠檢測(cè)完整細(xì)胞、組織切片、組織微陣列和cDNA微陣列中固定化的核酸(DNA和RNA)。
[0058]1.1常規(guī)ISH信號(hào)放大方法
[0059]已發(fā)展了多種ISH信號(hào)放大方法來檢測(cè)DNA或RNA目標(biāo)。以下將描述三種示例性ISH信號(hào)放大方法:(I)基于生物素-(抗生蛋白鏈菌素)抗生物素蛋白的ISH信號(hào)放大；
(2)基于抗體的ISH信號(hào)放大,和(3)基于酪胺信號(hào)放大(TSA)的ISH信號(hào)放大。技術(shù)人員
清楚可以在本發(fā)明中結(jié)合RNAscope?.使用任何ISH信號(hào)放大方法。因此，這些實(shí)例不應(yīng)
認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0060](I) RNAscope+生物素-(抗生蛋白鏈菌素)抗生物素蛋白系統(tǒng)(圖2)。
[0061]在一種實(shí)施方式中，基 于生物素-(抗生蛋白鏈菌素)抗生物素蛋白的ISH信號(hào)放
大方法與RNAscope?:結(jié)合使用。在一個(gè)方面，RNAscope包含一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探
針、多個(gè)標(biāo)記探針、多個(gè)擴(kuò)增子和多個(gè)預(yù)擴(kuò)增子。目標(biāo)核酸雜交至所述捕獲探針組。然后，所述捕獲探針組雜交至預(yù)擴(kuò)增子。所述預(yù)擴(kuò)增子進(jìn)一步雜交至多個(gè)擴(kuò)增子。然后，每個(gè)擴(kuò)增子雜交至多個(gè)標(biāo)記探針。然后，RNAscope復(fù)合結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針(LP)結(jié)合至ISH信號(hào)放大結(jié)構(gòu)的生物素分子并形成LP-生物素復(fù)合物。LP-生物素復(fù)合物進(jìn)一步與抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子結(jié)合?？股锼氐鞍?抗生蛋白鏈菌素分子具有結(jié)合最多4個(gè)生物素分子的能力，其中每個(gè)生物素分子進(jìn)一步結(jié)合至HRP或AP。可以通過顯色染料(如二氨基聯(lián)苯胺、DAB或固紅)可見檢測(cè)HRP或AP。因此，將基于生物素-(抗生蛋白鏈菌素)抗生物
素蛋白的ISH信號(hào)放大方法與RNAscope?:結(jié)合使得每個(gè)標(biāo)記探針的信號(hào)提高4倍。
[0062](2) RNAscope+抗體系統(tǒng)(圖 3)。
[0063]在另一種實(shí)施方式中，基于抗體的ISH信號(hào)放大方法與RNAscope?結(jié)合使用。
在一個(gè)方面，RNAscope包含一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針、多個(gè)標(biāo)記探針、多個(gè)擴(kuò)增子和多個(gè)預(yù)擴(kuò)增子。目標(biāo)核酸雜交至所述捕獲探針組。兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針雜交至核酸靶標(biāo)。每個(gè)預(yù)擴(kuò)增子雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針中的每一個(gè)，多個(gè)擴(kuò)增子雜交至所述預(yù)擴(kuò)增子中的每一個(gè)，并且多個(gè)標(biāo)記探針雜交至所述擴(kuò)增子。RNAscope復(fù)合結(jié)構(gòu)的每個(gè)標(biāo)記探針結(jié)合至HRP分子、AP分子、DNP分子或熒光團(tuán)分子，并因此分別形成了 HRP-LP復(fù)合物、AP-LP復(fù)合物、DNP-LP復(fù)合物或熒光團(tuán)-LP復(fù)合物。分別通過抗HRP抗體、抗AP-LP抗體、抗DNP-LP抗體或抗熒光團(tuán)-LP抗體識(shí)別HRP-LP、AP-LP、DNP-LP或熒光團(tuán)-LP復(fù)合物。通過動(dòng)物種A (如山羊)產(chǎn)生上述抗體。然后，通過抗種A的第二抗體識(shí)別該第一抗體。所述第二抗體與HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)結(jié)合并能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)第一抗體?？梢酝ㄟ^顯色染料(如二氨基聯(lián)苯胺(DAB)或固紅)可見地檢測(cè)HRP或AP。本發(fā)明的結(jié)果為除RNAscope信號(hào)放大以外的進(jìn)一步信號(hào)放大。
[0064](3) RNAscope+TSA 系統(tǒng)(圖 4)。
[0065]在另一種實(shí)施方式中，基于TSA的ISH信號(hào)放大方法與RNAscope?結(jié)合使用。
在一個(gè)方面，RNAscope包含一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針、多個(gè)標(biāo)記探針、多個(gè)擴(kuò)增子和多個(gè)預(yù)擴(kuò)增子。目標(biāo)核酸雜交至所述捕獲探針組。然后，所述捕獲探針組雜交至預(yù)擴(kuò)增子。所述預(yù)擴(kuò)增子進(jìn)一步雜交至多個(gè)擴(kuò)增子。然后，每個(gè)擴(kuò)增子雜交至多個(gè)標(biāo)記探針。RNAscope?
復(fù)合結(jié)構(gòu)的每個(gè)標(biāo)記探針結(jié)合至HRP分子，從而形成HRP-LP復(fù)合物。然后，HRP-LP復(fù)合物結(jié)合至多個(gè)酪胺-生物素或熒光團(tuán)-生物素分子。在該步驟中，HRP-LP復(fù)合物促使酪胺-生物素或熒光團(tuán)-生物素的多個(gè)拷貝共價(jià)結(jié)合至鄰近LP-HRP結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的富電子部分。隨后，通過檢測(cè)標(biāo)記物檢測(cè)酪胺-生物素或熒光團(tuán)-生物素。所述檢測(cè)標(biāo)記物是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯色底物的組合。通過顯色底物(如DAB或固紅)可見地檢測(cè)抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP復(fù)合物上的HRP或AP。由于酪胺-生物素或熒光團(tuán)-生物素的多個(gè)拷貝可以沉積在每個(gè)LP-HRP結(jié)合位點(diǎn)的周圍，因此顯著提高了作為RNAscope放大和TSA放大之和的最終信號(hào)的強(qiáng)度。
[0066]在基于TSA的ISH信號(hào)放大方法的其他實(shí)施方式中，酪胺還可以結(jié)合至其他半抗原，如地高辛(DIG)、三硝基苯基(TNP)、二硝基苯基(DNP)和熒光染料。當(dāng)在酪胺結(jié)合中使用熒光染料分子時(shí)，可以直接在RNAscope-TSA系統(tǒng)中將酪胺-染料結(jié)合物用于簡(jiǎn)單并且有效的熒光(FISH)檢測(cè)。
[0067]1.2改善RNAscope?中的擴(kuò)增子/預(yù)擴(kuò)增子之比
[0068]還可以微調(diào)本發(fā)明所公開的RNAscope?與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組合以提高信號(hào)放大的靈敏度 和特異性。在這種RNAscope?+常規(guī)ISH信號(hào)放大方法中，RNAscope?的主要貢獻(xiàn)是測(cè)定特異性。RNAscope?.還以高特異性提供了核酸靶標(biāo)的適度信號(hào)放大。常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的貢獻(xiàn)之一是它們的信號(hào)增強(qiáng)能力(signalboosting power).因此，除了 RNAscope?所提供的適度信號(hào)放大能力之外，常規(guī)ISH信號(hào)放大方法還將目標(biāo)核酸信號(hào)放大到高得多的水平。
[0069]一個(gè)潛在的問題是常規(guī)ISH信號(hào)放大方法不但放大真陽性信號(hào)，而且還放大假陽性信號(hào)。因此，RNAscope?-與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的簡(jiǎn)單組合面臨信號(hào)檢測(cè)中背景噪聲升高的問題。本發(fā)明公開了一種聰明的方法以降低假陽性信號(hào)的水平。
[0070]本發(fā)明所公開的RNAscope?與常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組合的一個(gè)平
衡因素是RNAscope?’中所使用的預(yù)擴(kuò)增子的大小。如果設(shè)計(jì)結(jié)合多個(gè)擴(kuò)增子，則RNAscope?!的預(yù)擴(kuò)增子可以是非常大的分子。例如，預(yù)擴(kuò)增子可以具有雜交至多于20
個(gè)擴(kuò)增子的能力。這種大分子在原位雜交期間在細(xì)胞基質(zhì)中傾向于非特異性結(jié)合。當(dāng)預(yù)擴(kuò)增子中的一個(gè)與樣品非特異性結(jié)合時(shí)，它將多個(gè)相同擴(kuò)增子和標(biāo)記探針吸引至其上，如與
目標(biāo)核酸結(jié)合時(shí)一樣。在單獨(dú)使用RNAscope?的情況下，與少量非特異性結(jié)合預(yù)擴(kuò)增子結(jié)合的標(biāo)記探針的數(shù)目不會(huì)產(chǎn)生任何可觀察到的信號(hào)。然而，如果通過來自連續(xù)的常規(guī)ISH信號(hào)放大的額外信號(hào)放大進(jìn)一步提高這些標(biāo)記探針的信號(hào)，則假陽性信號(hào)將足夠高以從而被檢測(cè)到。
[0071]降低這種假陽性信號(hào)的一種方法是降低預(yù)擴(kuò)增子的大小，從而，首先它不太可能被截留在細(xì)胞基質(zhì)中；第二，即使當(dāng)它在樣品中非特異性結(jié)合時(shí)，也僅有少量擴(kuò)增子分子將會(huì)與之雜交。因此，即使通過常規(guī)ISH信號(hào)放大增強(qiáng)信號(hào)時(shí)，通過非特異性結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)將可能過低而不能被檢測(cè)到。在該方法的一種實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)與I至16個(gè)擴(kuò)增子結(jié)合。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)與2至10個(gè)擴(kuò)增子結(jié)合。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)與2至5個(gè)擴(kuò)增子結(jié)合。
[0072]通過平衡測(cè)定中RNAscope?和TSA的放大能力和特異性，對(duì)于常規(guī)臨床組織樣品中的原位RNA檢測(cè)已實(shí)現(xiàn)了最佳的信噪比(參見實(shí)施例1和圖5)。
[0073]2.通過R NAscope?的目標(biāo)核酸的檢測(cè)
[0074]最近，AdvancedCell Diagnostics, Inc.開發(fā)出一種被稱為 RNAscope.?!的強(qiáng)大的原位雜交方法(美國專利N0.7，709，198，該專利以其全部?jī)?nèi)容作為參考并入本文)。由于RNAscope?是在本發(fā)明中所公開的方法的一部分，因此以下將描述RNAscope?的工作原理以更好地理解本發(fā)明。
[0075]RNAscope'?.'允許RNA直接原位顯像。該方法使用了如下所述的寡核苷酸探針
組和新型信號(hào)放大系統(tǒng)。該測(cè)定可以用于多種樣品類型，包括培養(yǎng)的細(xì)胞、周圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)、冷凍的組織和福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)組織。另外，該測(cè)定可以使用顯色和熒光檢測(cè)試劑。
[0076]RNAscope?測(cè)定技術(shù)提供了單細(xì)胞中的多重核酸測(cè)定(參見圖1)。該技術(shù)的核
心在于“雙z”探針設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)允許特異性雜交信號(hào)的強(qiáng)力放大，同時(shí)不會(huì)放大非特異性事件。每個(gè)捕獲探針(“Z”)具有與目標(biāo)mRNA、間隔區(qū)和“尾”序列結(jié)合的目標(biāo)特異性序列。兩個(gè)捕獲探針(雙Z)連續(xù)雜交至目標(biāo)mRNA，并且兩個(gè)“尾”序列形成了預(yù)擴(kuò)增子的28堿基雜交位點(diǎn)。雙Z探針設(shè)計(jì)確保信號(hào)放大的高保真度，這是因?yàn)?I)一對(duì)目標(biāo)探針彼此相鄰地非特異性雜交以形成預(yù)擴(kuò)增子的結(jié)合位點(diǎn)是非常不可能的；和2)在測(cè)定條件下，任一個(gè)尾單獨(dú)可以有效地結(jié)合至預(yù)擴(kuò)增子。預(yù)擴(kuò)增子、擴(kuò)增子和標(biāo)記探針順序雜交至每個(gè)捕獲探針對(duì)，從而導(dǎo)致每Ikb目標(biāo)RNA多達(dá)8，000個(gè)標(biāo)記分子的累積。標(biāo)記探針可以結(jié)合至熒光團(tuán)或顯色酶(例如，HRP或AP),從而使得能夠分別在標(biāo)準(zhǔn)明視野或反射突光顯微鏡(epif Iuorescentmicroscope)下觀察雜交信號(hào)。使用突光標(biāo)記探針,信號(hào)可以含有比常規(guī)RNA突光ISH法多至少100倍的熒光分子，并且在標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡下是容易地可見的。
[0077]另外，已構(gòu)建了多重信號(hào)擴(kuò)增子，其每一個(gè)識(shí)別目標(biāo)探針上獨(dú)特的尾序列，從而使得多個(gè)目標(biāo)RNA同時(shí)顯像。重要的是，該測(cè)定適合用于適合的FFPE組織中存在的部分降解的RNA，這是因?yàn)殡pZ探針對(duì)靶向長度為約50個(gè)核苷酸的短區(qū)域。
[0078]在一個(gè)實(shí)例中，RNAscope?用于檢測(cè)目標(biāo)核酸。在該方法中，提供了包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的樣品。所測(cè)試的細(xì)胞包含或者懷疑包含目標(biāo)核酸。在該測(cè)定中提供了:包含兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的一組捕獲探針，包含標(biāo)記物的標(biāo)記探針，以及可選地預(yù)擴(kuò)增子和擴(kuò)增子。
[0079]在該方法中，所述捕獲探針組在細(xì)胞中雜交至目標(biāo)核酸。所述標(biāo)記探針被捕獲至所述捕獲探針組，借此將所述標(biāo)記探針捕獲至所述目標(biāo)核酸。然后，檢測(cè)來自所述標(biāo)記物的信號(hào)。由于所述標(biāo)記物通過捕獲探針與目標(biāo)核酸相連，因此細(xì)胞中標(biāo)記物的存在表明細(xì)胞中相應(yīng)核酸靶標(biāo)的存在。所述方法是任選地定量的。因此，可以測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度，并且可以將信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞中目標(biāo)核酸的量相關(guān)聯(lián)。作為另一個(gè)實(shí)例，可以對(duì)目標(biāo)核酸的每個(gè)拷貝的信號(hào)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)以對(duì)它們進(jìn)行定量分析。
[0080]在一個(gè)方面，所述標(biāo)記探針直接結(jié)合至所述捕獲探針。在另一個(gè)方面，所述標(biāo)記探針被間接捕獲至所述捕獲探針，例如，通過預(yù)擴(kuò)增子和/或擴(kuò)增子的結(jié)合。擴(kuò)增子和預(yù)擴(kuò)增子的使用在提高信號(hào)強(qiáng)度方面可以是有利的，這是因?yàn)樗鼈兛梢暂o助多個(gè)標(biāo)記探針結(jié)合至每個(gè)核酸靶標(biāo)。
[0081]盡管可以在本發(fā)明的技術(shù)中使用直接捕獲方法和間接捕獲方法兩者，但是優(yōu)選間接捕獲方法，這是因?yàn)樗沟盟鰳?biāo)記探針能夠成為不依賴于目標(biāo)的，并且其他公開內(nèi)容將顯示該方法可以提供更好的特異性和靈敏度。
[0082]在RNAscope?測(cè)定中，所述捕獲探針是專門設(shè)計(jì)的。在每個(gè)捕獲探針中，存在
至少一個(gè)與目標(biāo)分子上的部分互補(bǔ)的部分T，和與標(biāo)記探針上的部分互補(bǔ)的另一個(gè)部分L。T和L部分通過部分C連接。在間接捕獲實(shí)施方式中，將兩個(gè)相鄰的捕獲探針引入到靶向所關(guān)心基因的探針組中。Tl和T2設(shè)計(jì)與目標(biāo)核酸上的兩個(gè)獨(dú)特并且相鄰的部分互補(bǔ)。LI和L2可以是不同的或相同的，并且它們與標(biāo)記探針上的兩個(gè)相鄰部分互補(bǔ)。它們的結(jié)合部分T、L或兩者的設(shè)計(jì)使得標(biāo)記探針和目標(biāo)之間的`連接是不穩(wěn)定的，并且當(dāng)捕獲探針中僅有一個(gè)就位時(shí)，它們?cè)陔s交溫度下傾向于分離。這種設(shè)計(jì)應(yīng)能夠使其具有超常的特異性，這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)單獨(dú)的捕獲探針均識(shí)別目標(biāo)并且與相鄰序列結(jié)合或與目標(biāo)基因非常接近時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記探針僅可以連接到所關(guān)心的目標(biāo)基因。在一種實(shí)施方式中，兩個(gè)捕獲探針的T部分的解鏈溫度Tm設(shè)計(jì)顯著高于雜交溫度，同時(shí)L部分的T1JS于雜交溫度。因此，在雜交期間T部分強(qiáng)烈并且穩(wěn)定地結(jié)合至目標(biāo)分子，而當(dāng)捕獲探針中只有一個(gè)存在時(shí)，L部分微弱并且不穩(wěn)定地結(jié)合至標(biāo)記探針。然而，當(dāng)兩個(gè)捕獲探針均存在時(shí)，LI和L2的組合在雜交期間強(qiáng)烈并且穩(wěn)定地保持標(biāo)記探針。例如，T部分的長度上可以是20-30個(gè)核苷酸，而L部分的長度上是13-15個(gè)核苷酸；C的長度上可以是0至10個(gè)核苷酸,例如,5個(gè)核苷酸。在另一種實(shí)施方式中，T部分的Tm低于雜交溫度,而L部分的Tm顯著高于雜交溫度。以同樣的方式，只有當(dāng)兩個(gè)捕獲探針以協(xié)作方式均雜交至目標(biāo)時(shí)，標(biāo)記探針和目標(biāo)之間的連接才可以在雜交期間保留。對(duì)于捕獲探針設(shè)計(jì)的其他詳細(xì)內(nèi)容，參見美國專利N0.7，709，198。
[0083]在以上種類的實(shí)施方式中，捕獲探針優(yōu)選地雜交至它們相應(yīng)的核酸靶標(biāo)中不重疊的多核苷酸序列。捕獲探針可以(但不需要)覆蓋核酸靶標(biāo)的鄰接區(qū)域。可選地提供了作為雜交至未被目標(biāo)探針占據(jù)的核酸靶標(biāo)區(qū)域的多核苷酸的阻斷探針，并且所述阻斷探針雜交至所述目標(biāo)。對(duì)于給定核酸靶標(biāo)，相應(yīng)的捕獲探針和阻斷探針優(yōu)選地與核酸靶標(biāo)中物理上分離的，不重疊的序列互補(bǔ)，所述不重疊的序列優(yōu)選(但不必需)是鄰接的。在一些實(shí)施方式中，使捕獲探針和任選的阻斷探針彼此鄰接可以提高雜交強(qiáng)度，除去二級(jí)結(jié)構(gòu)，并確保更一致并且可重復(fù)的信號(hào)。[0084]在細(xì)胞中核酸靶標(biāo)的檢測(cè)中，通常在捕獲探針的雜交之前將細(xì)胞固定并透性化以將所述核酸靶標(biāo)保留在細(xì)胞中并允許捕獲探針、標(biāo)記探針等進(jìn)入細(xì)胞?？蛇x地，清洗細(xì)胞以除去未捕獲至所述核酸靶標(biāo)之一上的物質(zhì)。在任意多個(gè)步驟之后，例如，在捕獲探針與核酸靶標(biāo)雜交以除去未結(jié)合的捕獲探針之后，在預(yù)擴(kuò)增子、擴(kuò)增子和/或標(biāo)記探針與捕獲探針雜交后和/或等等，可以清洗細(xì)胞。
[0085]在一些實(shí)施方式中，對(duì)于所述方法的所有或大部分步驟，細(xì)胞處于懸液中以便于處理。然而，所述方法還適用于固體組織樣品(例如，組織切片)中的細(xì)胞和/或固定在基底(例如，載玻片或其他表面)上的細(xì)胞。因此，在一種類型的實(shí)施方式中，細(xì)胞在包含所述細(xì)胞的樣品中處于懸液中和/或所述細(xì)胞在雜交、捕獲和/或檢測(cè)步驟期間處于懸液中。例如，所述細(xì)胞在樣品中和在雜交、捕獲、可選的清洗和檢測(cè)步驟期間可以處于懸液中。在其他實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在包含所述細(xì)胞的樣品中處于懸液中，并且所述細(xì)胞在雜交、捕獲和/或檢測(cè)步驟期間固定在基底上。例如，所述細(xì)胞可以在雜交、捕獲和任選的清洗步驟期間處于懸液中，而在檢測(cè)步驟期間固定在基底上。在其他實(shí)施方式中，所述樣品包含組織切片。
[0086]3.核酸的多重檢測(cè)
[0087]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了多重核酸測(cè)定。因此，一種常規(guī)類型的實(shí)施方式包括檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)核酸的方法。在以上部分中，已描述了使用RNAscope?檢測(cè)單個(gè)目
標(biāo)核酸的方法。在本部分中，首先將描述使用RNAscope_?:和常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組
合檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)核酸的方法。接著將描述使用RNAscope?和常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組
合檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)核酸的方法。除了使用不同的目標(biāo)特異性標(biāo)記物和探針之外，可以通過與檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)核酸相同的方式進(jìn)行兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)核酸的檢測(cè)。
[0088]在本發(fā)明的一種 實(shí)施方式中，提供了檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)核酸的方法。在該方法中，提供了包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸的樣品。還提供了:一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針，其中所述捕獲探針能夠結(jié)合至目標(biāo)核酸、信號(hào)產(chǎn)生多聚體和信號(hào)放大探針。
[0089]所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含至少標(biāo)記探針。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針和擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子能夠雜交至所述標(biāo)記探針，并且還能夠雜交至所述一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針、能夠雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子和能夠雜交至所述擴(kuò)增子并且還能夠雜交至所述一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的預(yù)擴(kuò)增子。
[0090]所述信號(hào)放大探針由在常規(guī)ISH信號(hào)放大測(cè)定中使用的組分組成。例如，在其中RNAscope?與基于生物素-抗生蛋白鏈菌素(抗生物素蛋白)的ISH測(cè)定結(jié)合的實(shí)施方
式中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至RNAscope?的標(biāo)記探針的生物素分子，能夠
結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，和結(jié)合至HRP、AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合至所述抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子的另外的生物素分子。
[0091]在其中RNAscope_?.與基于抗體的ISH測(cè)定結(jié)合的實(shí)施方式中，所述信號(hào)放大探
針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、DNP、熒光團(tuán)或AP分子，能夠結(jié)合至所述HRP、DNP、熒光團(tuán)或AP分子的一個(gè)或多個(gè)第一抗體，和與HRP、聚合物-HRP、AP或聚合物-AP結(jié)合并且能夠結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)所述第一抗體的一個(gè)或多個(gè)第二抗體。
[0092]在其中RNAscope?與基于TSA的ISH測(cè)定結(jié)合的實(shí)施方式中，所述信號(hào)放大探
針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、能夠與所述HRP分子反應(yīng)的多個(gè)酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、和能夠結(jié)合至所述酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子并因此可見地顯示所述目標(biāo)核酸的檢測(cè)標(biāo)記物。所述檢測(cè)標(biāo)記物是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合。
[0093]在檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法中，首先提供了包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸的樣品。然后，所述目標(biāo)核酸雜交至所述一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針。然后，加入所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體，并且所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體雜交至所述一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針，借此將其捕獲至所述目標(biāo)核酸。然后，將所述信號(hào)放大探針的組分順序加入到測(cè)定溶液中，并結(jié)合至所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體，借此將其捕獲至所述目標(biāo)核酸。然后，通過流式細(xì)胞儀或其它顯像裝置來檢測(cè)所述信號(hào)放大探針中的標(biāo)記物。所述標(biāo)記物的存在、不存在或量使得能夠靈敏地檢測(cè)和定位樣品中的目標(biāo)核酸。
[0094]在檢測(cè)兩個(gè)目標(biāo)核酸的方法中，提供了包含或懷疑包含兩個(gè)目標(biāo)核酸的樣品。還提供了兩組或更多組捕獲探針，每組捕獲探針包含兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針。第一組捕獲探針能夠雜交至第一目標(biāo)核酸但不能雜交至第二目標(biāo)核酸，而第二組捕獲探針能夠雜交至第二目標(biāo)核酸但不能雜交至第一目標(biāo)核酸。另外提供了第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體和第一信號(hào)放大探針，以及第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體和第二信號(hào)放大探針。
[0095]第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體可以雜交至第一組捕獲探針，但不能雜交至第二組捕獲探針。第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體可以雜交至第二組捕獲探針，但不能雜交至第一組捕獲探針。第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體具有第一標(biāo)記探針，其直接或通過預(yù)擴(kuò)增子和擴(kuò)增子間接雜交至第一組捕獲探針。第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體具有第二標(biāo)記探針，其直接或通過預(yù)擴(kuò)增子和擴(kuò)增子間接雜交至第二組捕獲探針。所述第一標(biāo)記探針不同于所述第二標(biāo)記探針。
[0096]用不同的信號(hào) 放大探針順序標(biāo)記第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體和第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體。所述兩種信號(hào)放大探針可以是雙色CISH或雙色FISH。
[0097]在雙重核酸檢測(cè)中將進(jìn)行至少三個(gè)步驟。在第一步中，用第一信號(hào)放大探針標(biāo)記第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體。在示例性實(shí)施方式中，第一信號(hào)放大探針是通過結(jié)合的LP-HRP復(fù)合物與RNAscope?放大的標(biāo)記探針連接的TSA基ISH信號(hào)放大。在實(shí)施了 RNAscope?:
法后，RNAscope?的標(biāo)記探針首先與HRP結(jié)合。然后，通過酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物DAB的順序培育來檢測(cè)結(jié)合的LP-HRP復(fù)合物，從而導(dǎo)致對(duì)第一目標(biāo)核酸產(chǎn)生棕色信號(hào)。在第二步中，阻斷用于第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體的殘留標(biāo)記試劑以防止標(biāo)記物與將要在第三步中加入的第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體反應(yīng)。在第三步中，用第二信號(hào)放大探針標(biāo)記第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體。在示例性實(shí)施方式中，在實(shí)施了 RNAscope?法后，
RNAscope?的標(biāo)記探針首先與二硝基苯基(DNP)結(jié)合。然后，通過抗DNP-AP和顯色底
物固紅的順序培育來檢測(cè)結(jié)合的LP-DNP復(fù)合物，從而導(dǎo)致對(duì)第一目標(biāo)核酸產(chǎn)生紅色信號(hào)。
[0098]上述方法對(duì)于多重核酸檢測(cè)也是有用的，包括三種以上的核酸靶標(biāo)的順序檢測(cè)。因此，可以通過如上所述的類似方法分析可選地包含或懷疑包含第三種、第四種、第五種、第六種、第七種或甚至更多種核酸靶標(biāo)的細(xì)胞。
[0099]4.試劑盒
[0100]另一種常規(guī)類型的實(shí)施方式提供了用于檢測(cè)一種或多種目標(biāo)核酸的試劑盒。在一個(gè)方面，所述試劑盒包含目標(biāo)核酸、RNAscope?組分和常規(guī)ISH信號(hào)放大組分。在一種實(shí)
施方式中，所述試劑盒包含目標(biāo)核酸、能夠雜交至所述目標(biāo)核酸的捕獲探針組、能夠雜交至捕獲探針組的信號(hào)產(chǎn)生多聚體和能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號(hào)放大探針。所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針和含有標(biāo)記物的信號(hào)放大探針。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒中的信號(hào)產(chǎn)生多聚體可以包含適合的擴(kuò)增子、預(yù)擴(kuò)增子。所述試劑盒還可以包含固體載體。所述試劑盒的ISH信號(hào)放大組分可以是任何ISH信號(hào)放大系統(tǒng)。例如，它可以是本發(fā)明部分
1.1中所述的三種ISH信號(hào)放大系統(tǒng)。所述試劑盒可以用于本發(fā)明申請(qǐng)之前所述的任何核酸的檢測(cè)，其包括，但不限于，DNA、cDNA、RNA和mRNA。
[0101]在試劑盒的多重實(shí)施方式中，可以用兩種或更多種不同的亞組來表示多種組分。例如，所述標(biāo)記探針可以包含兩種亞組，其分別雜交至第一和第二目標(biāo)核酸。所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體可以包含兩種不同的標(biāo)記探針，其每一個(gè)直接或間接雜交至第一和第二捕獲探針。所述試劑盒還可以包含兩種不同的信號(hào)放大探針，其每一個(gè)結(jié)合至第一和第二標(biāo)記探針。通過與不同顏色的底物結(jié)合，不同信號(hào)放大 探針彼此之間是可區(qū)分的。在另一個(gè)方面，所述試劑盒包含能夠阻斷殘留的用于第一信號(hào)產(chǎn)生多聚體的標(biāo)記試劑的封閉劑，并因此確保第二信號(hào)產(chǎn)生多聚體與第二目標(biāo)核酸的特異性結(jié)合。
[0102]實(shí)施例
[0103]提供了下列實(shí)施例以說明(但不限制)所主張的發(fā)明。
[0104]下列實(shí)施例顯示了通過優(yōu)化的預(yù)擴(kuò)增子/擴(kuò)增子比值進(jìn)一步提高的RNAscope?和常規(guī)ISH信號(hào)放大方法的組合如何實(shí)現(xiàn)對(duì)原位RNA檢測(cè)的特異性和靈敏度的顯著改善。
[0105]實(shí)施例1.RNAscope?+常規(guī)ISH信號(hào)放大測(cè)定
[0106]可以在一天之內(nèi)完成基本測(cè)定程序，并且該程序通常包括以下步驟。提供了含有懷疑包含目標(biāo)核酸HPRTl的多個(gè)細(xì)胞的樣品。在固定并透性化后，將固定在固體載體上或處于懸液中的細(xì)胞雜交至下列一系列寡核苷酸探針。首先，將捕獲探針組雜交至細(xì)胞內(nèi)部的目標(biāo)RNA。隨后，將預(yù)擴(kuò)增子分子雜交至捕獲探針，從而提供用于擴(kuò)增子分子雜交的橋。將多個(gè)擴(kuò)增子分子進(jìn)一步雜交至預(yù)擴(kuò)增子，例如，多至20個(gè)擴(kuò)增子雜交至每個(gè)預(yù)擴(kuò)增子。然后，將多個(gè)標(biāo)記探針雜交至擴(kuò)增子，例如，多至20個(gè)標(biāo)記探針雜交至每個(gè)擴(kuò)增子。
[0107]通過TSA基ISH信號(hào)放大進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。將HRP結(jié)合至每個(gè)標(biāo)記探針然后，將含有酪胺-生物素分子的試劑加入到測(cè)定溶液中。HRP-結(jié)合的標(biāo)記探針促使酪胺-生物素的多個(gè)拷貝共價(jià)結(jié)合至鄰近HRP-標(biāo)記探針結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的富電子部分。然后，通過抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP檢測(cè)酪胺-生物素分子，其中抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP可以通過顯示出棕色的標(biāo)記物底物DAB顯像。通過(例如)具有適合濾光器
的常規(guī)熒光顯微鏡或通過多色流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)。比較了通過單獨(dú)的RNAscope?.或RNAscope?+TSA基ISH信號(hào)放大的人乳腺癌FFPE切片中低拷貝基因HPRTl基因的mRNA的檢測(cè)。如圖5所示，得自RNAscope?+TSA基丨SH信號(hào)放大方法的信號(hào)比得自單獨(dú)的RNAscope?的信號(hào)顯著更強(qiáng)。
[0108]通過使用雙“Z”探針設(shè)計(jì)來設(shè)計(jì)靶向特異性mRNA序列的探針組以防止或最大程度降低非特異性結(jié)合。雙“Z”捕獲探針的設(shè)計(jì)是基于HPRTl序列的并且對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)篩選以確保最大程度減少與非預(yù)期核酸序列的交叉雜交。在雙“Z”設(shè)計(jì)中，兩個(gè)相鄰的探針分別含有目標(biāo)雜交序列，例如，Tffl顯著高于測(cè)定溫度，長度為20至30個(gè)堿基的序列，和預(yù)擴(kuò)增子雜交序列，例如，Tm明顯低于測(cè)定溫度，長度僅為14個(gè)堿基的序列。因此，在雜交期間，單個(gè)捕獲探針能夠強(qiáng)烈并且穩(wěn)定地結(jié)合至目標(biāo)RNA，但由于14個(gè)堿基對(duì)同源性區(qū)具有明顯低于測(cè)定溫度的Tm而將與預(yù)擴(kuò)增子微弱并且不穩(wěn)定地結(jié)合。然而，當(dāng)兩個(gè)捕獲探針在相鄰位置存在時(shí)，例如，28個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)的合并的雜交強(qiáng)度在測(cè)定溫度下強(qiáng)烈并且穩(wěn)定地保持住預(yù)擴(kuò)增子，從而使信號(hào)放大發(fā)生。這種雙“Z”設(shè)計(jì)確保了高檢測(cè)特異性，并且簡(jiǎn)化了多個(gè)目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的探針設(shè)計(jì)。
[0109]由于TSA基ISH信號(hào)放大方法的信號(hào)提高能力，可以放大原位雜交期間細(xì)胞基質(zhì)中預(yù)擴(kuò)增子的非特異性結(jié)合，并因此產(chǎn)生了假陽性信號(hào)。當(dāng)預(yù)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)結(jié)合多個(gè)擴(kuò)增子并因此尺寸較大時(shí)，該問題將是嚴(yán)重的。放大能力的提高是以結(jié)合特異性的損失為代價(jià)的。我們通過適當(dāng)減少預(yù)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)結(jié)合的擴(kuò)增子的個(gè)數(shù)解決了該問題。最終結(jié)果是提高了信噪比。通過ISH信號(hào)放大方法，具體地，TSA基ISH信號(hào)放大方法的信號(hào)放大能力來補(bǔ)償放大能力的損失。
[0110]在本測(cè)定中，已設(shè)計(jì)并測(cè)試了幾種擴(kuò)增子。預(yù)擴(kuò)增子PREAMP1設(shè)計(jì)結(jié)合20個(gè)擴(kuò)增子。預(yù)擴(kuò)增子PREAMP2設(shè)計(jì)結(jié)合16個(gè)擴(kuò)增子。預(yù)擴(kuò)增子PREAMP3設(shè)計(jì)結(jié)合10個(gè)擴(kuò)增子。預(yù)擴(kuò)增子PREAMP4設(shè)計(jì)結(jié)合5個(gè)擴(kuò)增子。
[0111]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于PREAMP1，PREAMP2具有改善的信噪比。在所有測(cè)試的PREAMP中，PREAMP3和PREAMP4具有最好的信噪比(數(shù)據(jù)未示出)。
[0112]實(shí)施例2.多重RISA sc ope?+常規(guī)ISH信號(hào)放大測(cè)定
[0113]以下多重放大的預(yù)示性實(shí)施例示出了本發(fā)明所公開的方法如何可以以高靈敏度檢測(cè)兩種目標(biāo)核酸。為了研究所公開的發(fā)明用于低拷貝RNA轉(zhuǎn)錄本的原位檢測(cè)的可能性及其用于多重檢測(cè)的能力，將18S和Her-2用作模式基因。
[0114]在第一放大中，將18S基因捕獲到設(shè)計(jì)用于18S的捕獲探針上。用于18S的捕獲探針的設(shè)計(jì)如實(shí)施例1中所述。然后，將捕獲探針雜交的18S基因順序雜交至預(yù)擴(kuò)增子、擴(kuò)增子和標(biāo)記探針。然后，將標(biāo)記探針結(jié)合至HRP。然后，通過酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和DAB的順序培育來檢測(cè)結(jié)合的LP-HRP復(fù)合物。雜交產(chǎn)物在檢測(cè)目標(biāo)基因18S的位置處產(chǎn)生棕色。
[0115]在開始第二放大之前，阻斷來自第一放大的殘留的HRP。在第二放大中，將Her-2基因捕獲在設(shè)計(jì)用于Her-2的捕獲探針上。用于Her_2的捕獲探針的設(shè)計(jì)如實(shí)施例1中所述。然后，將捕獲探針雜交的Her-2基因順序雜交至預(yù)擴(kuò)增子、擴(kuò)增子和標(biāo)記探針。然后，將標(biāo)記探針結(jié)合至二硝基苯基(DNP)。然后，通過抗DNP-AP的培育檢測(cè)結(jié)合的LP-DNP。然后，通過染料試劑固紅檢測(cè)抗DNP-AP復(fù)合物上的堿性磷酸酶(AP)分子。雜交產(chǎn)物對(duì)目標(biāo)基因Her-2產(chǎn)生紅色信號(hào)。[0116]在本實(shí)施例中，我們已證明本發(fā)明所公開的方法可以用于檢測(cè)兩種RNA轉(zhuǎn)錄本。相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度可以用于比較兩·種基因的基因表達(dá)水平。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)至少一種目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括: (a)提供包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸的樣品； (b)提供能夠雜交至所述目標(biāo)核酸的至少一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針； (c)提供能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的信號(hào)產(chǎn)生多聚體，其中所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針； (d)提供能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號(hào)放大探針，其中所述信號(hào)放大探針包含標(biāo)記物； Ce)將所述目標(biāo)核酸雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組； (f)將所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體捕獲至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組并借此將所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體捕獲至所述目標(biāo)核酸； (g)將所述信號(hào)放 大探針捕獲至所述標(biāo)記探針并借此將所述信號(hào)放大探針捕獲至所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體；和 (h)檢測(cè)所述標(biāo)記物的存在、不存在或量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的生物素分子，能夠結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，以及結(jié)合至辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合于所述抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子的另外的生物素分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、AP、二硝基苯基(DNP)或熒光團(tuán)分子，能夠結(jié)合至所述HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的一種或多種第一抗體，以及結(jié)合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合于所述一種或多種第一抗體的一種或多種第二抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、能夠與所述HRP分子反應(yīng)的多個(gè)酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、以及能夠可見地檢測(cè)所述酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子的檢測(cè)標(biāo)記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述檢測(cè)標(biāo)記物是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯色底物的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述顯色底物選自:二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和固紅。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含(i)能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的所述標(biāo)記探針，(ii)所述標(biāo)記探針和雜交至所述標(biāo)記探針并且能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的擴(kuò)增子，和(i i i )所述標(biāo)記探針、雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子、和雜交至所述擴(kuò)增子并且能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的預(yù)擴(kuò)增子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述預(yù)擴(kuò)增子:擴(kuò)增子之比為1-16之間、2-10之間或2-5之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述目標(biāo)核酸選自:DNA、cDNA、RNA和mRNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟(a)包括將所述目標(biāo)核酸捕獲到固體載體上。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟(a)中，所述樣品包含細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟(a)中，所述樣品包含細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或懷疑包含兩種或更多種不同的目標(biāo)核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟(a)中，所述樣品包含兩種或更多種不同的細(xì)胞，所述細(xì)胞中的每一種包含或懷疑包含不同的目標(biāo)核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，利用雙色顯色原位雜交(CISH)或雙色熒光原位雜交(FISH)來檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，利用兩種不同的信號(hào)放大探針來實(shí)施所述雙色CISH，其中第一信號(hào)放大探針包含:酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和DAB，而第二信號(hào)放大探針包含:抗-DNP-AP和固紅。
16.—種試劑盒,包含: Ca)目標(biāo)核酸； (b)能夠雜交至所述目標(biāo)核酸的一組兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針； (c)能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的信號(hào)產(chǎn)生多聚體，其中所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針；和 (d)能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號(hào)放大探針，其中所述信號(hào)放大探針包含標(biāo)記物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的生物素分子，能夠結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，以及結(jié)合至HRP、AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合于所述抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子的另外的生物素分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子，能夠結(jié)合于所述HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的一種或多種第一抗體，以及結(jié)合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合于所述一種或多種第一抗體的一種或多種第二抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述信號(hào)放大探針包含:能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、能夠與所述HRP分子反應(yīng)的多個(gè)酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、以及能夠可見地檢測(cè)所述酪胺-生物素分子的檢測(cè)標(biāo)記物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，所述檢測(cè)標(biāo)記物是抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯色底物的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述顯色底物選自:DAB和固紅。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，所述信號(hào)產(chǎn)生多聚體包含(i)能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的所述標(biāo)記探針，(?)所述標(biāo)記探針和雜交至所述標(biāo)記探針并且能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的擴(kuò)增子，和(i i i )所述標(biāo)記探針、雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子和雜交至所述擴(kuò)增子并且能夠雜交至所述兩個(gè)或更多個(gè)捕獲探針的組的預(yù)擴(kuò)增子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述預(yù)擴(kuò)增子:擴(kuò)增子之比為1-16之間、2-10之間或2-5之間。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中，所述目標(biāo)核酸選自:DNA、cDNA、RNA和mRNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，還包含細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或懷疑包含所述目標(biāo)核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，還包含兩種或更多種不同的細(xì)胞，所述細(xì)胞中的每一種包含或懷疑包含不同的目標(biāo)核酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的試劑盒，其中，所述信號(hào)放大探針是雙色顯色原位雜交(CISH)探針或雙色熒光原位雜交(FISH)探針。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，在所述 雙色CISH探針中，所述第一信號(hào)放大探針包含:酪胺-生物素、抗生蛋白鏈菌素-HRP和DAB，而所述第二信號(hào)放大探針包含:抗-DNP-AP和固紅。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103429755SQ201180062037
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月21日
【發(fā)明者】吳興永, 王暉瑜, 蘇楠, 王力翀, 羅宇齡 申請(qǐng)人:領(lǐng)先細(xì)胞醫(yī)療診斷有限公司