專利名稱：新城疫病毒重組疫苗a-ndv-lx/i4及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，產(chǎn)生一種表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，用于制造疫苗。
背景技術(shù)：
反向遺傳操作技術(shù)(Reverse genetics manipulation technique)是指在體夕卜通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術(shù)[Neumann G, Whitt M A, Kawaoka Y. Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned ？ Journal of General Virology, 2002,83 (11) J635-2662.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術(shù)，又常被稱為“病毒拯救”。由于最終“拯救”出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環(huán)節(jié)，在DNA水平上對RNA病毒基因組進(jìn)行各種體外人工操作，如進(jìn)行基因突變、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置換和基因互補(bǔ)(即構(gòu)建嵌合病毒)等改造，解決了對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進(jìn)行病毒各基因的功能、致病機(jī)理和病毒病防制策略的研究，同時為新型疫苗的研制和開發(fā)提供了新的思路[Huang， Ζ. , Elankumaran, S. , Panda, A. & Samal, S. K. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry Science，2003，82 :899-906. ]。 0 ;) (Newcastle disease virus, NDV)是新城疫(ND)的病原體。ND是雞的高度接觸性傳染病，可引起雞100%發(fā)病和死亡。新城疫病毒在分類上屬單鏈負(fù)股RNA病毒目(Mononegavirales)， 副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒屬 (Avulavirus)的成員。病毒有囊膜，基因組為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)模式為3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、 基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白 (NP)，P，M，F(xiàn)，HN和L蛋白。另外兩個蛋白，V和W蛋白由P基因編輯后表達(dá)[Alexander JA. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses. In Swayne, D., Glisson, J. R. , Jackwood, M. W. , Pearson, J. Ε. , Reed, W. M. (Eds. ). A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, fourth ed American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA 1998.]。根據(jù)對雞的毒力，NDV毒株可以為強(qiáng)毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已開展廣泛的試驗(yàn)來闡明病毒致病性的分子決定因素[Huang Z，Krishnamurthy S，Panda A，Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology，2003，77 (16) :8676-8685.]。大部分研究是關(guān)于 F和 HN 蛋白對致病性的作用，研究結(jié)果一致認(rèn)為F蛋白裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of thefusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct Integr Genomics，2004，4(4) 246-257.]。NDV毒力差異的分子基礎(chǔ)主要決定于FO蛋白的蛋白酶裂解位點(diǎn)的氨基酸序列，強(qiáng)毒的裂解位點(diǎn)有聚堿性氨基酸序列，其模式基序?yàn)?12GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位點(diǎn)則缺少聚堿性氨基酸序列，其模式基序?yàn)?12-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。在感染過程中，NDV HN蛋白首先與敏感細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，這種結(jié)合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F構(gòu)象發(fā)生變化；于是后者的融合肽被釋放出來，使病毒的包膜與細(xì) IfiII^^ffi^ [McGinnes, L. W. ， Sergei, Τ. ， Chen, H. ， Hamo, L. ， Schwertz, S. ， Li, D. & Morrison, Τ. G. Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of the Newcastle Disease Virus Fusion Protein. Virology, 2001, 289 :343-352.],強(qiáng)毒 F 蛋白的裂解位點(diǎn)為多個堿性氨基酸連續(xù)排列，可被機(jī)體多個組織器官的多種蛋白酶裂解， 因此，可導(dǎo)致全身性感染。弱毒株在該區(qū)域的堿性氨基酸則被中性氨基酸所代替，使相應(yīng)序列由 r/k112-r-q-k/r115-r-l117 變?yōu)?g/e112-r-q-g/e115-r-l117，這種 f 蛋白前體僅能被有限的組織或器官分泌的胰樣蛋白酶裂解，感染性很低或無感染性。因此，F(xiàn)蛋白是NDV毒力和致病性的主要決定因素[Peeters, B. P.，de Leeuw, 0. S.，Koch, G. & Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA :Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. Journal of Virology, 1999,73(6) :5001-5009.]。不少研究已經(jīng)通過反向遺傳技術(shù)將弱毒株F蛋白裂解位點(diǎn)突變成強(qiáng)毒株的裂解位點(diǎn)而使弱毒株變成了強(qiáng)毒株，這已被這些重組病毒的致病性試驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)；反之亦然。然而關(guān)于HN蛋白對毒力的作用的結(jié)果還沒有定論。在一些試驗(yàn)中，弱毒骨架中插入編碼強(qiáng)毒HN蛋白的嵌合體病毒致病性有了明顯增加，例如根據(jù)MDT 和ICPI指標(biāo)判斷重組病毒的致病性從弱毒增強(qiáng)為中等毒力；而在另一些試驗(yàn)中用相同的試驗(yàn)方法，在弱毒的骨架中置換強(qiáng)毒HN蛋白，但是重組病毒的毒力沒有上升[de Leeuw OS, Koch G，Hartog L，Ravenshorst N，Peeters BP. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin—neuraminidase protein.The Journal of general virology, 2005,86 (Pt 6) : 1759-1769.]。有人認(rèn)為，弱毒 ND 病毒載體骨架用于構(gòu)建重組病毒，很難提供合適的表達(dá)強(qiáng)毒HN蛋白基因的全部信息[Estevez C， King D，Seal B，Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research，2007，129(2) :182-190.]。
自1擬6年發(fā)現(xiàn)新城疫(ND)以來，ND已發(fā)生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現(xiàn)，尤其是90年代之后出現(xiàn)了新的基因VII型NDV，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經(jīng)濟(jì)的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由于ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發(fā)生十分普遍，ND仍然成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，也就是說，常規(guī)的疫苗對于NDV強(qiáng)毒的攻擊并不能提供理想的保護(hù)。從近十年來的ND流行特點(diǎn)來看， 臨床上所分離到的NDV毒株大多數(shù)屬于基因VII型[Liu XF, Wan HQ, Ni XX，Wu YT & LiuWB. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Archives of Virology, 2003,148(7) : 1387-1403.]，而常規(guī)的 ND 疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遺傳距離上當(dāng)前NDV分離株與常規(guī)ND疫苗株相差較遠(yuǎn)。2000年黃勇等在發(fā)病的鵝群中，成功分離到了基因VII型新城疫強(qiáng)毒ZJl株， 并進(jìn)行了全基因組測序，登錄號為AF431744[Huang Y，Wang HQ, Liu H Q, Wu YT & Liu XF. Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an out break in geese -.a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene. Archives of Virology, 2004,149 :1445-1457.]。在此基礎(chǔ)上， 2005年胡順林等建立了 NDV強(qiáng)毒株的反向遺傳操作平臺，成功拯救出了鵝源強(qiáng)毒ZJl株，并對該毒株進(jìn)行了致弱，但是獲救病毒的EID5tl和HA效價均較低，不適合于大規(guī)模的生產(chǎn)[胡順林，孫慶，吳艷濤，劉秀梵.用反向遺傳技術(shù)致弱基因VIId型鵝源新城疫病毒ZJl株.微生物學(xué)報，2007，47 O) :197-200. ] οHuang等人分別以弱毒株LaSota和強(qiáng)毒株Beaudette C(BC)為骨架，通過HN基因置換而構(gòu)建了兩株重組嵌合病毒 rlaSoBCHN 和 rBCLaSoHN[Huang Ζ, Elankumaran S, Yunus AS,Samal SK. A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV)protects against NDV and IBDV. Journal of virology, 2004, 78 (18) :10054-10063. ]。rIaSoBCHN 是用弱毒株 LaSota 的 HN 置換了骨架病毒BCHN的重組嵌合病毒。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，rlaSoBCHN的毒力比骨架病毒有顯著上升，而rBCLaSoHN的毒力比骨架病毒有明顯下降，而且重組嵌合病毒的組織嗜性與HN的來源有關(guān)，這說明HN是影響NDV毒力的一個重要決定因子[Huang Ζ, Elankumaran S，Panda A, Samal SK. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry science, 2003,82 (6) :899-906.]。但是 Wakamatsu 等人用 BC 強(qiáng)毒株的 HN 置換 LaSota 骨架病毒而得到的重組嵌合病毒，其致病指數(shù)或?qū)﹄u致病的嚴(yán)重程度與LaSota相比均未改變 [Wakamatsu N, King DJ, Seal BS, Samal SK, Brown CC. The pathogenesis of Newcastle disease :a comparison of selected Newcastle disease virus wild-type strains and their infectious clones. Virology, 2006, 353 (2) :333-343. ]。Estevez 等人以中毒株 Anhinga為骨架病毒，用嗜內(nèi)臟和嗜神經(jīng)強(qiáng)毒株的HN進(jìn)行置換而得到的重組嵌合病毒，其毒力與骨架病毒相比也沒有發(fā)生明顯改變[Estevez C，King D, Seal B, Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research,2007,129(2) :182-190.]。NDV/LX株是我們從健康雞群中分離到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/ LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應(yīng)答。NDV/LX病毒的ICPI值為0. 12，MDT為110h，按照OIE標(biāo)準(zhǔn)測得HA效價 10. 51og2。基因VII型強(qiáng)毒分離株JS-5-05-GO分離自發(fā)病鴨群，其F和HN基因序列號分別為EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分別是1. 91和46小時，HA效價平均為81og2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于發(fā)明一種表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗， 從而解決當(dāng)前所用疫苗株與流行株基因型不一致的問題。本發(fā)明表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5 月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC NO 3844。本發(fā)明的第二個目的在于發(fā)明一種表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗 A-NDV-LX/14的構(gòu)建方法本發(fā)明在建立雞源新城疫病毒NDV/LX株(CGMCC NO :3843)的反向遺傳操作平臺基礎(chǔ)上，將中國主要流行的NDV基因VII型分離株JS-5-05-GO的囊膜糖蛋白基因F基因的強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)裂解為弱毒位點(diǎn)，再將JS-5-05-GO的致弱的囊膜糖蛋白基因F基因和HN基因片段與NDV/LX株基因組的對應(yīng)部分進(jìn)行替換，拯救構(gòu)建出致弱的表達(dá)基因VII型F和HN 重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4。本發(fā)明利用反向遺傳技術(shù)成功拯救出了基因I型骨架替換上基因VII型流行毒株 JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因，該病毒具有弱毒和在雞胚上具有較高的繁殖滴度的特性，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，另外，該重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的F蛋白和HN蛋白為基因VII型與當(dāng)前我國NDV流行株的基因型相一致，因此，同常規(guī)疫苗(基因I和II型)相比，重組致弱毒株A-NDV-LX/I4在控制當(dāng)前新城疫的發(fā)病和流行方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4的構(gòu)建方法如下1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pA-NDV-LX/I4，構(gòu)建含有分離株NDV/LX的F基因和HN基因的質(zhì)粒pLI4，將分離株JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因替換到質(zhì)粒pLI4上，用Ml I和Spe I將質(zhì)粒mThl上的酶切片段替換到質(zhì)粒pLI4中，獲得質(zhì)粒FP ；將質(zhì)粒FP上裂解位點(diǎn)突變的F基因和HN基因替換NDV/LX株基因組的對應(yīng)部分，獲得質(zhì)粒pA_NDV_LX/I4 ；2)重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的拯救，將質(zhì)粒PA-NDV-LX/I4與表達(dá)NDVZJl毒株 NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI_L三個真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，轉(zhuǎn)染60h后將轉(zhuǎn)染樣品接種9 11日齡SPF 雞胚，即獲得表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4 ；3)重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的免疫保護(hù)效率的測定，將A-NDV-LX/I4株與骨架病毒 NDV/LX、供體病毒 JS-5-05-Go 株[Hu, ZL, Hu, SL, Meng C, Wang, XQ, Zhu, J, Liu, XF. Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs. " Aviandiseases 55(3) :391-397.)]禾口常規(guī)疫苗株進(jìn)行免疫保護(hù)效率的比較。經(jīng)過囊膜糖蛋白基因的替換和F基因裂解位點(diǎn)的突變，成功拯救出一株毒價高且高度致弱的表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4株。經(jīng)試驗(yàn)表明本發(fā)明構(gòu)建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫試驗(yàn)雞兩周后，雞血清HI 的平均效價為27 ；La Sota免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為10%和30% ；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為40%和 20% ；V4免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和10% ；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和20%，上述病毒的分離率均顯著高于A-NDV-LX/I4免疫組，從而證明與常規(guī)疫苗相比，重組弱毒疫苗能夠提供更加堅實(shí)的免疫保護(hù)效率。


圖1NDV/LX株全長克隆prLX構(gòu)建模式圖。圖2重組質(zhì)粒ρ LI4構(gòu)建模式圖。圖3F蛋白裂解位點(diǎn)突變模式圖。圖4重組質(zhì)粒pA-NDV-LX/I4構(gòu)建模式圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月 19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO :3844.實(shí)施例一、NDV/LX株全長克隆prLX構(gòu)建。構(gòu)建模式如圖1所示。步驟一 NDV/LX株的獲得從健康家禽腸道分離到一批新城疫病毒弱毒株，對其生物學(xué)特性血凝價、ICPI、 EID50進(jìn)行分析，在這些弱毒株中篩選出血凝價高、復(fù)制能力強(qiáng)的疫苗候選株；并對候選株進(jìn)行免疫原性分析，免疫2周齡SPF雞，免疫后測定血清中抗新城疫病毒的效價以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平，最終獲得能在呼吸道和消化道很好的復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應(yīng)答的新城疫弱毒株NDV/LX (基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。通過EID50 測定，獲得 IO8'7EID50/0. ImL NDV/LX 病毒，ICPI 值為 0. 12，MDT 為 IlOh0本發(fā)明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株，于2010年5月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCC NO :3843.步驟二 NDV/LX株基因組的修飾設(shè)計8對引物用于擴(kuò)增NDV/LX株基因組全長序列，并進(jìn)行測序，每個片段大小約 2000bp左右，引物序列如下CN 102533676 A
權(quán)利要求
1.新城疫病毒重組疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏號是CGMCC NO :3844。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏號是CGMCCNO3844。本發(fā)明構(gòu)建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫試驗(yàn)雞兩周后，雞血清HI的平均效價為27；LaSota免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為10%和30%；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為40%和20%；V4免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和10%；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和20%，與常規(guī)疫苗相比，本發(fā)明重組弱毒疫苗能夠提供更加堅實(shí)的免疫保護(hù)效率。
文檔編號C12N7/01GK102533676SQ20121000069
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者劉慧謀, 劉文博, 劉曉文, 劉秀梵, 王曉泉, 胡順林 申請人:揚(yáng)州大學(xué)