專(zhuān)利名稱(chēng)：人胃癌腫瘤干細(xì)胞株gam-016s的培養(yǎng)建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人胃癌腫瘤干細(xì)胞株的培養(yǎng)建立，屬于細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤組織中存在數(shù)量稀少的癌細(xì)胞，在腫瘤形成過(guò)程中充當(dāng)干細(xì)胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潛能，其眾多性質(zhì)與干細(xì)胞相似，因此被稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞(TIC)。由于在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的重要作用，TIC已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。但在腫瘤細(xì)胞群落中，Tic數(shù)目稀少，培養(yǎng)相對(duì)不穩(wěn)定，因此發(fā)展高效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)以及維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)今研究的重要任務(wù)。TIC的研究材料主要來(lái)自3個(gè)方面:患者的腫瘤標(biāo)本、腫瘤細(xì)胞株及腫瘤移植瘤。由于腫瘤細(xì)胞株容易獲得和培養(yǎng)，目前許多研究者使用細(xì)胞株作為T(mén)IC研究的重要材料，用以研究TIC調(diào)節(jié)通路，為臨床治療提供靶點(diǎn)。但腫瘤細(xì)胞株能否保持原代腫瘤的等級(jí)結(jié)構(gòu)一直遭到質(zhì)疑。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)得到的TIC表面標(biāo)記或調(diào)節(jié)通路上的調(diào)節(jié)分子或基因，最終都要通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)再進(jìn)行驗(yàn)證。以腫瘤移植瘤作為T(mén)IC的研究材料的方法則很大程度上解決了這種一致性的問(wèn)題。異體移植腫瘤是將來(lái)自于臨床的腫瘤標(biāo)本接入裸鼠皮下使其長(zhǎng)出實(shí)體瘤，再將長(zhǎng)出的實(shí)體瘤繼續(xù)接種裸鼠在裸鼠體內(nèi)傳代。實(shí)體瘤在裸鼠體內(nèi)傳代次數(shù)越多，越容易在短時(shí)間內(nèi)建立腫瘤細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)異體移植而得到的瘤塊組織在體外進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備，再將制備的單細(xì)胞進(jìn)一步的分離培養(yǎng)從而獲得TIC。雖然原代腫瘤免疫缺陷小鼠的異體移植會(huì)改變干細(xì)胞的生存環(huán)境，但使用這種方法得到的TIC仍是最接近體內(nèi)真實(shí)狀態(tài)的Tic。

發(fā)明內(nèi)容

專(zhuān)利的研究目的:胃癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在全世界癌癥死亡率中排名第二。雖然不斷有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤干細(xì)胞廣泛存在于各種實(shí)體瘤內(nèi)，但目前對(duì)胃癌干細(xì)胞的研究卻為數(shù)甚少。由于腫瘤干細(xì)胞在腫瘤研究和治療上的重要意義，我們使用異源移植裸鼠的實(shí)體瘤塊進(jìn)行了胃癌干細(xì)胞的分離和純化培養(yǎng)。專(zhuān)利的研究結(jié)果:本發(fā)明通過(guò)對(duì)病人胃癌組織異源移植小鼠瘤塊在體外的原代細(xì)胞培養(yǎng)、腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)和無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)獲得了腫瘤干細(xì)胞株GAM-016S。該細(xì)胞株可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下形成克隆球；流式細(xì)胞檢測(cè)(FACS)和免疫組織化學(xué)(IHC)分析結(jié)果顯示GAM-016S細(xì)胞系表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子⑶24、⑶44，但不表達(dá)⑶133 ;裸鼠腹腔注射100個(gè)克隆球細(xì)胞即可形成瘤塊。專(zhuān)利的研究意義:人胃癌腫瘤干細(xì)胞株GAM-016S的分離建系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，進(jìn)而建立相應(yīng)完善的藥物篩選平臺(tái)。由于腫瘤干細(xì)胞重要的生物學(xué)作用，GAM-016S細(xì)胞株的建立對(duì)探索TIC生物學(xué)行為的分子機(jī)制、篩選研發(fā)胃癌治療新藥以及胃癌的腫瘤臨床研究治療都具有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。


圖1:GAM_016S克隆形成分析A.無(wú)血清培養(yǎng)基B.瓊脂培養(yǎng)基圖2 =GAM-016S干細(xì)胞標(biāo)志分子的FACS和IHC分析圖3:GAM-016S體內(nèi)致瘤能力分析
具體實(shí)施例方式將來(lái)自于臨床的胃癌標(biāo)本皮下接種于B/C雄性裸鼠體內(nèi)，待長(zhǎng)出實(shí)體瘤后繼續(xù)接種裸鼠在裸鼠體內(nèi)傳代。將從裸鼠上得到的異體移植腫瘤組織進(jìn)行胰酶消化分散制成單細(xì)胞懸液，再通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)、腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)和無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離建立胃癌干細(xì)胞。1.腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng):將異體移植的瘤塊進(jìn)行剪切并使用胰酶消化得到單細(xì)胞懸液；將獲得的單細(xì)胞懸液培養(yǎng)在含有EGF、FGF-2的無(wú)血清培養(yǎng)基中；使用低粘附性的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)以降低細(xì)胞的粘附力并支持低分化的腫瘤細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每隔一周更換一次含培養(yǎng)因子的培養(yǎng)液，直到細(xì)胞開(kāi)始形成懸浮的細(xì)胞團(tuán)為止。2.腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn):制備0.5%的瓊脂糖凝膠培養(yǎng)基(I: I瓊脂糖/培養(yǎng)液)，均勻地平鋪于培養(yǎng)皿底層制備培養(yǎng)基層。將無(wú)血清培養(yǎng)形成的腫瘤細(xì)胞團(tuán)分離成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用1:1瓊脂糖/培養(yǎng)液重懸，鋪于培養(yǎng)基層。將培養(yǎng)皿其置于5% C02、37°C的濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)。3.流式細(xì)胞檢測(cè)(FACS)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)(IHC):將腫瘤克隆細(xì)胞團(tuán)制備成單細(xì)胞懸液，清洗并與相應(yīng)的抗體(⑶24、⑶44、⑶133)孵育進(jìn)行FACS檢測(cè)。IHC檢測(cè)需要固定石蠟包埋制片脫片制備標(biāo)本，再將樣品標(biāo)本進(jìn)行抗體孵育檢測(cè)。4.體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn):將腫瘤克隆細(xì)胞團(tuán)制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并重懸于1:1PBS/Matrigel中，將不同數(shù)量的細(xì)胞皮下接種于BALB/C裸鼠以觀察致瘤性。GAM-016S保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)； 保藏日期為2011年12月9日；保藏編號(hào)=CGMCC N0.5572 ；分類(lèi)命名:人胃癌干細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明培養(yǎng)建立了一株名為GAM-016s的胃癌腫瘤干細(xì)胞。
2.本發(fā)明使用了腫瘤異體移植技術(shù)，再經(jīng)原代細(xì)胞培養(yǎng)、腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)和無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)獲得了胃癌腫瘤干細(xì)胞株GAM-016S。
3.本發(fā)明建系的胃癌腫瘤干細(xì)胞株GAM-016S，可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下形成克隆球；裸鼠腹腔注射100個(gè)克隆球細(xì)胞即可形成瘤塊；流式細(xì)胞檢測(cè)(FACS)和免疫組織化學(xué)(IHC)分析顯示GAM-016S細(xì)胞表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子⑶24、⑶44，但不表達(dá)⑶133。
4.本發(fā)明可 用于針對(duì)⑶44，⑶24靶向抗腫瘤藥物的研制。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胃癌腫瘤干細(xì)胞株的培養(yǎng)建立，適用于細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范疇。本發(fā)明通過(guò)對(duì)病人胃癌組織異源移植小鼠瘤塊在體外的原代細(xì)胞培養(yǎng)、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)獲得了腫瘤干細(xì)胞株GAM-016S。該細(xì)胞株可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下形成克隆球；裸鼠腹腔注射100個(gè)克隆球細(xì)胞即可形成瘤塊；流式細(xì)胞檢測(cè)(FACS)和免疫組織化學(xué)(IHC)分析結(jié)果顯示GAM-016S細(xì)胞系表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子CD24、CD44，但不表達(dá)CD133。GAM-016細(xì)胞株的建立對(duì)胃癌的腫瘤學(xué)研究、藥物篩選、臨床治療等方面具有重要的意義和價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/91GK103194429SQ20121000126
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉巖, 張文娜, 寧金鷹, 陳一友 申請(qǐng)人:中美冠科生物技術(shù)(北京)有限公司