專利名稱：一種提高植物抗病性及促進(jìn)其生長的微生物菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌劑，更確切地說是一種枯草芽孢桿菌{Bacillus )EBC7活菌或發(fā)酵菌液的微生物菌劑以及該菌劑在促進(jìn)黃瓜生長和提高其抗病性上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜在我國已有2000多年的栽培歷史，富含維生素A、C以及多種有益礦物質(zhì)，是我國的主栽蔬菜作物之一，并且，我國保護(hù)地黃瓜種植面積呈上升趨勢。但保護(hù)地是一個高濕、弱光的生態(tài)環(huán)境，因此黃瓜抗病性降低，病害頻繁發(fā)生，包括立枯猝倒病、枯萎病等土傳真菌病害；灰霉病、白粉病等氣傳真菌病害；以及其它細(xì)菌和病毒引起的病害。目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)防治的方法控制這些病害的發(fā)生發(fā)展，但由于土傳病害病原菌的生物學(xué)特性及土壤的屏障作用增加了防治難度，導(dǎo)致化學(xué)防治劑用量雖大卻難以正常發(fā)揮作用，同時， 土壤微生物區(qū)系受到干擾，病原菌的抗藥性增強，對土壤及黃瓜污染嚴(yán)重。隨著全社會對食品安全的重視和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，利用安全、高效、無環(huán)境污染的微生物菌劑防治植物病害已普遍為人們所接受。生防微生物的作用機制主要包括以下幾個方面有些微生物可以產(chǎn)生一些抗生素對病原菌有拮抗作用；有些微生物能產(chǎn)生殺菌蛋白，起到殺滅病原菌的作用；有些微生物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，可以裂解真菌性病原菌的細(xì)胞壁從而起到生防作用；有些微生物能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。由于拮抗作用和誘導(dǎo)抗性作用具有抗菌譜廣、對植物病害防效顯著等優(yōu)點，因此在植物病害防治應(yīng)用方面?zhèn)涫芮嗖A。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群之一，是植物病害生防微生物的重要組成成分，在植物病害的生物防治方面發(fā)揮了重要作用，人們已在很多植物上檢測過芽孢桿菌某些種的生防作用，如Guo等研究表明，從番茄根際分離的A/s sp. BBll對 Ralstonia引起的番爺細(xì)菌性枯萎病有一定的防治作用。目前對有害生物的防治策略已經(jīng)從有害生物綜合治理轉(zhuǎn)向有害生物可持續(xù)控制。并且人們已越來越認(rèn)識到殺菌劑的大量重復(fù)使用對環(huán)境造成的惡劣影響以及病原菌產(chǎn)生的抗藥性所帶來的嚴(yán)重后果， 因此利用有益微生物對病原進(jìn)行防治是一種頗具潛力的方法。這種防治方法對人畜和非靶標(biāo)生物安全，對環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗藥性，易于保護(hù)生物多樣性等優(yōu)點。針對我國土壤、農(nóng)作物與水體中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，病原菌抗藥性嚴(yán)重等問題，利用有益防治蔬菜病害有利于環(huán)境保護(hù)和綠色蔬菜的生產(chǎn)，具有良好的市場前景，會產(chǎn)生巨大的生態(tài)效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是公開了一種枯草芽孢桿菌EBC7,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC No. 5586。本發(fā)明的另一個目的是公開了 CGMCC No. 5586菌株的制備方法。本發(fā)明的再一個目的是公開了采用CGMCC No. 5586制備微生物菌劑的方法。本發(fā)明的再一個目的是提供該微生物菌劑在促進(jìn)黃瓜生長，提高黃瓜抗病性方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
本發(fā)明公開的枯草芽孢桿菌于2011年12月13日；保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌株保藏號為CGMCC No. 5586?？莶菅挎邨U菌Uaci77心subti I is) CGMCC No. 5586所具有的形態(tài)、生理生化特征如下
(1)菌落及形態(tài)特征在NA培養(yǎng)基上菌落圓形、白色、表面色暗、不透明，細(xì)胞桿狀、革蘭氏染色陽性。顯微鏡觀察菌株形態(tài)。(2)生理生化特性接觸酶陽性，氧化酶陽性，V-P測定陽性，V-P培養(yǎng)物終pH〈6， D-葡萄糖、D-棉子糖、D-山梨糖醇和D-甘露醇產(chǎn)酸，葡萄糖不產(chǎn)氣，水解酪朊、明膠和淀粉，利用檸檬酸鹽、不利用丙酸鹽，不水解酪氨酸，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶和賴氨酸脫羧酶， 產(chǎn)生精氨酸雙水解酶，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，不形成吲哚，不需要NaCl、KC1、尿囊素和尿酸鹽，在PH5. 7和6. 8的營養(yǎng)肉湯中生長，在2、5和7%的NaCl中生長，在0. 001%的溶菌酶存在時生長。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌subtiIisXGmc No. 5586的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行
(X) Bacillus subti I is EBC7的分離從天津市西青區(qū)溫室采集健康的、“津優(yōu)10號” 黃瓜根系；流水沖洗1-2 h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6-8 min,無菌水沖洗干凈備用；
(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉(zhuǎn)移到無菌研缽中加入PBS緩沖液(pH7.0)研磨，取研磨汁液系列稀釋后，各取100 W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)；
(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌株；然后將枯草芽孢桿菌接種于NB培養(yǎng)液中，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存?zhèn)溆?；其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2;NB培養(yǎng)基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌心subti I is) EBC7的特點
檢驗項目小鼠急性經(jīng)口毒性試驗
檢測結(jié)果動物染毒后，未見明顯中毒表現(xiàn)，觀察期內(nèi)無死亡，尸檢中各主要臟器未見明顯異常。檢測結(jié)論本品的小鼠急性經(jīng)口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理學(xué)評價療程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品屬于無毒。本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用含量I.SUXIOki的枯草芽胞桿菌(也《77心
的發(fā)酵液制備微生物菌劑的方法，其特征在于枯草芽孢桿菌菌液在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到固體NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后取一環(huán)NA培養(yǎng)基上的菌苔接種于含有NB培養(yǎng)液基的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以1_3%的接種量接種于發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到含量I. 5-4. 5 X 101°發(fā)酵液；
其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ；
NB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至IOOOml， pH7. 0-7. 2 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本發(fā)明進(jìn)一步公開了微生物菌劑在制備作為促進(jìn)黃瓜植株生長、防治黃瓜抗病性菌劑方面的應(yīng)用。其中所述的黃瓜抗病性包括對黃瓜枯萎病或黃瓜白粉病的抗性。其中黃瓜種子與微生物菌劑的重量份數(shù)比為20 :1。本發(fā)明的微生物菌劑，對黃瓜白粉病和枯萎病有明顯的防治效果，并且能夠顯著促進(jìn)黃瓜植株生長。經(jīng)微生物菌劑處理后，黃瓜植株對白粉病的抗性明顯增強，病葉率明顯低于空白對照，相對免疫效果達(dá)到了 80.4%。經(jīng)微生物菌劑處理后，黃瓜植株對枯萎病的抗性明顯提高，出苗率明顯高于空白對照，相對防治效果達(dá)到了 78. 5%。經(jīng)微生物菌劑處理后， 黃瓜植株的生長明顯增強，株高、地上部鮮重和干重均顯著高于空白對照。本發(fā)明公開的微生物菌劑所具有的有益效果在于
有益生防細(xì)菌具有對人畜和非靶標(biāo)生物安全，對環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗藥性，易于保護(hù)生物多樣性，來源廣泛等優(yōu)點。針對我國土壤、農(nóng)作物與水體中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，病原菌抗藥性嚴(yán)重等問題，利用益微菌防治蔬菜病害有利于環(huán)境保護(hù)和綠色蔬菜的生產(chǎn)，具有良好的市場前景，會產(chǎn)生巨大的生態(tài)效益和社會效益。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。下面通過實例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明所用到的試劑除特別指出外均有市售。津研4號黃瓜種子、 津優(yōu)10號黃瓜種子均有市售。實施例I
細(xì)菌(枯草芽孢桿菌)的制備
(X) Bacillus subti I is EBC7的分離從天津市西青區(qū)溫室采集健康的、“津優(yōu)10號” 黃瓜根系；流水沖洗I h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6 min, 無菌水沖洗干凈備用；
(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉(zhuǎn)移到無菌研缽中加入PBS緩沖液研磨，取研磨汁液系列稀釋后，各取100W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)；
(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養(yǎng)，得到枯草芽胞桿菌菌株；然后將枯草芽孢桿菌接種于NB培養(yǎng)液中，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存?zhèn)溆?；其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ;NB培養(yǎng)基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。實施例2
細(xì)菌(枯草芽孢桿菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到NA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；活化后取一環(huán)菌苔接種于含有NB培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以3%的接種量接種于發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到含量I. 5 X IO10發(fā)酵液含有芽孢桿菌的營養(yǎng)體和/或芽孢以及抗菌代謝產(chǎn)物。其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培養(yǎng)基(種子菌培養(yǎng)基):蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，pH7. 0 ; 發(fā)酵用培養(yǎng)基黃豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. O。實施例3
細(xì)菌(枯草芽孢桿菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到NA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；活化后取一環(huán)菌苔接種于含有NB培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以3%的接種量接種于發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到含量4. 5 X 101°發(fā)酵液 (含有芽孢桿菌的營養(yǎng)體和/或芽孢以及抗菌代謝產(chǎn)物)。其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培養(yǎng)基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，7. 2 ;
發(fā)酵用培養(yǎng)基黃豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 2。實施例4
細(xì)菌在15%的甘油中-80°C保存，使用時接種到固體NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后取一環(huán)NA培養(yǎng)基上的菌苔接種于含有NB培養(yǎng)液基的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以1%的接種量接種于發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到含量3. 5X 101°發(fā)酵液 (含有芽孢桿菌的營養(yǎng)體和/或芽孢以及抗菌代謝產(chǎn)物);
其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
NB培養(yǎng)基(種子菌培養(yǎng)基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。實施例5
該微生物菌劑在促進(jìn)黃瓜生長，提高黃瓜抗病性方面的試驗應(yīng)用實例。[試驗實例I]
該微生物菌劑對黃瓜枯萎病的防治作用
將在沙-玉米粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)的黃瓜枯萎病菌(黃瓜研究所提供)與消毒土按I :50(w/ w)混勻，裝缽備用。津研4號黃瓜種子與該微生物菌劑的500倍水稀釋液(見實施例2)按 20 I (W/W)拌種，播于缽中，每缽6粒種子，每處理6缽，重復(fù)3次。以清水拌種為對照，播種后7d調(diào)查種子出苗率，15d時調(diào)查發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)及相對防治效果。病級如下 0 :未發(fā)??；1 :病斑面積占葉片的0-25% ；2:病斑面積占葉片的25-50% ；3 :病斑面積占葉片的50-75% ；4 :病斑面積站葉片的75-100%。采用單因素方差分析，并進(jìn)行F檢驗。表I微生物菌劑對黃瓜枯萎病的防治作用
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌仰況YJrY1S) EBC7,其在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5586。
2.權(quán)利要求I所述枯草芽孢桿菌(ifeciパsubtilis) CGMCC No. 5586的制備方法， 其特征在于按如下步驟進(jìn)行(X) Bacillus subtil is EBC7的分離從天津市西青區(qū)溫室采集健康的、“津優(yōu)10號” 黃瓜根系；流水沖洗1-2 h后，在70%的こ醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6_8 min,無菌水沖洗干凈備用；(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉(zhuǎn)移到無菌研缽中加入PBS緩沖液(pH7.0)研磨，取研 磨汁液系列稀釋后，各取100 W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)；(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌株；然后將枯草芽 孢桿菌接種于NB培養(yǎng)液中，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存?zhèn)溆茫黄渲械腘A培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂 粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2;NB培養(yǎng)基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。
3.一種提高黃瓜抗病性及促進(jìn)其生長的微生物菌劑，其特征在于主要活性成分為權(quán)利 要求I所述的含量I. 5-4. 5 X 101°的枯草芽孢桿菌UaciBy1S subtil is EBC7)的發(fā)酵液。
4.權(quán)利要求I所述的微生物菌劑，其中所述的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液是指含有芽孢桿 菌的營養(yǎng)體和/或芽孢以及抗菌活性代謝產(chǎn)物的ー個整體。
5.權(quán)利要求I所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于枯草芽孢桿菌菌液在15%的 甘油中-80°C保存，使用時接種到固體NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后取ー環(huán)NA培養(yǎng)基上的 菌苔接種于含有NB培養(yǎng)液基的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以 1-3%的接種量接種于發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液；其中的NA培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；NB培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，pH7. 0_7. 2 ;發(fā)酵培 養(yǎng)基黃豆粉10. OOg,玉米淀粉5. OOg,酵母粉0. 50g, KH2PO4 0. 35g，CaCl2 0. 20g,補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。
6.權(quán)利要求3中所述的微生物菌劑在制備作為促進(jìn)黃瓜植株生長菌劑方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的微生物菌劑在制備作為防治黃瓜抗病性菌劑方面的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的黃瓜抗病性包括對黃瓜枯萎病或黃瓜白粉病的 抗性。
9.權(quán)利要求6-8任ー項所述的應(yīng)用，其中黃瓜種子與微生物菌劑的重量份數(shù)比為201。
全文摘要
一種提高植物抗病性及促進(jìn)其生長的微生物菌劑。本發(fā)明公開了一種提高黃瓜抗病性及促進(jìn)其生長的微生物菌劑，主要活性成分為含量1.5-4.5×1010的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)EBC7發(fā)酵菌液。本發(fā)明進(jìn)一步公開了微生物菌劑在提高黃瓜抗病性和促進(jìn)其生長方面的應(yīng)用。其中對黃瓜枯萎病的相對防治效果達(dá)到78.5%；對黃瓜白粉病的相對防治效果達(dá)到80.4%；并且顯著增加黃瓜的株高以及地上部鮮重、干重。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌制劑可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，安全無污染，并且能夠恢復(fù)和保持土壤環(huán)境的生態(tài)平衡。
文檔編號C12R1/125GK102586136SQ201210003920
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者于海濤, 岳東霞, 張要武 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心