專利名稱：一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境污染的問(wèn)題日趨嚴(yán)重，已成為當(dāng)前國(guó)際上的研究熱點(diǎn)之一。我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，但近年來(lái)由于水產(chǎn)養(yǎng)殖污染加劇，造成養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量不斷惡化，病原生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問(wèn)題特別是細(xì)菌性病害在密集型養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)生頻繁且影響嚴(yán)重，這極大地限制了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物，抗生素作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍?？股氐拈L(zhǎng)期濫用很可能會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes, ARGs), ARGs 經(jīng)排泄后將對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域及其周邊環(huán)境造成潛在基因污染。隨著抗生素類藥物不斷的大量使用，許多細(xì)菌都有了耐藥性，且情況日益嚴(yán)重，抗生素抗性基因已經(jīng)成為一種新型的環(huán)境污染物。目前在不同的環(huán)境介質(zhì)如水體沉積物水生生物和細(xì)菌體內(nèi)等均已檢出AR(}S的存在， 并且有研究還發(fā)現(xiàn)AR(is能夠通過(guò)可移動(dòng)的遺傳元件(Genetic mobile elements)在細(xì)菌之間傳播，進(jìn)而在環(huán)境中擴(kuò)散，這將會(huì)對(duì)公共健康和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現(xiàn)狀，開(kāi)展?jié)O業(yè)環(huán)境抗生素抗性基因污染的研究，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定方法，揭示抗生素抗性基因在漁業(yè)環(huán)境中的擴(kuò)散和傳播規(guī)律，對(duì)于評(píng)價(jià)抗生素抗性基因的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)十分必要。不僅能確保我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，而且對(duì)于我國(guó)的生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，人們普遍認(rèn)為抗生素對(duì)環(huán)境微生物的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)可能是其環(huán)境效應(yīng)最重要的部分?？股貙?duì)耐藥菌株抗性基因ARGs的誘導(dǎo)具專一性，因此可以認(rèn)為抗生素本身在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨等環(huán)境行為與其所誘導(dǎo)的抗生素抗性基因在環(huán)境中的廣泛傳播在理論上應(yīng)該具有很大的相似性和一致性。己有一些研究證實(shí)了抗性基因的存在與抗生素的使用之間存在很好的相關(guān)性。研究表明，攜帶ARGS的微生物菌株死亡后，攜帶 ARGS的DNA可釋放到環(huán)境中并持久存在，原因是在脫氧核糖核酸酶的保護(hù)下，防止其被降解，裸露的DNA分子最終又可以轉(zhuǎn)入到其他細(xì)胞內(nèi)。抗生素抗性基因的分子檢出可以確定無(wú)疑地證明細(xì)菌的耐藥性，闡釋細(xì)菌耐藥機(jī)理，更可以檢查耐藥因子的起源及傳播擴(kuò)散途徑和動(dòng)態(tài)，為耐藥細(xì)菌，尤其是耐藥病原菌的追蹤監(jiān)測(cè)提供了其它方法無(wú)法取代的最佳手段。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)定耐藥基因的核酸序列還可用來(lái)檢測(cè)耐藥基因的變異，用來(lái)追蹤某一耐藥基因的系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化演化，并通過(guò)計(jì)算機(jī)分子結(jié)構(gòu)建模而預(yù)測(cè)該耐藥基因表達(dá)產(chǎn)物耐藥譜的演化。目前的抗性基因檢測(cè)方法主要有兩種，傳統(tǒng)的方法是利用抗性平板法篩選出抗性細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行總量的測(cè)定，并鑒定出抗性細(xì)菌的種屬，然后從菌體中提取DNA，再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)環(huán)境中的抗性基因。由于環(huán)境中許多微生物難以平板培養(yǎng)，主要是因?yàn)閷?duì)其最適生長(zhǎng)溫度、PH、氧、營(yíng)養(yǎng)成分等不十分清楚。因此，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)抗性難免低估了微生物的種類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種直接在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或環(huán)境樣品中提取總DNA，再利用PCR方法分析抗性菌株的方法，即一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，步驟如下
(1)細(xì)菌總DNA的提取提取水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境樣品里細(xì)菌總DNA；
(2)以步驟(1)所得總DNA為模板，SEQID NO:廣2所示序列為引物，PCR擴(kuò)增和分析 16S rDNA序列，進(jìn)行測(cè)序，鑒定菌株的種屬名稱；
(3)經(jīng)過(guò)種屬鑒定的菌株進(jìn)一步測(cè)序鑒定，檢測(cè)帶有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因?yàn)槟吐让顾鼗騠loR、耐磺胺類基因sull，和/或耐磺胺類基因sul2 (三種耐藥基因均為北京六合華大基因科技股份有限公司深圳分公司產(chǎn)品)。上游引物27f 有 19 個(gè)堿基=AGA GTT GAT CCT GGC TCA G(SEQ ID NO: 1)，下游引物 1492r 有 19 個(gè)堿基GGT TAC CTT GTT ACG ACT T (SEQ ID NO:2)。上述鑒定方法的步驟(2)中所述16S rDNA序列為SEQ ID NO:9^11所示任意一條序列；步驟(3)所述耐氯霉素基因floR序列如SEQ ID N0:12所示，耐磺胺類基因sull序列如SEQ ID N0:13所示。上述方法除用于鑒定外，也可以用于篩選水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的抗生素抗性菌株。其中，步驟(1)細(xì)菌總DNA的提取優(yōu)選如下操作方法
(1)將分離純化的細(xì)菌接種于2216E液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，隔夜搖床培養(yǎng)；其中分離純化優(yōu)選平板劃線法，2216E液體培養(yǎng)基(可從青島海博生物技術(shù)有限公司購(gòu)買)主要適用于海水環(huán)境，LB液體培養(yǎng)基主要適用于淡水環(huán)境，LB配方包括胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L ；
(2)吸取經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌液，7500rpm離心5min，棄上清液；
(3)沉淀加入無(wú)菌水，振蕩搖勻后，沸水煮IOmin；
(4)12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板。步驟(2)鑒定細(xì)菌的PCR反應(yīng)體系為50 μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix 25μ , 10 μ M的引物27f和引物1492r各2μ 、2. 5U的Taq酶0. 5 μ L、含50 150ng的DNA模板溶液 2μ 、ddH20 18. 5 μ L0步驟(2)鑒定細(xì)菌的PCR擴(kuò)增條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸90s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。步驟(2)鑒定細(xì)菌的PCR擴(kuò)增16S rDNA產(chǎn)物大小為1. 5Kbp。步驟(3)中檢測(cè)抗生素抗性基因的PCR反應(yīng)體系為20 μ L，其中2XPCR Reaction Mix 10μ L,2. 5U 的 Taq 酶 0. 2μ 、10 μ M 的上下游引物各 0. 8 μ L、含 50 150ng 的 DNA 模板溶液 lyL，ddH207. 2 μ L0擴(kuò)增耐氯霉素基因floR使用的引物序列上游引物floR-FW有18個(gè)堿基TGGCTC CTT TCG ACA TCC (SEQ ID NO: 3)，下游引物 floR-RV 有 19 個(gè)堿基:ATC CAC ATC GGT AGG ATG A (SEQ ID N0:4)。擴(kuò)增耐氯霉素基因floR的條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性45s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸5min。擴(kuò)增耐磺胺類基因sull使用的引物序列為上游引物sull-FW有22個(gè)堿基CGC ACC GGA AAC ATC GCT GCA C(SEQ ID NO: 5)，下游引物 sull-RV有 22 個(gè)堿基TGA AGT TCC GCC GCA AGG CTC G (SEQ ID NO:6)。擴(kuò)增耐磺胺類基因sul2使用的引物序列上游引物SU12-FW有22個(gè)堿基TCC GGT GGA GGC CGG TAT CTG G (SEQ ID N0:7)，下游引物sul2_RV有22個(gè)堿基CGG GAA TGC CAT CTG CCT TGA G (SEQ ID NO:8)。擴(kuò)增耐磺胺類基因sull或sul2的條件最佳為95 °C預(yù)變性5min，然后95 °〇變性15s, 63. 7°C退火30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸7min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的方法針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有效，DNA提取無(wú)需使用特殊試劑，也無(wú)需用酚和氯仿等有毒試劑，安全環(huán)保，價(jià)格低廉，步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠，PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增陽(yáng)性率高。以耐氯霉素基因(floR)、耐磺胺類基因(sull、su12)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具有與目的條帶吻合的菌株即為攜帶抗性基因的抗性菌株。運(yùn)用16S rDNA鑒定菌種和檢測(cè)抗性基因，DNA圖譜信息度高、實(shí)用性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，可運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定及相關(guān)分析，具有很高的理論研究意義和實(shí)用價(jià)值。


圖1.細(xì)菌菌株16S rDNA鑒定結(jié)果，其中1為陰性對(duì)照，2-10為鑒定菌種，M為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000。圖2.抗性基因檢測(cè)結(jié)果，其中1，2為floR基因檢測(cè)，3為sul2基因檢測(cè)，4為sull 基因檢測(cè)，5為陰性對(duì)照，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1抗生素抗性菌株篩選和鑒定
取養(yǎng)殖池塘的水樣，加Iml吐溫溶液，用滅菌的海水將水樣10_\10_2倍比稀釋，用移液槍吸取0. ImL的水樣涂布2216E液體培養(yǎng)基(海水)或LB液體培養(yǎng)基(淡水)平板，28°C隔夜搖床培養(yǎng)。用吸管吸取ImL的細(xì)菌培養(yǎng)液，7500rpm離心5min，棄掉上清，加入0. 4mL的無(wú)菌水，振蕩搖勻后，沸水浴煮lOmin，然后再12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板，-20°C保存。取制備的環(huán)境樣品DNA模板液，選取上游引物27f:AGA GTT GAT CCT GGC TCA G (SEQ ID N0:1)，下游引物 1492r :GGT TAC CTT GTT ACG ACT T (SEQ ID N0:2)，進(jìn)行 16S rDNA的PCR擴(kuò)增(引物由華大基因合成)。PCR反應(yīng)體系為50 μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix、10 μ M的引物27f和引物1492r、Taq酶、含50 150ng的DNA模板溶液、ddH20。具體成分見(jiàn)表1(其中2XPCR Reaction Mix,2. 5U的Taq酶來(lái)源于北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的PCR Kit)
表1 16S rDNA的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟如下(1)細(xì)菌總DNA的提取提取水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境樣品里細(xì)菌總DNA；(2)以步驟(1)所得總DNA為模板，SEQID NO:廣2所示序列為引物，PCR擴(kuò)增和分析 16S rDNA序列，進(jìn)行測(cè)序，鑒定菌株的種屬名稱；(3)經(jīng)過(guò)種屬鑒定的菌株進(jìn)一步測(cè)序鑒定，檢測(cè)帶有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因?yàn)槟吐让顾鼗騠loR、耐磺胺類基因sull，和/或耐磺胺類基因sul2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(1)細(xì)菌總DNA的提取具體操作如下(1)將分離純化的細(xì)菌接種于2216E液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，28°C隔夜搖床培養(yǎng)；(2)吸取經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌液，7500rpm離心5min，棄上清液；(3)沉淀加入無(wú)菌水，振蕩搖勻后，沸水煮IOmin；(4)12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(2)鑒定細(xì)菌的PCR反應(yīng)體系為50μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix 25μ 、2. 5U的Taq酶 0. 5 μ L、10yM 的引物 SEQ ID NO: 1 和引物 SEQ ID NO: 2 各 2μ 、含 50 150ng 的 DNA 模板溶液 2μ , ddH20 18. 5 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟 (2)鑒定細(xì)菌的PCR擴(kuò)增條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸90s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(2)鑒定細(xì)菌的PCR擴(kuò)增16SrDNA產(chǎn)物大小為1. 5Kbp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(3)中檢測(cè)抗生素抗性基因的PCR反應(yīng)體系為20μ L，其中2XPCR Reaction Mix 10 μ L、 2. 5U的Taq酶0. 2μ , 10 μ M的上下游引物各0. 8 μ L、含50 150ng的DNA模板溶液1 μ L， ddH207. 2 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴(kuò)增耐氯霉素基因fIoR使用的引物序列為SEQ ID N0:3、。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴(kuò)增耐氯霉素基因f IoR的條件為95 °C預(yù)變性5min，然后98°C變性15s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴(kuò)增耐磺胺類基因sull使用的引物序列為SEQ ID N0:5 6 ；擴(kuò)增耐磺胺類基因sul2使用的引物序列為SEQ ID N0:7 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴(kuò)增耐磺胺類基因sull或sul2的條件為95 °C預(yù)變性5min，然后98 °C變性1 ，63. 7°C退火30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，最后在72°C充分延伸7min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，該方法是提取細(xì)菌的總DNA作為模板，SEQIDNO:1~2所示序列為引物，PCR擴(kuò)增和16SrDNA序列分析鑒定菌株，同時(shí)以SEQIDNO:3~8所示序列為引物，進(jìn)行測(cè)序鑒定，檢測(cè)帶有抗性基因的抗性菌株。本發(fā)明的方法針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有效，DNA提取無(wú)需使用特殊試劑，也無(wú)需用酚和氯仿等有毒試劑，安全環(huán)保，價(jià)格低廉，步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠，PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增陽(yáng)性率高。運(yùn)用16SrDNA鑒定菌種和檢測(cè)抗性基因，DNA圖譜信息度高、實(shí)用性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景、有很高的理論研究意義和實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534002SQ20121000454
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者何建國(guó), 陳旭凌, 黃志堅(jiān) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)