專利名稱：基于微小rna的宮頸癌診斷和治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微小RNA(HIiciX)RNA)進(jìn)行宮頸癌的診斷和治療的方法。通過(guò)檢測(cè)微小RNA的表達(dá)，對(duì)宮頸癌進(jìn)行診斷；通過(guò)給病人抑癌作用的微小RNA，或者抑制致癌微小RNA的活性，達(dá)到治療宮頸癌的目的。
背景技術(shù)：
眾所周知，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因。E6和E7是在HPV感染的早期出現(xiàn)的兩種主要癌蛋白，在宮頸癌組織和宮頸癌誘導(dǎo)的細(xì)胞系中均表達(dá)升高。盡管微小RNA的生物學(xué)功能還不十分清楚，ー些研究發(fā)現(xiàn)微小RNA可導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生發(fā)展，而且它有可能參與細(xì)胞自然抵抗病毒感染的過(guò)程。微小RNA用于診斷有些微小RNA的降低導(dǎo)致了靶向的致瘤基因的調(diào)控紊亂， 進(jìn)而加速了致瘤基因的轉(zhuǎn)化。例如，在慢性粒細(xì)胞性白血病和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-15a，miR-16-l的表達(dá)缺失，在3'端的UTR區(qū)Bcl_2轉(zhuǎn)錄子與miR_15a，miR-16-l結(jié)合，從而降調(diào)抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)。同時(shí)miR-15a，miR-16-l促進(jìn)白血病細(xì)胞系的凋亡。所以miR-15a，miR-16-l被認(rèn)為是誘導(dǎo)原癌基因Bcl-2mRNA失活的腫瘤抑制劑。微小RNA與宮頸癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系之間的研究并不多見(jiàn)。我們用基因芯片的方法對(duì)1145種微小RNA在宮頸癌腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了與宮頸癌的發(fā)病相關(guān)聯(lián)的微小RNA.我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織，宮頸癌細(xì)胞系的微小RNA表達(dá)譜，確定ー個(gè)精確的宮頸癌診斷和分類系統(tǒng)，也為發(fā)現(xiàn)新型治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。微小RNA用于癌癥的治療一些微小RNA是癌基因，一些是抑癌基因,還有一些參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此模擬天然的Pri-微小RNA和Pre-微小RNA的人工微小RNA正應(yīng)用于基因的研究和治療領(lǐng)域。ー些研究表明微小RNAs可以作為很多疾病有用的治療靶點(diǎn)。對(duì)于那些致癌性微小RNAs，它的潛在的治療方法包括微小RNAs沉默，反義阻抑和微小RNA修正。而對(duì)于抑癌性微小RNAs，過(guò)表達(dá)它們可能是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的最有效的策略。微小RNA沉默是在它的生成過(guò)程中阻止其成熟的ー種方法。這可以通過(guò)干擾微小RNAs生成過(guò)程中的ー些成分如Drosha等的活性來(lái)實(shí)現(xiàn),寡核苷酸導(dǎo)入不同的pri-微小RNAs中也可能干擾發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。Pre-微小RNA的siRNA也可抑制微小RNA的合成,但是它的效率卻不高?；瘜W(xué)修飾的寡核苷酸反義阻抑是最常用的ー種抑制微小RNA功能的方法，這些寡核苷酸叫做微小RNA“拮抗劑”，它們能夠特異性的有效沉默微小RNA的表達(dá)。這種拮抗作用是特異的、有效的和長(zhǎng)久的，它們可用于抗癌治療中沉默癌性微小RNAs有力的工具。LNA (Locked nucleic acid)變更常常導(dǎo)致溶解溫度的提高并且增加了雙鏈的穩(wěn)定性。LNA可以按照不同的模式合成，它的優(yōu)點(diǎn)在于高的親和力，好的甚至可以提高錯(cuò)配的識(shí)別能力，低毒性并且可以增加代謝的穩(wěn)定性。它最吸引人的地方在于它在體內(nèi)發(fā)揮抑制癌性微小RNAs的作用是RNAi永遠(yuǎn)也達(dá)不到的，也就是說(shuō)LNA可以作為一個(gè)最有希望的抗癌的的反義治療方法。
微小RNA激動(dòng)劑可用模擬微小RNA結(jié)構(gòu)的微小RNA模擬物(Mimics)，也可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)的作用來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)源性抑癌性微小RNA的表達(dá)。近十年來(lái)，隨著微小RNAs發(fā)現(xiàn)和研究的快速進(jìn)展，微小RNA表達(dá)譜對(duì)闡明疾病發(fā)生機(jī)制和提供新的治療策略將發(fā)揮重要作用。而且，微小RNAs的突變或異常表達(dá)以及他們所控制的通路可能將成為有用的治療靶點(diǎn)。因此，微小RNA是腫瘤分類、早期檢測(cè)、疾病預(yù)后、制定治療方案和治療靶點(diǎn)等方面的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對(duì)臨床上宮頸癌的診斷和治療效果不佳的問(wèn)題，提供了基于微小RNA的診斷、治療的解決方法。我們首先應(yīng)用芯片技術(shù)對(duì)宮頸癌及癌周組織微小RNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。我們應(yīng)用的芯片中包含了 miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中幾乎所有的微小RNAs，這就為我們發(fā)現(xiàn)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的微小RNAs提供了重要的技術(shù)支持和保障。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩查用7個(gè)微小RNAs (4個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào))將上述兩組組織準(zhǔn)確的區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且發(fā)現(xiàn)了miR-886-5p (也叫VaultRNA2)在宮頸癌組織中表達(dá)最高。miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a*在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌周組織，是致癌性微小RNA ；而宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b是抑癌性微小RNA ;測(cè)定這些微小RNA可幫助宮頸癌的診斷；miR-886-5p、miR-610, miR-10a*、miR_30a*的抑制劑可用于腫瘤的治療；激活抑癌性微小RNAmiR-302d、miR-346、和miR_518b或者直接用這些抑癌性微小RNA的模擬物(mimics)也可以用于治療宮頸癌。微小RNA可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞凋亡通路，比如，miR-886-5p(VaultRNA2)降低細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期抑制蛋白Bax、p53和pl4的含量。提示這些微小RNA的作用物可以用干與化療藥的合并用藥，提高化療效果。本方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明用微小RNA進(jìn)行宮頸癌的診斷。在以往的研究中，mRNA在臨床主要應(yīng)用于腫瘤診斷，預(yù)后分析和腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)基于微小RNA的分類方法比基于mRNA的分類方法更為準(zhǔn)確。因?yàn)橄噍^需要分析成千上萬(wàn)的mRNA的方法，現(xiàn)在只需分析幾百種微小RNAs即能有效的進(jìn)行診斷。不同腫瘤特異的微小RNA表達(dá)譜可以成為癌癥診斷和預(yù)后評(píng)判的有用的指標(biāo)。另外，微小RNA特別穩(wěn)定，不像mRNA —樣容易分解。利用微小RNA進(jìn)行治療，可以同時(shí)進(jìn)行靶向多個(gè)蛋白質(zhì)，因?yàn)槲⑿NA?？刂埔幌盗泄δ艿鞍椎谋磉_(dá)。以腫瘤特異性微小RNA作為靶點(diǎn)，可以減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用。


圖I為在宮頸癌腫瘤組織升高和降低的微小RNA圖2為各個(gè)微小RNA的序列圖3為過(guò)表達(dá)miR-886后細(xì)胞的生長(zhǎng)增加
圖4為用miR-886_5p的拮抗劑后細(xì)胞凋亡的變化圖5為用miR-886_5p的激動(dòng)劑(模擬物)后細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)Bax的表達(dá)增加。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例I用Real-time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)的方法對(duì)宮頸組織或細(xì)胞的miR-886_5p進(jìn)行定量分析。I.用Trizol等方法提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行定量；2.用 Stem-Loop 引物進(jìn)行 microRNA 逆轉(zhuǎn)錄。MiR_886_5p Stem-Ioop RT引物序列5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGCTT-3'；上游引物序列為5'-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3'；下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；內(nèi)參U6SnRNA:Stem-Ioop 引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；上游引物序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；下游引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。3.逆轉(zhuǎn)錄(Reverse-transcriptase, RT)體系的配制每個(gè)10 μ I的RT體系，其中加入O. 5-1 μ g的總RNA作為模板(另6對(duì)宮頸癌及癌周組織提取的總RNA，提取步驟同前)。體系如下(具體體系需要根據(jù)RT酶的說(shuō)明而定)，在O. 5ml的薄壁管(或200 μ I PCR小管)中依次加入下列組分
總 RNA 模板O. 5-1 Ug
dNTP混合物(IOmM )0.5u I
IOOmM DTTO. 5 μ I
RNase 抑制劑 40U/ μ IO. 25 μ I
Stem-loop RT 引物(IwM)O. 5u I
M-MuLv反轉(zhuǎn)錄酶O. 5 U I
5X First-strand Buffer2 μ I
1%DEPC 水補(bǔ)足 10 μ IStem-Loop引物的microRNA逆轉(zhuǎn)錄,運(yùn)行RT程序16 0C X30min42 °C X45min85 °C X5min4°C Hold Stem-Loop引物的microRNA逆轉(zhuǎn)錄，RT產(chǎn)物的保存短期使用，于4°C保存；長(zhǎng)期保存，分裝后置于-70°C。3. Real-time PCR 檢測(cè)Real-time PCR 體系配制(25 μ I)
反應(yīng)體系
Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix12. 5μ I
上游引物(ΙΟμΜ)1μ I
下游引物(IOuM)1μ I
cDNA 模板2 μ I 加無(wú)菌水至25 μ IPCR 程序?yàn)?br> 95°C (I)6min
95O (2)30s
60°C (3)Imin
重復(fù)2—340次 根據(jù)(2_Λετ)計(jì)算每對(duì)樣本的相對(duì)表達(dá)量。序列表〈110〉首都醫(yī)科大學(xué)〈120〉基于微小RNA的宮頸癌診斷和治療方法〈140>201210005318· X<141>2005-01-10<160>13<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>50<212>DNA〈213〉人工的〈220〉 <223>Stem-loop RT 引物〈400〉Igtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccgctt 50<210>2<211>18<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物
<400>2cgggtcggagttagctca18
<210>3<211>16<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>3gtgcagggtccgaggt16<210>4<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉<223>Stem-loop RT 引物<400>4ggaacgcttcacgaatttg19<210>5<211>23<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>5attggaacgatacagagaagatt23<210>6<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>6ggaacgcttcacgaatttg23<210>7<211>23<212>RNA〈213〉人屬(Homo Sapiens)〈220〉〈223>miR-886_5p<400>權(quán)利要求
1.我們對(duì)宮頸癌組織和癌旁組織的微小RNA(HiiciX)RNA)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了一組在癌癥表達(dá)升高的微小RNA，一組在癌癥組織降低的微小RNA。我們的研究結(jié)果提示微小RNA可用于宮頸癌的診斷和治療。
2.miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌周組織；而宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b ;測(cè)定這些微小RNA可幫助宮頸癌的診斷。
3.miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a* 的抑制物(inhibitor)用于宮頸癌的治療；miR-302d、miR-346 和 miR-518b 模擬物(mimics)可以用于治療。
4.上述微小RNA用于診斷時(shí)，可用原位雜交、PCR、測(cè)序等方法測(cè)定組織或/和血中的微小RNA濃度。
5.用于治療時(shí)，抑制物和模擬物可用DNA、RNA或者肽結(jié)構(gòu)的衍生物；可以局部和全身用藥。
全文摘要
微小RNA用于宮頸癌的診斷和治療。miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌周組織，是癌基因；而宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)的包括miR-302d、miR-346、和miR-518b，是抑癌基因。這些微小RNA可用于宮頸癌的診斷；miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*的抑制物(inhibitor)用于宮頸癌的治療；miR-302d、miR-346和miR-518b模擬物(mimics)或表達(dá)激動(dòng)劑也可以用于宮頸癌的治療。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102660542SQ201210005318
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者張玉祥, 李晶華, 賈弘褆, 郝啟 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)