專(zhuān)利名稱(chēng)：利用細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體地是一種將細(xì)菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法。
背景技術(shù)：
能源危機(jī)與環(huán)境污染都是當(dāng)今世界面臨的突出問(wèn)題，氫氣是一種清潔、燃燒值高、利用形式多樣的可再生生物能源[1]。光合生物制氫技術(shù)能直接轉(zhuǎn)化太陽(yáng)能為氫能，特別是微藻光合制氫的底物是水，來(lái)源豐富，培養(yǎng)容易，不占用可耕地，是利用太陽(yáng)能生產(chǎn)氫氣的理想模式，成為目前國(guó)際上生物制氫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)β]。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因?yàn)槠錃浠富钚愿?、培養(yǎng)容易、生長(zhǎng)速度快、遺傳學(xué)背景清晰和轉(zhuǎn)化容易等原因被選為微藻制氫研究的模式物種M。但是，衣藻的氫化酶活性很容易受氧氣的抑制而失去活性[3’4]，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物，是導(dǎo)致了衣藻產(chǎn)氫效率低的主要原因。目前降低萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)氧氣含量的方法主要是通過(guò)去除培養(yǎng)基中硫元素來(lái)抑制光合系統(tǒng)II活性、進(jìn)而降低光解水產(chǎn)生的氧氣[5]，但是該方法同時(shí)抑制了光解水所產(chǎn)生的電子產(chǎn)量，最終仍然導(dǎo)致產(chǎn)氫效率低[3_5]。因此，要提高萊茵衣藻的產(chǎn)氫效率就需要既降低細(xì)胞內(nèi)的氧濃度又要保障電子的供應(yīng)。目前最有效的萊茵衣藻產(chǎn)氫技術(shù)為兩步法培養(yǎng)技術(shù)，即第一步為在正常TAP培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)萊茵衣藻，以獲得最大生物量；然后收集萊茵衣藻在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，最大限度獲得氫氣產(chǎn)量。萊茵衣藻在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)很容易污染其它細(xì)菌等微生物，在實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)過(guò)程中也很容易污染一些細(xì)菌，并且有些細(xì)菌能與萊茵衣藻長(zhǎng)期共棲，不顯著影響萊茵衣藻的生長(zhǎng)。本發(fā)明對(duì)在實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)過(guò)程中與萊茵衣藻藻株cc849(以下簡(jiǎn)稱(chēng)衣藻)共棲的細(xì)菌進(jìn)行了分離純化，得到三株分離菌，命名為L(zhǎng)2、L3和L4，經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析鑒定，分別與嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株776、微桿菌 (Microbacterium paraoxydans)菌株 591 禾口假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 A8 的 16S rRNA序列的相似性達(dá)到99 %，100 %和99 %。由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性，都對(duì)氧氣敏感，但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性，是因?yàn)楦鲋杏懈鼍木壒?。因此本發(fā)明還選取了慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)，驗(yàn)證其對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)和產(chǎn)氫的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用細(xì)菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法，使之更適合于萊茵衣藻及其它微藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中的第二階段增加氧氣消耗和提高產(chǎn)氫量的方法。本發(fā)明將上述三株分離菌和一株慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)根瘤菌)分別與純凈的萊茵衣藻藻株cc849在兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第一階段和第二階段按一定體積比混合進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明在第一階段的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，假單胞菌對(duì)衣藻的生長(zhǎng)有抑制作用，其它三種細(xì)菌無(wú)顯著影響。在第二階段的產(chǎn)氫培養(yǎng)時(shí)期，上述四種細(xì)菌都能顯著提高衣藻的產(chǎn)氫量，其最大產(chǎn)氫量分別是純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的4. 0 倍、2. 9倍、4. 1倍和5. 5倍。對(duì)藻菌共培養(yǎng)體系內(nèi)氧氣含量的檢測(cè)表明呼吸耗氧的增加是細(xì)菌-衣藻共培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量提高的主要原因。本發(fā)明的方法為衣藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中進(jìn)一步提高產(chǎn)氫量提供新方法，隨著生物制氫技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明將顯現(xiàn)出越來(lái)越大的實(shí)用性和重要性。本發(fā)明方法的要點(diǎn)是本發(fā)明提供了一種在萊茵衣藻兩步法制氫技術(shù)中的第二階段，向衣藻培養(yǎng)體系中加入一定量的某種細(xì)菌以增加培養(yǎng)體系內(nèi)呼吸耗氧和提高產(chǎn)氫量的方法及具體實(shí)施辦法。本發(fā)明所使用的某種細(xì)菌是這樣選取的在與萊茵衣藻藻株CC849共棲的細(xì)菌中分離并純化出了三株細(xì)菌L2、L3和L4，經(jīng)16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)分析，分別鑒定為嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、微桿菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591和假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8。它們都是能與萊茵衣藻共棲的好氧細(xì)菌。慢生大豆根瘤菌的選擇是由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性，都對(duì)氧氣敏感，但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性，是因?yàn)楦鲋杏懈鼍木壒?。本發(fā)明在將上述四種細(xì)菌分別在兩步法萊茵衣藻產(chǎn)氫技術(shù)中的第一階段和第二階段與純凈的萊茵衣藻cc849按照一定比例混合后共培養(yǎng)，證明了在第一階段的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，除了假單胞菌菌株A8抑制衣藻的生長(zhǎng)，其它三種細(xì)菌對(duì)衣藻生物量積累沒(méi)有顯著影響；在第二階段的產(chǎn)氫培養(yǎng)時(shí)期，在一定的藻菌體積比范圍內(nèi)，上述四種細(xì)菌均能顯著促進(jìn)衣藻的產(chǎn)氫量，尤其以根瘤菌的促進(jìn)作用最大，最大可提高產(chǎn)氫量4. 5倍。這種結(jié)果及其用途是人們?cè)谖⒃迳镏茪漕I(lǐng)域一直尋求的。通過(guò)檢測(cè)藻菌共培養(yǎng)體系的光合速率和呼吸速率，發(fā)現(xiàn)在衣藻培養(yǎng)液中弓丨入一定量的細(xì)菌顯著增加了藻菌共培養(yǎng)體系的呼吸耗氧速率，尤其以根瘤菌的作用最為顯著，是引起培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量增加的重要原因，這種結(jié)果及其用途是人們?cè)谖⒃迳镏茪漕I(lǐng)域一直尋求和希望實(shí)現(xiàn)的。按照本發(fā)明，所用的細(xì)菌是能與萊茵衣藻共棲的好氧細(xì)菌——嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、微桿菌菌株591和假單胞菌菌株A8以及慢生大豆根瘤菌，但不局限于這四種細(xì)菌，凡是對(duì)萊茵衣藻無(wú)毒性、并且能顯著增加藻菌共培養(yǎng)體系呼吸耗氧作用的細(xì)菌和其它微生物都適用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選的細(xì)菌是慢生大豆根瘤菌、假單胞菌菌株A8和嗜麥芽寡食單胞菌菌株776。按照本發(fā)明，所用的萊茵衣藻為細(xì)胞壁缺欠型藻株cc849，是為了實(shí)驗(yàn)研究的方便，但不局限于該藻株，其它萊茵衣藻藻株和其它具有相似代謝特征的產(chǎn)氫微藻都適用于本發(fā)明的方法，特別是產(chǎn)氫量高的藻株品種更適合于本發(fā)明方法和更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在本發(fā)明中，對(duì)從萊茵衣藻cc849培養(yǎng)液中分離純化出來(lái)的三株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析的物種分類(lèi)鑒定，其中16S rDNA基因的克隆所用的通用引物為 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘)，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知和在生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中能檢索得到的信息。本發(fā)明的具體實(shí)例中該對(duì)引物是合成于上海生工公司?？蛇x擇的，合成于其它生物公司。在本發(fā)明中，用于16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析的軟件——BLAST軟件、ClustalX V2. 0軟件和MEGA5. 05軟件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知和在生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中能檢索得到的信息。在本發(fā)明中，所用的進(jìn)行PCR擴(kuò)增的Taq酶和保存16Sr DNA基因的載體以及相關(guān)的分子生物學(xué)操作都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉和公知的。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，LA Taq 酶和PMD-19T vector購(gòu)自于寶生物公司(Takara)?？蛇x擇的，購(gòu)自于其它生物公司。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、首次將能與萊茵衣藻共棲的細(xì)菌以及慢生大豆根瘤菌用于萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中。2、顯著提高了產(chǎn)氫量。3、除了具有在生物能源生產(chǎn)方面具有重要應(yīng)用意義，在(X)2減排、緩解溫室效應(yīng)等環(huán)境保護(hù)方面也具有重要生態(tài)意義。


圖1三種分離菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。M 分子標(biāo)記；L2 分離菌L2 ； L3 分離菌L3 ；L4 分離菌L4。圖2基于16S rRNA序列的萊茵衣藻藻株cc849的共棲細(xì)菌L2、L3和L4的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。圖3萊茵衣藻cc849與分離菌L2、L3和L4以及根瘤菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況。圖4分離菌和根瘤菌對(duì)萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的影響。圖5正常培養(yǎng)條件下萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)的呼吸速率。圖6缺硫產(chǎn)氫條件下萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)的呼吸速率。圖7最佳產(chǎn)氫條件下純凈萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)體系上方的氧氣(A)和氫氣(B)含量變化。
具體實(shí)施例方式一、萊茵衣藻培養(yǎng)A、選取細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849，購(gòu)自美國(guó)Duke大學(xué)衣藻藻種庫(kù)；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)萊茵衣藻培養(yǎng)條件溫度25 士 1°C ；日光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光量子 /平方米 秒；50 IOOml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始 PH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天接種繼代培養(yǎng)m ；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5% ；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每2至3周繼代一次；C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件使用氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅制備缺硫TAP培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)TAP-S)[5]；將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝入培養(yǎng)管，培養(yǎng)瓶上方留IOml的空CN 間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)M小時(shí)；然后放在光照強(qiáng)度60微摩爾光量子/平方米·秒連續(xù)光照件下培養(yǎng)，溫度25士 1°C ；每M小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩型號(hào)5X1/8，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度200°C，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C;測(cè)氣體的組成和含量；二、細(xì)菌的分離、純化、鑒定和培養(yǎng)A、衣藻共棲細(xì)菌的分離、純化和培養(yǎng)取不同生長(zhǎng)時(shí)期染菌的衣藻培養(yǎng)液lmL，用無(wú)菌雙蒸水稀釋10人10_2、10_3三個(gè)濃度梯度，依次涂布于TAP培養(yǎng)基、TAP+大腸桿菌培養(yǎng)基LB (TAP培養(yǎng)基[7]和LB培養(yǎng)基[8]按照1 1的體積比混合)和YEM培養(yǎng)基M的固體平板上，分別置于25°C、28-30°C和37°C 的溫度下培養(yǎng)，待有菌落長(zhǎng)出來(lái)后，挑取單菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。B、細(xì)菌的分子鑒定(a)、細(xì)菌基因組的制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液2mL，加入無(wú)菌離心管中，12，OOOr/ min離心5min。棄上清，向裝有細(xì)菌沉淀的離心管中加入300 μ L10mg/mL溶菌酶，溫育2小時(shí)。然后依次加入 15 μ L 10mg/mLRNAase,30y L 20mg/mL 的蛋白酶 K，100 μ L 10%SDS，混勻，65°C保溫45分鐘至澄清。再加入125 μ L 5Μ NaCl和100 μ L 10% CTAB，65°C溫育30分鐘，充分裂解細(xì)胞和去除多糖。然后按照提取DNA常規(guī)步驟用苯酚抽提、無(wú)水乙醇沉淀DNA， 最后將DNA溶解于純水中備用。(b)、引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)選取細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增的通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘)(合成于上海生物工程公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]。(c)、PCR反應(yīng)體系與條件PCR采用50 μ L體系，LATaq酶(Takara)，反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 60s，55°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 15min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和純化。(d)、PCR產(chǎn)物測(cè)序和克隆純化后的PCR產(chǎn)物送華大基因生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector(Takara)連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 α細(xì)胞保存，并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片段測(cè)序的驗(yàn)證。(e)、16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析上述測(cè)序得到的16S rDNA基因序列提交 GenBanK,用 BLAST 軟件(http//www. ncbi. nlm. nih. gov)與已知序列進(jìn)行對(duì)比，用 ClustalX V2. 0軟件進(jìn)行排列，利用MEGA5. 05軟件采用Maximum-Likehood方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并確定它們的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)地位。三、慢生大豆根瘤菌的培養(yǎng)慢生大豆根瘤菌(B. japonicum)購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，正常培養(yǎng)條件是^°C，黑暗培養(yǎng)，水平搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)基是YEM(pH 7. 2)[15]，固體培養(yǎng)基含2%瓊脂，每3周繼代一次保種。四、細(xì)菌和萊茵衣藻cc849共培養(yǎng)方法A、正常條件下的共培養(yǎng)方法純凈的萊茵衣藻cc849在正常TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中后期，將藻細(xì)胞密度調(diào)整為lX107cells/mL。每一種細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，分別4000g離心5分鐘，用TAP培養(yǎng)
6基洗三遍去除YEM培養(yǎng)基，然后重懸于TAP培養(yǎng)基中。分別將每種細(xì)菌的濃度調(diào)整至0D_ 為1. 0。然后將30mL藻液與2mL細(xì)菌分別在IOOmL的三角瓶中混合，培養(yǎng)條件為溫度25°C， 光照強(qiáng)度60 μ πιοΙπΓ、-1。以純凈的萊茵衣藻cc849作為對(duì)照，培每天取ImL藻液，顯微鏡下觀察衣藻7天內(nèi)的生長(zhǎng)情況。B、產(chǎn)氫條件下的共培養(yǎng)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的衣藻培養(yǎng)液，5000r/min離心5min，收集細(xì)胞。收集后的藻細(xì)胞用全缺硫的培養(yǎng)基(TAP-幻洗三次，然后懸浮在TAP-S中，測(cè)定其葉綠素濃度，按照每管 0. 5mg葉綠素的量分裝在50mL的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)將每種細(xì)菌的濃度調(diào)整為0D_為1，分別按照藻液菌液(體積比)為8 1 20 1 80 1 200 1、400 1的比例加入每管藻液中，最后用TAP-S補(bǔ)充至40mL，密封，黑暗M小時(shí)呼吸耗氧以誘導(dǎo)氫酶的表達(dá)。然后放在連續(xù)光照(eOymol.n^.s—1)的條件下培養(yǎng)，每隔M小時(shí)用微量進(jìn)樣器抽取瓶中氣體，用高壓氣相色譜儀(GC)測(cè)定氫氣和氧氣的含量。從而得出最佳產(chǎn)氫量的菌液和藻液的體積比例。五、衣藻的生長(zhǎng)情況以及光合和呼吸速率檢測(cè)A、生長(zhǎng)情況檢測(cè)每天取ImL藻液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下數(shù)藻細(xì)胞數(shù)。B、光合和呼吸速率的檢測(cè)在衣藻培養(yǎng)過(guò)程中，每天取樣上下充分混勻后取2ml的藻液加入Hanstech Dff/1 型氧電極儀的反應(yīng)杯中，暗適應(yīng)5分鐘，記錄反應(yīng)杯中溶解氧下降的速率，即為呼吸耗氧速率；然后在不同光照條件下，記錄反應(yīng)杯中溶解氧上升的速率，即為光合放氧速率。數(shù)據(jù)分析后按照下列公式計(jì)算，即為呼吸速率V = S · K · 60 · 1000/P其中v為吸氧活性，單位是ymolA -mg^Chl化―1，S為曲線的斜率，單位是mirT1， K為常數(shù)，表示25°C下水中的溶氧量，單位是ymol02/ml，P為樣品的葉綠素濃度，單位是 mgChl/ml,60表示60min，1000表示記錄紙的滿量程為1000。實(shí)施例1萊茵衣藻培養(yǎng)萊茵衣藻生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低、氫化酶活性高，是微藻光合制氫的代表物種。 為了使實(shí)驗(yàn)因容易操作，本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞壁缺欠型的萊茵衣藻藻種cc849。①萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件按照Harris主編的《The Chlamydomonas Sourcebook :a comprehensive guide to biology and laboratory use. New York Academic Press. 1989》，優(yōu)選條件 25 士 1 °C，日光燈光照強(qiáng)度(100 200ymol photons HT2S4)；液體培養(yǎng)是在 50 lOOmlTris-Acetate-Phosphate (TAP)培養(yǎng)基，初始 pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天接種繼代培養(yǎng)；固體TAP平板培養(yǎng)基含1. 5%的瓊脂粉，藻種的保存和純化是挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上，每3 周繼代一次。②萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件按照Melis等(Plant Physiology. 2000,122 127-136)的方法，萊茵衣藻的產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)基(TAP-S)中進(jìn)行。缺硫培養(yǎng)基 (TAP-S)是把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾濃度的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅。本發(fā)明為了將來(lái)在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，有目的的簡(jiǎn)化了其產(chǎn)氫培養(yǎng)的操作步驟即將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用TAP-S培養(yǎng)基洗3次，然后懸浮在TAP-S或者含有不同濃度硫酸鹽的TAP-S 培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在50ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留IOml的空間，用翻口橡皮塞塞緊培養(yǎng)瓶密閉培養(yǎng)。放在黑暗條件下培養(yǎng)M小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 IOOymol photons IrT2iT1,溫度25 士 1°C。每M小時(shí)用微量氣密進(jìn)樣器抽取瓶中氣體，進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)。③按照冉春秋等(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2006，27 :62-66.)的方法用GC測(cè)定氫氣和氧氣含量。氣相色譜儀為Agilent Technologies GC 7890A，USA，分子篩5 X 1/8 (OD)，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣。進(jìn)樣體積0. 5ml，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度 200°C，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的外標(biāo)法計(jì)算氫氣和氧氣體積。實(shí)施例2衣藻共棲細(xì)菌的分離和鑒定①衣藻共棲細(xì)菌的分離、純化和培養(yǎng)取不同生長(zhǎng)時(shí)期染菌的衣藻培養(yǎng)液lmL，用無(wú)菌雙蒸水稀釋10人10_2、10_3三個(gè)濃度梯度，依次涂布于TAP培養(yǎng)基、TAP+大腸桿菌培養(yǎng)基LB (TAP培養(yǎng)基[7]和大腸桿菌LB培養(yǎng)基M按照1 1的體積比混合)和YEM培養(yǎng)基M的固體平板上，分別置于25°C、28-30°C 和37°C的溫度下培養(yǎng)，待有菌落長(zhǎng)出來(lái)后，挑取單菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。利用TAP+LB、YEM和TAP三種培養(yǎng)基平板，初步對(duì)與萊茵衣藻cc849共棲的細(xì)菌進(jìn)行分離，結(jié)果在TAP+LB混合培養(yǎng)基上分離得到兩種不同特征的單菌落，分別命名為L(zhǎng)2和 L3 ；在YEM培養(yǎng)基上分離得到一種單菌落，命名為L(zhǎng)4。②細(xì)菌的分子鑒定分別提取三種細(xì)菌基因組DNA作為底物，分別用通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物分別為單一條帶(如圖1所示)，經(jīng)電泳、回收純化后測(cè)序，分別對(duì)每株細(xì)菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)L2、L3和L4的16S rRNA基因序列在GeneBank 中分別與嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、微桿菌菌株591和假單胞菌菌株A8的16S rRNA基因序列具有較高的相似性，相似度分別達(dá)99%、100%和99% (如圖2所示)。實(shí)施例3細(xì)菌與萊茵衣藻cc849共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫的第一階段是衣藻在正常TAP培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，以獲得最大生物量的積累。在此階段，分別將上述分離得到的細(xì)菌L2、L3、L4和根瘤菌按照 2ml 30ml的菌藻體積比與純凈的萊茵衣藻cc849混合培養(yǎng)，以純凈萊茵衣藻cc849為對(duì)照，每天檢測(cè)培養(yǎng)液的藻細(xì)胞數(shù)(如圖3所示)，結(jié)果顯示萊茵衣藻cc849與上述細(xì)菌分別共培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)趨勢(shì)與純凈萊茵衣藻cc849的相似，細(xì)胞數(shù)都在培養(yǎng)的第四天達(dá)到最大，分別約為 3. 67X IO7 個(gè) /mL、3. 48X IO7 個(gè) /mL、2. 90X IO7 個(gè) /mL 和 3. 50X IO7 個(gè)/mL，純凈的萊茵衣藻cc849約為3. 56 X IO7個(gè)/mL。此結(jié)果表明L4菌明顯抑制萊茵衣藻的生長(zhǎng)，使細(xì)胞數(shù)降低了約18. 5%，是在萊茵衣藻培養(yǎng)中應(yīng)該盡量避免污染的細(xì)菌。根瘤菌和其它兩種細(xì)菌對(duì)萊茵衣藻的生物量積累無(wú)顯著影響。實(shí)施例4分離菌和根瘤菌對(duì)萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫的影響萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第二階段是在缺硫培養(yǎng)基中的光合產(chǎn)氫培養(yǎng)階段，分別上述三株分離菌L2、L3、L4和根瘤菌按照不同的體積比與萊茵衣藻cc849混合，在產(chǎn)氫條件下共培養(yǎng)并連續(xù)檢測(cè)產(chǎn)氫量的差別(如圖4所示)。結(jié)果表明這些細(xì)菌對(duì)衣藻產(chǎn)氫量的影響與藻菌的體積比有關(guān)。當(dāng)細(xì)菌的濃度為0D_ = 1、萊茵衣藻cc849的細(xì)胞濃度為12. 5mg葉綠素/L時(shí)，在適當(dāng)?shù)脑逡壕?體積比)組合下都使衣藻的產(chǎn)量顯著增加，尤其是衣藻與根瘤菌按照100 1的體積比共培養(yǎng)條件下，產(chǎn)氫量是純凈萊茵衣藻cc849單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)氫量的5. 5倍，約為82. 95 μ mol ；其次是分離菌L2和L4在藻液菌液(體積比) 為80 1時(shí)，氫氣積累量達(dá)到約60. 16 μ mol和62. 66 μ mol，是純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的4. 0和4. 1倍；分離菌L3對(duì)衣藻產(chǎn)氫的促進(jìn)作用較小，它在藻液菌液(體積比)為 200 1時(shí)，氫氣累積量最大，約為43. 83 μ mol，為純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的2. 9倍。結(jié)果表明，在產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下，上述分離菌和根瘤菌、尤其是根瘤菌在適當(dāng)?shù)谋壤履茱@著提高衣藻的產(chǎn)氫積累量，可以在兩步法衣藻產(chǎn)氫技術(shù)的第二階段引入衣藻培養(yǎng)體系以促進(jìn)萊茵衣藻產(chǎn)氫量的提高。實(shí)施例5藻菌共培養(yǎng)體系的光合放氧和呼吸耗氧在正常TAP培養(yǎng)基和光照條件下，純凈萊茵衣藻cc849分別與分離菌L2、L3、L4 和根瘤菌按照anl 30ml的菌藻體積比混合共培養(yǎng)，但是用氧電極法檢測(cè)不到光合放氧現(xiàn)象，只能檢測(cè)到呼吸耗氧速率。如圖5所示，在7天連續(xù)培養(yǎng)中的前3天，純凈萊茵衣藻 cc849的呼吸速率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，在第三天達(dá)到最低，約為4. 22 μ mol O2. mg^chl. h"1, 之后又略有回升，但基本穩(wěn)定在4. 46 4. 49 μ mol O2. mg—chl. h—1之間。當(dāng)衣藻cc849分別與上述細(xì)菌共培養(yǎng)后，培養(yǎng)體系的呼吸耗氧速率均明顯地呈現(xiàn)一直升高的趨勢(shì)，尤其是與根瘤菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率最高，最高達(dá)到5. 940 μ mol O2. mg—chl. h—1，提高了 32%， 與L2、L3和L4共培養(yǎng)體系的最高呼吸速率分別為5. 514 μ mol O2. mg^chl. 310 μ mol O2. mg^chl. IT1 和 5. 609 μ moIO2. mg^chl. tT1，分別提高了 23%、18%禾口 25%和。此結(jié)果表明這些細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)時(shí)，均顯著加速了培養(yǎng)體系內(nèi)的呼吸耗氧速率。在缺硫培養(yǎng)基中，即兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第二階段，上述細(xì)菌分別與萊茵衣藻cc849 共培養(yǎng)的體系中仍然檢測(cè)不到光合放氧現(xiàn)象，但呼吸速率均非常顯著地升高。如圖6所示， 在產(chǎn)氫培養(yǎng)的第一天，藻菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率均呈現(xiàn)最高值，與根瘤菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率最高，約為34. 80 μ mol O2. mg^chl. h—1，提高了約5. 0倍之多，與L2、L3和L4共培養(yǎng)體系的呼吸速率分別約為 30. 80 μ mol 02.mg_1chl.r\26. 80 μ mol O2. mg-1chl. IT1 禾口 32. 27 μ mol O2. mg^chl. h—1，分別提高了 6. 6倍、5. 7倍和6. 9倍。在產(chǎn)氫培養(yǎng)的第二天，藻菌共培養(yǎng)液的呼吸速率開(kāi)始迅速下降，下降了約39% 43%，到第三天時(shí)候降到零。在這一過(guò)程中，純凈的萊茵衣藻cc849的呼吸速率維持在5. 89 μ mol O2. mg^chl. IT1 6. 58 μ mol
Hig-1Chl. h—1。此結(jié)果表明呼吸耗氧速率的顯著增加是藻菌共培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量提高的重要原因。實(shí)施例6最佳產(chǎn)氫條件下藻菌混合培養(yǎng)體系中的氫氣和氧氣含量在兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第二階段，將萊茵衣藻cc849分別與上述各細(xì)菌按照產(chǎn)氫量最大的體積比混合，進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)。各體系中培養(yǎng)管上方的氧氣含量和氫氣含量的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化如圖7所示。圖7A顯示所有藻菌共培養(yǎng)體系中的氧氣含量都明顯快速降低，基本都在培養(yǎng)的第三天就降到了最低值，約為5. 7% 6. 4%，并保持在這一水平。與根瘤菌共培養(yǎng)體系的氧氣含量更是在共培養(yǎng)后的第一天就降到約6. 2 %，后期一直保持在4% 5%。 而純凈萊茵衣藻cc849在這一培養(yǎng)過(guò)程中的氧氣含量下降緩慢，直到培養(yǎng)的第六天才逐漸降到最低，約為7.6%，并保持在這一較高的水平。相對(duì)應(yīng)的，與根瘤菌共培養(yǎng)體系的氫氣積累量最高(如圖7B所示)，達(dá)到約83 μ mol,比純凈萊茵衣藻cc849體系的高約4. 5倍，與L2和L4共培養(yǎng)體系的最高氫氣積累量達(dá)到約60. 1 61. 5 μ mol,比純凈衣藻體系的高約4倍；與L3共培養(yǎng)體系的最大氫氣積累量略低，約為44. Oumol,比純凈衣藻體系的高約 3倍。此結(jié)果表明，根瘤菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)最利于產(chǎn)氫作用，本發(fā)明分離純化得到的嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、假單胞菌菌株A8和微桿菌菌株591對(duì)促進(jìn)衣藻產(chǎn)氫代謝的作用則依次次之。參考文獻(xiàn)[1]Hemschemeier A, Melis A, Thomas Happe. Analytical approaches to photobiological hydrogen production in unicellular green algae. Photosynthesis Research. 2009，102 :523-540[2]韓志國(guó)，李?lèi)?ài)芬，龍敏南，韓博平.微藻光合作用制氫-能源危機(jī)的最終出路 [J].生態(tài)科學(xué)· 2003,22 ) :104-108.[3]吳雙秀，王全喜.衣藻生物制氫的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志.2006， 26(10) :88-92.[4]Happe T,Mosler B,Naber J D. Induction,isolation and characterization metal content of hydrogenase in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. European Journal of Biochemistry. 1994, 222 :769-774.[5]Melis, A. ， Zhang, L. ， Forestier, Μ. ， Ghirardi, Μ. L. ， Seibert, Μ. ,2000. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol. 122，127—136.[6]趙亞蘭，尉亞輝，等.豆血紅蛋白的研究進(jìn)展.西北植物學(xué)報(bào).2000, 20 (4) 684-689[7]Harris Ε. H. , The Chlarmydomonas Sourcebook -.a comprehensive guide to biology and laboratory use, Academic Press, New York,1989.[8]Russell, David W. ； Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning :a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y :Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 0-87969-576-5.[9] Regensburger B. , Meyer L. , FUser M. , Weber J. , Studer D. , Lamb J. W., Fischer H. -M. , Hahn Μ. , and Hennecke H. . Bradyrhizobium japonicum mutants defective in root-nodule bacteroid development and nitrogen fixation, Arch Microbiol. 1986，144 :355-366.
權(quán)利要求
1.一種在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中提高產(chǎn)氫量的方法，其特征在于將好氧細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述好氧細(xì)菌選自嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、 微桿菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591、假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8和慢生大豆根瘤菌 (Bradyrhizobiumjaponicum)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中在兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第二階段中將好氧細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述好氧細(xì)菌為慢生大豆根瘤菌，在共培養(yǎng)體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD6tltl = 1、萊茵衣藻的細(xì)胞濃度為12. 5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為100 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述好氧細(xì)菌為嗜麥芽寡食單胞菌菌株776或假單胞菌菌株A8，在共培養(yǎng)體系中好氧細(xì)菌的濃度為0D_ = 1、萊茵衣藻的細(xì)胞濃度為12. 5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為80 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述好氧細(xì)菌為微桿菌菌株591，在共培養(yǎng)體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD6tltl = 1、萊茵衣藻的細(xì)胞濃度為12. 5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為200 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體涉及一種利用細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法。將以慢生大豆根瘤菌為代表的一些好氧細(xì)菌按一定比例與萊茵衣藻混合培養(yǎng)，能顯著提高產(chǎn)氫量。本發(fā)明為萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中進(jìn)一步提高產(chǎn)氫量提供了一種新方法。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102559832SQ20121000763
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者吳雙秀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所