專利名稱：轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，及其在定性檢測轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物及定量檢測轉(zhuǎn)Bt基因水稻轉(zhuǎn)基因含量上的應(yīng)用，以及利用該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對轉(zhuǎn)Bt基因水稻的轉(zhuǎn)基因含量進行檢測的熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
Bt基因是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶體蛋白基因的簡稱。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因中分為Cry和Cyt 二大類。迄今為止，已經(jīng)報道的 Bt 達(dá)至Ij 476 種，其中 Cry 分為 58 群、449 種，Cyt 分為 2 群、27 種(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2. html)。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的 Bt 基因已被成功地導(dǎo)入煙草、玉米、棉花等多種植物，獲得一大批具良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物品種和種質(zhì)資源，Bt基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最廣泛、最具潛力和應(yīng)用前景的抗蟲基因。目前全世界已獲得了50多種轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白基因植物，其中水稻、玉米、棉花、 馬鈴薯、油菜、楊樹、煙草等已商品化，我國農(nóng)業(yè)部于2009年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的生物安全證書。自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與應(yīng)用產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。截至2010年底，已有25個國家批準(zhǔn)了 24種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用。以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的170萬公頃發(fā)展到2010 年的14800萬公頃，14年間增長了 87倍。SPS(sucrose phosphate synthase)基因是水稻中的單拷貝基因，其核昔酸序列不僅具備種內(nèi)一致性，即所有水稻品種中含有SPS基因；還具備種間特異性，即在除水稻外其它物種里沒有該基因DNA片段；可作為轉(zhuǎn)基因水稻熒光定量PCR定量分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。近年來，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的安全性事件報道不斷，如1996年巴西豆過敏事件、 1998年P(guān)usztai事件、1999年美國大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星聯(lián)Bt玉米事件、2007年印度轉(zhuǎn)基因抗蟲棉事件、加拿大超級雜草事件和中國抗蟲棉事件等，這些事件促使國際組織和國家紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對遺傳改良植物及其產(chǎn)品實施標(biāo)識制度。為了應(yīng)對遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，有必要建立一套高效、快速、 特異的檢測技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)無疑是最佳選擇。在實際檢測中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分關(guān)鍵。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等在2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)實驗驗證，不管是由單一特異性外源序列還是多段目標(biāo)序列構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，都能很好的達(dá)到轉(zhuǎn)基因作物定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子由于生產(chǎn)方便、易擴增、操作簡便、穩(wěn)定性好、純度較高、高效經(jīng)濟等優(yōu)點愈來愈受全世界轉(zhuǎn)基因檢測專家和研究者們重視，在轉(zhuǎn)基因生物鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因品系以及其加工品的定量PCR檢測。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因作物和附屬產(chǎn)品檢測鑒定中的應(yīng)用將會發(fā)揮越來越重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，解決轉(zhuǎn)Bt基因水稻和轉(zhuǎn)Bt 基因農(nóng)作物檢測中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，提供一種準(zhǔn)確、快速、簡便的轉(zhuǎn)基因Bt農(nóng)作物尤其是轉(zhuǎn)Bt基因水稻的檢測方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ ID No. I (174bp)所示核苷酸片段與SEQ ID No. 2 (8 Ibp)所示核苷酸片段經(jīng)過拼接后，加入常見的酶切位點，插入常規(guī)克隆載體(如 pEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T等)制得。加入常見的酶切位點Pst I、Nde I和Sal I制得。具體的，所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ ID No. 3所示核苷酸片段插入 PEASY-T3載體制得，以下簡稱273號質(zhì)粒。所述SEQ ID No. 3核苷酸片段由SEQ IDNo. I片段與SEQ ID No. 2片段經(jīng)過拼接后，在插入片段兩端加入常見的酶切位點為Pst I.Nde I， 在SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2之間加入酶切位點Sal I得到。所述273號質(zhì)粒由如下方法構(gòu)建
I.設(shè)計PCR特異性引物；
2. PCR擴增；
3. Bt目標(biāo)序列獲取，片段長度174bp，通過測序進行驗證；并設(shè)計熒光定量PCR引物及探針；
4. SPS目標(biāo)序列獲取，片段長度81bp，通過測序進行驗證；并設(shè)計熒光定量PCR引物及探針；
5.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
6.通過PCR、酶切、測序等驗證標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
7.對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行特異性、穩(wěn)定性及均勻性檢測；
8.對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒特異性、穩(wěn)定性及均勻性結(jié)果進行分析。
(其他質(zhì)粒中也參照下述內(nèi)容做類似的修改)
本發(fā)明轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子既含有Bt外源基因又包括SPS水稻內(nèi)源基
因，Bt外源基因既可用于定性待測農(nóng)產(chǎn)制品是否含有轉(zhuǎn)Bt基因，水稻SPS內(nèi)源基因可定性檢測農(nóng)產(chǎn)制品中是否含有水稻；同時，Bt外源基因和水稻SPS內(nèi)源基因可以定量檢測水稻類農(nóng)產(chǎn)制品中的轉(zhuǎn)Bt基因水稻的含量。本發(fā)明還涉及所述轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在檢測水稻類農(nóng)產(chǎn)制品中轉(zhuǎn)Bt基因水稻含量中的應(yīng)用。所述轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒可用于檢測下列之一的Bt外源基因(I)CryIA(a)，
(2)CryIA (b), (3)CryIA (c), (4)Crylab/ac。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻的熒光定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，所述特異性引物和探針序列如下用于檢測Bt外源基因的引物和探針
Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’用于檢測水稻SPS內(nèi)源基因的引物和探針SPS-F-Primer :5’ -TTGCGCCTGAACGGATAT-3’SPS-R-Primer :5’ -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3’SPS-Probe :5’ -FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3'，其中FAM為熒光報告基團，Eclipse和TAMRA為熒光淬滅基團；所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由SEQ ID No. 3所示核苷酸片段插入pEASY_T3載體制得。使用以上試劑盒對轉(zhuǎn)Bt基因水稻的熒光定量PCR檢測可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進行， 提取待測樣品基因組DNA后，配制PCR緩沖液進行PCR擴增，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測農(nóng)作物是否含有相應(yīng)外源及內(nèi)源基因若出現(xiàn)Bt基因的特異性條帶(174bp)，則可判斷待測樣品中含有Bt外源基因；若同時出現(xiàn)SPS基因的特異性條帶(Slbp)，則可判斷待測樣品為轉(zhuǎn)Bt基因水稻；同時可以以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度濃度溶液于相同條件下進行擴增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲得待測樣品中Bt外源基因和水稻SPS內(nèi)源基因的拷貝數(shù)，即可獲知待測樣品中轉(zhuǎn)Bt基因水稻的含量。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，生產(chǎn)方便、易擴增、操作簡便、穩(wěn)定性好、高效經(jīng)濟，解決了轉(zhuǎn)Bt基因水稻檢測中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，并且提供了一種準(zhǔn)確、快速、簡便的轉(zhuǎn)Bt基因水稻檢測試劑盒，能夠很好的達(dá)到轉(zhuǎn) Bt基因水稻定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。


圖I為pEASY-T3重組載體結(jié)構(gòu)圖；圖2為Bt基因驗證電泳圖(M Marker, DL2000 ;1 4 :Bt基因);圖3為SPS基因驗證電泳圖(M Marker, DL2000 ;1 6 :SPS基因)；圖4為EcoRI單酶切結(jié)果(M :Marker，I :273號質(zhì)粒；2 :273號質(zhì)粒EcoRI單酶切)；圖5為EcoRI&Spel雙酶切結(jié)果(M =Marker, I :273號質(zhì)粒；2 :273號質(zhì)粒 EcoRI&Spel 雙酶切)；圖6為273號質(zhì)粒測序結(jié)果與合成序列比對圖；圖7為273號質(zhì)粒的Bt基因熒光定量PCR結(jié)果；圖8為273號質(zhì)粒的SPS基因熒光定量PCR結(jié)果；圖9為273號質(zhì)粒Bt基因均勻性qPCR分析；其中A為qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；B SqPCR 擴增曲線圖；圖10為273號質(zhì)粒SPS基因均勻性qPCR分析；其中A為qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；B為 qPCR擴增曲線圖；圖11為273號質(zhì)粒熒光定量檢測極限分析；
5
圖7 圖11中，A為熒光定量PCR分析圖，其中橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct值；B為Ct值確定圖，其中橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的對數(shù)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例I :273號標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明所述轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒包含外源Bt基因和水稻SPS內(nèi)源基因，其構(gòu)建方法包括如下步驟I.設(shè)計PCR特異性引物Bt-F :5’ -TTCCTTGGACGAAATCCCACC-3’Bt-R :5，-GCCAGAATTGAACACATGAGCGC-3，2. PCR 擴增利用設(shè)計的PCR引物特異性擴增轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物的特異性序列。3. Bt目標(biāo)序列獲取，并通過測序進行驗證步驟2獲得的擴增后特異性序列即為Bt目標(biāo)序列，其片段為174bp，用美國ABI公司3730型測序儀對其進行測序驗證；并設(shè)計熒光定量PCR引物及探針，熒光定量PCR引物及探針如下所示Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’其中FAM為熒光報告基團，Eclipse為熒光淬滅基團。4.采用與步驟4相同方法選擇SPS目標(biāo)序列，選取長度為Slbp的序列(SEQ ID No. 2)作為質(zhì)粒的內(nèi)源基因特異性片段，并設(shè)計熒光定量PCR引物及探針。熒光定量PCR引物及探針如下所示SPS-F-Primer :5’ -TTGCGCCTGAACGGATAT-3’SPS-R-Primer :5’ -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3’SPS-Probe :5’ -FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMR A~3'其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。5.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；將步驟4中選取的174bp的Bt特異片段與步驟5中選取的81bp的SPS內(nèi)源特異性片段經(jīng)過拼接，兩端添加Pst I、Nde I酶切位點，兩片段間添加酶切位點Sal I后，所得片段插入PEASY-T3克隆載體(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，完成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的組合， 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子如附圖I (因其插入片段長度為273bp，本發(fā)明簡稱273號質(zhì)粒)。其重組流程如下a.基因序列的QC :對所需合成的基因全序列進行分析，檢查基因內(nèi)部是否含有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列。根據(jù)序列情況設(shè)計合成方案；b.根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，進行單鏈oligo的設(shè)計及合成；c.利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因；
d.將合成好的基因裝入PEASY-T3 Cloning載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α ；e.測序驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符。質(zhì)粒重組片段序列如下273 號質(zhì)粒插入片段長度為 273bp (SEQ ID No. 3)，包含 Bt (174bp)、SPS (81bp)、 插入片段兩端的酶切位點Pst I和Nde I、Bt和SPS片段之間的酶切位點Sal I。6.通過PCR、酶切、測序等驗證273號質(zhì)粒構(gòu)建的正確性(I) PCR 驗證對構(gòu)建的273號質(zhì)粒用Bt基因及SPS基因引物進行擴增電泳，在目標(biāo)片段區(qū)域獲得清晰的單一預(yù)期條帶，如圖2、3，說明這二個片段已經(jīng)被正確地插入質(zhì)粒中。(2)酶切驗證根據(jù)插入片段和pEASY-T3載體TA克隆位點兩端特異性較高的酶切位點選擇 EcoRI單酶切和EcoRI&Spel雙酶切，結(jié)果見圖4、5。根據(jù)載體結(jié)構(gòu)圖以及載體和整合片段序列估算，273號質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單酶切以后除了載體片段，可以看到308bp左右的酶切片段，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致；經(jīng)EcoRI&Spel雙酶切處理后，同樣除了載體片段，清晰可見302bp 左右的酶切片段，與預(yù)期結(jié)果相符。(3)測序驗證根據(jù)插入片段(含兩端酶切位點)設(shè)計引物，進行PCR擴增，將擴增結(jié)果進行測序。并對測序結(jié)果與設(shè)計序列進行匹配對比，結(jié)果完全吻合，驗證了質(zhì)粒序列100%的可靠性，比較結(jié)果如圖6。7.對273號質(zhì)粒進行濃度、檢測重復(fù)性、穩(wěn)定性及均勻性檢測；(1)273號質(zhì)粒的濃度測定和檢測重復(fù)性質(zhì)粒突光定量PCR引物與4、5中相同，探針采用Primer Express2. O和Beacon designer 設(shè)計，然后由 TaKaRa公司負(fù)責(zé)合成。根據(jù)PicoGreen dsDNA Reagent and Kits所測定母液濃度計算質(zhì)?？截悢?shù)，再用滅菌去離子水分別稀釋成初始模板拷貝數(shù)為107，IO6, IO5, IO4, IO3,100，10拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行熒光定量PCR繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的qPCR定量分析體系并用于實際標(biāo)準(zhǔn)分子的定量分析，重復(fù)定量分析3次，分析檢測靈敏性。表I為熒光定量PCR 25 μ L擴增體系，表2為qPCR擴增程序，熒光定量PCR探針序列如下Bt :5’ -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’SPS 5/ -FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3/表I :熒光定量PCR 25 μ L擴增體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ ID No. I所示核苷酸片段與SEQ ID No. 2所示核苷酸片段經(jīng)過拼接后，插入克隆載體制得。
2.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQID No. 3所示核苷酸片段插入 PEASY-T3載體制得。
3.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在檢測轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因含量中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用于檢測下列之一的 Bt 外源基因(I)CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述農(nóng)作物可為下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述農(nóng)作物為水稻。
7.一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻的熒光定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針、PCR 緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，所述特異性引物和探針序列如下Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’SPS-F-Primer :5’ -TTGCGCCTGAACGGATAT-3’SPS-R-Primer :5’ -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3’SPS-Probe :5’ -FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3'，其中FAM為熒光報告基團，Eclipse和TAMRA為熒光淬滅基團；上述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由SEQ ID No. 3所示核苷酸片段插入pEASY_T3載體制得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因克螟稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及其應(yīng)用，一種轉(zhuǎn)基因克螟稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ ID No.1所示核苷酸片段與SEQ ID No.2所示核苷酸片段經(jīng)過拼接后，插入克隆載體制得。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因克螟稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，生產(chǎn)方便、易擴增、操作簡便、穩(wěn)定性好、純度較高、高效經(jīng)濟，解決了轉(zhuǎn)基因克螟稻和轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物檢測中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，并且提供了一種準(zhǔn)確、快速、簡便、省時省力的轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物檢測試劑盒，能夠很好的達(dá)到轉(zhuǎn)Bt基因作物定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102586303SQ20121000832
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者付賢樹, 俞曉平, 葉子弘, 崔海峰, 趙煦泓, 金榮愉 申請人:中國計量學(xué)院