專利名稱：一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌及其制品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，同時還涉及一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌作為飼料添加劑在飼料方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素酶是降解纖維素的一組酶系總稱，主要由外切￠-葡聚糖酶、內(nèi)切￠-葡聚糖酶和3-葡萄糖苷酶組成。由于纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場潛力，已被國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人士看好，將是繼糖化酶 、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工業(yè)酶種，甚至在中國完全有可能成為第一大酶種[YANG Sheng, HOU Hong-ping, et al. Recentadvance in cellulase [J]. China Condiment，2008，11 :56 62.]，因此纖維素酶是酶制劑工業(yè)中的一個新的增長點。纖維素酶應(yīng)用廣泛，在飼料方面，飼用纖維素酶對于反芻動物來說，可以補(bǔ)充體內(nèi)微生物形成纖維素酶的不足，促進(jìn)胃腸道有益微生物生長，提高飼料利用率；對于單胃動物來說，可以降低可溶性非淀粉多糖在食糜中產(chǎn)生的黏性，促進(jìn)內(nèi)源酶擴(kuò)散，改善消化道環(huán)境[ZHANG Weiwei,SHAO Shuli,WANG Shudan,et al. Characterization of a High CellulaseProducing Strain from Chicken Crop [J]. China Poultry，2009，22 :23 25.]。在稻桿處理方面，獲取高效降解秸桿纖維素的微生物菌株，是解決我國秸桿飼料化和人畜爭糧的最好的方法之一[Guillaume P，Zoulikha M R，F(xiàn)rederic S，et al. High-performancehydrolysis of wheat straw using cellulase and thermomechanical pretreatment[J].Process Biochemistry，2011，46，11 :2194 2200.]。因此，顯示其具有巨大的利用價值和商業(yè)價值。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體內(nèi)。早在20世紀(jì)初，人們已經(jīng)在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)有纖維素酶，能分解天然纖維素。20世紀(jì)40 50年代對產(chǎn)纖維素酶的微生物進(jìn)行了大量的分離篩選工作，建立起比較完整的分離篩選方法。在動物界，纖維素酶已經(jīng)在松木線蟲Bursaphelenchus xylophilus、長角天牛甲蟲Apriona germari、藍(lán)蛘 Mytilus edulis 和淡水螺 Ampullaria. crossean 等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[Kentaro Sakamoto,Haruhiko Toyohara. Molecular cloning of glycoside hydrolase family 45 cellulasegenes from brackish water clam Corbicula japonica[J]. Comprative Biochemistryand Physiology, PartB, 2009，152 :390 396.]。在微生物界，木霉 Trichoderma spp.、曲霉 Aspergillus、青霉 Penicillium 等主要產(chǎn)耐酸纖維素酶[Mohammad I G，MohammadA M. Production of carboxymethyl cellulase from local isolate of AspergillusSpecies [J] Pak. j. life soc. Sci，2010，8 (I) :1 6.];乳酸桿菌 LactobacillusAcidophilus[LI Jv_di，LIU Jian-xin，WU Yue-ming，et al. Effects of Lactobacillusand Cellulase on Fermentation Characteristics of Water Hyacinth Stem andLeaf [J]. Chinese Journal of Animal Science，2007，11 :29 32.]、芽抱桿菌Bacillaceae[Samanta B P，F(xiàn)lorencia C 0，Daniel J D，et al. Cellulase-producingBacillus strains isolated from the intestine of Amazon basin fish[J].Aquaculture Research, 2011,42 (6) :887 891.]等主要產(chǎn)中性和耐喊纖維素酶。真菌中的綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉，是目前公認(rèn)的較好纖維素酶產(chǎn)生菌，但霉菌為好氧微生物，而飼料發(fā)酵、污染物的纖維素類分解等都是在少氧或缺氧環(huán)境中進(jìn)行，并且細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶大多為中性和弱堿性，在腸道特定環(huán)境中具有較高活性，故來源于細(xì)菌的纖維素酶更具有應(yīng)用上的現(xiàn)實意義。雖然現(xiàn)在市場上已有纖維素酶的成熟產(chǎn)品，但是由于這些酶產(chǎn)品是通過微生物發(fā)酵、分離、純化，再與相應(yīng)的載體混合等一系列工藝后才能推向市場，而且這些酶在保存和應(yīng)用時又有嚴(yán)格的條件限制，如溫度、PH等，很容易受外界條件的影響而使其酶活降低，甚至失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌。 再者，本發(fā)明的目的還在于提供一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌制成的飼料添加劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的還在于提供了一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌在制備飼料方面的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，它編碼的蛋白質(zhì)具有序列表SEQ ID NO. I所述的氨基酸序列。所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌是將乳酸桿菌的信號肽基因與纖維素酶基因重組到乳酸桿菌的表達(dá)載體上，再電轉(zhuǎn)化整合到乳酸桿菌，得到轉(zhuǎn)纖維素酶重組乳酸桿菌。具體為所述的重組乳酸桿菌基因組中整合了帶有乳酸桿菌信號肽(signalpeptide, sp)的枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因(cel);其中，纖維素酶基因來源于GenBank上的登陸號為AB016164的枯草芽孢桿菌，所擴(kuò)增的序列是從727-2232bp位堿基；信號肽基因來源于GenBank上的登陸號為Z14250的短小乳酸桿菌L. brevisl. 2028，所擴(kuò)增的序列是260-349位的堿基；將纖維素酶基因和信號肽基因連接后插入到乳酸桿菌表達(dá)載體pllac的多克隆位點，然后再將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276的核糖體結(jié)合位點中，從而獲得纖維素酶基因重組乳酸桿菌。所述的重組乳酸桿菌在重組表達(dá)質(zhì)粒中，設(shè)計并合成的一對特異性引物用于擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因，分別為上游引物PI : 5' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3'(下劃線為 XbaI 酶切位點)；下游引物P2 5 ' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3 '(下劃線為 SmaI 酶切位點)；所說的纖維素的DNA序列，其包含序列表SEQ ID NO. 2的序列或經(jīng)修飾的序列。所述的重組乳酸桿菌在重組表達(dá)質(zhì)粒中，設(shè)計并合成的一對特異性引物用于擴(kuò)增短小乳桿菌的信號肽基因，其引物分別為上游引物P3 :5 ’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 ’，PstI 位點為 CTGCAG ；
下游引物P4 :5 ’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3 ’，XbaI 位點為 CTGCAG ；所述的用于擴(kuò)增短小乳桿菌(Lactobacillus brevis I. 2028)的信號肽基因具有序列表SEQID NO. 3所述的氨基酸序列。則更具體的，重組乳酸桿菌含有表達(dá)質(zhì)粒pllac-sp-cel，重組表達(dá)質(zhì)粒pllac-cel含有乳酸桿菌復(fù)制子ori、核糖體結(jié)合位點RBS、操縱子lac、乳酸桿菌信號肽基因sp、纖維素酶基因cel、核糖體結(jié)合位點RBS和抗性篩選基因紅霉素Ery基因，其表達(dá)式為 -ori-RBS-lac-sp-ceI-RBS-Ery-o由轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌菌種可以發(fā)酵形成的液態(tài)、固態(tài)產(chǎn)品。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌制備而成的飼 料，具體組成為轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌占飼料總重的0. I %。 進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌作為添加劑在制備飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明是從芽孢桿菌中克隆出纖維素酶基因，并將其重組到乳酸桿菌高效表達(dá)載體中，通過向飼料中添加能夠表達(dá)纖維素酶的重組乳酸桿菌來達(dá)到補(bǔ)充動物機(jī)體內(nèi)纖維素酶的不足。在以玉米、大麥、糠麩、餅柏等植物性飼料為主要原料的豬禽的飼料中添加高產(chǎn)纖維素酶的重組乳酸桿菌，一方面乳酸桿菌在生長繁殖過程中分泌的纖維素酶可以使構(gòu)成植物細(xì)胞壁等不易利用的植物纖維素分解成能被吸收的葡萄糖，從而提高動物對高纖維飼料的消化吸收，提高飼料利用率，降低飼料成本；另一方面乳酸桿菌本身可以提高動物生產(chǎn)性能，促進(jìn)動物生長，從而實現(xiàn)一菌多用的功能，不僅促進(jìn)了動物的生長，降低了飼料成本，更是促進(jìn)了動物的健康，可以作為一種無殘留畜禽產(chǎn)品有效的飼料添加劑。本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌可以作為一種口服飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)或養(yǎng)禽業(yè)，從而可以彌補(bǔ)豬、禽腸道不能分泌纖維素酶的不足，而不必添加昂貴的纖維素酶制劑，不僅有利于促進(jìn)飼料原料中的粗纖維的代謝，而且可以促進(jìn)豬的生長，增加養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。此外，宿主菌乳酸桿菌是一種干酪乳桿菌，其本身對動物機(jī)體也有益生功能，通過本發(fā)明可提供一種人工產(chǎn)纖維素酶益生基因工程乳酸桿菌，在豬、禽等單胃動物生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明的一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其構(gòu)建方法包括引物設(shè)計、枯草芽孢桿菌基因組的提取、纖維素酶cel基因的PCR擴(kuò)增、cel基因與pMD18_T載體的連接與轉(zhuǎn)化、短小乳桿菌L. brevis I. 2028基因組的提取、信號肽SP基因的PCR擴(kuò)增、sp基因與PMD18-T的連接、sp基因和cel基因的連接、sp-cel基因與表達(dá)載體pllac的連接、重組表達(dá)載體pllac-sp-cel的轉(zhuǎn)化,具體步驟為I、引物設(shè)計11纖維素酶基因引物設(shè)計利用生物學(xué)軟件Primer Premier6. 0,參照GenBank中菌株AB016164所提供的信息設(shè)計一對引物，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列如下上游引物5 ' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3 '(下劃線為 XbaI 酶切位點)；下游引物5' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3'(下劃線為 SmaI 酶切位點);
I. 2信號肽基因引物設(shè)計利用生物學(xué)軟件Primer Premier6. 0,參考短小乳桿菌L. brevisl. 2028的S-層蛋白基因信號肽序列設(shè)計一對引物，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列如下上游引物P3 :5 ’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 ’，PstI 位點為 CTGCAG ；下游引物P4 :5 ’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3 ’，XbaI 位點為 CTGCAG ；2、枯草芽孢桿菌基因組的提取
將活化的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)18h后，取3ml菌液，然后參照北京艾德萊生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取其基因組DNA，方法按使用說明書步驟進(jìn)行；3、纖維素酶cel基因的PCR擴(kuò)增以上述提取的枯草芽孢桿菌基因組為模板，擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因，反應(yīng)體系如下表I纖維素酶cel基因PCR擴(kuò)增體系
上游引物(20pM)__1.5 U I
下游引物(20pM)__1.5 U I
10XPCR Buffer__5.0 U IPyrobest DNA Polymerase (5U/ U I)1.0 U I
dNTPs (IOpM)__0.25 U I
模板 DNA__0.5 u I
加滅菌超純水至__50 u I輕輕混勻，2000 Xg瞬時離心后進(jìn)行PCR。反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性5min，95°C變性40s，56°C退火50s，72°C延伸70s，循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin，得到PCR產(chǎn)物，于4°C保存?zhèn)溆?；PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行鑒定，例如可以取5iU PCR產(chǎn)物在I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，以Markerl05為對照，觀察擴(kuò)增片段的長度是否約為1152bp，如是，則初步判定為正確；4、cel基因與pMD18_T載體的連接與轉(zhuǎn)化將上述鑒定正確的PCR產(chǎn)物按照北京艾德萊生物科技有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進(jìn)行回收，然后再按照大連寶生物有限公司的pMDlS-T試劑盒說明進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化按照常規(guī)方法將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中，例如，可以使用J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T最尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版第96頁上介紹的方法；利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，驗證正確后命名為pMD-cel。5、短小乳桿菌L. brevis I. 2028基因組的提取方法同步驟2。6、信號肽SP基因的PCR擴(kuò)增以上述提取的基因組為模板，擴(kuò)增短小乳桿菌的信號肽基因，反應(yīng)體系如下
表2信號肽SP基因PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于它編碼的蛋白質(zhì)具有序列表SEQID NO. I所述的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌是將乳酸桿菌的信號肽基因與纖維素酶基因重組到乳酸桿菌的表達(dá)載體上，再電轉(zhuǎn)化整合到乳酸桿菌，得到轉(zhuǎn)纖維素酶重組乳酸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所述的重組乳酸桿菌基因組中整合了帶有乳酸桿菌信號肽(signal peptide, sp)的枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因(cel);其中，纖維素酶基因來源于GenBank上的登陸號為AB016164的枯草芽孢桿菌，所擴(kuò)增的序列是從727-2232bp位堿基；信號肽基因來源于GenBank上的登陸號為Z14250的短小乳酸桿菌L. brevisl. 2028，所擴(kuò)增的序列是260-349位的堿基；將纖維素酶基因和信號肽基因連接后插入到乳酸桿菌表達(dá)載體Pllac的多克隆位點，然后再將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276的核糖體結(jié)合位點中，從而獲得纖維素酶基因重組乳酸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所述的重組乳酸桿菌在重組表達(dá)質(zhì)粒中，設(shè)計并合成的一對特異性引物用于擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因，分別為 上游引物 PI : 5' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3'(下劃線為 XbaI 酶切位點); 下游引物 P2 :5' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3'(下劃線為 Sma I 酶切位點)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所說的纖維素的DNA序列，其包含序列表SEQ ID NO. I的序列或經(jīng)修飾的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所述的重組乳酸桿菌在重組表達(dá)質(zhì)粒中，設(shè)計并合成的一對特異性引物用于擴(kuò)增短小乳桿菌的信號肽基因，其引物分別為上游引物 P3 :5’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 , PstI 位點為 CTGCAG ； 下游引物 P4 :5’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3，, XbaI 位點為 CTGCAG?！?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于所述的用于擴(kuò)增短小乳桿菌(Lactobacillus brevis I. 2028)的信號肽基因具有序列表SEQ ID NO. 2 PJf述的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌，其特征在于重組乳酸桿菌含有表達(dá)質(zhì)粒pllac-sp-cel,重組表達(dá)質(zhì)粒pllac-cel含有乳酸桿菌復(fù)制子ori、核糖體結(jié)合位點RBS、操縱子lac、乳酸桿菌信號肽基因sp、纖維素酶基因cel、核糖體結(jié)合位點RBS和抗性篩選基因紅霉素Ery基因，其表達(dá)式為-ori-RBS-lac-sp-cel-RBS-Ery-。
9.一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌制備而成的飼料，其特征在于具體組成為轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌占飼料總重的O. 1%。
10.一種該轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌作為添加劑在制備飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌及其制品和應(yīng)用，轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌編碼的蛋白質(zhì)具有序列表SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)纖維素酶基因重組乳酸桿菌可以作為一種口服飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)或養(yǎng)禽業(yè)，從而可以彌補(bǔ)豬、禽腸道不能分泌纖維素酶的不足，而不必添加昂貴的纖維素酶制劑，不僅有利于促進(jìn)飼料原料中的粗纖維的代謝，而且可以促進(jìn)豬的生長，增加養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。此外，宿主菌乳酸桿菌是一種干酪乳桿菌，其本身對動物機(jī)體也有益生功能，通過本發(fā)明可提供一種人工產(chǎn)纖維素酶益生基因工程乳酸桿菌，在豬、禽等單胃動物生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N9/42GK102676441SQ20121001085
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者丁軻, 余祖華, 劉一塵, 劉煒, 王天奇, 程相朝, 胡益源, 趙振升, 閆文朝, 黃俊克 申請人:河南科技大學(xué)