專利名稱：一種一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種ー菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，具體涉及對(duì)一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酶制劑最初是以動(dòng)、植物作為原料直接提取，但由于動(dòng)、植物生長周期長、原料有限、酶提取エ藝復(fù)雜等多種因素的影響，不適于大規(guī)模的エ業(yè)生產(chǎn)。而微生物在酶制劑的生產(chǎn)中有其他生物不可比擬的優(yōu)越性微生物對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性和變異能力，人們可利用各種生物學(xué)技術(shù)按照自己的意愿對(duì)微生物進(jìn)行改造，生產(chǎn)出目的酶；微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求不高，大部分是農(nóng)產(chǎn)品廢棄物，價(jià)格低廉，易得到，生產(chǎn)成本低；大部分微生物繁殖快，生長周期短，有利于提高酶制劑的產(chǎn)量等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種ー菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的方法采用了ー種ー菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法包括以下步驟將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)l. 1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011286，可產(chǎn)蛋白酶等9種酶，其中蛋白酶活特別高，將其刺種在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，發(fā)現(xiàn)有水解圈產(chǎn)生,而且水解圈與菌落直徑的可達(dá)4. 80。在培養(yǎng)基初始pH值7. 0，接種量為3%，種齡22h，培養(yǎng)溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間24h時(shí)，所產(chǎn)生的蛋白酶酶活達(dá)到最高。以I %可溶性淀粉為最佳碳源、I %酵母浸粉為最佳氮源，使發(fā)酵培養(yǎng)基組分達(dá)到最優(yōu)。所產(chǎn)生的蛋白酶在溫度25_40°C范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。所產(chǎn)生的蛋白酶最適作用溫度為40°C。所產(chǎn)生的蛋白酶在pH5. 5-6. 5條件下較穩(wěn)定。所產(chǎn)生的蛋白酶在最適pH為值5. 7。在所產(chǎn)生的蛋白酶，Mn2+和Cu2+可顯著提高該蛋白酶的酶活，Mg2+、Ba2+、Zn2+對(duì)該蛋白酶也有一定的促進(jìn)作用，Al3+、Fe2+對(duì)該蛋白酶具有不同程度的抑制作用，且Al3+的抑制作用明顯強(qiáng)于Fe2+。本發(fā)明對(duì)影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件如pH值、接種量、裝液量、種齡、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分中的碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)蛋白酶的最適發(fā)酵時(shí)間24h，最適宜培養(yǎng)基pH值7. 0，接種量為3 %，裝液量15mL/100mL，種齡22h，控制培養(yǎng)溫度37°C。最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉。并通過Folin酚法對(duì)影響蛋白酶酶活的溫度、pH、熱穩(wěn)定性以及金屬離子等因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)蛋白酶最適作用溫度為40°C，最適作用pH為5. 7，Mn2+和Cu2+對(duì)酶有一定的促進(jìn)作用，Al3+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。本發(fā)明中所涉及的枯草芽孢桿菌菌株可產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、月旨肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9種酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶和糖化酶產(chǎn)量比較高，而各酶之間的相互影響因素、誘導(dǎo)條件，最佳產(chǎn)酶條件及復(fù)合酶制劑最佳配伍都有待于進(jìn)ー步開發(fā)研究。本發(fā)明對(duì)蛋白酶最適的培養(yǎng)基配制、最適的發(fā)酵條件以及影響其酶活的相關(guān)因素進(jìn)行了探討，以期達(dá)到高質(zhì)、高量的產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等復(fù)合酶制劑，實(shí)現(xiàn)ー菌多酶發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，依照表I配制不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取上述溶液各I. OOmL，各加O. 4mol/L碳酸鈉溶掖5. OOmL，F(xiàn)olin酚試劑稀釋液I. OOmL，置于40°C ±2°C水浴中顯色20min后取出，用分光光度計(jì)于波長660nm,用IOmm比色皿比色，以不含酪氨酸的O號(hào)管為空白，分別測定其吸光度，記錄0D660 值。以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)作圖，計(jì)算出當(dāng)吸光度為I時(shí)的酪氨酸的量，即為吸光常數(shù)K值。表I酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法
體ロ 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度取lOOug/mL酪氨酸標(biāo)取水的體積(mL)
(ug/mL)準(zhǔn)溶液體積(mL)
0OO10
12028
24046
36064
48082
一5 _100_10 _O _酶活的計(jì)算公式蛋白酶活力(U/mL) = Δ 0D660nmXNXKX4/10A0D660nm為以對(duì)照樣品為空白時(shí)樣品的光密度值；K為光密度為I. 00時(shí)所相當(dāng)?shù)睦野彼釢舛?；N為酶液的稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)試劑的總體積；10為反應(yīng)時(shí)間IOmin?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化I.菌種的活化及種子液的制備取凍干枯草芽孢桿菌菌種劃線法接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37°C條件下培養(yǎng)18-24h。并挑起單個(gè)菌落接種于液體培養(yǎng)中，37°C、140rpm條件下培養(yǎng)18h，保存?zhèn)溆谩?.發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)酶活的影響(I)不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將種子液按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37。。140印111培養(yǎng)，于811、1211、1611、2011、2411、2811分別去發(fā)酵產(chǎn)物，用改良？01丨11酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。(2)不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將種子液按2%接種量接入pH值分別是5. 4,6. 2,7. 0,7. 8,8. 6發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 140rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以上述時(shí)間為最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間，分別取樣用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。
(3)不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響種子液分別按112%,314%,5%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 140rpm以上述最優(yōu)時(shí)間、最佳pH值培養(yǎng)，分別取樣用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。(4)不同菌齡對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響分別取種子液菌齡為10h、13h、16h、19h、22h、25h接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 140rpm以最優(yōu)時(shí)間、pH值、接種量培養(yǎng)分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。(5)不同溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將最佳菌齡的種子液按最佳接種量接種于適宜培養(yǎng)基中，分別在27 °C、32 °C、37 °C、42で、47 °C下，140rpm培養(yǎng)，分別取樣，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。3.發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)酶活的影響

(I)不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響分別用1%葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵液中的蔗糖制成培養(yǎng)基。在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。(2)不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響采用最優(yōu)碳源，氮源改用1%尿素、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液中1%蛋白胨，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。枯草芽孢桿菌蛋白酶影響因素的研究I. pH對(duì)蛋白酶活性的影響以不同pH值的緩沖液I倍稀釋酶液，制得pH分別為5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. O的酶液，在40°C下保溫30min，并用相應(yīng)pH值的緩沖液配制酪蛋白溶液作為底物，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定。2.溫度對(duì)蛋白酶活性的影響將酶液用pH 7.5的磷酸緩沖液1倍稀釋后，分別在25で、30で、35で、40で、45で下以酪素溶液為底物，用改良Folin酚法測定酶活力。3.常見金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響分別將CuS04、FeS04、MgS04、MnS04、ZnS04、BaCl2、AlCl3 配成 O. Olmol/L 的溶液，各取ImL分別加入到純化的ImL酶液中(即將酶液稀釋2倍)，在最適溫度下處理IOmin后，并以不加金屬離子的酶液作對(duì)照，用改良Folin酚法測定殘余蛋白酶活力。
本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) I. 1111,保藏于位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011286，保藏日期為2011年8月11日。


圖I為酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響；圖3為不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響；圖4為不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響；圖5為不同種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響；圖6為不同溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響；圖7為不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響；圖8為不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響；
圖9不同pH對(duì)酶活的影響；圖10為溫度對(duì)酶活的影響；圖11金屬離子對(duì)酶活的影響。
具體實(shí)施例方式(一)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實(shí)施例依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖I所示，據(jù)圖計(jì)算線性回歸方程的斜率K = 92. 98，即吸光常數(shù)為92. 98。( ニ)枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)施例

I.發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響(I)發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將種子液按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 140印111培養(yǎng)，于811、1211、1611、2011、24h、28h分別去發(fā)酵產(chǎn)物，用改良Folin酚法測定酶活結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)初期枯草芽孢桿菌開始產(chǎn)生蛋白酶，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，酶活性逐漸升高。培養(yǎng)24h酶活性達(dá)到最高，為23. 39U/mL, 28h后酶活性比24h的低。因此該菌株產(chǎn)生蛋白酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間為20-24h，隨后酶活力開始下降，產(chǎn)蛋白酶與菌體生長同步進(jìn)行，該蛋白酶生物合成類型屬于同步合成型。(2)培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將種子液按2%接種量接入pH值分別是5. 4,6. 2,7. 0,7. 8,8. 6發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C 140rpm搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，分別取樣用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)基起始pH過高或過低都會(huì)影響蛋白酶的產(chǎn)生，尤其是當(dāng)pH值達(dá)8. 6時(shí)，對(duì)蛋白酶的產(chǎn)生有非常大影響，pH為6. 2吋，酶活為17. 39U/mL, pH為7. O時(shí)，產(chǎn)酶效果最好，酶活達(dá)到19. 67U/mL。(3)接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響種子液分別按I %、2 %、3 %、4 %、5 %接種于pH7. O發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C 140rpm24h，分別取樣用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，接種量3%時(shí)，其酶活最高。接種量為1%、2%時(shí)產(chǎn)酶量較低；接種量為4%、5%時(shí)，蛋白酶產(chǎn)量也較低。(4)不同菌齡對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響分別取種子液菌齡為1011、1311、1611、1911、2211、2511按3%接種于？!17.0發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 140rpm24h,分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，其結(jié)果見圖5所示。由圖5可知，接種13h菌齡的種子液產(chǎn)酶量最低，比IOh種齡的還低，這可能是由實(shí)驗(yàn)條件引起的，如發(fā)酵瓶溶氧量等，接種19h到22h菌齡的種子液，菌株產(chǎn)酶量大逐漸增大，22h后產(chǎn)酶量大逐漸減少。(5)不同溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將22h菌齡的種子液按3%接種于pH7. O發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于27°C、32°C、37°C、42°C、47°C，140rpm搖床振蕩24h，分別取樣用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，其結(jié)果見圖6所示。
由圖6可知，培養(yǎng)溫度低于27°C時(shí)，酶活性較低，隨著溫度的升高，酶活性逐漸提高；培養(yǎng)溫度達(dá)到37°C時(shí)，發(fā)酵液的酶活性最高，為23. 39U/mL ;隨著溫度升高，酶活性開始下降2.發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)酶活的影響(I)不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響分別用I %葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵液中的蔗糖制成培養(yǎng)基，置于37°C 140rpm下培養(yǎng)24h，分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，其結(jié)果見圖7。由圖7可知，以可溶性淀粉為碳源時(shí)酶活最高，蔗糖次之，而麥芽糖作為碳源時(shí)產(chǎn)酶量最低。(2)不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響 采用可溶性淀粉為碳源，氮源改用1%尿素、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液中1%蛋白胨，置于37°C 140rpm下培養(yǎng)24h，分別取樣品，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8。由圖8可知，蛋白胨、牛肉膏等有機(jī)氮相對(duì)尿素、氯化銨等無機(jī)氮而言，產(chǎn)蛋白酶酶活較高，尤其是以酵母浸粉為氮源時(shí)酶活最高。(三)枯草芽孢桿菌蛋白酶影響因素的研究實(shí)施例I. pH對(duì)蛋白酶活性的影響以不同pH值的緩沖液I倍稀釋酶液并用相應(yīng)pH值的緩沖液配制酪素溶液作為底物，用改良Folin酚法對(duì)其酶活進(jìn)行測定，其結(jié)果見圖9。如圖9所示，pH在5. 0-5. 7時(shí)，酶活性隨著pH值的升高而升高；pH5. 7時(shí)，酶活性達(dá)到最高；PH > 5. 7時(shí)，酶活性呈下降趨勢。因此，該酶在弱酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定，酶的最適pH為5. 7。2.溫度對(duì)蛋白酶活性的影響將酶液用pH 7.5的磷酸緩沖液1倍稀釋后，分別在25で、30で、35で、40で、45で下以酪素溶液為底物，用改良Folin酚法測定酶活力，其結(jié)果見圖10。如圖10示，在25_40°C之間，酶活性隨著溫度的上升而上升；40°C時(shí)，酶活性達(dá)到最高；超過40°C后，酶活性開始下降。因此，蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為40°C。3.常見金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響分別將CuS04、FeSO4, MgSO4, MnSO4, ZnSO4, BaCl2, AlCl3 配成 O. Olmol/L 的溶液，各取ImL分別加入到純化的ImL酶液中(即將酶液稀釋2倍)，在40°C處理IOmin后，并以不加金屬離子的酶液作對(duì)照，用改良Folin酹法測定殘余蛋白酶活力,其結(jié)果見圖11。由圖11可知，經(jīng)Al3+、Fe2+處理后，酶活性低于對(duì)照，表明這兩種離子對(duì)蛋白酶活性有不同程度的抑制作用，而Al3+的抑制作用明顯強(qiáng)于Fe2+ ;經(jīng)Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+處理后，酶活性高于對(duì)照，表明這幾種金屬離子對(duì)蛋白酶活性有促進(jìn)作用，其中Mn2+和Cu2+的促進(jìn)作用尤其強(qiáng)，酶活分別增加了 42. 4%和38. 9%, Mg2+、Zn2+、Ba2+的促進(jìn)作用相近，酶活分別增加了 9. 4%,8. 2%和7. 6%。
權(quán)利要求
1.一種一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)l. 1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNO M2011286刺種在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，發(fā)現(xiàn)有水解圈產(chǎn)生，而且水解圈與菌落直徑的可達(dá)4. 80。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I中所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于在培養(yǎng)基初始pH值7. O，接種量為3 %，種齡22h，培養(yǎng)溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間24h時(shí)，所產(chǎn)生的蛋白酶酶活達(dá)到最聞。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于以1%可溶性淀粉為最佳碳源、I %酵母浸粉為最佳氮源，使發(fā)酵培養(yǎng)基組分達(dá)到最優(yōu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于所產(chǎn)生的蛋白酶在溫度25-40°C范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于所產(chǎn)生的蛋白酶最適作用溫度為40°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求書I所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于所產(chǎn)生的蛋白酶在pH5. 5-6. 5條件下較穩(wěn)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求書6所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于所產(chǎn)生的蛋白酶在最適pH為值5. 7。
8.根據(jù)權(quán)利要求書I所述一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于在所產(chǎn)生的蛋白酶，Mn2+和Cu2+可顯著提高該蛋白酶的酶活，Mg2+、Ba2+、Zn2+對(duì)該蛋白酶也有一定的促進(jìn)作用，Al3+、Fe2+對(duì)該蛋白酶具有不同程度的抑制作用，且Al3+的抑制作用明顯強(qiáng)于Fe2+。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一菌多酶菌株產(chǎn)蛋白酶的方法，包括以下步驟將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NOM 2011286刺種在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃溫箱中培養(yǎng)24h，發(fā)現(xiàn)有水解圈產(chǎn)生，而且水解圈與菌落直徑的可達(dá)4.80。本發(fā)明通過Folin酚測定酶活法測定其最優(yōu)酶活條件為在培養(yǎng)基初始pH值7.0，接種量為3％，種齡22h，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間24h時(shí)，所產(chǎn)生的蛋白酶酶活達(dá)到最高。同時(shí)，通過Folin酚測定酶活法對(duì)影響蛋白酶酶活的溫度、pH、熱穩(wěn)定性以及金屬離子等因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)蛋白酶最適作用溫度為40℃，最適作用pH為5.7，Mn2+和Cu2+對(duì)酶有一定的促進(jìn)作用，Al3+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。本發(fā)明為進(jìn)一步探索各酶相關(guān)影響因素、最適的培養(yǎng)基配制、最適的發(fā)酵條件、最佳的復(fù)合酶配伍，以期實(shí)現(xiàn)一菌多酶高質(zhì)、高量的共同發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102676483SQ20121001142
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者丁軻, 關(guān)隨霞, 劉一塵, 吳庭才, 張謙, 李宏偉, 李小康, 李銀聚, 汪洋, 王臣, 盛敏, 程相朝, 龔婷 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)