專利名稱：硫化物醌氧化還原酶基因載體構建及其轉基因工程乳酸菌菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及硫化物醌氧化還原酶基因載體(pMG36e-SQR-Myc)構建及其轉基因工程乳酸菌菌株，屬于生物技術領域。該轉SQR基因工程菌可導入畜禽腸道內定居，以降低腸道糞便中硫化物廢氣的產生與排放，減少環(huán)境污染。ニ背景技術：
隨著畜牧產業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖場規(guī)模的不斷擴大，畜禽(豬、雞、牛等)糞便產生的廢氣(H2S等硫化物)已經成為不容忽視的空氣污染源，如何使這些廢氣無害化是保證環(huán)境友好型養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的必要條件之一。然而，目前采用堆放發(fā)酵、沼氣化、吸附、焚燒以及除臭劑等常規(guī)方法可一定程度上降低廢氣對環(huán)境的污染，還不能做到無害化。所以探求ー種廢氣無害化處理技術途徑非常必要。硫化物-醌氧化還原酶(Sul de-Quinone Reductase，SQR)廣泛存在于光營養(yǎng)和化學營養(yǎng)細菌中(綠菌屬、莢膜桿菌屬、著色菌屬等)，它是一條57-kDa的多肽，能夠分解 H2S等硫化物。1997年，ShUtz等從紅莢膜桿菌中分離純化出SQR，并將SQR基因成功克隆于大腸桿菌，結果顯示，大腸桿菌表達的SQR具有生物酶活性。近十余年來，國內外科學家對 SQR基因的序列結構及其降解硫化物的生物功能進行了系統(tǒng)的研究，取得顯著進展，其特殊生物功能的利用前景已初見端倪。但目前為止尚未開展有關利用SQR用于降低畜禽糞便中硫化物排放的研究。乳酸菌是宿主(人和動物)腸道中重要的益生菌群之一，對調節(jié)維持腸道微生態(tài)平衡，促進攝入養(yǎng)分的消化、吸收利用，維持宿主健康狀態(tài)等具有非常有益的作用。隨著乳酸菌的各種表達調控元件的成功分離，使得乳酸菌成為較理想的轉基因工程受體菌。pMG36e 是常用于乳酸乳球菌的一種表達型質粒載體，該質粒大小為361Λ，含紅霉素抗性基因、p32 啟動子、多克隆位點和Prtp轉錄終止子。Guchte和Brurberg等以此為載體已在乳酸菌中成功表達溶菌酶和幾丁質酶等外源基因產物。趙瑩等成功獲得了酸性纖維素酶轉基因乳酸桿菌菌株；趙丹等則獲得了轉雞球蟲基因的乳酸桿菌。目前，轉基因乳酸桿菌研究已見諸于動物營養(yǎng)和動物疾病防治等領域，但尚未涉及于應用轉SQR基因乳酸菌降低動物腸道糞便中廢氣產生于排放，減少環(huán)境廢氣污染相關領域的研究。SQR能夠降解等硫化物的生物功能已經得到肯定，但是通過轉基因乳酸菌表達的SQR降解H2S等硫化物這一新途徑降低畜禽糞便中的硫化物排放，尚需解決諸種技術問題，如構建出適宜的SQR基因乳酸菌表達質粒，該質粒經轉化整合在乳酸菌基因組中及其傳代過程中穩(wěn)定遺傳以及SQR能否在乳酸菌中高效表達等，這些技術環(huán)節(jié)必須在開展SQR 轉基因乳酸菌微生態(tài)制劑的研究及用于活體動物實驗之前得到有效解決。針對上述技術環(huán)節(jié)問題，本發(fā)明構建出SQR基因的乳酸菌表達質粒pMG36e-SQR，經電轉化方法感染乳酸菌工程菌，鑒定和篩選出高效穩(wěn)定表達SQR的乳酸菌菌株，并經反復傳代、建系。為進ー步開展SQR轉基因乳酸菌微生態(tài)制劑的研制，有效解決畜禽養(yǎng)殖過程中H2S等硫化物環(huán)境污染難題提供必要的實驗材料和關鍵技術支撐。

發(fā)明內容
技術問題
本發(fā)明的目的是提供表達SQR蛋白的重組載體pMG36e-SQR構建方法及其轉基因乳酸菌工程菌株制備技木，最終獲得的轉基因乳酸菌株可穩(wěn)定、高效地表達SQR。技術方案
表達SQR蛋白的乳酸菌，是通過以下方法生產的，包括 (一)乳酸菌SQR蛋白表達載體pMG36e-SQR的構建 1. pMG36e-SQR-Myc載體構建及其鑒定
本發(fā)明SQR基因載體pMG36e-SQR-Myc的構建選用pcDNA3. I-SQR-Myc (圖1)真核表達質粒為最初原材料，首先，利用限制性內切酶Kpn I和)(ba I將SQR目的基因連同Myc標記基因(即SQR-Myc)從pcDNA3. I-SQR-Myc載體上酶切下來，回收SQR-Myc基因片段，采用T4 連接酶將其連接于pMG36e載體(圖2)相應的酶切位點，構建成pMG36e-SQR-Myc (圖3)原核表達載體。將轉化子利用KCM轉化法導入大腸桿菌DH5 α中，在含有紅霉素的LB培養(yǎng)基上篩選、鑒定出陽性轉化子。2.含SQR基因的重組質粒鑒定
為確認轉化子的陽性，必須對重組質粒pMG36e-SQR-Myc進行PCR法和雙酶切法鑒定。 在KCM法轉化大腸桿菌后接種的固體培養(yǎng)基上分別挑取白色菌落，接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，堿裂解法少量提取質粒，經雙酶切鑒定目的基因SQR和標記基因Myc連接于pMG36e的相應位點(見圖4)。以質粒為模板，P1、P2為引物進行擴増，鑒定陽性重組質粒。引物Pl TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT, P2 TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反應條件為 94°C，預變性 5min， 94°C變性10s，51°C退火30s，72°C延伸80s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測出該重組質粒含有SQR基因(圖5)。(ニ)乳酸乳球菌MG1363的電轉化 1.乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)的制備
接種MG1363于GM17培養(yǎng)基中，30で培養(yǎng)過夜，按5%接種量接種于含1%甘氨酸的高滲GM17培養(yǎng)基(SGM17)至OD值為0. 2^0. 8，培養(yǎng)結束后將細菌培養(yǎng)物冰浴lOmin，離心收集菌體，冰冷的甘油磷酸緩沖液洗滌菌體3次，最后采用菌液體積的1/100的電擊緩沖液重思菌體。2.電穿孔法轉化MG1363
質粒pMG36e-SQR-Myc與上述感受態(tài)MG1363混合，冰浴lOmin，電擊。電轉參數如下電壓2000 V，電容25 μ F，電阻400 Ω。30°C復蘇培養(yǎng)3 h后，將其涂布在含有10 μ g/ mL 的紅霉素GM17平板上，培養(yǎng)2 3 d，獲得陽性轉化子菌落。(三)SQR在乳酸乳球菌MG1363中的表達
取陽性乳酸菌菌株，接種于5mL液體GM17培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，收集菌體，用雙蒸水洗2次，加入終濃度lOmg/mL溶菌酶100 μ 1，37°C消化30min，加等量的上樣緩沖液，100 °C 作用5 min，高速離心后用于SDS-PAGE電泳，結果顯示表達產物中含有目的蛋白大小的條帶(圖6)。有益效果
本發(fā)明成功構建了 SQR的乳酸菌表達載體pMG36e-SQR-Myc，為了檢測目的蛋白SQR的表達情況，同時將標簽蛋白Myc也連入其中，并通過雙酶切和PCR兩種方法鑒定 pMG36e-SQR-Myc是否連接成功。獲得感受態(tài)的乳酸乳球菌MG1363，并進一歩調節(jié)優(yōu)化電轉化參數(電壓、電容等)，建立高效轉化乳酸乳球菌的電轉化參數條件，獲得表達SQR的乳酸乳球菌菌株，SQR的表達通過SDS-PAGE電泳和^festern Blot進行檢測。迄今為止已有大腸桿菌表達SQR的文獻報道，但尚未見SQR在乳酸菌中的表達研究。之所以選擇乳酸菌是因為乳酸菌為益生菌類，可作為ー種安全的微生態(tài)制劑直接飼喂動物，使之棲居于腸道內發(fā)揮正常生理作用，而SQR乳酸菌有望在動物腸道中發(fā)揮降解硫化物的功能，最終降低糞便中硫化物的排放。四

圖1 :pcDNA3. 1(-)-SQR-Myc重組質粒示意圖。圖2 :pMG36e質粒圖譜示意圖，藍線標注分別為)(ba I和Kpn I酶切位點。圖3 :pMG36e-SQR-Myc重構質粒示意圖，顯示SQR-Myc的插入位置。圖4 :pMG36e-SQR-Myc經過Kpn I和Xba I酶切后的電泳圖。M: Marker ;1和2: pMG36e_SQR-Myc酶切后產生的目的基因條帶(2個重復)。圖 5 :pMG36e-SQR-Myc PCR 擴增鑒定圖。M: Marker ； 1-4: pMG36e_SQR-Myc PCR 擴增產物條帶(4 個重復)。圖6 轉基因乳酸乳球菌中表達SQR的SDS-PAGE圖譜。M 蛋白 Marker ；1 陰性對照；2、3 :pMG36e-SQR-Myc_MG1363 陽性菌株，箭頭標記為目的蛋白條帶。圖7 =SQR在乳酸菌中的表達Western檢測分析。M 蛋白 Marker ；1 陰性對照；2、3 :pMG36e_SQR-Myc- MG1363 陽性菌株中提取的總蛋白，箭頭所指為目的基因表達的SQR酶蛋白條帶。圖8 轉SQR乳酸乳球菌MG1363的生長曲線圖。五具體實施例方式
(一)乳酸菌SQR蛋白表達載體pMG36e-SQR-Myc的構建(圖1_5) 1.主要實驗材料
質粒:pcDNA3. I-SQR-Myc (于峰祥等，江蘇農業(yè)學報，2011，27 (5) 1043-1046)，pMG36e 由贏潤生物技術公司購買。菌種大腸桿菌DH5ci購于大連寶生物有限公司。酶及試劑限制性內切酶Kpn I和)(ba I、T4連接酶、酶切反應的緩沖液、DL5000 Marker, PCR premix均購自大連Takara公司；膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技公司；其余化學試劑為國產、進ロ分裝或進ロ。2.溶液配制
培養(yǎng)基、試劑的配制若無特別要求，均以重蒸水為溶剤，高壓滅菌條件為102. 9kPa蒸氣滅菌30分鐘。LB液體培養(yǎng)基蛋白陳10g，酵母粉5g，NaCl IOg，溶于800ml水中，調節(jié)pH值至 7. 5，定容至1000ml，高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基蛋白陳10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加瓊脂粉15g， 調節(jié)PH值至7. 5，定容至1000ml，高壓滅菌。
紅霉素配制將紅霉素溶于無水乙醇中，濃儲液濃度為50mg/ml，工作濃度 250μ g/ml。KCM轉化法相關試劑配制 (1) TSM 液配制(IOml)
權利要求
1.硫化物醌氧化還原酶基因載體pMG36e-SQR-Myc，其構建方法包括1)pMG36e-SQR-Myc 載體構建選用pcDNA3. I-SQR-Myc真核表達質粒為最初原材料，利用限制性內切酶Kpn I和 Xba I將SQR目的基因連同Myc標記基因SQR-Myc從pcDNA3. I-SQR-Myc載體上酶切下來， 回收SQR-Myc基因片段，采用T4連接酶將其連接于pMG36e載體相應的酶切位點，構建成 pMG36e-SQR-Myc原核表達載體；利用KCM轉化法導入大腸桿菌DH5 α中，在含有紅霉素的 LB培養(yǎng)基上篩選、鑒定出陽性轉化子；2)含SQR基因的重組質粒陽性鑒定分別挑取陽性轉化子白色菌落進行PCR法和雙酶切法鑒定接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，堿裂解法少量提取質粒，經雙酶切鑒定目的基因SQR和標記基因Myc連接于pMG36e的相應位點；以質粒為模板，根據SQR基因序列設計引物PI、P2，鑒定陽性重組質粒，引物Pl TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT, P2 TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反應條件為 94°C，預變性 5min， 94°C變性10s，51°C退火30s，72°C延伸80s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，含有SQR基因的條帶，大小為1179bp。
2.用權利要求1所述載體轉化獲得的轉基因工程乳酸菌菌株，是由以下步驟獲得的1)乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)的制備接種MG1363于GM17培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)過夜，按體積比5%接種量接種于含體積比1% 的甘氨酸的SGM17培養(yǎng)基至OD值為0. 2^0. 8，培養(yǎng)結束后將細菌培養(yǎng)物冰浴lOmin，離心收集菌體，冰冷的甘油磷酸緩沖液洗滌菌體3次，最后采用菌液體積的1/100的電擊緩沖液重懸菌體；2)電穿孔法轉化MG1363質粒pMG36e-SQR-Myc與上述感受態(tài)MG1363混合，冰浴lOmin，電擊，電轉參數如下電壓 2000 V，電容 25 μ F,電阻 400 Ω，300C復蘇培養(yǎng)3 h后，將其涂布在含有10 μ g/ mL的紅霉素GM17平板上，培養(yǎng)2 3 d，獲得轉基因工程乳酸菌菌株菌落。
3.權利要求2所述轉基因工程乳酸菌菌株表達的硫化物醌氧化還原酶，是由以下步驟獲得的取權利要求2所述轉基因工程乳酸菌菌株，接種于5mL液體GM17培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，收集菌體，用雙蒸水洗2次，加入終濃度lOmg/mL溶菌酶ΙΟΟμ 1，37°C消化30min，加等量的上樣緩沖液，100で作用5 min，高速離心后用于SDS-PAGE電泳，結果顯示表達產物中含有目的蛋白的條帶，大小為53KD，即為獲得的所述轉基因工程乳酸菌菌株表達的硫化物醌氧化還原酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及硫化物醌氧化還原酶基因載體(pMG36e-SQR-Myc)構建及其轉基因工程乳酸菌菌株,屬于生物技術領域。選用pcDNA3.1-SQR-Myc真核表達質粒為最初原材料，將SQR-Myc基因片段，連接于pMG36e載體，電轉化乳酸乳球菌MG1363并得到高效穩(wěn)定表達。本發(fā)明選擇乳酸菌是因為乳酸菌為益生菌類，可作為一種安全的微生態(tài)制劑直接飼喂動物，使之棲居于腸道內發(fā)揮正常生理作用，而SQR乳酸菌有望在動物腸道中發(fā)揮降解硫化物的功能，最終降低糞便中硫化物的排放。
文檔編號C12N1/21GK102559732SQ20121001167
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權日2012年1月16日
發(fā)明者于峰祥, 于建寧, 徐小波, 李燕, 潘偉芹, 王公金, 陳哲 申請人:江蘇省農業(yè)科學院