專(zhuān)利名稱(chēng)：一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株及用該酶生產(chǎn)果聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的一種新微生物菌株及其培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶，并將該酶用于生物制備果聚糖的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體的說(shuō)本發(fā)明涉及來(lái)源于土壤的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(也<^77心methylotrophicus) SK 21. 002,它能夠產(chǎn)生果聚糖蔗糖酶，并利用該酶催化蔗糖合成果聚糖(levan)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，功能食品成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)，更是廣大食品從業(yè)者研發(fā)的焦點(diǎn)。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能營(yíng)養(yǎng)特性的功能食品配料成為關(guān)注的熱點(diǎn)。
果聚糖，是由D-果糖經(jīng)P (2 — 6)鍵連接而成的線性直鏈多糖，聚合度(DP)為 2 90，平均在14 20，聚合度較低時(shí)(DP=2 9)則稱(chēng)為低果聚糖。果聚糖可用作水溶性的膳食纖維，膠體穩(wěn)定劑等，它能減少膽固醇和豬油、脂肪等動(dòng)植物脂肪在人體中的吸收，加快人體對(duì)金屬離子的吸收，并能調(diào)理腸道，比如腸道雙歧桿菌的增生和限制食品工業(yè)中有毒微生物的生長(zhǎng)，也能用作清潔劑的軟化劑，血漿添加物和化妝品的保濕劑。2001年3月， 使用果聚糖作為食品的國(guó)家有美國(guó)(FDA )、歐洲(SCF )、日本、澳大利亞和新西蘭(ANZFA )。 大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家批準(zhǔn)果聚糖為食品原料。在日本，果聚糖被用作乳酸菌食品的原料。
因此，果聚糖作為一種功能性食品添加劑廣泛應(yīng)用于低脂食品、糖果、糕點(diǎn)等食品。
酶法合成是工業(yè)化生產(chǎn)果聚糖的主要途徑。酶法合成果聚糖的產(chǎn)率受多種因素影響，酶的來(lái)源直接影響酶法合成的果聚糖的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)率。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種微生物可以產(chǎn)生此酶，其中主要集中在解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyIoIiquefaciens、、'運(yùn)_另]發(fā)_ 酵單胞菌QZytnotnonas mobi/is )、枯草芽抱桿菌iBaciIlus sub )、多粘類(lèi)芽抱桿菌 {PaenibadIlus polymyxa^{Actinomyces iscosus、。
本發(fā)明人深入調(diào)查和研究了現(xiàn)有技術(shù)并對(duì)各種高收率生產(chǎn)果聚糖的方法進(jìn)行了研究，最終我們篩選到一株能產(chǎn)生果聚糖蔗糖酶的新微生物，證明了通過(guò)此酶與高濃度的蔗糖反應(yīng)能得到高轉(zhuǎn)化率的果聚糖，并通過(guò)濃縮干燥等手段得到果聚糖的糖漿或粉末。基于上述發(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的微生物，它能夠生產(chǎn)高酶活的果聚糖蔗糖酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種該果聚糖蔗糖酶與高濃度蔗糖溶液反應(yīng)的方法， 以得到高轉(zhuǎn)化率的果聚糖。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種果聚糖提純與精制的方法，以得到高濃度果聚糖糖漿或粉末。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株來(lái)源于土壤的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌me thyIo trophi cus ) SK21. 002,其為能夠產(chǎn)生果聚糖鹿糖酶的菌株,并利用該果聚糖鹿糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生成果聚糖。
本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類(lèi)命名為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌{Bacillus me thyIo trophi cus ) SK21. 002,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為 CCTCC NO M 2011476。
用所述的微生物甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌CCTCC NO M 2011476，發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的方法，步驟為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件菌株于30-37 °C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10-20h活化該菌株；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；發(fā)酵條件接種量1%_10%，30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵10-48h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；(3)發(fā)酵后處理發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集上清液即為粗酶液，經(jīng)檢測(cè)酶活達(dá)到l_50U/mL ；所得粗酶液進(jìn)一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
用制備的果聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)果聚糖的方法，向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)果聚糖，轉(zhuǎn)化條件為蔗糖溶液的蔗糖質(zhì)量濃度為10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8.0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為40_60°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間 24-72h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)10%以上，得到含有果聚糖的酶反應(yīng)液，進(jìn)一步加工處理用來(lái)制備果聚糖糖漿或果聚糖粉末。
果聚糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有果聚糖的酶反應(yīng)液中添加酶反應(yīng)液固形物質(zhì)量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進(jìn)行硅藻土過(guò)濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為10%-70%，即得果聚糖糖漿。
果聚糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同果聚糖糖漿制備所述的脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度150-200°C、出風(fēng)溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來(lái)的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌 {Bad Ilus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,以此甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，以鹿糖為碳源、酵母浸出物和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶，發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，在發(fā)酵液中酶活達(dá)到l_50U/mL。將該果聚糖蔗糖酶添加到質(zhì)量濃度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，轉(zhuǎn)化24-72h，轉(zhuǎn)化率達(dá)10%以上。本發(fā)明方法生產(chǎn)的果聚糖產(chǎn)品安全可靠，是一種很有市場(chǎng)潛力的功能性食品配料。
生物材料樣品保藏一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類(lèi)命名為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿儀{Bacillus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng) CCTCC，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011476，保藏日期2011年12月 23日。
具體實(shí)施方式
以下是甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌SK21. 002進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)果聚糖的實(shí)施實(shí)例，但本發(fā)明并不限于所列出的幾個(gè)實(shí)例。
實(shí)施例I微生物發(fā)酵產(chǎn)酶用SK21. 002進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，按說(shuō)明書(shū)所述的發(fā)酵條件，通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)酶的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵20h后酶活已經(jīng)趨于平穩(wěn)，故確定發(fā)酵時(shí)間為20h左右。發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響如表I所示。酶活力定義為每分鐘轉(zhuǎn)移I U mol果糖所需的酶量為一個(gè)果聚糖蔗糖酶活力單位。
酶活的測(cè)定方法HPLC法測(cè)定果聚糖的生成量。
表I發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響時(shí)間(h)691215182022果聚糖蔗糖酶酶活(U/mL)0. 56I. 26I. 49I. 62I. 902. 892. 62實(shí)施例2酶法轉(zhuǎn)化蔗糖生成果聚糖向質(zhì)量濃度20%蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶催化轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為底物蔗糖質(zhì)量濃度為20%，pH7. 0，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為50°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間48h。
實(shí)施例3果聚糖糖漿的制備(1)脫色在含有果聚糖的酶反應(yīng)液中添加酶反應(yīng)液固形物質(zhì)量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進(jìn)行硅藻土過(guò)濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為20%-70%，即得果聚糖糖漿。
實(shí)施例4果聚糖粉末的制備(I)脫色同實(shí)施例3的脫色條件。
(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度150-200°C、出風(fēng)溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類(lèi)命名為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌 methylotrophicus)^ 21. 002，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011476。
2.用權(quán)利要求I所述的CCTCCNO M 2011476菌株發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于步驟為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件CCTCC NO M 2011476菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20h活化該菌株；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；發(fā)酵條件接種量1%_10%，30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵10-48h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；(3)發(fā)酵后處理發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集上清液即為粗酶液，經(jīng)檢測(cè)酶活達(dá)到1-50 U/mL ；所得粗酶液進(jìn)一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
3.用權(quán)利要求2所述方法制備的果聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)果聚糖的方法，其特征在于向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)果聚糖，轉(zhuǎn)化條件為蔗糖溶液的蔗糖質(zhì)量濃度為10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8. 0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為40-60°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間24-72h，轉(zhuǎn)化率達(dá)10%以上，得到含有果聚糖的酶反應(yīng)液，進(jìn)一步加工處理用來(lái)制備果聚糖糖漿或果聚糖粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有果聚糖的酶反應(yīng)液中添加酶反應(yīng)液固形物質(zhì)量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進(jìn)行硅藻土過(guò)濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為10%-70%，即得果聚糖糖漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同果聚糖糖漿制備所述的脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度150-200°C、出風(fēng)溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
全文摘要
一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株及用該酶生產(chǎn)果聚糖的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來(lái)的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)SK21.002，以此甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，以蔗糖為碳源、酵母浸出物和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶，發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，在發(fā)酵液中酶活達(dá)到1-50U/mL。將該果聚糖蔗糖酶添加到質(zhì)量濃度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，轉(zhuǎn)化24-72h，轉(zhuǎn)化率達(dá)10%以上。本發(fā)明方法生產(chǎn)的果聚糖產(chǎn)品安全可靠，是一種很有市場(chǎng)潛力的功能性食品配料。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102533605SQ20121001200
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者張濤, 李潤(rùn)靜, 江波, 沐萬(wàn)孟, 繆銘 申請(qǐng)人:江南大學(xué)